Profilowanie genetyczne i badania przesiewowe w skali genomu w celu identyfikacji celów terapeutycznych w mysich modelach złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych

Brittany Turner-Ivey; Jody Fromm Longo; Dorea P. Jenkins; Stephen T. Guest; Steven L. Carroll

doi:10.3791/65430

Method Article

Profilowanie genetyczne i badania przesiewowe w skali genomu w celu identyfikacji celów terapeutycznych w mysich modelach złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych

DOI:

10.3791/65430

⸱

August 25th, 2023

Brittany Turner-Ivey¹ , Jody Fromm Longo² , Dorea P. Jenkins² , Stephen T. Guest³ , Steven L. Carroll¹^,²

¹Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina, ²Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, ³Department of Computational Medicine and Bioinformatics, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy międzygatunkowe porównawcze podejście onkogenomiczne, wykorzystując analizy genomiczne i funkcjonalne badania genomowe do identyfikacji i porównania celów terapeutycznych w nowotworach powstających w genetycznie modyfikowanych modelach mysich i odpowiadającym im typie nowotworu ludzkiego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Złośliwe guzy osłonki nerwów obwodowych (MPNST) pochodzą z komórek Schwanna lub ich prekursorów. U pacjentów z zespołem podatności na nowotwory nerwiakowłókniakowatość typu 1 (NF1) MPNST są najczęstszą złośliwością i główną przyczyną zgonów. Te rzadkie i agresywne mięsaki tkanek miękkich oferują surową przyszłość, z 5-letnimi wskaźnikami przeżycia wolnego od choroby wynoszącymi 34-60%. Możliwości leczenia osób z MPNST są rozczarowująco ograniczone, a główną opcją leczenia jest operacja szpecąca. Wiele niegdyś obiecujących terapii, takich jak tyfifarnib, inhibitor sygnalizacji Ras, poniosło kliniczne porażkę. Podobnie, badania kliniczne II fazy z erlotynibem, który jest ukierunkowany na naskórkowy czynnik wzrostu (EFGR) i sorafenibem, który jest ukierunkowany na receptor czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), receptorem płytkowego czynnika wzrostu (PDGF) i Raf, w połączeniu ze standardową chemioterapią, również nie przyniosły odpowiedzi u pacjentów.

W ostatnich latach funkcjonalne metody badań przesiewowych genomu w połączeniu z profilowaniem genetycznym linii komórek nowotworowych okazały się przydatne do identyfikacji istotnych szlaków sygnalizacji cytoplazmatycznej i rozwoju terapii specyficznych dla celu. W przypadku rzadkich typów nowotworów odmiana tego podejścia, znana jako onkogenomika porównawcza między gatunkami, jest coraz częściej stosowana do identyfikacji nowych celów terapeutycznych. W onkogenomice porównawczej międzygatunkowej profilowanie genetyczne i genomika funkcjonalna są przeprowadzane w genetycznie modyfikowanych modelach myszy (GEM), a wyniki są następnie weryfikowane na rzadkich próbkach ludzkich i liniach komórkowych, które są dostępne.

Ten artykuł opisuje, jak zidentyfikować potencjalne mutacje genów sterujących w ludzkich i mysich komórkach MPNST za pomocą sekwencjonowania całego egzomu (WES). Następnie opisujemy, jak wykonywać badania przesiewowe shRNA w skali genomu w celu identyfikacji i porównania krytycznych szlaków sygnałowych w mysich i ludzkich komórkach MPNST oraz identyfikacji celów lekowych w tych szlakach. Metodologie te zapewniają skuteczne podejście do identyfikacji nowych celów terapeutycznych w różnych typach nowotworów u ludzi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Złośliwe guzy osłonki nerwów obwodowych (MPNST) są wysoce agresywnymi nowotworami wrzecionowatokomórkowymi, które powstają w związku z zespołem podatności na nowotwory nerwiakowłókniakowatość typu 1 (NF1), sporadycznie w populacji ogólnej i w miejscach wcześniejszej radioterapii^1,²^,³. Pacjenci z NF1 rodzą się z dziką kopią genu supresorowego NF1 i drugim allelem NF1 z mutacją powodującą utratę funkcji. Ten stan haploinsuficjencji sprawia, że pacjenci z NF1 są podatni na drugą mutację powodującą utratę funkcji w genie NF1 typu dzikiego, która wywołuj....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przed rozpoczęciem badań, procedury i protokoły postępowania z wektorami wirusowymi na zwierzętach są przejrzane i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) oraz Instytucjonalny Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC). Opisane tutaj procedury zostały zatwierdzone przez zarządy IACUC i IBC Uniwersytetu Medycznego w Południowej Karolinie i zostały wykonane przez odpowiednio przeszkolony personel zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz wytycznymi MUSC dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Analizy WES-Seq i identyfikacja wariantów patoge....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykresy 5 pokazują wyniki wyczerpania podstawowych niezbędnych genów (CEG) oznaczonych jako PRAWDZIWE w porównaniu z nie-CEG (oznaczonych jako FAŁSZ) w każdej ludzkiej linii komórkowej, która została przebadana. Punkty reprezentują log2 wyników krotnego wyczerpania dla poszczególnych genów, które są wykreślane na wykresie pudełkowym przedstawiającym ogólny rozkład wyników. Test t Studenta został wykorzystany do zbadania istotnej różnicy w średnich wynikach wyczerpania między dwiema .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione tu szczegółowe metody zostały opracowane w celu badania neoplazji obwodowego układu nerwowego i patogenezy MPNST. Chociaż stwierdziliśmy, że te metody są skuteczne, należy zdać sobie sprawę, że istnieją pewne potencjalne ograniczenia metod, które tutaj opisujemy. Poniżej omawiamy niektóre z tych ograniczeń i potencjalne strategie ich pokonywania w innych systemach modelowych.

Odkryliśmy, że sekwencjonowanie całego egzomu skutecznie identyfikuje interesujące mutacje u myszy P 0-GG.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 i R01 NS109655 dla S.L.C.; R01 NS109655-03S1 do D.P.J.), National Cancer Institute (R01 CA122804 do S.L.C.) oraz Departament Obrony (X81XWH-09-1-0086 i W81XWH-12-1-0164 do S.L.C.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
System Sonikacji Bioruptor	Diagenode	UCD-600
CASAVA 1.8.2
Cbot	Illumina, San Diego, Kalifornia
cytometru obrazowego Celigo	Nexcelom	N/A
Cellecta Analizator kodów kreskowych i oprogramowanie
Citrisolve Hybrid	Decon Laboratories	5989-27-5
Corning 96-dołkowa mikropłytka	Millipore Sigma	CLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml	Diagenode
mieszanka dNTP	Clontech	639210
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Bufor elucyjny	Qiagen	19086
Etanol (200 dowodów)	Decon Laboratories	2716
Excel	Microsoft
FWDGEX 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3'
FWDHTS 5'-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3'
GexSeqS (5' AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3'			Oczyszczony HPLC
GraphPad Prism	Dotmatics
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Illumina HiScanSQ	Illumina, San Diego, CA	Nie dotyczy
Paraformaldehydu (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
PLUS Odczynnik do transfekcji	Thermo Scientific	11514015
Odczynnik do transfekcji polibrenu	Millipore Sigma	TR1003G
PureLink Zestaw do szybkiego oczyszczania PCR	Invitrogen	K310001
Qiagen Buffer P1	Qiagen	19051
Zestaw do ekstrakcji żelu Qiagen	Qiagen	28704
RevGEX 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3'
RevHTS1 5'-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3'
Polimeraza tytanowa Taq	Clontech	639210
Oprogramowanie		www.usadellab.org

Nie dotyczy dekonwolucyjne Rurki stożkowe C30010009 Trimmomatic

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathol. 123 (3), 321-348 (2012).
Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. Recent ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Profilowanie genetyczne i badania przesiewowe w skali genomu w celu identyfikacji celów terapeutycznych w mysich modelach złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles