Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badania przesiewowe kanałów jonowych w komórkach nowotworowych

4.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65427

⸱

16 czerwca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology and Rehabilitation Medicine, Division of Neuro-Oncology, University of Cincinnati College of Medicine, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, University of Saint Joseph, 3The Vontz Center for Molecular Studies, University of Cincinnati College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Farmakologiczne celowanie w kanały jonowe jest obiecującym podejściem do leczenia guzów litych. Podano szczegółowe protokoły charakteryzujące funkcję kanałów jonowych w komórkach nowotworowych i oznaczające wpływ modulatorów kanałów jonowych na żywotność raka.

Streszczenie

Kanały jonowe są kluczowe dla rozwoju komórek i utrzymania homeostazy komórek. Zaburzenia funkcji kanałów jonowych przyczyniają się do rozwoju szerokiego zakresu zaburzeń lub kanałopatii. Komórki rakowe wykorzystują kanały jonowe do kierowania własnym rozwojem, a także do doskonalenia się jako guz i asymilacji w mikrośrodowisku, które obejmuje różne komórki nienowotworowe. Co więcej, wzrost poziomu czynników wzrostu i hormonów w mikrośrodowisku guza może powodować zwiększoną ekspresję kanałów jonowych, co przyczynia się do proliferacji i przeżycia komórek rakowych. W związku z tym farmakologiczne celowanie w kanały jonowe jest potencjalnie obiecującym podejściem do leczenia litych nowotworów złośliwych, w tym pierwotnych i przerzutowych nowotworów mózgu. W niniejszym artykule opisano protokoły charakteryzujące funkcję kanałów jonowych w komórkach nowotworowych oraz podejścia do analizy modulatorów kanałów jonowych w celu określenia ich wpływu na żywotność raka. Obejmują one barwienie komórki (komórek) pod kątem kanału jonowego, testowanie spolaryzowanego stanu mitochondriów, ustalanie funkcji kanałów jonowych za pomocą elektrofizjologii oraz wykonywanie testów żywotności w celu oceny siły działania leku.

Wprowadzenie

Białka transportujące błonę są kluczowe dla komunikacji między komórkami, jak również dla utrzymania homeostazy komórkowej. Wśród białek transportujących błonę, kanały jonowe służą do napędzania wzrostu i rozwoju komórek oraz do utrzymania stanu komórek w trudnych i zmieniających się środowiskach. Doniesiono również, że kanały jonowe napędzają i wspierają rozwój guzów litych, zarówno ogólnoustrojowo, jak i w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN)1,2. Na przykład kanały KCa3.1 są odpowiedzialne za regulację potencjału błonowego i kontrolowanie objętości komórek, co jest ważne w regulacji cyklu komórkowego. Doniesiono, że wadliwe kanały KCa3.1 przyczyniają się do nieprawidłowej proliferacji komórek nowotworowych3. Ponadto kanały jonowe mogą przyczyniać się do przerzutowego rozprzestrzeniania się nowotworów. Na przykład kanały przejściowego potencjału receptorowego (TRP) są zaangażowane w napływ Ca2+ i Mg2 +; Ten napływ aktywuje kilka kinaz i białek szoku cieplnego, które działają w celu regulacji macierzy zewnątrzkomórkowej otaczającej guz, co z kolei jest ważne dla inicjowania przerzutów raka4.

Ponieważ kanały jonowe mogą przyczyniać się do rozwoju nowotworów, mogą być również celem leczenia raka związanego z lekami. Na przykład oporność na metody leczenia, w tym chemioterapię i nowatorską immunoterapię, jest związana z dysregulacją funkcji kanałów jonowych5,6,7. Ponadto kanały jonowe stają się ważnymi celami leków hamujących wzrost i rozwój nowotworów, przy czym badane są leki małocząsteczkowe (zatwierdzone przez FDA), a także biopolimery, w tym przeciwciała monoklonalne1,2,8,9. Chociaż poczyniono znaczne postępy na tym froncie, odkrywanie leków na raka z kanałem jonowym pozostaje słabo rozwinięte. Wynika to częściowo z wyjątkowych wyzwań związanych z badaniem kanałów jonowych w komórkach nowotworowych. Na przykład istnieją ograniczenia techniczne w tworzeniu testów elektrofizjologicznych dla związków wolno działających oraz czasowe różnice w aktywacji kanału i działaniu leków. Co więcej, rozpuszczalność związków może również hamować postęp, ponieważ większość powszechnie stosowanych obecnie zautomatyzowanych systemów elektrofizjologii wykorzystuje podłoża hydrofobowe, które mogą przyczyniać się do powstawania artefaktów w wyniku adsorpcji związków. Ponadto duże bioorganiczne terapie molekularne, takie jak produkty naturalne, peptydy i przeciwciała monoklonalne, są technicznie trudne do zbadania przy użyciu konwencjonalnych testów elektrofizjologicznych10. Wreszcie, właściwości bioelektryczne komórek nowotworowych pozostają słabo poznane11.

Tymczasem, barwienie immunofluorescencyjne kanałów jonowych jest często trudne. Wynika to częściowo ze złożoności ich struktur i kontekstu w błonie, które wpływają na zdolność zarówno do wytwarzania, jak i wykorzystywania przeciwciał do badań mikroskopowych. Szczególnie ważne jest, aby przeciwciała używane do barwienia kanałów jonowych zostały zweryfikowane pod kątem swoistości, powinowactwa i odtwarzalności. Komercyjne przeciwciała dla kanałów jonowych powinny być brane pod uwagę w oparciu o ich strategię walidacji i wyniki publikacji. Doświadczenia powinny obejmować kontrole ujemne w celu wykazania braku niespecyficznego wiązania przez knockdown lub knockout białka docelowego. Alternatywnie, linie komórkowe, w których białko docelowe jest nieobecne lub występuje w niskiej liczebności na podstawie oznaczeń mRNA lub białka, mogą służyć jako kontrole negatywne. Na przykład badanie to pokazuje lokalizację podjednostki receptora (GABA) Gabra5 w linii komórkowej rdzeniaka zarodkowego (D283). Komórki D283 z knockdownem siRNA i komórki Daoy, inna linia komórkowa rdzeniaka zarodkowego móżdżku, zostały wybarwione pod kątem Gabra5 i nie wykazały znaczącego zabarwienia (dane nie pokazane).

Tutaj prezentowane są metody analizy i oceny funkcji kanałów jonowych, a także wpływu modulatorów kanałów jonowych na komórki nowotworowe. Przewidziano protokoły dla (1) barwienia komórek pod kątem kanału jonowego, (2) testowania spolaryzowanego stanu mitochondriów, (3) ustalania funkcji kanałów jonowych za pomocą elektrofizjologii oraz (4) walidacji leków in vitro. Protokoły te kładą nacisk na badania receptora kwasu gamma-aminomasłowego (GABAA) typu A2,12,13,14,15,16, kanał anionowy chlorków i główny receptor neuroprzekaźnika hamującego. Jednak przedstawione tutaj metody mają zastosowanie do badania wielu innych komórek nowotworowych i kanałów jonowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Znakowanie immunologiczne kanałów jonowych w hodowanych komórkach

  1. Przygotowanie komórek i konfiguracja doświadczalna
    1. Utrzymuj komórki jako aktywnie rosnącą kulturę w kolbach hodowlanych o długości75 cm2. Przenikaj komórki raz, aż staną się zlewające się w 50%-90%, w zależności od czasu podwojenia używanej linii komórkowej.
      UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano komórki D283, linię komórkową rdzeniaka zarodkowego grupy 3.
    2. Zebrać komórki z kolby hodowlanej do probówki wirówkowej (15 ml lub 50 ml) i dodać 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA w celu odłączenia przylegających komórek. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Po 5 minutach postukaj w kolbę trzy do pięciu razy, aby pomóc w odłączeniu komórek. Zbierz komórki w 10 ml pożywki z 10% FBS, aby zatrzymać działanie trypsyny.
    3. Wirować przy 480 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie zassać pożywkę. Nie naruszaj osadu komórkowego.
    4. Zawiesić komórki w pożywce o pojemności od 5 ml do 10 ml, w zależności od gęstości hodowli.
      UWAGA: Gęstość musi być zgodna z aktywnie rosnącymi komórkami i zależy od zbiegu komórek w kolbie. Należy przeprowadzić ocenę wizualną w celu przybliżenia optymalnej gęstości komórek; W szczególności komórki powinny być zlewające się w 40%-90% i równomiernie rozmieszczone.
    5. Usunąć 100 μl komórek i dodać do 1,5 ml probówki zawierającej 100 μl 0,4% błękitu trypanowego, aby oznaczyć komórki niezdolne do życia. Inkubować 5-15 minut w temperaturze pokojowej, w zależności od linii komórkowej.
    6. Policzyć komórki ręcznie za pomocą hemocytometru (patrz Tabela materiałów) w 10 μl roztworu. Policz żywe, niebarwione komórki w każdym z czterech rogów 16 kwadratów hemocytometru. Pomnóż średnią liczbę komórek przez współczynnik rozcieńczenia i przez 10 000, aby uzyskać komórki na mililitr (komórki/ml). Alternatywnie można zastosować automatyczny licznik komórek.
    7. Rozcieńczyć komórki do 1 x 105 komórek/ml w pożywce hodowlanej określonej dla każdej linii komórkowej. Ziarno 1. 8 ml komórek do każdego dołka 6-dołkowej płytki zawierającej szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm wstępnie pokryte 0,1 mg/ml poli-D-lizyny zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Można przetestować użycie zarówno poli-D-lizyny, jak i poli-L-lizyny, ponieważ istnieją doniesienia o preferencjach specyficznych dla linii komórkowych17,18. Niektóre linie komórkowe mają proteazy, które mogą rozkładać poli-L-lizynę, podczas gdy istnieją doniesienia, że poli-D-lizyna jest toksyczna dla niektórych linii komórkowych. W przeciwieństwie do tego, komórki neuronalne, takie jak PC12, są zdrowsze na powierzchniach poli-D-lizyny.
    8. Hodować komórki w inkubatorze z nawilżonym 5% środowiskiem CO2 w temperaturze 37 °C przez noc, aby umożliwić komórkom przyczepienie się do szkiełka nakrywkowego. Zbadaj przyczepienie komórek pod mikroskopem odwróconym z obiektywem 20x.
      UWAGA: Komórki muszą być całkowicie przymocowane do szkiełka nakrywkowego przed leczeniem lub bezpośrednim barwieniem immunologicznym. W tym czasie komórki mogą być traktowane lekami (lub kontrolą nośnika) poprzez dodanie skoncentrowanego materiału wyjściowego (na przykład 600 μl 4-krotnego roztworu podstawowego) lub zastąpienie pożywki świeżą pożywką zawierającą lek o pożądanym stężeniu 1x; Komórki można następnie umieścić z powrotem w inkubatorze na okres do dodatkowych 48 godzin. Włącza się komórki traktowane rozpuszczalnikiem w celu oceny wpływu leku na poziom i lokalizację cząsteczki docelowej. W niniejszym badaniu komórki D283 traktowano 600 μL 3,2 μM roztworu allosterycznego modulatora allosterycznego z dodatnim receptorem GABAA, QH-II-06614 (patrz Tabela Materiałów), przez 48 godzin. Komórki kontrolne potraktowano równoważną objętością DMSO.
  2. Przygotowanie do znakowania immunologicznego: utrwalanie, przepuszczalność i blokowanie
    1. Przepłukać komórki 2,5 ml 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, patrz Tabela Materiałów) i natychmiast odessać roztwór.
    2. Utrwalić komórki za pomocą 1 ml 4% PFA w 1x PBS przez 1 godzinę w RT.
      UWAGA: Podczas gdy 4% PFA jest standardowym utrwalaczem do barwienia immunologicznego, aldehyd glutarowy lub glioksal mogą być również stosowane do utrwalania białek błonowych w celu immunofluorescencji. Metody utrwalania na bazie alkoholu, takie jak leczenie lodowatym metanolem, mogą prowadzić do gorzej zachowanej morfologii i utraty białek błonowych19,20.
    3. Umyć sześć razy 2,0 ml 1x PBS (5 minut na pranie) przez mieszanie na shakerze. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w buforze blokującym składającym się z 1x PBS z 0,8% Triton X-100 i 10% normalnej surowicy pasującej do gatunku gospodarza przeciwciała pierwszorzędowego (alternatywnie zamiast normalnej surowicy można użyć 3% BSA lub albuminy V frakcji V surowicy bydlęcej).
      UWAGA: Ten krok służy do blokowania niespecyficznych powiązań.
  3. Znakowanie immunologiczne
    UWAGA: Po dodaniu przeciwciał sprzężonych z fluoroforami, należy wkrótce wykonać pomiary, aby zapobiec fotowybielaniu. Inkubacje ze sprzężonymi przeciwciałami muszą być chronione przed światłem. Zastosowanie podłoża montażowego, które zawiera środki wymiatające wolne rodniki, zmniejszy fotowybielanie. Przechowywać szkiełka podstawowe w światłoszczelnym, nieprzezroczystym pojemniku (w temperaturze 4 °C) po zamknięciu szkiełek nakrywkowych. Podczas obrazowania fotowybielanie można zminimalizować, ograniczając intensywność oświetlenia wzbudzenia i czasy ekspozycji.
    1. Przygotuj nawilżoną komorę, wykładając dno naczynia hodowlanego o średnicy 150 mm bibułą filtracyjną. Zwilżyć bibułę filtracyjną sterylną wodą destylowaną. Narysuj siatkę 3 x 2 na kawałku folii laboratoryjnej przyciętej tak, aby pasowała do bibuły filtracyjnej, i oznacz ją, aby zachować orientację szkiełek nakrywkowych na płytce 6-dołkowej. Umieść folię laboratoryjną na bibule filtracyjnej, odsłaniając górną i dolną krawędź w celu nawilżenia komory.
    2. Przygotować 100 μl na szkiełko nakrywkowe pożądanego rozcieńczenia przeciwciała pierwszorzędowego w 1x PBS z 3% BSA. Aby wykryć produkt białkowy genu GABRA, należy użyć rekombinowanego pierwszorzędowego przeciwciała monoklonalnego królika w rozcieńczeniu 1:200 (przeciwciało Gabra5, region środkowy; patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Aby empirycznie określić stężenie przeciwciała pierwszorzędowego, które wytwarza optymalny sygnał na tle, należy użyć serii rozcieńczeń przeciwciała pierwszorzędowego, utrzymując stałe stężenie drugorzędowe. Zaleca się rozcieńczenia 1:100, 1:250, 1:500, 1:750 i 1:1,000 w celu ustalenia optymalnych stężeń przeciwciał pierwszorzędowych.
    3. Przenieść szkiełko nakrywkowe z roztworu blokowego na płytce 6-dołkowej w odpowiednie miejsce na siatce narysowanej na folii laboratoryjnej. Wylać roztwór blokowy z płytki 6-dołkowej i zachować płytkę na etapy mycia.
    4. Ostrożnie dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego do środka każdego szkiełka nakrywkowego. Unikać umieszczania roztworu na krawędzi szkiełka nakrywkowego. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    5. Dodaj 2,5 ml 1x PBS do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Przenieść szkiełko nakrywkowe z powrotem w odpowiednie miejsce w płytce 6-dołkowej.
    6. Wykonaj sześć prań po 5 minut każde z 2,5 ml 1x PBS.
      UWAGA: Nie pozwól, aby szkiełka nakrywkowe wyschły podczas etapów płukania, ponieważ może to przyczynić się do powstania sygnału fluorescencji tła.
    7. Umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem we właściwym miejscu na folii laboratoryjnej. Do każdego szkiełka nakrywkowego dodać 100 μl przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w 1x PBS + 1%-5% BSA.
      UWAGA: Początkowo przeciwciała drugorzędowe sprzężone z Alexa Fluor 488 (patrz Tabela materiałów) stosuje się w rozcieńczeniu 1:1,000 w 1x PBS + 3% BSA. Stężenie przeciwciał drugorzędowych można zoptymalizować, zwiększając stężenie w celu wykrycia białek docelowych o niskiej liczebności lub zmniejszając stężenie w celu zmniejszenia tła, jeśli to konieczne.
    8. W przypadku pozostałych etapów zminimalizuj ekspozycję na światło, aby zapobiec fotowybielaniu sprzężonego przeciwciała drugorzędowego. Przykryj naczynie hodowlane folią aluminiową i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    9. Przenieść szkiełka nakrywkowe z powrotem na płytkę 6-dołkową. Za pomocą shakera wykonaj sześć prań po 5 minut, każde z 2,5 ml 1x PBS. Wyjmij PBS, odwracając talerz nad zlewem lub pojemnikiem na odpady. Po ostatnim umyciu należy pozostawić PBS w studzince, aby ułatwić usunięcie szkiełka nakrywkowego.
    10. Oznacz szkiełko mikroskopowe dla każdego szkiełka nakrywkowego. Dodać kroplę podłoża montażowego zawierającego glicerol za pomocą DAPI (w celu zabarwienia jąder) (patrz Tabela Materiałów) na środek szkiełka.
    11. Za pomocą kleszczy wyjmij szkiełko nakrywkowe ze studzienki i delikatnie umieść je na kropli podłoża montażowego na środku szkiełka.
      UWAGA: Unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza w medium montażowym.
    12. Użyj małych kawałków bibuły filtracyjnej, aby usunąć nadmiar medium montażowego. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci i pozwól lakierowi całkowicie wyschnąć przed obrazowaniem. Szkiełka podstawowe przechowywać w temperaturze 4 °C w nieprzezroczystym plastikowym pudełku.
  4. Obrazowanie i analiza
    1. Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego pod obiektywem 40x z olejkiem immersyjnym (patrz tabela materiałów).
    2. Wizualizuj obrazy fluorescencyjne za pomocą odpowiednich filtrów.
    3. UWAGA: W przypadku Alexa Fluor 488 należy użyć wzbudzenia/emisji 496 nm/519 nm; w przypadku DAPI należy użyć wzbudzenia/emisji 358 nm/461 nm.
    4. Przechwyć i zapisz cyfrowe pliki obrazów. Wartość kategoryzacji 4 x 4 jest używana w celu ułatwienia szybkości zbierania obrazów i zmniejszenia tła.
    5. Przygotuj ostateczne obrazy. Obrazy mogą być przetwarzane za pomocą ImageJ lub dostępnego na rynku oprogramowania. Wyniki są zilustrowane w Rysunek 1.

2. Testowanie spolaryzowanego stanu mitochondriów

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje test TMRE (tetrametylorodamina, ester etylowy) do oznaczania potencjału błonowego w aktywnych mitochondriach, utrzymując ładunek ujemny21,22. TMRE jest przepuszczalnym dla komórek, czerwono-pomarańczowym, dodatnio naładowanym barwnikiem gromadzącym się w aktywnych mitochondriach ze względu na ich względny ładunek ujemny. Nieaktywne lub zdepolaryzowane mitochondria mają zmniejszony potencjał błonowy i nie są w stanie proporcjonalnie sekwestrować TMRE. FCCP (4-[trifluorometoksy] fenylohydrazon cyjanku karbonylu), jonoforowy rozprzęgacz fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS), depolaryzuje błony mitochondrialne, zapobiegając w ten sposób akumulacji i sekwestracji TMRE23. Jest to zilustrowane w Rysunek 2.

  1. Przygotowanie komórek i konfiguracja doświadczalna
    1. Utrzymać komórki w kolbach hodowlanych o długości75 cm2. Odessać pożywkę hodowlaną i przepłukać komórki 1x PBS bez wapnia i magnezu.
    2. Dodaj 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA, aby odłączyć przylegające komórki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki.
    3. Zebrać komórki z kolby hodowlanej do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 480 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zassać pożywkę.
    4. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml do 10 ml pożywki, w zależności od pierwotnego zbiegu hodowli, tak aby stężenie komórek wynosiło 50-100 komórek na kwadrat na hemocytometrze. W razie potrzeby dostosuj objętość, aby zapewnić gęstość komórek potrzebną do dokładnego liczenia.
    5. Usuń 100 μl komórek i dodaj do 1,5 ml probówki zawierającej 100 μl 0,4% błękitu trypanowego. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Rozcieńczyć komórki do 3 x 104 komórek/ml w pożywce hodowlanej bez czerwieni fenolowej.
      UWAGA: Stosuje się pożywkę DMEM pozbawioną czerwieni fenolowej, ponieważ ekspozycja na czerwień fenolową hamuje przepuszczalność błony i może przyczyniać się do autofluorescencji tła.
    6. Wysiewać 2,5 ml zawiesiny komórek (75 000 komórek) na studzienkę do 6-dołkowej płytki zawierającej szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 x 22 mm wstępnie pokryte poli-D-lizyną zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
    7. Hodować komórki w inkubatorze z nawilżonym 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez noc, aby umożliwić komórkom przyczepienie się do szkiełka nakrywkowego.
    8. Zbadaj przyczepienie komórek pod mikroskopem odwróconym z obiektywem 20x. Komórki muszą być całkowicie przymocowane do szkiełka nakrywkowego przed kontynuowaniem pracy.
  2. Przygotowanie roztworów podstawowych
    1. Aby przygotować 1 mM roztwór podstawowy (1 000x) TMRE (MW = 514,96 g/mol) (patrz Tabela materiałów), należy rozpuścić 1 mg TMRE w 1,94 ml DMSO. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C z dala od światła. Unikaj powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania.
    2. Aby przygotować 50 mM (2,500x) roztwór podstawowy FCCP (MW = 254,17 g/mol) (rozprzęgacz mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej), rozpuść 10 mg FCCP w 786,9 μl DMSO. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C z dala od światła. Unikaj powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania.
    3. UWAGA: Przygotowane roztwory podstawowe są częścią zestawu TMRE Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit (patrz Tabela materiałów).
  3. Ustalanie stężenia TMRE dla linii komórkowych
    1. Przygotować roboczy roztwór TMRE o stężeniu 500 nM w pożywce do hodowli komórkowych. Chronić roztwór roboczy przed światłem.
    2. Dodać TMRE do komórek wyhodowanych na szkiełkach nakrywkowych w pożywce do końcowego zakresu stężeń między 50-200 nM. W tym celu należy najpierw zassać pożywkę hodowlaną i zastąpić ją pożywką zawierającą TMRE.
    3. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Należy upewnić się, że czas leczenia jest rozłożony w czasie, aby umożliwić obrazowanie, ponieważ komórki są oglądane na żywo.
    4. Umyj komórki dwukrotnie 1x PBS i odwróć szkiełko nakrywkowe na szkiełku mikroskopowym oznaczonym końcowym stężeniem TMRE.
    5. Natychmiast zobrazuj żywe komórki (pik Ex/Em = 549 nm/575 nm).
      UWAGA: Natychmiast zobrazuj próbki po wyjęciu z warunków hodowli, ponieważ zdrowie mitochondriów jest zagrożone po wyjęciu komórek z pożywki i umieszczeniu ich na szkiełku mikroskopowym. Jako alternatywę dla szkiełek nakrywkowych, komórki można obrazować w naczyniach ze szklanym dnem.
    6. Uchwyć obrazy za pomocą dostępnego mikroskopu i oprogramowania.
      UWAGA: Ustal parametry obrazowania mikroskopii eksperymentalnej podczas procesu optymalizacji stężenia TMRE i utrzymuj te same warunki w kolejnych eksperymentach, aby zapewnić dokładne porównanie danych. W szczegółowym protokole wykorzystano mikroskop konfokalny i kompatybilne oprogramowanie (patrz tabela materiałów).
    7. Wybierz optymalne stężenie TMRE, które jest zależne od linii komórkowej.
      UWAGA: Stężenie TMRE, które zapewnia najlepszy sygnał do rozwiązania zmian w mitochondrialnych poziomach TMRE, jest na ogół najniższym stężeniem TMRE, dając równomierny i łatwo wykrywalny sygnał fluorescencyjny.
  4. Testowanie stanu spolaryzowanego komórki
    1. Przygotowanie testu
      1. Przygotować roztwory podstawowe do traktowania w pożądanych stężeniach i przygotować pożywkę z końcowym stężeniem związku do oznaczenia. W przypadku FCCP roztwór podstawowy powinien mieć 20 mM (przygotowany za pomocą DMSO z roztworu podstawowego o objętości 50 mM).
      2. Pracując na pojedynczym szkiełku nakrywkowym na raz, dodaj 1,8 ml pożywki plus badany związek do komórek.
      3. Inkubować komórki z badanym związkiem w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnym środowisku przez pożądany okres czasu.
        UWAGA: Czas leczenia będzie się różnić w zależności od mechanizmu, za pomocą którego badany związek może zmieniać potencjał błony mitochondrialnej. Silne protonofory, takie jak FCCP, które szybko i bezpośrednio depolaryzują potencjały błony mitochondrialnej, wymagają analizy wkrótce po leczeniu (w ciągu kilku minut). W przeciwieństwie do tego, efekty leczenia związkami, które pośrednio wpływają na funkcję mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów, takimi jak te, które zmieniają aktywację białek lub obrót białek lub wymagają syntezy białek, mogą wymagać więcej czasu, aby wykazać efekt.
      4. Podczas inkubacji włącz mikroskop i ustaw go na określone optymalne parametry obrazowania, w tym pod względem wzmocnienia, intensywności lasera, szybkości przechwytywania obrazu, uśredniania i czasu ekspozycji.
      5. Po okresie leczenia farmakologicznego dodać 200 μl 10x TMRE (optymalne stężenie określone powyżej) do komórek kontrolnych i leczonych lekiem.
      6. Inkubować przez 15-30 minut w temperaturze 37 °C w 5% CO2 w wilgotnym środowisku. Delikatnie zassać pożywkę i raz przepłukać komórki 1x PBS.
      7. Powtórz etap płukania 1x PBS, aby uniknąć tła spowodowanego przez pożywkę do hodowli komórkowych lub związki poddane zabiegowi, i odwróć szkiełko nakrywkowe na szkiełku mikroskopowym oznaczonym warunkami leczenia.
      8. Obraz komórek na żywo przy Ex/Em = 549 nm/575 nm. Za pomocą mikroskopu konfokalnego zbierz kilka pól stosu z szybkim przechwytywaniem obrazu (512 pikseli x 512 pikseli, średnia = 4) przed utratą integralności komórek.
      9. Zapisz i zapisz plik obrazu do analizy. Procedurę powtarza się dla następnego warunku doświadczalnego.
    2. Kontrole eksperymentalne
      1. Zastosować kontrolę (ujemną) bez poddawania działaniu substancji, przeprowadzoną w sposób opisany powyżej (etapy 3.1.1–3.1.8), bez obecności badanego związku w pożywce.
      2. Stosować kontrolę (dodatnią) zakłócenia potencjału błony mitochondrialnej składającą się ze związku protonoforowego FCCP. Dodać 1,8 ml 20 μM FCCP (patrz tabela materiałów) w pożywce do komórek. Jak opisano powyżej (kroki 3.1.1-3.1.2; oraz obrazowanie komórek, jak opisano w krokach 3.1.3-3.1.8), inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C w 5 % CO2 w wilgotnym środowisku przed barwieniem TMRE.
        UWAGA: W tych eksperymentach wymagane są zarówno kontrole pozytywne, jak i negatywne.
    3. Kwantyfikacji
      1. Zmierz intensywność przechwyconych pikseli poszczególnych komórek na podstawie pojedynczego reprezentatywnego obrazu z centralnego obszaru każdego stosu z. W tej pracy wybrano pojedynczą płaszczyznę ostrości, aby ułatwić analizę.
      2. Przeanalizuj intensywność pikseli z co najmniej 30 komórek (w całości) na zabieg. Użyj Excela lub Prism, aby uśrednić intensywność pikseli dla każdego zabiegu i przedstawić w formacie wykresu słupkowego z błędem standardowym średniej.
        UWAGA: ImageJ może być również używany do ilościowego oznaczania fluorescencji. Alternatywnie, fluorescencję barwienia TMRE można określić ilościowo za pomocą komercyjnych platform oprogramowania.

3. Ustalanie funkcji kanału jonowego za pomocą elektrofizjologii

UWAGA: Procedura opisana w tej sekcji opisuje użycie zautomatyzowanego testu elektrofizjologicznego do badania związków w linii komórek nowotworowych (Rysunek 3).

  1. Przygotowanie komórek
    1. Zbierz komórki ze zdrowej kultury, w której nie ma martwych komórek i/lub przerostu komórek. Użyj chemicznego roztworu do odrywania komórek TrypLE lub ręcznego skrobaka do komórek, aby zebrać przylegające i zgrupowane komórki. Dysocjuj komórki, które rosną w grudkach lub kulach, co jest szczególnie powszechne wśród komórek rakowych OUN.
      UWAGA: Delikatna dysocjacja komórek pomaga utrzymać integralność białek błonowych niezbędnych do przewodnictwa jonowego.
    2. Odwirować komórki przy 561 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i zawiesić osad w DMEM (bez czerwieni fenolowej), HEPES i penicylinie/streptomycynie z 20% FBS i 4 mM L-glutaminą (patrz tabela materiałów) utrzymywanymi w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Stosuje się pożywkę DMEM pozbawioną czerwieni fenolowej, ponieważ ekspozycja na czerwień fenolową hamuje przepuszczalność błony.
    3. Umieść komórki na szkiełku nakrywkowym pokrytym poli-L-lizyną o niskiej gęstości, tak aby zachować separację między pojedynczymi komórkami.
      UWAGA: Stosuje się tutaj poli-L-lizynę, a nie poli-D-lizynę, ponieważ poli-L-lizyna ma lepsze właściwości powlekające.
    4. Przed wykonaniem zapisu inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnej komorze przez 12 godzin do 24 godzin (należy ustalić optymalny czas).
  2. Zapis elektrofizjologiczny
    1. Usunąć podłoże z szkiełek nakrywkowych. Delikatnie umyj komórki dwukrotnie za pomocą 1x PBS. Dodać ~300 μL roztworu TrypLE. Za pomocą pipety delikatnie pipetuj w górę/w dół cztery do pięciu razy, aż komórki zostaną odłączone.
    2. Dodaj pożywkę bez surowicy (DMEM) (bez czerwieni fenolowej) i utrzymuj końcową liczbę komórek na objętość co najmniej 1 milion komórek/ml. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml uporządkuj komórki, aby uzyskać zawiesinę komórek pozbawioną skupisk komórek.
    3. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 1 ml. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez 10 minut w celu ustabilizowania błony komórkowej. Utrzymuj komórki obracające się na wytrząsarce (delikatny cykl), aby uniknąć tworzenia się grudek komórek.
    4. Przygotuj konfigurację Port-a-Patch (patrz tabela materiałów). Włącz komputer, wzmacniacz i system perfuzyjny. Otwórz oprogramowanie Patch-Master i utwórz nowy plik.
    5. Przynieś (zewnątrzkomórkowe i wewnętrzne) do RT, a następnie załaduj do odpowiednich probówek perfuzyjnych.
      UWAGA: Zapisy receptora GABAA wymagają zarówno "roztworu zewnątrzkomórkowego (kąpielowego)" zawierającego 161 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl2, 10 mM HEPES i 6 mM D-glukozy (pH dostosowane do 7,4 przy użyciu NaOH), jak i "roztworu wewnętrznego" zawierającego 120 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM EGTA i 10 mM HEPES (pH dostosowane do 7,2 przy użyciu NaOH).
    6. Napełnij spód chipa elektrody (dostarczonego przez producenta) 5 μl roztworu wewnętrznego i umieść chip elektrody na górze Faradaya Port-a-Patch. Dodaj 10 μl roztworu zewnętrznego do chipa i obserwuj prostokątny impuls na oscyloskopie za pomocą oprogramowania Patch-Master (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Rezystancja może mieścić się w zakresie 2-3 MΩ, ale jest to zależne od linii komórkowej.
    7. Rozpocznij nagrywanie, gdy impuls prostokątny jest widoczny, po wstępnych regulacjach elektronicznych i po tym, jak oprogramowanie poprosi użytkownika o dodanie komórek.
    8. Delikatnie dodaj 20 μl zawiesiny pojedynczej komórki na środkową część elektrody i poczekaj na łatkę ogniwa, a następnie uszczelkę Giga-Ohm, obserwując wartości rezystancji w oprogramowaniu.
    9. Postęp łatania komórek na żywo można obserwować w lewej kolumnie oprogramowania. Gdy komórka jest "utrzymywana w trybie całej komórki", rozpocznij nagrywanie, otwierając protokół w oprogramowaniu.
    10. Ustawić potencjał podtrzymania na -80 mV. Uruchom protokół ciągłego nagrywania bez przerw za pomocą oprogramowania Patch-Master, aby zarejestrować prąd z ogniwa.
    11. Uzyskaj stabilną linię bazową i przełącz się na aplikację liganda i odpowiedniego związku na określony czas, korzystając z zakładki automatycznej perfuzji w lewym panelu oprogramowania.
    12. Pozyskaj dane za pomocą oprogramowania Patch-Master.
      UWAGA: Dane są filtrowane dolnoprzepustowo przy 1 kHz i digitalizowane przy 100 kHz.
    13. Przeprowadź analizę danych, obliczając maksymalną amplitudę bieżącej odpowiedzi za pomocą oprogramowania Nest-o-Patch (patrz tabela materiałów).

4. Siła działania in vitro

UWAGA: Ta procedura szczegółowo opisuje test MTS w celu określenia siły działania leku. Test proliferacji komórek w jednym roztworze łączy wszystkie wymagane odczynniki testowe w przygotowany roztwór, który można dodać w jednym kroku do studzienek hodowli komórkowych w celu oceny żywotności i proliferacji komórek po traktowaniu związkami eksperymentalnymi. Odczynnik rozpuszcza się zgodnie z zaleceniami producenta (patrz Tabela Materiałów), porcjuje i przechowuje w temperaturze -20 °C. W tej sekcji opisano zastosowanie testu do oznaczania IC50 badanych związków w określonej linii komórkowej (Rysunek 4). Ten odczynnik MTS może być również stosowany do wysokoprzepustowych badań przesiewowych dużej liczby związków w znanych stężeniach.

  1. Przygotowanie komórek
    UWAGA: Liczba komórek zależy od wzrostu i metabolizmu każdej pojedynczej linii komórkowej. Określ eksperymentalnie optymalną liczbę komórek przed użyciem testu w celu oceny wszelkich eksperymentalnych metod leczenia.
    1. Zbierz przylegające komórki z kultury przez trypsynizację i użyj Akutazy (patrz Tabela Materiałów) do dysocjacji komórek, które rosną w kępach lub kulach.
      UWAGA: Linie komórkowe glejaka i pierwotnego rdzeniaka często wymagają Akutazy, ponieważ mają tendencję do wzrostu w kępkach lub kulach.
    2. Policz komórki i przygotuj roztwór komórkowy z 10 000 komórek na studzienkę w objętości 75 μl. Rozcieńczyć zapas dla numerów komórek, które mają być badane. Przygotować co najmniej 1 ml na rozcieńczenie.
    3. Umieścić 75 μl każdego rozcieńczenia w zestawach pięciu kolejnych studzienek na płytce 96-dołkowej. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc w wilgotnym środowisku (tj. w inkubatorze).
      UWAGA: Linie komórkowe o powolnym wzroście lub metabolizmie (które zakwaszają pożywkę wzrostową w ciągu 3 dni) mogą wymagać więcej niż 10 000 komórek jako górny zakres liczby komórek, podczas gdy linie komórkowe, które rosną szybko (zwykle szybciej niż 20 godzin podwojenia) wymagają mniejszej liczby komórek. Linie komórkowe o wysokim metabolizmie mogą wymagać mniej niż 1000 komórek na studzienkę. Zakres komórek można dostosować w celu określenia optymalnej gęstości posiewu dla testu MTS dla tych linii komórkowych.
  2. Pozorowana kontrola leczenia
    1. Dodać 25 μl pożywki na studzienkę, aby zasymulować dodanie badanego związku w teście MTS.
      UWAGA: W rzeczywistym teście MTS do komórek zostanie dodanych 25 μl 4-krotnego zapasu wybranego stężenia poddanego działaniu substancji dla badanego związku (w tym przypadku modulatora receptoraA, QH-II-066), aby uzyskać 1x końcowe stężenie poddane działaniu substancji w całkowitej objętości 100 μL na studzienkę.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 w wilgotnym środowisku przez 48 godzin. Symuluje to standardową inkubację w obecności leku.
  3. Test MTS
    1. Rozmrozić wymagane porcje odczynnika MTS. Dodać 20 μl odczynnika MTS do dołka. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 w wilgotnym środowisku przez 1 godzinę.
    2. Odwirować płytkę (1 350 x g przez 5 min) w temperaturze pokojowej w celu usunięcia pęcherzyków, które mogą zakłócać odczyt absorbancji.
      UWAGA: Usuń wszelkie pęcherzyki za pomocą drobnej igły.
    3. Odczytać absorbancję przy 490 nm. Zapisz dane jako plik Excel.
    4. Przywrócić płytki do temperatury 37 °C przy 5% CO2 i czytać wielokrotnie w ciągu 4 godzin w okresie liniowym testu.
      UWAGA: Nie ma potrzeby ponownego odwirowywania przed odczytaniem absorbancji. Dane z późniejszych odczytów, zwłaszcza odczyt 2-godzinny, mogą być ważne dla zbadania, jak szybko linia komórkowa metabolizuje odczynnik MTS i są przydatne w doborze liczby komórek do płytki do testu.
    5. Wykreślić gęstość optyczną absorbancji (OD) przy 490 nm (OD490) w stosunku do liczby platerowanych komórek za pomocą Excela lub pryzmatu.
    6. Wybierz numer komórki dla testu. Optymalna liczba komórek będzie znajdować się w zakresie liniowym i poniżej nasycenia (OD490 = 1).
      UWAGA: W przypadku komórek o powolnym wzroście najwyższą liczbę komórek posianych można dostosować do 20 000 komórek na studzienkę, a 500 komórek na studzienkę można pominąć w teście.
  4. Określanie IC50
    1. Dzień 1: Płytki komórek do testu MTS
      1. Zapisz nazwę linii komórkowej i numer przejścia każdej linii w badaniu. Aby przeciwdziałać parowaniu podczas testu, należy co najmniej wypełnić górne i dolne rzędy zewnętrznego obwodu oraz końcową lewą i prawą kolumnę obwodową płytki 96-dołkowej 1x PBS, 100 μl na studzienkę, aby przeciwdziałać parowaniu podczas testu.
      2. Na płytce należy umieścić optymalną liczbę komórek dla każdej linii komórkowej, zgodnie z ustaleniami przed rozpoczęciem testu. Umieść komórki w 75 μl na studzienkę z pożywką wolną od czerwieni fenolowej, antybiotyków, która nie zawiera buforu HEPES. FBS można zwiększyć do 20%, aby wspomóc wzrost linii komórkowych.
        UWAGA: Stosuje się pożywkę pozbawioną czerwieni fenolowej, ponieważ ekspozycja na czerwień fenolową hamuje przepuszczalność błony.
      3. Pokryć próbkę co najmniej pięciokrotnie w celu uzyskania stężenia poddanego działaniu substancji. Policz komórki za pomocą ręcznego lub automatycznego hemocytometru.
        UWAGA: Aby użyć ręcznego hemocytometru, (1) przygotować rozcieńczenie 1:1 komórek zawieszonych w pożywce w błękitu trypanowym; (2) inkubować 5-15 minut, w zależności od linii komórkowej; (3) załadować 10 μl komórek w błękitu trypanowym do komory zliczania hemocytometrów; (4) policz żywotne komórki w czterech rogach i środkowych kwadratach i określ średnią liczbę komórek w kwadracie; (5) Oblicz żywe komórki na mililitr w następujący sposób:
        Komórki żywotne na ml = Średnia żywotna komórka × 2 (współczynnik rozcieńczenia) × 104
      4. Użyj wystarczającej objętości, aby przygotować pożądane stężenie komórek w pożywce wolnej od czerwieni fenolowej, bez antybiotyków, która nie zawiera buforu HEPES (tj. 75 μl na studzienkę x 60 dołków na płytkę = 4,5 ml komórek na płytkę).
        UWAGA: Każda płyta musi mieć kontrolkę tylko ze średnim elementem do odejmowania tła. W razie potrzeby regulator pożywki może zastąpić studnie PBS.
    2. Dzień 2: Dodanie środka leczniczego
      1. Przygotować zabiegi eksperymentalne przy 4-krotnym pożądanym stężeniu końcowym, aby uzyskać pożądane stężenie końcowe, gdy 25 μl roztworów poddanych działaniu substancji dodaje się do komórek posianych w 75 μl pożywki (= 100 μl całkowitej objętości na studzienkę).
      2. Przygotować roztwory badane (w tym przypadku modulator receptoraA GABA QH-II-066) przez seryjne rozcieńczanie zapasów o najwyższym stężeniu. Na przykład, jeśli końcowe stężenia leku mają wynosić 5,0 μM, 2,5 μM, 1,25 μM, 0,625 μM i 0,3125 μM, należy przygotować seryjne rozcieńczenia 1:1, zaczynając od 20 μM, aby uzyskać odpowiednio stężenia 10 μM, 5 μM, 2,5 μM i 1,25 μM.
        UWAGA: Każda płytka wymaga dwóch kontroli opartych na komórkach oprócz kontroli opartej tylko na pożywce: komórki niepoddane działaniu substancji (samo podłoże) i komórki poddane działaniu rozpuszczalnika (często DMSO) o znanym stężeniu. Dobrą praktyką jest zapewnienie, że nośnik nie wpływa na proliferację komórek w zakresie aktywnym związku.
      3. Po dodaniu badanego związku inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnym środowisku przez 48 godzin.
    3. Dzień 3: Wykonanie testu proliferacji komórek (MTS)
      1. Obliczyć potrzebną objętość odczynnika MTS (20 μl na 100 μl badanej kultury) i rozmrozić wymaganą objętość podzielonego odczynnika MTS (patrz Tabela materiałów).
      2. Odczynnik należy wykonać wir i upewnić się, że odczynnik jest całkowicie w roztworze przed użyciem. Odpipetować rozmrożony odczynnik do sterylnego zbiornika na odczynnik o pojemności 25 ml.
      3. Odmierzyć pipetą 20 μl odczynnika MTS (za pomocą pipety wielokanałowej) do każdego dołka 96-dołkowej płytki zawierającej próbki w 100 μl pożywki hodowlanej.
      4. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnym środowisku przez 1 h do 4 h. Płytki można odczytywać w wielu punktach czasowych. Generalnie tablice odczytuje się po 1 godzinie i po 2 lub 3 godzinach.
      5. Bąbelki w pożywce mogą prowadzić do błędnych wyników. Przed odczytaniem do czytnika płytek należy obracać płytkę o wymiarach 1 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Za pomocą igły lub końcówki pipety można usunąć wszelkie pęcherzyki, które pozostały po odwirowaniu.
      6. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 490 nm za pomocą odpowiedniego czytnika mikropłytek lub spektrofotometru (patrz tabela materiałów).
      7. Zapisz dane jako plik Excel.
        UWAGA: Czas inkubacji w obecności badanego związku będzie się różnił w zależności od tempa metabolizmu i wzrostu badanej linii komórkowej, a także badanego związku. Okres inkubacji wynoszący 48 godzin jest dobrym punktem wyjścia dla większości linii komórkowych i badanych związków.
  5. analiza danych
    1. Przenieś dane do pliku Excel i uporządkuj dane dla każdej repliki, zwiększając stężenie badanego związku. Uśrednij wartość kontrolną tylko pożywki i odejmij tę wartość od danych eksperymentalnych.
    2. Określić procent proliferacji komórek w studzienkach poddanych działaniu substancji w porównaniu z dołkami nośnikowymi (lub studzienkami kontrolnymi poddanymi działaniu rozpuszczalnika), ustawiając kontrolę na 100% proliferację dla każdej kontrpróby.
    3. Przenieś dane wygenerowane w Excelu do wybranego programu. Autorzy zazwyczaj używają oprogramowania Prism (patrz tabela materiałów) do określenia stężenia leku, który hamuje proliferację komórek o 50% (IC50).
    4. W oprogramowaniu Prism utwórz tabelę danych z kolumną X jako numerami komórek i kolumną Y jako średnią OD dla pięciu wartości replikacji w podkolumnach obok siebie.
    5. Wprowadź wartości stężenia leczenia w kolumnie X podczas analizy leczenia farmakologicznego. Oznacz oś x nazwą związku leczniczego i jednostkami stężenia.
    6. Wprowadź obliczone wartości żywotności replikowanych komórek z analizy programu Excel w podkolumnach Y. Oznacz oś y jako proliferację komórek (%).
    7. Korzystając z narzędzia do analizy, wybierz opcję Regresja nieliniowa (dopasowanie krzywej) w obszarze Analizy XY.
    8. Wybierz dawka-odpowiedź [hamowanie] vs. znormalizowana odpowiedź - zmienne nachylenie.
    9. Wykonaj funkcję analizy. Zapoznaj się z tabelą wyników, aby zobaczyć obliczone wartości najlepszego dopasowania dla IC50 oraz wykres dopasowania krzywej. W razie potrzeby oś x wykresu można zmienić na skalę logarytmiczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Powyżej przedstawiono wybrane procedury, które można zastosować do charakterystyki kanałów jonowych w komórkach nowotworowych. Pierwszy protokół skupia się na barwieniu kanału jonowego. Jak szczegółowo opisano, istnieje wiele wyzwań podczas barwienia kanału jonowego lub jakiegokolwiek białka obecnego w błonie zewnątrzkomórkowej. Na Rysunku 1 przedstawiono barwienie podjednostki pentamerycznego receptora GABAA. Drugi protokół podkreśla wyniki badania stanu polaryzacji mitochondriów...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zmiany w funkcji kanałów jonowych zmieniają wewnątrzkomórkowe kaskady sygnalizacyjne, co może wpływać na ogólne funkcjonowanie komórki. W ciągu ostatniej dekady stało się coraz bardziej jasne, że kanały jonowe są ważne dla wzrostu komórek rakowych i przerzutów. Co ważne, wiele kanałów jonowych jest głównymi celami zatwierdzonych terapii ukierunkowanych na szeroki zakres zaburzeń24. Badacze badali, czy kanały jonowe mogą być celami przeciwnowotworowymi, a wstępne wyniki są obiecujące

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

D.A.P.K. jest współzałożycielem, prezesem i dyrektorem generalnym Amlal Pharmaceuticals Inc. S.S. jest współzałożycielem Amlal Pharmaceuticals Inc. i zasiada w Radzie Monitorującej Bezpieczeństwa Leków Bexion Pharmaceuticals, Inc.

Podziękowania

Autorzy dziękują za wsparcie ze strony Fundacji Rodzinnej Thomasa E. i Pameli M. Mischell dla S.S. oraz Fundacji Harolda C. Schotta fundującej Harold C. Schott Endowed Chair, UC College of Medicine, dla S.S.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Czytnik płytek ABS SpectraMaxUrządzenia molekularneABS
AccutaseInvitrogen00-4555-56
Alexa Flor 488InvitrogenA32723Koza Anti-Rabbit
Antybiotyk-PrzeciwgrzybiczaGibco15240-062100x
Suplement B27Gibco12587-010Brak
bezpieczeństwa biologicznego witaminy A SzafkaLABCONCO302381101klasa II, typ A2
Albumina surowicy bydlęcejFisher ScientificBP1606-100
Inkubator CO2Fisher Scientific13-998-211Heracell VIOS 160i
Chlorek wapniaFisher ScientificC7902
Dwuwodne naczynia do hodowli komórkowych, 150 mmFisher Scientific12-600-004komórkowych poddane działaniu hodowli komórkowych
, 75 cm2Fisher Scientific430641Upoddane hodowli komórkowej
6-dołkoweFisher Scientific 353046Płytki
hodowli komórkowych, 96 dołkówFisher Scientific353072Wirówka do hodowli komórkowych
EppendorfEP-5804RChłodzone
Corning CoolCellFisher Scientific07-210-0006
Szkiełka nakrywkowe, 22 x 22 mmFisher Scientific12-553-450Marka Corning
D283 MedATCCHTB-185
DABCO Mediamontażowe EMS17989-97
D-GlucoseSigma Life SciencesD9434
Dimetyl SulfoxideSigma AldrichD2650Klasa hodowli komórkowych
DMEM/F12, podłoże bazoweFisher Scientific11330-032Z czerwienią fenolową
DMEM / F12, bez czerwieni fenolowejFisher Scientific21041-025
EGTASigma AldrichE4378
Naskórkowy czynnik wzrostuSTEMCELL78006.1
FCCPAbcam
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowanaGibco10437-028
Czynnik wzrostu fibroblastów, PodstawowemiliporoweGF003
GARBA5AvivaARP30687_P050Poliklonalny
królik GlutamaxGibco35050-061
Podłoże montażowe gliceroluEMS17989-60z DAPI + DABCO
HemocytometrMillipore Sigma
HeparynaSTEMCELL7980
HEPESHyCloneSH3023701Solution
HEPESFisher ScientificBP310-500Solid
ImageJOtwarta platformaZ wtyczkami Fiji
Immuno Mount DAPIEMS17989-97
KRM-II-08Eksperymentalne związki niedostępne w źródle komercyjnym
Leica Application Suite XLeica Microsystems
Czynnik hamujący białaczkęNovusN276314100U
L-glutaminaGibco25030-081
Chlorek magnezuSigma AldrichM9272Hexahydrate
Mikroskop, konfokalnyLeicaSP8
, światłoVWR76382-982DMiL odwrócony
MTS - Promega One StepPromegaG3581
Pipeta wielokanałowa, 0,5-10 i mikro; LEppendorfZ683914
Pipeta wielokanałowa, 10-100 &mikro; LEppendorfZ683930
Pipeta wielokanałowa, 30-300 i mikro; LEppendorfZ683957
Nest-O-PatchHeka
Neurobasal-A MediumGibco10888022Bez witaminy A
Neurobasal-A MediumGibco12348-017bez czerwieni fenolowej
Gibco11140-050
NOR-QH-II-66związki eksperymentalne nie dostępne ze źródła komercyjnego
Parafilm FisherScientific50-998-944szerokość 4 cali
ParaformaldehydEMSRT-15710
PATHCHMASTERHeka
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-122
System perfuzyjnyNanion4000120
PFAEMSRT-15710
Sól fizjologiczna z fosforanamiFisher ScientificAAJ75889K2Klasa odczynnika
Poli-D-LizynaFisher ScientificA3890401
Poly-L-LizynaSigma Life SciencesP4707
Port-a-PatchNanion21000072
Chlorek potasuSigma Life SciencesP5405
Przeciwciało pierwotneInvitrogenMA5-34653Pryzmat monoklonalny królika
GraphPad
PropofolFisher ScientificNC07586761 ml ampułki
QH-II-66eksperymentalne związki niedostępne w komercyjnym źródle
Zbiorniki na odczynnikiVWR89094-664Sterylne
szkiełka podstawowe, 75 x 25 mmFisher Scientific12-544-7Matowy jednostronnie
Wodorowęglan soduCorning25-035-Cl
Chlorek soduFisher ScientificS271-3
Pirogronian soduGibco11360-070
Synth-a-Freeze MediumGibcoR00550Kriokonserwacja
TMREFisher Scientific50-196-4741Zestaw
odczynników TMRE ZestawAbcamAB113852
Triton X-100Sigma AldrichNC0704309
Trypan BlueGibco15-250-061Roztwór, 0,4%
trypsyna/EDTAGibco25200-072, 0,25%
mieszalnik wirowyVWR97043-562
Bibuła filtracyjna WhatmanFisher Scientific09-927-841
Kolby do hodowli Płytki do hodowli komórkowych , do AB120081 przeciwciało mikroskop Aminokwasy endogenne 4

Bibliografia

  1. Prevarskaya, N., Skryma, R., Shuba, Y. Ion channels in cancer: Are cancer hallmarks oncochannelopathies. Physiological Reviews. 98 (2), 559-621 (2018).
  2. Rao, R., et al. Ligand-gated neurotransmitter receptors as targets for treatment and management of cancers. Frontiers in Physiology. 13, 839437(2022).
  3. Mohr, C. J., et al. Cancer-associated intermediate conductance Ca2+-activated K+ channel KCa3.1. Cancers. 11 (1), 109(2019).
  4. Fels, B., Bulk, E., Petho, Z., Schwab, A. The role of TRP channels in the metastatic cascade. Pharmaceuticals. 11 (2), 48(2018).
  5. Eil, R., et al. Ionic immune suppression within the tumour microenvironment limits T cell effector function. Nature. 537 (7621), 539-543 (2016).
  6. Haustrate, A., Hantute-Ghesquier, A., Prevarskaya, N., Lehen'kyi, V. Monoclonal antibodies targeting ion channels and their therapeutic potential. Frontiers in Pharmacology. 10, 606(2019).
  7. Kischel, P., et al. Ion channels: New actors playing in chemotherapeutic resistance. Cancers. 11 (3), 376(2019).
  8. Tuszynski, J., Tilli, T. M., Levin, M. Ion channel and neurotransmitter modulators as electroceutical approaches to the control of cancer. Current Pharmaceutical Design. 23 (32), 4827-4841 (2017).
  9. Kale, V. P., Amin, S. G., Pandey, M. K. Targeting ion channels for cancer therapy by repurposing the approved drugs. Biochimica Biophysica Acta. 1848 (10), 2747-2755 (2015).
  10. Wickenden, A., Priest, B., Erdemli, G. Ion channel drug discovery: Challenges and future directions. Future Medicinal Chemistry. 4 (5), 661-679 (2012).
  11. Rocha, P. R. F., Elghajiji, A., Tosh, D. Ultrasensitive system for electrophysiology of cancer cell populations: A review. Bioelectricity. 1 (3), 131-138 (2019).
  12. Sengupta, S., et al. α5-GABAA receptors negatively regulate MYC-amplified medulloblastoma growth. Acta Neuropathologica. 127 (4), 593-603 (2014).
  13. Jonas, O., et al. First in vivo testing of compounds targeting Group 3 medulloblastomas using an implantable microdevice as a new paradigm for drug development. Journal of Biomedical Nanotechnology. 12 (6), 1297-1302 (2016).
  14. Kallay, L., et al. Modulating native GABAA receptors in medulloblastoma with positive allosteric benzodiazepine-derivatives induces cell death. Journal of Neurooncology. 142 (3), 411-422 (2019).
  15. Pomeranz Krummel, D. A., et al. Melanoma cell intrinsic GABAA receptor enhancement potentiates radiation and immune checkpoint response by promoting direct and T cell-mediated anti-tumor activity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 109 (4), P1040-P1053 (2021).
  16. Bhattacharya, D., et al. Therapeutically leveraging GABAA receptors in cancer. Experimental Biology and Medicine. 246 (19), 2128-2135 (2021).
  17. Mazia, D., Schatten, G., Sale, W. Adhesion of cells to surfaces coated with polylysine. Applications to electron microscopy. Journal of Cell Biology. 66 (1), 198-200 (1975).
  18. Wiatrak, B., Kubis-Kubiak, A., Piwowar, A., Barg, E. PC12 cell line: Cell types, coating of culture vessels, differentiation and other culture conditions. Cells. 9 (4), 958(2020).
  19. Baker, J. R. Fixation in cytochemistry and electron-microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 6 (5), 303-308 (1958).
  20. Chung, J. Y., et al. Histomorphological and molecular assessments of the fixation times comparing formalin and ethanol-based fixatives. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (2), 121-135 (2018).
  21. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
  22. Cory, A. H., Owen, T. C., Barltrop, J. A., Cory, J. G. Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture. Cancer Communications. 3 (7), 207-212 (1991).
  23. Maro, B., Marty, M. C., Bornens, M. In vivo and in vitro effects of the mitochondrial uncoupler FCCP on microtubules. EMBO Journal. 1 (11), 1347-1352 (1982).
  24. IUPHAR/BPS Guide to Pharmacology. , Available from: www.guidetopharmacology.org/GRAC/ReceptorFamiliesForward?type=IC (2022).
  25. Zheng, J., et al. Mechanism for regulation of melanoma cell death via activation of thermo-TRPV4 and TRPV. Journal of Oncology. 2019, 7362875(2019).
  26. Konno, K., Watanabe, M. Immunohistochemistry for ion channels and their interacting molecules: Tips for improving antibody accessibility. Receptor and Ion Channel Detection in the Brain. Luján, R., Ciruela, F. , Humana Press. New York, NY. (2016).
  27. Mortensen, M., Smart, T. G. Single-channel recording of ligand-gated ion channels. Nature Protocols. 2 (11), 2826-2841 (2007).
  28. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  29. Rafehi, H., et al. Clonogenic assay: Adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (49), 2573(2011).
  30. Scudiero, D. A., et al. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Research. 48 (17), 4827-4833 (1988).
  31. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, e10202(2010).
  32. Berridge, M. V., Tan, A. S. Characterization of the cellular reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT): subcellular localization, substrate dependence, and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction. Archives of Biochemistry and Biophysics. 303 (2), 474-482 (1993).
  33. Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay. Cancer Research. 49 (16), 4435-4440 (1989).
  34. Chakrabarti, R., Kundu, S., Kumar, S., Chakrabarti, R. Vitamin A as an enzyme that catalyzes the reduction of MTT to formazan by vitamin C. Journal of Cellular Biochemistry. 80 (1), 133-138 (2000).
  35. Dong, G. W., Preisler, H. D., Priore, R. Potential limitations of in vitro clonogenic drug sensitivity assays. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 13 (3), 206-210 (1984).
  36. Sun, J., et al. STIM1- and Orai1-Mediated Ca2+oscillation orchestrates invadopodium formation and melanoma invasion. Journal of Cell Biology. 207 (4), 535-548 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przesiewanie kana w jonowychmikro rodowisko guzareceptor GABAAtest proliferacji kom rekmikroskopia konfokalnabarwienie TMREtest MTSywotno kom rekelektrofizjologia
Badania przesiewowe kanałów jonowych w komórkach nowotworowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.