Badania przesiewowe kanałów jonowych w komórkach nowotworowych

Białka transportujące błonę są kluczowe dla komunikacji między komórkami, jak również dla utrzymania homeostazy komórkowej. Wśród białek transportujących błonę, kanały jonowe służą do napędzania wzrostu i rozwoju komórek oraz do utrzymania stanu komórek w trudnych i zmieniających się środowiskach. Doniesiono również, że kanały jonowe napędzają i wspierają rozwój guzów litych, zarówno ogólnoustrojowo, jak i w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN)^1,2. Na przykład kanały KCa3.1 są odpowiedzialne za regulację potencjału błonowego i kontrolowanie objętości komórek, co jest ważne w regulacji cyklu komórkowego. Doniesiono, że wadliwe kanały KCa3.1 przyczyniają się do nieprawidłowej proliferacji komórek nowotworowych³. Ponadto kanały jonowe mogą przyczyniać się do przerzutowego rozprzestrzeniania się nowotworów. Na przykład kanały przejściowego potencjału receptorowego (TRP) są zaangażowane w napływ Ca²⁺ i Mg^{2 +}; Ten napływ aktywuje kilka kinaz i białek szoku cieplnego, które działają w celu regulacji macierzy zewnątrzkomórkowej otaczającej guz, co z kolei jest ważne dla inicjowania przerzutów raka⁴.

Ponieważ kanały jonowe mogą przyczyniać się do rozwoju nowotworów, mogą być również celem leczenia raka związanego z lekami. Na przykład oporność na metody leczenia, w tym chemioterapię i nowatorską immunoterapię, jest związana z dysregulacją funkcji kanałów jonowych^5,6,7. Ponadto kanały jonowe stają się ważnymi celami leków hamujących wzrost i rozwój nowotworów, przy czym badane są leki małocząsteczkowe (zatwierdzone przez FDA), a także biopolimery, w tym przeciwciała monoklonalne^1,2,8,9. Chociaż poczyniono znaczne postępy na tym froncie, odkrywanie leków na raka z kanałem jonowym pozostaje słabo rozwinięte. Wynika to częściowo z wyjątkowych wyzwań związanych z badaniem kanałów jonowych w komórkach nowotworowych. Na przykład istnieją ograniczenia techniczne w tworzeniu testów elektrofizjologicznych dla związków wolno działających oraz czasowe różnice w aktywacji kanału i działaniu leków. Co więcej, rozpuszczalność związków może również hamować postęp, ponieważ większość powszechnie stosowanych obecnie zautomatyzowanych systemów elektrofizjologii wykorzystuje podłoża hydrofobowe, które mogą przyczyniać się do powstawania artefaktów w wyniku adsorpcji związków. Ponadto duże bioorganiczne terapie molekularne, takie jak produkty naturalne, peptydy i przeciwciała monoklonalne, są technicznie trudne do zbadania przy użyciu konwencjonalnych testów elektrofizjologicznych¹⁰. Wreszcie, właściwości bioelektryczne komórek nowotworowych pozostają słabo poznane¹¹.

Tymczasem, barwienie immunofluorescencyjne kanałów jonowych jest często trudne. Wynika to częściowo ze złożoności ich struktur i kontekstu w błonie, które wpływają na zdolność zarówno do wytwarzania, jak i wykorzystywania przeciwciał do badań mikroskopowych. Szczególnie ważne jest, aby przeciwciała używane do barwienia kanałów jonowych zostały zweryfikowane pod kątem swoistości, powinowactwa i odtwarzalności. Komercyjne przeciwciała dla kanałów jonowych powinny być brane pod uwagę w oparciu o ich strategię walidacji i wyniki publikacji. Doświadczenia powinny obejmować kontrole ujemne w celu wykazania braku niespecyficznego wiązania przez knockdown lub knockout białka docelowego. Alternatywnie, linie komórkowe, w których białko docelowe jest nieobecne lub występuje w niskiej liczebności na podstawie oznaczeń mRNA lub białka, mogą służyć jako kontrole negatywne. Na przykład badanie to pokazuje lokalizację podjednostki receptora (GABA) Gabra5 w linii komórkowej rdzeniaka zarodkowego (D283). Komórki D283 z knockdownem siRNA i komórki Daoy, inna linia komórkowa rdzeniaka zarodkowego móżdżku, zostały wybarwione pod kątem Gabra5 i nie wykazały znaczącego zabarwienia (dane nie pokazane).

Tutaj prezentowane są metody analizy i oceny funkcji kanałów jonowych, a także wpływu modulatorów kanałów jonowych na komórki nowotworowe. Przewidziano protokoły dla (1) barwienia komórek pod kątem kanału jonowego, (2) testowania spolaryzowanego stanu mitochondriów, (3) ustalania funkcji kanałów jonowych za pomocą elektrofizjologii oraz (4) walidacji leków in vitro. Protokoły te kładą nacisk na badania receptora kwasu gamma-aminomasłowego (GABA_A) typu A^{2,12,13,14,15,16}, kanał anionowy chlorków i główny receptor neuroprzekaźnika hamującego. Jednak przedstawione tutaj metody mają zastosowanie do badania wielu innych komórek nowotworowych i kanałów jonowych.

1. Znakowanie immunologiczne kanałów jonowych w hodowanych komórkach

1. Przygotowanie komórek i konfiguracja doświadczalna
   1. Utrzymuj komórki jako aktywnie rosnącą kulturę w kolbach hodowlanych o długości^{75 cm2}. Przenikaj komórki raz, aż staną się zlewające się w 50%-90%, w zależności od czasu podwojenia używanej linii komórkowej.
      UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano komórki D283, linię komórkową rdzeniaka zarodkowego grupy 3.
   2. Zebrać komórki z kolby hodowlanej do probówki wirówkowej (15 ml lub 50 ml) i dodać 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA w celu odłączenia przylegających komórek. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Po 5 minutach postukaj w kolbę trzy do pięciu razy, aby pomóc w odłączeniu komórek. Zbierz komórki w 10 ml pożywki z 10% FBS, aby zatrzymać działanie trypsyny.
   3. Wirować przy 480 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie zassać pożywkę. Nie naruszaj osadu komórkowego.
   4. Zawiesić komórki w pożywce o pojemności od 5 ml do 10 ml, w zależności od gęstości hodowli.
      UWAGA: Gęstość musi być zgodna z aktywnie rosnącymi komórkami i zależy od zbiegu komórek w kolbie. Należy przeprowadzić ocenę wizualną w celu przybliżenia optymalnej gęstości komórek; W szczególności komórki powinny być zlewające się w 40%-90% i równomiernie rozmieszczone.
   5. Usunąć 100 μl komórek i dodać do 1,5 ml probówki zawierającej 100 μl 0,4% błękitu trypanowego, aby oznaczyć komórki niezdolne do życia. Inkubować 5-15 minut w temperaturze pokojowej, w zależności od linii komórkowej.
   6. Policzyć komórki ręcznie za pomocą hemocytometru (patrz Tabela materiałów) w 10 μl roztworu. Policz żywe, niebarwione komórki w każdym z czterech rogów 16 kwadratów hemocytometru. Pomnóż średnią liczbę komórek przez współczynnik rozcieńczenia i przez 10 000, aby uzyskać komórki na mililitr (komórki/ml). Alternatywnie można zastosować automatyczny licznik komórek.
   7. Rozcieńczyć komórki do 1 x 10⁵ komórek/ml w pożywce hodowlanej określonej dla każdej linii komórkowej. Ziarno 1. 8 ml komórek do każdego dołka 6-dołkowej płytki zawierającej szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm wstępnie pokryte 0,1 mg/ml poli-D-lizyny zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Można przetestować użycie zarówno poli-D-lizyny, jak i poli-L-lizyny, ponieważ istnieją doniesienia o preferencjach specyficznych dla linii komórkowych^17,18. Niektóre linie komórkowe mają proteazy, które mogą rozkładać poli-L-lizynę, podczas gdy istnieją doniesienia, że poli-D-lizyna jest toksyczna dla niektórych linii komórkowych. W przeciwieństwie do tego, komórki neuronalne, takie jak PC12, są zdrowsze na powierzchniach poli-D-lizyny.
   8. Hodować komórki w inkubatorze z nawilżonym 5% środowiskiem CO₂ w temperaturze 37 °C przez noc, aby umożliwić komórkom przyczepienie się do szkiełka nakrywkowego. Zbadaj przyczepienie komórek pod mikroskopem odwróconym z obiektywem 20x.
      UWAGA: Komórki muszą być całkowicie przymocowane do szkiełka nakrywkowego przed leczeniem lub bezpośrednim barwieniem immunologicznym. W tym czasie komórki mogą być traktowane lekami (lub kontrolą nośnika) poprzez dodanie skoncentrowanego materiału wyjściowego (na przykład 600 μl 4-krotnego roztworu podstawowego) lub zastąpienie pożywki świeżą pożywką zawierającą lek o pożądanym stężeniu 1x; Komórki można następnie umieścić z powrotem w inkubatorze na okres do dodatkowych 48 godzin. Włącza się komórki traktowane rozpuszczalnikiem w celu oceny wpływu leku na poziom i lokalizację cząsteczki docelowej. W niniejszym badaniu komórki D283 traktowano 600 μL 3,2 μM roztworu allosterycznego modulatora allosterycznego z dodatnim receptorem GABA_A, QH-II-066¹⁴ (patrz Tabela Materiałów), przez 48 godzin. Komórki kontrolne potraktowano równoważną objętością DMSO.
2. Przygotowanie do znakowania immunologicznego: utrwalanie, przepuszczalność i blokowanie
   1. Przepłukać komórki 2,5 ml 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, patrz Tabela Materiałów) i natychmiast odessać roztwór.
   2. Utrwalić komórki za pomocą 1 ml 4% PFA w 1x PBS przez 1 godzinę w RT.
      UWAGA: Podczas gdy 4% PFA jest standardowym utrwalaczem do barwienia immunologicznego, aldehyd glutarowy lub glioksal mogą być również stosowane do utrwalania białek błonowych w celu immunofluorescencji. Metody utrwalania na bazie alkoholu, takie jak leczenie lodowatym metanolem, mogą prowadzić do gorzej zachowanej morfologii i utraty białek błonowych^19,20.
   3. Umyć sześć razy 2,0 ml 1x PBS (5 minut na pranie) przez mieszanie na shakerze. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w buforze blokującym składającym się z 1x PBS z 0,8% Triton X-100 i 10% normalnej surowicy pasującej do gatunku gospodarza przeciwciała pierwszorzędowego (alternatywnie zamiast normalnej surowicy można użyć 3% BSA lub albuminy V frakcji V surowicy bydlęcej).
      UWAGA: Ten krok służy do blokowania niespecyficznych powiązań.
3. Znakowanie immunologiczne
   UWAGA: Po dodaniu przeciwciał sprzężonych z fluoroforami, należy wkrótce wykonać pomiary, aby zapobiec fotowybielaniu. Inkubacje ze sprzężonymi przeciwciałami muszą być chronione przed światłem. Zastosowanie podłoża montażowego, które zawiera środki wymiatające wolne rodniki, zmniejszy fotowybielanie. Przechowywać szkiełka podstawowe w światłoszczelnym, nieprzezroczystym pojemniku (w temperaturze 4 °C) po zamknięciu szkiełek nakrywkowych. Podczas obrazowania fotowybielanie można zminimalizować, ograniczając intensywność oświetlenia wzbudzenia i czasy ekspozycji.
   1. Przygotuj nawilżoną komorę, wykładając dno naczynia hodowlanego o średnicy 150 mm bibułą filtracyjną. Zwilżyć bibułę filtracyjną sterylną wodą destylowaną. Narysuj siatkę 3 x 2 na kawałku folii laboratoryjnej przyciętej tak, aby pasowała do bibuły filtracyjnej, i oznacz ją, aby zachować orientację szkiełek nakrywkowych na płytce 6-dołkowej. Umieść folię laboratoryjną na bibule filtracyjnej, odsłaniając górną i dolną krawędź w celu nawilżenia komory.
   2. Przygotować 100 μl na szkiełko nakrywkowe pożądanego rozcieńczenia przeciwciała pierwszorzędowego w 1x PBS z 3% BSA. Aby wykryć produkt białkowy genu GABRA, należy użyć rekombinowanego pierwszorzędowego przeciwciała monoklonalnego królika w rozcieńczeniu 1:200 (przeciwciało Gabra5, region środkowy; patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Aby empirycznie określić stężenie przeciwciała pierwszorzędowego, które wytwarza optymalny sygnał na tle, należy użyć serii rozcieńczeń przeciwciała pierwszorzędowego, utrzymując stałe stężenie drugorzędowe. Zaleca się rozcieńczenia 1:100, 1:250, 1:500, 1:750 i 1:1,000 w celu ustalenia optymalnych stężeń przeciwciał pierwszorzędowych.
   3. Przenieść szkiełko nakrywkowe z roztworu blokowego na płytce 6-dołkowej w odpowiednie miejsce na siatce narysowanej na folii laboratoryjnej. Wylać roztwór blokowy z płytki 6-dołkowej i zachować płytkę na etapy mycia.
   4. Ostrożnie dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego do środka każdego szkiełka nakrywkowego. Unikać umieszczania roztworu na krawędzi szkiełka nakrywkowego. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   5. Dodaj 2,5 ml 1x PBS do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Przenieść szkiełko nakrywkowe z powrotem w odpowiednie miejsce w płytce 6-dołkowej.
   6. Wykonaj sześć prań po 5 minut każde z 2,5 ml 1x PBS.
      UWAGA: Nie pozwól, aby szkiełka nakrywkowe wyschły podczas etapów płukania, ponieważ może to przyczynić się do powstania sygnału fluorescencji tła.
   7. Umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem we właściwym miejscu na folii laboratoryjnej. Do każdego szkiełka nakrywkowego dodać 100 μl przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w 1x PBS + 1%-5% BSA.
      UWAGA: Początkowo przeciwciała drugorzędowe sprzężone z Alexa Fluor 488 (patrz Tabela materiałów) stosuje się w rozcieńczeniu 1:1,000 w 1x PBS + 3% BSA. Stężenie przeciwciał drugorzędowych można zoptymalizować, zwiększając stężenie w celu wykrycia białek docelowych o niskiej liczebności lub zmniejszając stężenie w celu zmniejszenia tła, jeśli to konieczne.
   8. W przypadku pozostałych etapów zminimalizuj ekspozycję na światło, aby zapobiec fotowybielaniu sprzężonego przeciwciała drugorzędowego. Przykryj naczynie hodowlane folią aluminiową i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   9. Przenieść szkiełka nakrywkowe z powrotem na płytkę 6-dołkową. Za pomocą shakera wykonaj sześć prań po 5 minut, każde z 2,5 ml 1x PBS. Wyjmij PBS, odwracając talerz nad zlewem lub pojemnikiem na odpady. Po ostatnim umyciu należy pozostawić PBS w studzince, aby ułatwić usunięcie szkiełka nakrywkowego.
   10. Oznacz szkiełko mikroskopowe dla każdego szkiełka nakrywkowego. Dodać kroplę podłoża montażowego zawierającego glicerol za pomocą DAPI (w celu zabarwienia jąder) (patrz Tabela Materiałów) na środek szkiełka.
   11. Za pomocą kleszczy wyjmij szkiełko nakrywkowe ze studzienki i delikatnie umieść je na kropli podłoża montażowego na środku szkiełka.
       UWAGA: Unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza w medium montażowym.
   12. Użyj małych kawałków bibuły filtracyjnej, aby usunąć nadmiar medium montażowego. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci i pozwól lakierowi całkowicie wyschnąć przed obrazowaniem. Szkiełka podstawowe przechowywać w temperaturze 4 °C w nieprzezroczystym plastikowym pudełku.
4. Obrazowanie i analiza
   1. Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego pod obiektywem 40x z olejkiem immersyjnym (patrz tabela materiałów).
   2. Wizualizuj obrazy fluorescencyjne za pomocą odpowiednich filtrów.
   3. UWAGA: W przypadku Alexa Fluor 488 należy użyć wzbudzenia/emisji 496 nm/519 nm; w przypadku DAPI należy użyć wzbudzenia/emisji 358 nm/461 nm.
   4. Przechwyć i zapisz cyfrowe pliki obrazów. Wartość kategoryzacji 4 x 4 jest używana w celu ułatwienia szybkości zbierania obrazów i zmniejszenia tła.
   5. Przygotuj ostateczne obrazy. Obrazy mogą być przetwarzane za pomocą ImageJ lub dostępnego na rynku oprogramowania. Wyniki są zilustrowane w Rysunek 1.

2. Testowanie spolaryzowanego stanu mitochondriów

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje test TMRE (tetrametylorodamina, ester etylowy) do oznaczania potencjału błonowego w aktywnych mitochondriach, utrzymując ładunek ujemny^21,22. TMRE jest przepuszczalnym dla komórek, czerwono-pomarańczowym, dodatnio naładowanym barwnikiem gromadzącym się w aktywnych mitochondriach ze względu na ich względny ładunek ujemny. Nieaktywne lub zdepolaryzowane mitochondria mają zmniejszony potencjał błonowy i nie są w stanie proporcjonalnie sekwestrować TMRE. FCCP (4-[trifluorometoksy] fenylohydrazon cyjanku karbonylu), jonoforowy rozprzęgacz fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS), depolaryzuje błony mitochondrialne, zapobiegając w ten sposób akumulacji i sekwestracji TMRE²³. Jest to zilustrowane w Rysunek 2.

1. Przygotowanie komórek i konfiguracja doświadczalna
   1. Utrzymać komórki w kolbach hodowlanych o długości⁷⁵ cm2. Odessać pożywkę hodowlaną i przepłukać komórki 1x PBS bez wapnia i magnezu.
   2. Dodaj 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA, aby odłączyć przylegające komórki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki.
   3. Zebrać komórki z kolby hodowlanej do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 480 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zassać pożywkę.
   4. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml do 10 ml pożywki, w zależności od pierwotnego zbiegu hodowli, tak aby stężenie komórek wynosiło 50-100 komórek na kwadrat na hemocytometrze. W razie potrzeby dostosuj objętość, aby zapewnić gęstość komórek potrzebną do dokładnego liczenia.
   5. Usuń 100 μl komórek i dodaj do 1,5 ml probówki zawierającej 100 μl 0,4% błękitu trypanowego. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Rozcieńczyć komórki do 3 x 10⁴ komórek/ml w pożywce hodowlanej bez czerwieni fenolowej.
      UWAGA: Stosuje się pożywkę DMEM pozbawioną czerwieni fenolowej, ponieważ ekspozycja na czerwień fenolową hamuje przepuszczalność błony i może przyczyniać się do autofluorescencji tła.
   6. Wysiewać 2,5 ml zawiesiny komórek (75 000 komórek) na studzienkę do 6-dołkowej płytki zawierającej szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 x 22 mm wstępnie pokryte poli-D-lizyną zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
   7. Hodować komórki w inkubatorze z nawilżonym 5% CO₂ w temperaturze 37 °C przez noc, aby umożliwić komórkom przyczepienie się do szkiełka nakrywkowego.
   8. Zbadaj przyczepienie komórek pod mikroskopem odwróconym z obiektywem 20x. Komórki muszą być całkowicie przymocowane do szkiełka nakrywkowego przed kontynuowaniem pracy.
2. Przygotowanie roztworów podstawowych
   1. Aby przygotować 1 mM roztwór podstawowy (1 000x) TMRE (MW = 514,96 g/mol) (patrz Tabela materiałów), należy rozpuścić 1 mg TMRE w 1,94 ml DMSO. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C z dala od światła. Unikaj powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania.
   2. Aby przygotować 50 mM (2,500x) roztwór podstawowy FCCP (MW = 254,17 g/mol) (rozprzęgacz mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej), rozpuść 10 mg FCCP w 786,9 μl DMSO. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C z dala od światła. Unikaj powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania.
   3. UWAGA: Przygotowane roztwory podstawowe są częścią zestawu TMRE Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit (patrz Tabela materiałów).
3. Ustalanie stężenia TMRE dla linii komórkowych
   1. Przygotować roboczy roztwór TMRE o stężeniu 500 nM w pożywce do hodowli komórkowych. Chronić roztwór roboczy przed światłem.
   2. Dodać TMRE do komórek wyhodowanych na szkiełkach nakrywkowych w pożywce do końcowego zakresu stężeń między 50-200 nM. W tym celu należy najpierw zassać pożywkę hodowlaną i zastąpić ją pożywką zawierającą TMRE.
   3. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Należy upewnić się, że czas leczenia jest rozłożony w czasie, aby umożliwić obrazowanie, ponieważ komórki są oglądane na żywo.
   4. Umyj komórki dwukrotnie 1x PBS i odwróć szkiełko nakrywkowe na szkiełku mikroskopowym oznaczonym końcowym stężeniem TMRE.
   5. Natychmiast zobrazuj żywe komórki (pik E_x/E_m = 549 nm/575 nm).
      UWAGA: Natychmiast zobrazuj próbki po wyjęciu z warunków hodowli, ponieważ zdrowie mitochondriów jest zagrożone po wyjęciu komórek z pożywki i umieszczeniu ich na szkiełku mikroskopowym. Jako alternatywę dla szkiełek nakrywkowych, komórki można obrazować w naczyniach ze szklanym dnem.
   6. Uchwyć obrazy za pomocą dostępnego mikroskopu i oprogramowania.
      UWAGA: Ustal parametry obrazowania mikroskopii eksperymentalnej podczas procesu optymalizacji stężenia TMRE i utrzymuj te same warunki w kolejnych eksperymentach, aby zapewnić dokładne porównanie danych. W szczegółowym protokole wykorzystano mikroskop konfokalny i kompatybilne oprogramowanie (patrz tabela materiałów).
   7. Wybierz optymalne stężenie TMRE, które jest zależne od linii komórkowej.
      UWAGA: Stężenie TMRE, które zapewnia najlepszy sygnał do rozwiązania zmian w mitochondrialnych poziomach TMRE, jest na ogół najniższym stężeniem TMRE, dając równomierny i łatwo wykrywalny sygnał fluorescencyjny.
4. Testowanie stanu spolaryzowanego komórki
   1. Przygotowanie testu
      1. Przygotować roztwory podstawowe do traktowania w pożądanych stężeniach i przygotować pożywkę z końcowym stężeniem związku do oznaczenia. W przypadku FCCP roztwór podstawowy powinien mieć 20 mM (przygotowany za pomocą DMSO z roztworu podstawowego o objętości 50 mM).
      2. Pracując na pojedynczym szkiełku nakrywkowym na raz, dodaj 1,8 ml pożywki plus badany związek do komórek.
      3. Inkubować komórki z badanym związkiem w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w wilgotnym środowisku przez pożądany okres czasu.
         UWAGA: Czas leczenia będzie się różnić w zależności od mechanizmu, za pomocą którego badany związek może zmieniać potencjał błony mitochondrialnej. Silne protonofory, takie jak FCCP, które szybko i bezpośrednio depolaryzują potencjały błony mitochondrialnej, wymagają analizy wkrótce po leczeniu (w ciągu kilku minut). W przeciwieństwie do tego, efekty leczenia związkami, które pośrednio wpływają na funkcję mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów, takimi jak te, które zmieniają aktywację białek lub obrót białek lub wymagają syntezy białek, mogą wymagać więcej czasu, aby wykazać efekt.
      4. Podczas inkubacji włącz mikroskop i ustaw go na określone optymalne parametry obrazowania, w tym pod względem wzmocnienia, intensywności lasera, szybkości przechwytywania obrazu, uśredniania i czasu ekspozycji.
      5. Po okresie leczenia farmakologicznego dodać 200 μl 10x TMRE (optymalne stężenie określone powyżej) do komórek kontrolnych i leczonych lekiem.
      6. Inkubować przez 15-30 minut w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ w wilgotnym środowisku. Delikatnie zassać pożywkę i raz przepłukać komórki 1x PBS.
      7. Powtórz etap płukania 1x PBS, aby uniknąć tła spowodowanego przez pożywkę do hodowli komórkowych lub związki poddane zabiegowi, i odwróć szkiełko nakrywkowe na szkiełku mikroskopowym oznaczonym warunkami leczenia.
      8. Obraz komórek na żywo przy E_x/E_m = 549 nm/575 nm. Za pomocą mikroskopu konfokalnego zbierz kilka pól stosu z szybkim przechwytywaniem obrazu (512 pikseli x 512 pikseli, średnia = 4) przed utratą integralności komórek.
      9. Zapisz i zapisz plik obrazu do analizy. Procedurę powtarza się dla następnego warunku doświadczalnego.
   2. Kontrole eksperymentalne
      1. Zastosować kontrolę (ujemną) bez poddawania działaniu substancji, przeprowadzoną w sposób opisany powyżej (etapy 3.1.1–3.1.8), bez obecności badanego związku w pożywce.
      2. Stosować kontrolę (dodatnią) zakłócenia potencjału błony mitochondrialnej składającą się ze związku protonoforowego FCCP. Dodać 1,8 ml 20 μM FCCP (patrz tabela materiałów) w pożywce do komórek. Jak opisano powyżej (kroki 3.1.1-3.1.2; oraz obrazowanie komórek, jak opisano w krokach 3.1.3-3.1.8), inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C w 5 % CO₂ w wilgotnym środowisku przed barwieniem TMRE.
         UWAGA: W tych eksperymentach wymagane są zarówno kontrole pozytywne, jak i negatywne.
   3. Kwantyfikacji
      1. Zmierz intensywność przechwyconych pikseli poszczególnych komórek na podstawie pojedynczego reprezentatywnego obrazu z centralnego obszaru każdego stosu z. W tej pracy wybrano pojedynczą płaszczyznę ostrości, aby ułatwić analizę.
      2. Przeanalizuj intensywność pikseli z co najmniej 30 komórek (w całości) na zabieg. Użyj Excela lub Prism, aby uśrednić intensywność pikseli dla każdego zabiegu i przedstawić w formacie wykresu słupkowego z błędem standardowym średniej.
         UWAGA: ImageJ może być również używany do ilościowego oznaczania fluorescencji. Alternatywnie, fluorescencję barwienia TMRE można określić ilościowo za pomocą komercyjnych platform oprogramowania.

3. Ustalanie funkcji kanału jonowego za pomocą elektrofizjologii

UWAGA: Procedura opisana w tej sekcji opisuje użycie zautomatyzowanego testu elektrofizjologicznego do badania związków w linii komórek nowotworowych (Rysunek 3).

1. Przygotowanie komórek
   1. Zbierz komórki ze zdrowej kultury, w której nie ma martwych komórek i/lub przerostu komórek. Użyj chemicznego roztworu do odrywania komórek TrypLE lub ręcznego skrobaka do komórek, aby zebrać przylegające i zgrupowane komórki. Dysocjuj komórki, które rosną w grudkach lub kulach, co jest szczególnie powszechne wśród komórek rakowych OUN.
      UWAGA: Delikatna dysocjacja komórek pomaga utrzymać integralność białek błonowych niezbędnych do przewodnictwa jonowego.
   2. Odwirować komórki przy 561 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i zawiesić osad w DMEM (bez czerwieni fenolowej), HEPES i penicylinie/streptomycynie z 20% FBS i 4 mM L-glutaminą (patrz tabela materiałów) utrzymywanymi w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Stosuje się pożywkę DMEM pozbawioną czerwieni fenolowej, ponieważ ekspozycja na czerwień fenolową hamuje przepuszczalność błony.
   3. Umieść komórki na szkiełku nakrywkowym pokrytym poli-L-lizyną o niskiej gęstości, tak aby zachować separację między pojedynczymi komórkami.
      UWAGA: Stosuje się tutaj poli-L-lizynę, a nie poli-D-lizynę, ponieważ poli-L-lizyna ma lepsze właściwości powlekające.
   4. Przed wykonaniem zapisu inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w wilgotnej komorze przez 12 godzin do 24 godzin (należy ustalić optymalny czas).
2. Zapis elektrofizjologiczny
   1. Usunąć podłoże z szkiełek nakrywkowych. Delikatnie umyj komórki dwukrotnie za pomocą 1x PBS. Dodać ~300 μL roztworu TrypLE. Za pomocą pipety delikatnie pipetuj w górę/w dół cztery do pięciu razy, aż komórki zostaną odłączone.
   2. Dodaj pożywkę bez surowicy (DMEM) (bez czerwieni fenolowej) i utrzymuj końcową liczbę komórek na objętość co najmniej 1 milion komórek/ml. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml uporządkuj komórki, aby uzyskać zawiesinę komórek pozbawioną skupisk komórek.
   3. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 1 ml. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez 10 minut w celu ustabilizowania błony komórkowej. Utrzymuj komórki obracające się na wytrząsarce (delikatny cykl), aby uniknąć tworzenia się grudek komórek.
   4. Przygotuj konfigurację Port-a-Patch (patrz tabela materiałów). Włącz komputer, wzmacniacz i system perfuzyjny. Otwórz oprogramowanie Patch-Master i utwórz nowy plik.
   5. Przynieś (zewnątrzkomórkowe i wewnętrzne) do RT, a następnie załaduj do odpowiednich probówek perfuzyjnych.
      UWAGA: Zapisy receptora GABA_A wymagają zarówno "roztworu zewnątrzkomórkowego (kąpielowego)" zawierającego 161 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1,5 mM CaCl₂, 10 mM HEPES i 6 mM D-glukozy (pH dostosowane do 7,4 przy użyciu NaOH), jak i "roztworu wewnętrznego" zawierającego 120 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 10 mM EGTA i 10 mM HEPES (pH dostosowane do 7,2 przy użyciu NaOH).
   6. Napełnij spód chipa elektrody (dostarczonego przez producenta) 5 μl roztworu wewnętrznego i umieść chip elektrody na górze Faradaya Port-a-Patch. Dodaj 10 μl roztworu zewnętrznego do chipa i obserwuj prostokątny impuls na oscyloskopie za pomocą oprogramowania Patch-Master (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Rezystancja może mieścić się w zakresie 2-3 MΩ, ale jest to zależne od linii komórkowej.
   7. Rozpocznij nagrywanie, gdy impuls prostokątny jest widoczny, po wstępnych regulacjach elektronicznych i po tym, jak oprogramowanie poprosi użytkownika o dodanie komórek.
   8. Delikatnie dodaj 20 μl zawiesiny pojedynczej komórki na środkową część elektrody i poczekaj na łatkę ogniwa, a następnie uszczelkę Giga-Ohm, obserwując wartości rezystancji w oprogramowaniu.
   9. Postęp łatania komórek na żywo można obserwować w lewej kolumnie oprogramowania. Gdy komórka jest "utrzymywana w trybie całej komórki", rozpocznij nagrywanie, otwierając protokół w oprogramowaniu.
   10. Ustawić potencjał podtrzymania na -80 mV. Uruchom protokół ciągłego nagrywania bez przerw za pomocą oprogramowania Patch-Master, aby zarejestrować prąd z ogniwa.
   11. Uzyskaj stabilną linię bazową i przełącz się na aplikację liganda i odpowiedniego związku na określony czas, korzystając z zakładki automatycznej perfuzji w lewym panelu oprogramowania.
   12. Pozyskaj dane za pomocą oprogramowania Patch-Master.
       UWAGA: Dane są filtrowane dolnoprzepustowo przy 1 kHz i digitalizowane przy 100 kHz.
   13. Przeprowadź analizę danych, obliczając maksymalną amplitudę bieżącej odpowiedzi za pomocą oprogramowania Nest-o-Patch (patrz tabela materiałów).

4. Siła działania in vitro

UWAGA: Ta procedura szczegółowo opisuje test MTS w celu określenia siły działania leku. Test proliferacji komórek w jednym roztworze łączy wszystkie wymagane odczynniki testowe w przygotowany roztwór, który można dodać w jednym kroku do studzienek hodowli komórkowych w celu oceny żywotności i proliferacji komórek po traktowaniu związkami eksperymentalnymi. Odczynnik rozpuszcza się zgodnie z zaleceniami producenta (patrz Tabela Materiałów), porcjuje i przechowuje w temperaturze -20 °C. W tej sekcji opisano zastosowanie testu do oznaczania IC₅₀ badanych związków w określonej linii komórkowej (Rysunek 4). Ten odczynnik MTS może być również stosowany do wysokoprzepustowych badań przesiewowych dużej liczby związków w znanych stężeniach.

1. Przygotowanie komórek
   UWAGA: Liczba komórek zależy od wzrostu i metabolizmu każdej pojedynczej linii komórkowej. Określ eksperymentalnie optymalną liczbę komórek przed użyciem testu w celu oceny wszelkich eksperymentalnych metod leczenia.
   1. Zbierz przylegające komórki z kultury przez trypsynizację i użyj Akutazy (patrz Tabela Materiałów) do dysocjacji komórek, które rosną w kępach lub kulach.
      UWAGA: Linie komórkowe glejaka i pierwotnego rdzeniaka często wymagają Akutazy, ponieważ mają tendencję do wzrostu w kępkach lub kulach.
   2. Policz komórki i przygotuj roztwór komórkowy z 10 000 komórek na studzienkę w objętości 75 μl. Rozcieńczyć zapas dla numerów komórek, które mają być badane. Przygotować co najmniej 1 ml na rozcieńczenie.
   3. Umieścić 75 μl każdego rozcieńczenia w zestawach pięciu kolejnych studzienek na płytce 96-dołkowej. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez noc w wilgotnym środowisku (tj. w inkubatorze).
      UWAGA: Linie komórkowe o powolnym wzroście lub metabolizmie (które zakwaszają pożywkę wzrostową w ciągu 3 dni) mogą wymagać więcej niż 10 000 komórek jako górny zakres liczby komórek, podczas gdy linie komórkowe, które rosną szybko (zwykle szybciej niż 20 godzin podwojenia) wymagają mniejszej liczby komórek. Linie komórkowe o wysokim metabolizmie mogą wymagać mniej niż 1000 komórek na studzienkę. Zakres komórek można dostosować w celu określenia optymalnej gęstości posiewu dla testu MTS dla tych linii komórkowych.
2. Pozorowana kontrola leczenia
   1. Dodać 25 μl pożywki na studzienkę, aby zasymulować dodanie badanego związku w teście MTS.
      UWAGA: W rzeczywistym teście MTS do komórek zostanie dodanych 25 μl 4-krotnego zapasu wybranego stężenia poddanego działaniu substancji dla badanego związku (w tym przypadku modulatora receptora_A, QH-II-066), aby uzyskać 1x końcowe stężenie poddane działaniu substancji w całkowitej objętości 100 μL na studzienkę.
   2. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5 % CO₂ w wilgotnym środowisku przez 48 godzin. Symuluje to standardową inkubację w obecności leku.
3. Test MTS
   1. Rozmrozić wymagane porcje odczynnika MTS. Dodać 20 μl odczynnika MTS do dołka. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5 % CO₂ w wilgotnym środowisku przez 1 godzinę.
   2. Odwirować płytkę (1 350 x g przez 5 min) w temperaturze pokojowej w celu usunięcia pęcherzyków, które mogą zakłócać odczyt absorbancji.
      UWAGA: Usuń wszelkie pęcherzyki za pomocą drobnej igły.
   3. Odczytać absorbancję przy 490 nm. Zapisz dane jako plik Excel.
   4. Przywrócić płytki do temperatury 37 °C przy 5% CO₂ i czytać wielokrotnie w ciągu 4 godzin w okresie liniowym testu.
      UWAGA: Nie ma potrzeby ponownego odwirowywania przed odczytaniem absorbancji. Dane z późniejszych odczytów, zwłaszcza odczyt 2-godzinny, mogą być ważne dla zbadania, jak szybko linia komórkowa metabolizuje odczynnik MTS i są przydatne w doborze liczby komórek do płytki do testu.
   5. Wykreślić gęstość optyczną absorbancji (OD) przy 490 nm (OD₄₉₀) w stosunku do liczby platerowanych komórek za pomocą Excela lub pryzmatu.
   6. Wybierz numer komórki dla testu. Optymalna liczba komórek będzie znajdować się w zakresie liniowym i poniżej nasycenia (OD₄₉₀ = 1).
      UWAGA: W przypadku komórek o powolnym wzroście najwyższą liczbę komórek posianych można dostosować do 20 000 komórek na studzienkę, a 500 komórek na studzienkę można pominąć w teście.
4. Określanie IC₅₀
   1. Dzień 1: Płytki komórek do testu MTS
      1. Zapisz nazwę linii komórkowej i numer przejścia każdej linii w badaniu. Aby przeciwdziałać parowaniu podczas testu, należy co najmniej wypełnić górne i dolne rzędy zewnętrznego obwodu oraz końcową lewą i prawą kolumnę obwodową płytki 96-dołkowej 1x PBS, 100 μl na studzienkę, aby przeciwdziałać parowaniu podczas testu.
      2. Na płytce należy umieścić optymalną liczbę komórek dla każdej linii komórkowej, zgodnie z ustaleniami przed rozpoczęciem testu. Umieść komórki w 75 μl na studzienkę z pożywką wolną od czerwieni fenolowej, antybiotyków, która nie zawiera buforu HEPES. FBS można zwiększyć do 20%, aby wspomóc wzrost linii komórkowych.
         UWAGA: Stosuje się pożywkę pozbawioną czerwieni fenolowej, ponieważ ekspozycja na czerwień fenolową hamuje przepuszczalność błony.
      3. Pokryć próbkę co najmniej pięciokrotnie w celu uzyskania stężenia poddanego działaniu substancji. Policz komórki za pomocą ręcznego lub automatycznego hemocytometru.
         UWAGA: Aby użyć ręcznego hemocytometru, (1) przygotować rozcieńczenie 1:1 komórek zawieszonych w pożywce w błękitu trypanowym; (2) inkubować 5-15 minut, w zależności od linii komórkowej; (3) załadować 10 μl komórek w błękitu trypanowym do komory zliczania hemocytometrów; (4) policz żywotne komórki w czterech rogach i środkowych kwadratach i określ średnią liczbę komórek w kwadracie; (5) Oblicz żywe komórki na mililitr w następujący sposób:
         Komórki żywotne na ml = Średnia żywotna komórka × 2 (współczynnik rozcieńczenia) × 10⁴
      4. Użyj wystarczającej objętości, aby przygotować pożądane stężenie komórek w pożywce wolnej od czerwieni fenolowej, bez antybiotyków, która nie zawiera buforu HEPES (tj. 75 μl na studzienkę x 60 dołków na płytkę = 4,5 ml komórek na płytkę).
         UWAGA: Każda płyta musi mieć kontrolkę tylko ze średnim elementem do odejmowania tła. W razie potrzeby regulator pożywki może zastąpić studnie PBS.
   2. Dzień 2: Dodanie środka leczniczego
      1. Przygotować zabiegi eksperymentalne przy 4-krotnym pożądanym stężeniu końcowym, aby uzyskać pożądane stężenie końcowe, gdy 25 μl roztworów poddanych działaniu substancji dodaje się do komórek posianych w 75 μl pożywki (= 100 μl całkowitej objętości na studzienkę).
      2. Przygotować roztwory badane (w tym przypadku modulator receptora_A GABA QH-II-066) przez seryjne rozcieńczanie zapasów o najwyższym stężeniu. Na przykład, jeśli końcowe stężenia leku mają wynosić 5,0 μM, 2,5 μM, 1,25 μM, 0,625 μM i 0,3125 μM, należy przygotować seryjne rozcieńczenia 1:1, zaczynając od 20 μM, aby uzyskać odpowiednio stężenia 10 μM, 5 μM, 2,5 μM i 1,25 μM.
         UWAGA: Każda płytka wymaga dwóch kontroli opartych na komórkach oprócz kontroli opartej tylko na pożywce: komórki niepoddane działaniu substancji (samo podłoże) i komórki poddane działaniu rozpuszczalnika (często DMSO) o znanym stężeniu. Dobrą praktyką jest zapewnienie, że nośnik nie wpływa na proliferację komórek w zakresie aktywnym związku.
      3. Po dodaniu badanego związku inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w wilgotnym środowisku przez 48 godzin.
   3. Dzień 3: Wykonanie testu proliferacji komórek (MTS)
      1. Obliczyć potrzebną objętość odczynnika MTS (20 μl na 100 μl badanej kultury) i rozmrozić wymaganą objętość podzielonego odczynnika MTS (patrz Tabela materiałów).
      2. Odczynnik należy wykonać wir i upewnić się, że odczynnik jest całkowicie w roztworze przed użyciem. Odpipetować rozmrożony odczynnik do sterylnego zbiornika na odczynnik o pojemności 25 ml.
      3. Odmierzyć pipetą 20 μl odczynnika MTS (za pomocą pipety wielokanałowej) do każdego dołka 96-dołkowej płytki zawierającej próbki w 100 μl pożywki hodowlanej.
      4. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w wilgotnym środowisku przez 1 h do 4 h. Płytki można odczytywać w wielu punktach czasowych. Generalnie tablice odczytuje się po 1 godzinie i po 2 lub 3 godzinach.
      5. Bąbelki w pożywce mogą prowadzić do błędnych wyników. Przed odczytaniem do czytnika płytek należy obracać płytkę o wymiarach 1 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Za pomocą igły lub końcówki pipety można usunąć wszelkie pęcherzyki, które pozostały po odwirowaniu.
      6. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 490 nm za pomocą odpowiedniego czytnika mikropłytek lub spektrofotometru (patrz tabela materiałów).
      7. Zapisz dane jako plik Excel.
         UWAGA: Czas inkubacji w obecności badanego związku będzie się różnił w zależności od tempa metabolizmu i wzrostu badanej linii komórkowej, a także badanego związku. Okres inkubacji wynoszący 48 godzin jest dobrym punktem wyjścia dla większości linii komórkowych i badanych związków.
5. analiza danych
   1. Przenieś dane do pliku Excel i uporządkuj dane dla każdej repliki, zwiększając stężenie badanego związku. Uśrednij wartość kontrolną tylko pożywki i odejmij tę wartość od danych eksperymentalnych.
   2. Określić procent proliferacji komórek w studzienkach poddanych działaniu substancji w porównaniu z dołkami nośnikowymi (lub studzienkami kontrolnymi poddanymi działaniu rozpuszczalnika), ustawiając kontrolę na 100% proliferację dla każdej kontrpróby.
   3. Przenieś dane wygenerowane w Excelu do wybranego programu. Autorzy zazwyczaj używają oprogramowania Prism (patrz tabela materiałów) do określenia stężenia leku, który hamuje proliferację komórek o 50% (IC₅₀).
   4. W oprogramowaniu Prism utwórz tabelę danych z kolumną X jako numerami komórek i kolumną Y jako średnią OD dla pięciu wartości replikacji w podkolumnach obok siebie.
   5. Wprowadź wartości stężenia leczenia w kolumnie X podczas analizy leczenia farmakologicznego. Oznacz oś x nazwą związku leczniczego i jednostkami stężenia.
   6. Wprowadź obliczone wartości żywotności replikowanych komórek z analizy programu Excel w podkolumnach Y. Oznacz oś y jako proliferację komórek (%).
   7. Korzystając z narzędzia do analizy, wybierz opcję Regresja nieliniowa (dopasowanie krzywej) w obszarze Analizy XY.
   8. Wybierz dawka-odpowiedź [hamowanie] vs. znormalizowana odpowiedź - zmienne nachylenie.
   9. Wykonaj funkcję analizy. Zapoznaj się z tabelą wyników, aby zobaczyć obliczone wartości najlepszego dopasowania dla IC₅₀ oraz wykres dopasowania krzywej. W razie potrzeby oś x wykresu można zmienić na skalę logarytmiczną.

Powyżej znajdują się wybrane procedury, które mogą być wykorzystane do scharakteryzowania kanałów jonowych w komórkach nowotworowych. Pierwszy protokół podkreśla zabarwienie kanału jonowego. Jak szczegółowo wspomniano, istnieje wiele wyzwań związanych z barwieniem kanału jonowego lub, jeśli o to chodzi, dowolnego białka obecnego w błonie zewnątrzkomórkowej. Pokazane w Rysunek 1 to barwienie podjednostki pentamerycznego receptoraGABA A. Drugi protokół podkreśla wyniki testowania spolaryzowanego stanu mitochondriów w komórkach nowotworowych. Mitochondria odgrywają role niezbędne dla żywotności i proliferacji komórek, a także śmierci komórki. W komórkach ssaków mitochondria aktywują apoptozę w odpowiedzi na stres komórkowy poprzez uwalnianie białek z rodziny Bcl-2 znajdujących się między mitochondrialną błoną wewnętrzną i zewnętrzną. W cytozolu białka z rodziny Bcl-2 aktywują proteazy kaspazy, które pośredniczą w zaprogramowanej śmierci komórki. Zmiany w funkcjonowaniu kanału jonowego błony komórkowej mogą powodować zakłócenie homeostazy jonów wewnątrzkomórkowych, w tym pod względem poziomów jonów w mitochondriach, co może prowadzić do utraty potencjału błonowego, wywołując w ten sposób apoptozę14. Poziomy Ca2+, K +, Na + i H+ są ważnymi determinantami w sygnalizacji zdarzeń, które mogą wywołać śmierć komórki inicjowaną przez mitochondria. Pokazane w Rysunek 2 to barwienie przepuszczalnym dla komórek, dodatnio naładowanym barwnikiem TMRE w celu oznaczenia i zobrazowania potencjału błonowego w aktywnych mitochondriach, które utrzymują ładunek ujemny21,22. TMRE to czerwono-pomarańczowy barwnik, który wiąże się z aktywnymi mitochondriami ze względu na ich względny ładunek ujemny. Zdepolaryzowane lub nieaktywne mitochondria mają zmniejszony potencjał błonowy, a zatem nie są w stanie sekwestrować TMRE. W tym eksperymencie rozprzęgacz jonoforowy FCCP jest ważną kontrolą, ponieważ depolaryzuje błony mitochondrialne, zapobiegając w ten sposób akumulacji TMRE23. Trzeci protokół kładzie nacisk na elektrofizjologię jednokomórkowych patch-clamp. Pokazane w Rysunek 3 to reprezentatywne nagrania śladu zarejestrowanego z linii komórkowej rdzeniaka zarodkowego pochodzącej od pacjenta D283. Wreszcie czwarty protokół kładzie nacisk na test mający na celu określenie stanu proliferacji komórek rakowych. Pokazane w Rysunek 4 to szczegóły dotyczące działania testu MTS oraz ilustracja płytki i odczyt podczas inkubacji z czynnikiem, który upośledza żywotność badanych komórek rakowych (w tym przypadku DAOY).

Rysunek 1: Barwienie komórek pod kątem kanałów jonowych. (A) Barwienie białka Gabra5, podjednostki receptora GABAA, w komórkach raka rdzeniaka zarodkowego D283. (B) Utrwalone komórki poddane barwieniu fluorescencyjnemu 4′,6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI), który wiąże się z DNA. (C) Połączenie komórek raka rdzeniaka zarodkowego barwionych zarówno dla Gabra5, jak i DAPI. Podziałka = 10 μm. Rysunek został zaadaptowany z Kallay et al.14. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Testowanie stanu polaryzacji mitochondriów. (A) Żywe komórki raka rdzeniaka zarodkowego D283 są leczone rosnącym stężeniem leku QH-II-066. Komórki są następnie traktowane dodatnio naładowanym, przepuszczalnym dla komórek TMRE (tetrametylorodamina, ester etylowy), który gromadzi się w aktywnych (ujemnie naładowanych) mitochondriach. Zdepolaryzowane lub nieaktywne mitochondria mają zmniejszony potencjał błonowy i dlatego nie zatrzymują barwnika TMRE; W rezultacie wykazują niski sygnał fluorescencji. Obrazowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej; FCCP (4-[trifluorometoksy]fenylohydrazon cyjanku karbonylu). Pik: λex, 549 nm; λem, 575 nm. Podziałka = 10 μm. (B) Kwantyfikacja barwienia TMRE (obrazy pokazane w panelu A) za pomocą platformy oprogramowania. Dane są prezentowane jako średnia i błąd standardowy średniej. Rysunek został zaadaptowany z Kallay et al.14. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Ustalanie funkcji kanału jonowego za pomocą elektrofizjologii. (A) Pokazano zestaw lub zestaw Port-a-Patch, składający się z klatki Faradaya (a), komory rejestracyjnej (b) i jednostki ssącej (c, po prawej). (B) Widok z góry na platformę Port-a-Patch z podkreśleniem komory rejestracyjnej wyposażonej w wlot perfuzyjny (a), wylot (b) i elektrodę odniesienia (c). (C) Port-a-Patch jest podłączony do systemu szybkiej wymiany roztworu z automatycznymi i ręcznymi trybami pracy oraz zbiornikami roztworu. (D) Reprezentatywny ślad prądu z zapisu elektrofizjologii klamru krosowego całej komórki przy użyciu zestawu Port-a-Patch (Nanion) i komórek raka rdzeniaka zarodkowego D283. GABA (10 μM) stosowano przez 5 s z potencjałem trzymania -80 mV. (E) Reprezentatywny ślad prądu z zapisu elektrofizjologii całego ogniwa patch-clamp przy użyciu zestawu Port-a-Patch (Nanion) i komórek raka rdzeniaka zarodkowego D283 z jednoczesnym zastosowaniem GABA (1 μM) i agonisty receptora GABAA (znieczulenie ogólne) propofolu (50 μM), który nasila prąd indukowany przez sam GABA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Test MTS do oceny siły działania leku. (A) Reakcje chemiczne leżące u podstaw "testu MTS" używanego do oceny siły działania czynnika, odzwierciedlonej przez zmniejszenie proliferacji komórek. Redukcja tetrazolu MTS przez komórki, które są zdolne do życia, wytwarzając barwnik formazan. (B) 96-dołkowa płytka przedstawiająca wyniki kolorymetryczne testu MTS ze wzrostem stężeń leku. W tym eksperymencie komórki raka rdzeniaka zarodkowego DAOY są leczone rosnącymi stężeniami leku przedklinicznego, KRM-II-08, dodatniego modulatora allosterycznego receptora GABAA. (C) Krzywa dawka-odpowiedź wygenerowana za pomocą testu MTS (na podstawie oceny ilościowej płytki 96-dołkowej). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Porównanie ręcznych i częściowo i/lub w pełni zautomatyzowanych ustawień elektrofizjologii.

D.A.P.K. jest współzałożycielem, prezesem i dyrektorem generalnym Amlal Pharmaceuticals Inc. S.S. jest współzałożycielem Amlal Pharmaceuticals Inc. i zasiada w Radzie Monitorującej Bezpieczeństwa Leków Bexion Pharmaceuticals, Inc.