Artykuł metodologiczny

Profilowanie genetyczne i badania przesiewowe w skali genomu w celu identyfikacji celów terapeutycznych w mysich modelach złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych

DOI:

10.3791/65430

⸱

25 sierpnia 2023

 ,  ,  ,  , 
1Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 3Department of Computational Medicine and Bioinformatics, University of Michigan, Ann Arbor

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy międzygatunkowe porównawcze podejście onkogenomiczne, wykorzystując analizy genomiczne i funkcjonalne badania genomowe do identyfikacji i porównania celów terapeutycznych w nowotworach powstających w genetycznie modyfikowanych modelach mysich i odpowiadającym im typie nowotworu ludzkiego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Złośliwe guzy osłonki nerwów obwodowych (MPNST) pochodzą z komórek Schwanna lub ich prekursorów. U pacjentów z zespołem podatności na nowotwory nerwiakowłókniakowatość typu 1 (NF1) MPNST są najczęstszą złośliwością i główną przyczyną zgonów. Te rzadkie i agresywne mięsaki tkanek miękkich oferują surową przyszłość, z 5-letnimi wskaźnikami przeżycia wolnego od choroby wynoszącymi 34-60%. Możliwości leczenia osób z MPNST są rozczarowująco ograniczone, a główną opcją leczenia jest operacja szpecąca. Wiele niegdyś obiecujących terapii, takich jak tyfifarnib, inhibitor sygnalizacji Ras, poniosło kliniczne porażkę. Podobnie, badania kliniczne II fazy z erlotynibem, który jest ukierunkowany na naskórkowy czynnik wzrostu (EFGR) i sorafenibem, który jest ukierunkowany na receptor czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), receptorem płytkowego czynnika wzrostu (PDGF) i Raf, w połączeniu ze standardową chemioterapią, również nie przyniosły odpowiedzi u pacjentów.

W ostatnich latach funkcjonalne metody badań przesiewowych genomu w połączeniu z profilowaniem genetycznym linii komórek nowotworowych okazały się przydatne do identyfikacji istotnych szlaków sygnalizacji cytoplazmatycznej i rozwoju terapii specyficznych dla celu. W przypadku rzadkich typów nowotworów odmiana tego podejścia, znana jako onkogenomika porównawcza między gatunkami, jest coraz częściej stosowana do identyfikacji nowych celów terapeutycznych. W onkogenomice porównawczej międzygatunkowej profilowanie genetyczne i genomika funkcjonalna są przeprowadzane w genetycznie modyfikowanych modelach myszy (GEM), a wyniki są następnie weryfikowane na rzadkich próbkach ludzkich i liniach komórkowych, które są dostępne.

Ten artykuł opisuje, jak zidentyfikować potencjalne mutacje genów sterujących w ludzkich i mysich komórkach MPNST za pomocą sekwencjonowania całego egzomu (WES). Następnie opisujemy, jak wykonywać badania przesiewowe shRNA w skali genomu w celu identyfikacji i porównania krytycznych szlaków sygnałowych w mysich i ludzkich komórkach MPNST oraz identyfikacji celów lekowych w tych szlakach. Metodologie te zapewniają skuteczne podejście do identyfikacji nowych celów terapeutycznych w różnych typach nowotworów u ludzi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Złośliwe guzy osłonki nerwów obwodowych (MPNST) są wysoce agresywnymi nowotworami wrzecionowatokomórkowymi, które powstają w związku z zespołem podatności na nowotwory nerwiakowłókniakowatość typu 1 (NF1), sporadycznie w populacji ogólnej i w miejscach wcześniejszej radioterapii1,2,3. Pacjenci z NF1 rodzą się z dziką kopią genu supresorowego NF1 i drugim allelem NF1 z mutacją powodującą utratę funkcji. Ten stan haploinsuficjencji sprawia, że pacjenci z NF1 są podatni na drugą mutację powodującą utratę funkcji w genie NF1 typu dzikiego, która wywołuje nowotworzenie Kiedy ta mutacja NF1 "drugiego trafienia" występuje w komórce z linii komórek Schwanna, powstały guz jest albo nerwiakowłókniakiem skóry powstającym w skórze, albo nerwiakowłókniakiem splotowym, który rozwija się w dużych nerwach lub splotach nerwowych. Chociaż patologia nerwiakowłókniaków skórnych i splotowatych jest identyczna, ich zachowanie biologiczne jest zupełnie inne - chociaż zarówno nerwiakowłókniaki skórne, jak i splotowate są łagodne, tylko nerwiakowłókniaki splotowate mogą ulegać transformacji i powodować powstawanie MPNST. Oprócz utraty neurofibrominy, białka aktywującego GTPazę Ras kodowanego przez gen NF1, MPNST przenoszą mutacje wielu innych genów supresorowych nowotworów, w tym TP534,5,6,7, CDKN2A8,9 oraz PTEN10, mutacje genów kodujących składniki kompleksu represyjnego Polycomb 211,12 (PRC2; geny SUZ12 i EED) oraz nieprawidłowa ekspresja receptorowych kinaz tyrozynowych 1,2. Mutacje NF1 i innych genów wymienionych powyżej są również obecne w sporadycznych i wywołanych promieniowaniem MPNSTs11,12.

Chociaż te postępy w naszym zrozumieniu nieprawidłowości genomowych w MPNST były nieocenione dla zrozumienia ich patogenezy, nie doprowadziły jeszcze do opracowania nowych, skutecznych terapii dla MPNST. Główną barierą utrudniającą opracowywanie nowych metod leczenia jest fakt, że MPNST są rzadkimi nowotworami. Z tego powodu trudno jest uzyskać dużą liczbę próbek pacjentów, która jest wymagana do globalnych analiz definiujących kluczowe mutacje powodujące, takich jak te przeprowadzone przez The Cancer Genome Atlas (TCGA). Z naszego doświadczenia wynika, że zgromadzenie nawet niewielkiej liczby ludzkich próbek MPNST może zająć lata. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, wielu badaczy badających inne rzadkie typy nowotworów zwróciło się ku wykorzystaniu onkogenomiki porównawczej między gatunkami w celu zidentyfikowania istotnych mutacji genów napędowych, zdefiniowania podstawowych cytoplazmatycznych szlaków sygnałowych w guzie będącym przedmiotem zainteresowania i zidentyfikowania nowych celów terapeutycznych. Ponieważ szlaki sygnałowe, które są niezbędne do nowotworzenia, są wysoce konserwatywne między ludźmi a innymi gatunkami kręgowców, zastosowanie podejść genomiki funkcjonalnej, takich jak badania przesiewowe shRNA w skali genomu, może być skutecznym sposobem identyfikacji tych nowych mutacji napędzających, szlaków sygnałowych i celów terapeutycznych13,14,15,16,17,18,19, szczególnie podczas badania rzadkich typów nowotworów u ludzi, które są dostępne w ograniczonej liczbie20.

W prezentowanych tutaj metodologiach opisujemy to podejście do przeprowadzania profilowania genomowego w ludzkich liniach komórkowych MPNST i wczesnych pasażach hodowli MPNST pochodzących od myszy P 0-GGFβ3, genetycznie modyfikowany model myszy (GEM), w którym specyficzna dla komórek Schwanna nadekspresja czynnika wzrostu neureguliny-1 (NRG1) promuje patogenezę nerwiakowłókniaków splotowatych i ich późniejszą progresję do MPNSTs21,22,23. Pierwszym krokiem w tym podejściu jest identyfikacja potencjalnych genów sterujących w P 0-GGFβ3 MPNST, ludzkich liniach komórkowych MPNST i chirurgicznie wyciętych ludzkich MPNST. Aby funkcjonalnie zweryfikować szlaki sygnałowe, na które wpływają te mutacje, używamy badań przesiewowych shRNA w skali genomu w celu identyfikacji genów wymaganych do proliferacji i przeżycia w ludzkich i mysich liniach komórkowych MPNST. Po zidentyfikowaniu genów wymaganych do proliferacji i przeżycia, identyfikujemy produkty genów podatnych na działanie leków w kolekcji "trafień" za pomocą Bazy Danych Interakcji Genów Leków. Porównujemy również "trafienia" w ludzkich i mysich komórkach MPNST, aby określić, czy model GEM i ludzkie MPNST wykazują podobną zależność od tych samych genów i szlaków sygnałowych. Identyfikacja nakładających się genów wymaganych do proliferacji i przeżycia oraz dotkniętych szlaków sygnałowych służy jako sposób walidacji mysiego modelu P 0-GGFβ3 na poziomie molekularnym. Podejście to podkreśla również skuteczność łączenia badań przesiewowych na ludziach i myszach w celu identyfikacji nowych celów terapeutycznych, w przypadku których model mysi może służyć jako uzupełnienie badań przesiewowych u ludzi. Wartość tego międzygatunkowego podejścia jest szczególnie widoczna, gdy poszukuje się celów terapeutycznych w rzadkich nowotworach, w których ludzkie nowotwory i linie komórkowe są trudne do uzyskania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przed rozpoczęciem badań, procedury i protokoły postępowania z wektorami wirusowymi na zwierzętach są przejrzane i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) oraz Instytucjonalny Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC). Opisane tutaj procedury zostały zatwierdzone przez zarządy IACUC i IBC Uniwersytetu Medycznego w Południowej Karolinie i zostały wykonane przez odpowiednio przeszkolony personel zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz wytycznymi MUSC dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Analizy WES-Seq i identyfikacja wariantów patogennych

  1. Wyizoluj genomowe DNA z próbki guza lub sub-zlewających się (70%) komórek MPNST wyhodowanych na szalce o średnicy 60 mm, przy użyciu standardowych dostępnych na rynku metod adsorpcji żelu krzemionkowego (szczegółowe kroki można znaleźć w protokole producenta). Ogólny przebieg pracy jest przedstawiony na diagramie Rysunek 1.
  2. Przesłać co najmniej 10 μl genomowego DNA w stężeniu 50 ng/μl do rdzenia sekwencjonowania, chyba że określono różne ilości lub stężenia genomowego DNA.
    1. Główny zakład fragmentuje genomowe DNA za pomocą sonikacji, a następnie oczyszcza je przy użyciu preferowanej metody. Wychwytywanie egzomu i budowa biblioteki są wykonywane przy użyciu preferowanego zestawu do sekwencjonowania egzomu, a znaczniki indeksu są dodawane do amplifikowanego przechwyconego egzomu.
    2. Prześlij próbki do rdzenia sekwencjonowania w celu wykonania sekwencjonowania całego egzomu na sparowanych końcach (WES; sekwencjonowanie 100 pz z każdego końca).
    3. Pliki FASTQ wygenerowane przez rdzeń są dostarczane badaczowi. Używaj tylko plików FASTQ, które przekazują metryki jakości do analizy.
  3. Dopasuj i przeanalizuj pliki FASTQ za pomocą dostępnych na rynku programów (np. DNAStar19,20, Partek21 lub Varsome). Dopasuj pliki FASTQ do genomu referencyjnego myszy GRCm38/mm10 przy użyciu ustawień domyślnych.
    UWAGA: Używając DNAStar i mysiego próbki MPNST jako przykładu, ogólny przepływ pracy jest przedstawiony na diagramie Rysunek 1 i pokrótce wyjaśniony poniżej.
    1. Otwórz oprogramowanie DNAStar i wybierz przepływ pracy SeqMan NGen.
    2. Wybierz opcję Przepływ pracy, wybierając opcję Analiza wariantów/Ponowne sekwencjonowanie i typ analizy sekwencjonowania: Amplicon oparty na NGS, panel genów lub egzom. Kliknij Dalej.
    3. Wybierz preferowaną sekwencję referencyjną, wybierając opcję Pobierz pakiet genomu i odpowiedni genom referencyjny (tj. Mus_musculus-GRCm38-dbSNP146.zip lub Homo sapien-GRCh37.p13.zip). Jeśli podstawowa placówka dostarczyła plik łóżka, prześlij ten plik pomocniczy. Kliknij Dalej.
    4. Wybierz Sekwencje wejściowe, wybierając odpowiednią technologię sekwencera, Illumina, i wyznacz, że odczyty sekwencjonowania są sparowane. Następnie wybierz konfigurację eksperymentu, wiele przykładów i przekaż pliki sekwencjonowania FASTQ, wybierając pozycję Dodaj. Jeśli przeprowadzasz wiele próbek, oznacz każdy zestaw sparowanych końców unikalnym eksperymentem lub nazwą próbki Guz, Linia komórkowa lub A18, A202... Kliknij Dalej.
    5. Ustaw zestaw danych kontrolnych, jeśli taki istnieje. Kliknij przycisk Dalej, a następnie ponownie kliknij przycisk Dalej w obszarze Opcje zespołu. W obszarze Opcje analizy kliknij odpowiedni tryb wykrywania wariantów jako Diploid, a następnie kliknij przycisk Dalej. W obszarze Dane wyjściowe zespołu nazwij i wyznacz lokalizację zapisywania pliku projektu; kliknij Dalej. Uruchom zestaw na komputerze lokalnym lub w chmurze.
      UWAGA: Wynikowe pliki wyrównania można otworzyć w przepływie pracy ArrayStar w celu adnotacji wariantowej wykrytych polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP). Ten przepływ pracy wykrywa SNP, a nie zyski lub straty liczby kopii genów. Oddzielna analiza zwana macierzą SNP o wysokiej gęstości wykrywa zmiany liczby kopii; Sekwencjonowanie całego egzomu nie wykrywa niezawodnie zmian liczby kopii. Zapoznaj się z instrukcją obsługi programu, aby uzyskać informacje na temat konkretnych kroków, które należy wykonać za pomocą programu do wyrównywania.
    6. Zastosuj filtry zdefiniowane przez użytkownika do adnotacji wariantu wykrytych SNP, aby uwzględnić lub wykluczyć określone dane. Aby uzyskać skondensowaną listę prawdopodobnych funkcjonalnie istotnych wariantów, należy zastosować następujące filtry do zestawów danych wariantów w tej hierarchii: brak kontroli (jeśli dostępna jest normalna próbka kontrolna), częstość populacji (gnomAD, ExAC, częstość występowania 1000 genomów), częstość występowania alleli (w tym ≤0,001 lub 0,1%), głębokość pokrycia (z wyłączeniem głębokości <10), patogenność lub klasa ClinVar (w tym: chorobotwórczy, prawdopodobnie chorobotwórczy; z wyłączeniem: niepewny, prawdopodobnie łagodny, łagodny), a w razie potrzeby typ SNP i wpływ kodowania (w tym: niesynonimiczne, błędne znaczenie, nonsens, przesunięcie ramki, w ramce, splicing).
      UWAGA: Znana lista genów raka może być również zastosowana do ostatecznej listy, aby pobrać tylko określone geny istotne dla choroby, patrz krok 1.3.7. Filtry te mogą zredukować listę wariantów genów do mniej niż 20 genów.
      1. Użyj częstości alleli wariantów, aby odfiltrować SNP błędu sekwencjonowania. Warianty homozygotyczne i heterozygotyczne będą reprezentowane odpowiednio w przybliżeniu 100% i 50% dla czystej populacji komórek niezanieczyszczających (ustalona linia komórkowa pochodząca z guza powinna reprezentować pojedynczą populację izogenicznych komórek nowotworowych). W takim przypadku zastosuj częstości alleli 100-90% i 50-40% dla wariantów jako filtr, usuwając w ten sposób wszelkie warianty poniżej. Jeśli dane z macierzy SNP o dużej gęstości są również dostępne dla tego samego zestawu danych, zastosuj przyrost lub utratę liczby kopii do SNP o częstości występowania alleli wariantowych mniejszych niż proporcje homozygotyczne lub heterozygotyczne (tj. przyrost liczby kopii skutkujący 2 kopiami allelu A i 1 kopią allelu B zapewni odpowiednią częstość występowania alleli wariantu wynoszącą 75%, 25%, odpowiednio).
    7. Po zidentyfikowaniu patogennych wariantów za pomocą ArrayStar, wyeksportuj i zapisz listę wariantów genów jako plik csv, txt lub xls i porównaj geny zawierające te mutacje z genami w kohorcie guzów generowanych przez P 0-GGFβ3 w celu określenia nakładających się i unikalnych zmutowanych list genów. Porównaj zmutowane geny ze znanymi zmutowanymi genami związanymi z ich ludzkimi odpowiednikami (np. lista genów raka Bushman Lab lub lista wyselekcjonowana przez użytkownika).
      1. Opcjonalnie, przed zastosowaniem jakichkolwiek filtrów zdefiniowanych przez użytkownika (1.3.6), wyeksportuj i zapisz plik z adnotacjami jako plik VCF.
        UWAGA: Ten plik VCF można przesłać do innego oprogramowania do przewidywania efektorów wariantów Varsome lub VEP w celu porównania jako analiza wtórna. Analizę biologiczną i szlakową można również przeprowadzić na przefiltrowanych listach genów wariantów.
    8. Wykonaj klasyfikację funkcjonalną listy wariantów genów za pomocą preferowanej przez użytkownika bazy danych, aby uzyskać informacje o klasie białka, szlaku, składniku szlaku oraz rodzinie genów i ontologii.
      UWAGA: PANTHER (pantherdp.org) jest tutaj używany jako przykład.
      1. Prześlij przefiltrowaną listę genów z identyfikatorem genu.
      2. Wybierz organizm (Mus musculus).
      3. Wybierz analizę (Klasyfikacja funkcjonalna wyświetlana na liście genów) i kliknij przycisk prześlij analizę biologiczną i ścieżkę na przefiltrowanych listach wariantów genów.

2. Badania przesiewowe shRNA w skali genomu

UWAGA: Dostępnych jest kilka bibliotek shRNA i CRISPR, które mogą być używane do funkcjonalnych badań przesiewowych na skalę genomu z hodowlami guzów o niskim pasażu. Tutaj opisujemy zastosowanie bibliotek shRNA CELLECTA DECIPHER jako przykład. Biblioteki lentiwirusowego shRNA projektu CELLECTA DECIPHER są zoptymalizowane pod kątem genetycznych badań przesiewowych RNAi w formacie zbiorczym. Każdy transkrypt jest ukierunkowany na co najmniej 5-6 unikalnych shRNA, a każdy lentiwirusowy wektor shRNA zawiera unikalny genetyczny kod kreskowy otoczony miejscami starterów PCR. Biblioteki te obejmują większość genów istotnych dla chorób ludzi i myszy, ale nie obejmują wszystkich genów w genomie. Pule plazmidowego DNA w bibliotece ludzkiej Cellecta są dostępne w trzech modułach (Human Module I, II, III; celuje w 15 377 genów), podczas gdy pule plazmidów w bibliotece myszy są dostępne w dwóch modułach (Moduły myszy I i II; celuje w 9 145 genów). Biblioteki te są wykorzystywane do przeprowadzania testów "odpadania", w których docelowe geny, które są wymagane do proliferacji i/lub przeżycia, ulegają zróżnicowanej ekspresji w różnych punktach czasowych po transdukcji wirusa.

  1. Opakowania lentiwirusowe
    1. Dzień 0: Talerz 10 szalek po 10 milionach komórek 293T / 15 cm szalka w 30 ml / naczynie DMEM bez antybiotyków zawierający 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
    2. Dzień 1: Następnego dnia upewnij się, że komórki są w ~ 80% zlewające się i gotowe do transfekcji. W stożkowej probówce o pojemności 50 ml wymieszaj w następującej kolejności: 600 μl opakowania mieszanki plazmidowej (0,5 μg/μl), 60 μl biblioteki kodów kreskowych plazmidu, 12 ml DMEM (bez surowicy i antybiotyków) i 600 μl odczynnika do transfekcji. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    3. Umieścić 900 μl odczynnika do transfekcji i 12 ml DMEM w oddzielnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml i wymieszać przez wirowanie. Dodać 12,9 ml mieszaniny odczynnika do transfekcji/DMEM do mieszaniny DNA i przetrzeć do wymieszania. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut bez dalszego mieszania. Dodaj 2,5 ml tej mieszanki, kroplami, do każdej 15-centymetrowej płytki z komórkami 293T i inkubuj przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych.
    4. Dzień 2: Zastąp pożywkę następnego dnia zwykłą pożywką wzrostową zawierającą antybiotyki.
    5. Dzień 3: Zebrać wirusa, zbierając pożywkę i przepuszczając ją przez jednostkę filtracyjną 0,2 μm i rozdzielając do stożkowych probówek o pojemności 15 ml; należy również przygotować pięć podwielokrotności przefiltrowanego wirusa o pojemności 1 ml w kriowialach do wykorzystania w miareczkowaniu wirusa (uważa się, że wirus trwa 48 godzin); należy przechowywać wirusa w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Zastąp pożywkę 30 ml pożywki wzrostowej na płytkach pojedynczo, aby uniknąć wysychania komórek.
    6. Dzień 4: Zbierz wirusa, zbierając pożywkę i przepuszczając ją przez jednostkę filtracyjną 0,2 μm. Podwielokrotność wirusa rozlać do stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Jest to uważane za wirusa 72 h; Wirusa należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
  2. Miano basenów lentiwirusowych
    1. Dodaj 65 μl polimeru kationowego (10 mg/ml) do 65 ml pożywki do wzrostu komórek nowotworowych. Odpipetować 1 ml/dołek pożywki zawierającej polimer do jedenastu 6-dołkowych płytek do hodowli tkankowych. Trypsynizuj komórki nowotworowe we wczesnym okresie pasażu i policz komórki przy użyciu preferowanej metody, tak aby każda studzienka otrzymała 50 000 komórek / ml / studzienkę. Rozmrozić 1 ml porcji lentiwirusa z 48 godzin z zamrażarki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Dla każdego modułu wirusowego należy przygotować infekcję, jak pokazano w Tabeli 1.
    3. Umieść wszystkie 6-dołkowe płytki w inkubatorze do hodowli tkankowych. Następnego dnia usuń pożywkę wirusową i uzupełnij świeżą pożywką wzrostową. Po 48 godzinach dodać pożywkę zawierającą puromycynę do wszystkich studzienek, które otrzymują selekcję. Zanim komórki kontrolne zlegną się ze sobą, należy przeprowadzić zliczanie komórek klonów, które przeżyły, przy użyciu preferowanej metody.
      UWAGA: Stężenie puromycyny wymagane do zabicia komórek nietransdukowanych musi być wstępnie określone empirycznie poprzez testowanie zakresu stężeń na krzywej "zabijania". Używaj najniższego stężenia, które równomiernie indukuje śmierć kultur nietransdukowanych.
  3. Zakażenie lentiwirusowe komórek docelowych
    1. Trypsynizuj komórki MPNST i policz. Talerz: 2,5 miliona komórek na 15 cm talerza, co daje łącznie dwadzieścia 15 cm szalek na moduł. Rozmrozić wirusa i przeprowadzić transdukcję komórek z wirusem przy MOI 0,5 w obecności 5 μg/ml polimeru kationowego (Rysunek 2A).
    2. Usuń pożywkę zawierającą wirusa następnego ranka i zastąp ją świeżą pożywką wzrostową. Hoduj komórki przez dodatkowe 2 dni, aby umożliwić ekspresję markera selekcyjnego, a następnie dodaj puromycynę do kultur w celu wyeliminowania komórek nietransdukowanych.
    3. Trzy dni po dodaniu puromycyny trypsynizuj komórki i odwiruj połowę populacji komórek przy 200 × g przez 5 minut w wirówce stołowej. Granulowane komórki należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C do przyszłego przygotowania genomowego DNA; jest to punkt czasowy odniesienia lub punkt czasowy 1 (T1).
    4. Ponownie pokryj drugą połowę populacji komórek i hoduj ją przez około 7 podwojeń populacji przed zbiorem i odwirowaniem, jak powyżej. Ta osadka komórkowa będzie służyć jako końcowy punkt czasowy (punkt czasowy 2, T2) i jest przechowywana w temperaturze -80 °C do przyszłej izolacji genomowego DNA (Rysunek 2).
  4. Izolowanie genomowego DNA z komórek transdukowanych pulami wirusów
    1. Rozmrozić osad komórkowy z zamrażarki o temperaturze -80 °C i ponownie zawiesić osad w 10 ml buforu do resuspensji z dodatkiem RNAzy i natychmiast rozdzielić na dwie probówki z polimetylopentenu o pojemności 15 ml (Rysunek 2B).
    2. Dodać 500 μl 10% SDS na 5 ml, wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie umieść probówki w urządzeniu do ścinania DNA, aby sonizować DNA przez 25 cykli po 30 s włączenia/30 s przerwy, upewniając się, że utrzymuje temperaturę na poziomie 4 °C.
    3. Dodać 5 ml fenolu/chloroformu o pH 8,0 (przechowywanym w temperaturze 4 °C), upewniając się, że przed użyciem dobrze wymieszano fenol/chloroform. Po dodaniu fenolu/chloroformu dobrze wymieszaj, energicznie wirując na maksymalnym ustawieniu przez 45-60 s. Wirować przez 60 min, -20 °C w temperaturze 7 200 × g.
      UWAGA: Pienisty/mleczny wygląd po wirowaniu będzie sygnalizował całkowite ponowne wymieszanie.
    4. Przenieś 3 ml klarownej górnej fazy do świeżej probówki o pojemności 15 ml i dodaj 0,5 ml 3 M octanu sodu i 4 ml izopropanolu i dobrze wymieszaj (Rysunek 2C). Wirować przez 30 minut w temperaturze 20 °C i temperaturze 7 200 × g.
    5. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant, a następnie ostrożnie odpipetować pozostałą ciecz. Dodaj 0,5 ml 70% etanolu i usuń granulkę, pipetując w górę iw dół. Przenieś ponownie zawieszony osad do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i połącz oba granulki z tej samej próbki w jedną probówkę wirówkową o pojemności 1,5 ml. Wirować z maksymalną prędkością w wirówce stołowej przez 5 minut.
    6. Wyrzucić sklarowany nad osadem i użyć chusteczki laboratoryjnej, aby wchłonąć resztki 70% etanolu. Ponownie zawiesić granulkę w 0,5 ml wody destylowanej, uważając, aby nie dopuścić do wyschnięcia granulki, ponieważ utrudni to ponowne zawieszenie. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C przed pomiarem stężenia DNA.
  5. Zagnieżdżony PCR do amplifikacji kodów kreskowych shRNA
    UWAGA: Pobrać DNA z magazynu i umieścić na lodzie. Jeśli stężenie DNA jest niższe niż 100 ng/μl, należy szybko wysuszyć próżniowo DNA i ponownie zawiesić w odpowiedniej objętości wody destylowanej. Zalecamy przetwarzanie tylko jednego modułu na raz (punkt czasowy 1 (T1) lub punkt czasowy 2 (T2)). Wykonaj dwa przygotowania każdego punktu czasowego, które mają zostać zebrane na końcu; Dlatego ważne jest, aby nie przetwarzać replikowanych punktów czasowych tego samego dnia. Poniższy protokół dotyczy jednego punktu czasowego genomowego DNA.
    1. Ustaw 7 probówek i oznacz je zgodnie z opisem: kontrola ujemna, kontrola pozytywna, 4 probówki dla genomowego DNA i jedna dla mieszanki głównej (Rysunek 3A). Kontrolą ujemną jest woda destylowana; kontrola pozytywna to plazmidowe DNA używane w transfekcji 293T do generowania lentiwirusa.
    2. Najpierw dodaj wodę do każdej probówki, jak wskazano w Tabeli 2.
    3. Przygotować mieszankę wzorcową (MM), jak pokazano w Tabeli 3.
    4. Dodać 18 μl MM do każdej probówki zawierającej wodę. Następnie dodaj 25 μl genomowego DNA do każdej z 4 probówek matrycowych. Następnie dodać 1 μl kontroli dodatniej (10 ng/μl) do probówki kontroli dodatniej, uważając, aby nie zanieczyścić innych probówek DNA kontroli dodatniej. Na koniec dodać 2 μl polimerazy do każdej probówki, dodając najpierw do 4 probówek z próbkami, a na końcu do probówki z kontrolą dodatnią; wymieszaj i odwiruj probówki do PCR (Rysunek 3).
    5. Przeprowadzić reakcję PCR w warunkach podanych w tabeli 4.
    6. Podczas wykonywania pierwszego PCR przygotuj probówki do 2. PCR, jak wskazano w Tabeli 5. Ustaw siedem probówek: kontrola ujemna, kontrola pozytywna, 4 probówki dla genomowego DNA i jedna dla MM (Rysunek 3B).
    7. Dodaj 22 μl MM do każdej probówki zawierającej wodę i poczekaj na zakończenie pierwszej rundy PCR przed dodaniem DNA i polimerazy.
      1. Po zakończeniu pierwszej rundy PCR połącz 4 probówki z próbkami w jedną probówkę do mikrowirówki i wymieszaj.
      2. Dodać 25 μl do każdej probówki z próbką zawierającej wodę.
      3. Następnie dodaj 2 μl pierwszej kontroli ujemnej PCR i 2 μl pierwszej kontroli dodatniej PCR do odpowiednio oznakowanych probówek.
      4. Dodać 2 μl polimerazy do każdej probówki, dodając najpierw do 4 probówek z próbkami, a na końcu do kontroli ujemnej.
    8. Przeprowadź reakcję PCR zgodnie z tabelą 6.
      UWAGA: Po przeanalizowaniu wyników pierwszej reakcji PCR metodą elektroforezy na 3,5% żelu agarozowym, jeśli uzyska się dużą ilość produktu, liczbę cykli można zmniejszyć do 9-10 przy następnym powtórzeniu tej procedury; Podobnie, jeśli wydajność produktu jest niska, liczbę cykli można zwiększyć do 14.
    9. Po zakończeniu drugiej reakcji PCR połącz 4 próbki w jednej probówce mikrowirówkowej plus 80 μl 6-krotnie obciążającego barwnika. Do kontroli dodatniej i ujemnej należy użyć 20 μl próbki.
      1. Przygotuj 3,5% żel agarozowy w buforze Tris-Borate-EDTA (TBE) (Rysunek 4A). Aby pomieścić dużą objętość próbki, utwórz jedną dużą studzienkę w grzebieniu żelowym, sklejając ze sobą kilka studzienek (jeśli grzebień pasujący do objętości nie jest dostępny), upewniając się, że pozostawiłeś dwie studzienki dostępne dla kontroli dodatniej i ujemnej. Uruchom żel pod napięciem 90 V przez 1 godzinę.
    10. Wizualizuj żel i potwierdź pasmo na około 250 parach zasad (bp).
  6. Pierwsze oczyszczanie: ekstrakcja żelu
    1. Za pomocą czystego skalpela lub żyletki wytnij pasmo 250 pz, odcinając jak najwięcej żelu. Pokrój dużą taśmę na 4 części i przenieś każdy kawałek do czystej probówki do mikrowirówki. Zmierz i zapisz wagę każdego plasterka żelu.
      UWAGA: Każda sztuka powinna zawierać około 200 mg lub mniej na probówkę.
    2. Dodać 6 objętości buforu do rozpuszczania (np. jeśli kawałek żelu waży 200 mg, dodać 1,2 ml buforu). Umieść probówki w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C i obracaj co 10-15 minut, aż plastry żelu się rozpuszczą. Następnie dodaj 1 objętość izopropanolu do każdej probówki (np. 0,2 ml izopropanolu, jeśli kawałek żelu waży 200 mg).
    3. Używając dwóch kolumn wirowych do oczyszczania, załaduj próbki ze wszystkich 4 probówek do kolumn. Wykonaj wiele wirowań, aby przetworzyć całą objętość próbki, ponieważ kolumny mieszczą tylko 750 μl. Obracaj kolumny z prędkością 17 900 × g przez 1 minutę w konwencjonalnej mikrowirówce stołowej i za każdym razem odrzucaj przepływ.
    4. Przemyć kolumny 750 μl buforu płuczącego i odwirować w stężeniu 17 900 × g przez 1 min. Po umyciu wyrzuć przepływowy i wysusz kolumnę wirową, odwirowując przy 17 900 × g przez 3 minuty. Eluować DNA za pomocą 50 μl wody destylowanej na kolumnę i wirować jak poprzednio przez 1 minutę i połączyć obie probówki w całkowitej objętości 100 μl próbki.
  7. Drugie oczyszczenie
    1. W kolejnym kroku oczyszczania zostanie wykorzystany Binding Buffer 2 (z zestawu do oczyszczania PCR), który nie eliminuje małych fragmentów. Dodaj 400 μl buforu do 100 μl DNA i załaduj go do jednej kolumny wirowej (Rysunek 4B). Odwirować próbkę o masie 17 900 × g przez 1 minutę.
    2. Następnie przemyć membranę 650 μl buforu do płukania i odwirować jak poprzednio. Suszyć kolumnę wirową za pomocą dodatkowego wirowania jak powyżej przez 3 minuty.
    3. Eluować DNA za pomocą 30 μl wody destylowanej i wirować z maksymalną prędkością przez 1 minutę. Po elucji sprawdzić stężenie na spektrofotometrze; upewnić się, że stężenie nie jest niższe niż 10 ng/μl lub wyższe niż 70-80 ng/μl. Przechowuj DNA w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
  8. Sekwencjonowanie wzmocnionych kodów kreskowych
    1. Do sekwencjonowania należy rozcieńczyć oczyszczone kody kreskowe do 0,75 ng/μl za pomocą buforu elucyjnego (EB). Aby dodać różnorodność sekwencji, amplikony są grupowane o godzinie 17 pM, w tym 30% (v/v) PhiX. Klastrowanie typu single-end (SE) należy wykonać w zautomatyzowanym systemie generowania klastrów zgodnie z protokołem producenta.
    2. Niech rdzeń sekwencjonujący wykona łącznie 36 cykli sekwencjonowania pojedynczego końca na sekwenserze NextGen (Rysunek 4C). Dodaj niestandardowy starter GexSeqS do starterów sekwencjonujących Illumina przy 0,5 μM.
    3. Użyj referencyjnego oprogramowania analitycznego, aby wygenerować pliki Fastq i przetworzyć je za pomocą oprogramowania do przycinania długości odczytu do 18 nukleotydów.
    4. Użyj oprogramowania Barcode Analyzer i Deconvoluter, aby zdekonwolucjonizować przycięte odczyty. Oblicz wyniki zubożenia krotności dla każdego shRNA jako stosunek liczby odczytów w referencyjnym punkcie czasowym (T1) do końcowego punktu czasowego (T2).
  9. Analiza wyników badań przesiewowych shRNA i identyfikacja potencjalnych celów terapeutycznych
    UWAGA: W bibliotece shRNA Cellecta większość genów jest ukierunkowana na 5 (67%) lub 6 różnych shRNA (32%). Jednak kilka genów porządkowych, które powinny być trafione w większość komórek, jest celem dużej liczby shRNA i służy jako kontrole, które definiują zakres wyników dla negatywów.
    1. Aby zapobiec stronniczości w kierunku genów, do których dąży większa liczba shRNA, należy przekształcić wyniki wyczerpania logarytmicznie. Wykonaj oszacowanie kwantylowe, obliczając 80. percentyl dla każdego genu na podstawie jego rozkładu empirycznego.
    2. Aby wygenerować rozkład zerowy wyników zubożenia logarytmicznego, załóżmy, że >95% genów nie zostanie zubożonych i że ich wyniki kwantylu logarytmicznego będą miały rozkład normalny. Użyj mediany rozkładu empirycznego, aby oszacować średnią rozkładu zerowego. Korzystając z tego rozkładu zerowego, sklasyfikuj wszystkie geny z wynikami wyczerpania logarytmicznie krotnego, które są większe niż 95. percentyl rozkładu zerowego jako "trafienia"
      UWAGA: Wszystkie trafienia powinny mieć co najmniej dwa shRNA z wynikami zubożenia powyżej punktu odcięcia (Rysunek 5).
    3. Aby ocenić jakość danych z ekranu zaniku RNAi i trafność punktu odcięcia, użyj zestawu genów, które zostały zdefiniowane jako "podstawowe niezbędne" przez inicjatywę badań przesiewowych COLT Cancer RNAi24,25 dla porównania. Usuń CEG z listy trafień, aby utworzyć wstępną listę potencjalnych celów terapeutycznych.
      UWAGA: Geny w zestawie COLT uzyskały wynik w >50% z 72 linii komórek rakowych, które zostały przebadane przez COLT. Podstawowa lista niezbędnych genów zawiera 640 genów.
    4. Aby zidentyfikować potencjalne cele terapeutyczne, które są powszechnie lub jednolicie wymagane przez wiele linii komórkowych MPNST, skonstruuj diagramy Venna trafień innych niż CEG zidentyfikowanych w badaniach przesiewowych różnych linii komórkowych MPNST lub kultur wczesnego pasażu (Rysunek 6A). Określ priorytety trafień innych niż CEG, które są wymagane we wszystkich lub większości linii lub kultur MPNST.
      1. Alternatywnie, należy przeprowadzić analizy szlaków na liście trafień innych niż CEG z każdej linii komórkowej lub kultury wczesnego pasażu, aby zidentyfikować geny, których produkty kodują składniki szlaków sygnałowych, które są wymagane do proliferacji komórek nowotworowych i / lub przeżycia. Następnie porównaj szlaki sygnałowe, które zostały zidentyfikowane w analizie szlaków innych niż CEG, ze szlakami sygnałowymi, które zostały zidentyfikowane jako dotknięte mutacjami zidentyfikowanymi za pomocą WES.
        UWAGA: Uważamy, że szczególnie przydatna jest identyfikacja szlaków sygnałowych, na które konsekwentnie wpływają mutacje zidentyfikowane w WES i porównanie ich ze szlakami sygnałowymi zidentyfikowanymi jako krytyczne w badaniach przesiewowych shRNA.
    5. Aby zidentyfikować cele ulegające uleczeniu, dla których środki terapeutyczne są już dostępne, należy przesiać listę trafień pozostałych po usunięciu podstawowych genów za pomocą bazy danych interakcji genów leków (dgidb.org).
      UWAGA: Ta baza danych umożliwia jednoczesne wprowadzanie i badanie przesiewowe genów oraz zawiera wskazówki dotyczące leków, które są obecnie dostępne do zwalczania tych genów.
    6. Najpierw zweryfikuj zidentyfikowane cele o wysokim zainteresowaniu, obniżając ich ekspresję genów za pomocą shRNA różniących się od tych używanych w początkowym badaniu przesiewowym biblioteki w formacie pojedynczej partii (a nie w formacie biblioteka-partia, który właśnie opisano). Aby obniżyć ekspresję genów, użyj dwóch do trzech różnych lentiwirusowych shRNA. Trzy do czterech dni po zakażeniu określ wpływ, jaki ma to na proliferację i przeżycie komórek nowotworowych, jak opisano poniżej.

3. Wykonywanie cytometrycznych testów liczby komórek i żywotności w komórkach MPNST poddanych próbie użycia potencjalnych środków terapeutycznych

  1. Hoduj komórki MPNST w DMEM do 80% konfluencji. Opłucz komórki zrównoważonym roztworem soli Hanksa o temperaturze pokojowej (HBSS).
    UWAGA: Nie hoduj komórek do zbieżności, ponieważ wzrost tych komórek będzie opóźniony przez pewien czas po ponownym posianiu.
  2. Odłącz komórki od podłoża, pokrywając je na 30 s do 1 minuty nieenzymatycznym roztworem do dysocjacji komórek. Dodać 5 ml DMEM na 1 ml roztworu dysocjacyjnego i delikatnie pipetować komórki w górę iw dół, aby oderwać się od podłoża.
  3. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Komórki płytkowe o gęstości 1,200 komórek na studzienkę w czarnościennych płytkach 96-dołkowych; Umieścić na płytce co najmniej trzy dołki dla każdego rozcieńczenia leku, który będzie badany, i przeprowadzić trzy powtórzenia biologiczne tych eksperymentów.
  4. Aby określić początkowe stężenia leku, który będzie testowany, należy dokonać przeglądu literatury, aby ocenić, jakie stężenia były skuteczne przeciwko innym typom komórek nowotworowych. W początkowych eksperymentach przetestuj zakres dwóch rzędów wielkości powyżej i dwa rzędy wielkości poniżej stężenia leku stosowanego w innych typach raka.
  5. Przygotować rozcieńczenia badanego leku i dodać każde rozcieńczenie lub nośnik do co najmniej trzech powtórzonych studzienek.
  6. Oceń bezpośrednie numery komórek 1, 3, 5 i 7 dni po dodaniu leków. Dodać Hoechst 33342 do końcowego stężenia 5 μg/ml i inkubować płytki przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Odczytać płytki na wysokoprzepustowym cytometrze obrazowym przy użyciu opcji bezpośredniego zliczania komórek dla całkowitej liczby komórek z czasem naświetlania 100 000 ms.
  7. Analizuj odczyty za pomocą oprogramowania i eksportuj je do arkusza kalkulacyjnego oraz używaj odpowiedniego oprogramowania do analiz statystycznych.
  8. Jeśli w studzienkach poddanych działaniu leku obserwuje się statystycznie istotne zmniejszenie liczby komórek, należy przeprowadzić test "Żywy/martwy" w celu ustalenia, czy to zmniejszenie jest częściowo spowodowane indukcją śmierci komórki.
    1. Komórki płytkowe w czarnościennych płytkach 96-dołkowych, jak opisano w kroku 3.3.
    2. Przygotuj i dodaj leki zgodnie z opisem w kroku 3.5.
    3. Oceń żywotność i śmierć komórek 1, 3, 5 i 7 dni po dodaniu leku. Dodać kalceinę AM do końcowego stężenia 1 μM i jodek propidyny do końcowego stężenia 1 μM w każdym dołku. Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
    4. Obrazowanie komórek na cytometrze obrazującym za pomocą opcji oprogramowania Live+Dead. Analizuj odczyty za pomocą oprogramowania i eksportuj je do arkusza kalkulacyjnego oraz używaj odpowiedniego oprogramowania do analiz statystycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykresy 5 pokazują wyniki wyczerpania podstawowych niezbędnych genów (CEG) oznaczonych jako PRAWDZIWE w porównaniu z nie-CEG (oznaczonych jako FAŁSZ) w każdej ludzkiej linii komórkowej, która została przebadana. Punkty reprezentują log2 wyników krotnego wyczerpania dla poszczególnych genów, które są wykreślane na wykresie pudełkowym przedstawiającym ogólny rozkład wyników. Test t Studenta został wykorzystany do zbadania istotnej różnicy w średnich wynikach wyczerpania między dwiema ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione tu szczegółowe metody zostały opracowane w celu badania neoplazji obwodowego układu nerwowego i patogenezy MPNST. Chociaż stwierdziliśmy, że te metody są skuteczne, należy zdać sobie sprawę, że istnieją pewne potencjalne ograniczenia metod, które tutaj opisujemy. Poniżej omawiamy niektóre z tych ograniczeń i potencjalne strategie ich pokonywania w innych systemach modelowych.

Odkryliśmy, że sekwencjonowanie całego egzomu skutecznie identyfikuje interesujące mutacje u myszy P 0-GG...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 i R01 NS109655 dla S.L.C.; R01 NS109655-03S1 do D.P.J.), National Cancer Institute (R01 CA122804 do S.L.C.) oraz Departament Obrony (X81XWH-09-1-0086 i W81XWH-12-1-0164 do S.L.C.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System Sonikacji BioruptorDiagenode UCD-600
CASAVA 1.8.2
CbotIllumina, San Diego, Kalifornia
cytometru obrazowego CeligoNexcelomN/A
Cellecta Analizator kodów kreskowych i oprogramowanie
Citrisolve HybridDecon Laboratories5989-27-5
Corning 96-dołkowa mikropłytkaMillipore SigmaCLS3603
Diagenode Bioruptor 15mlDiagenode 
mieszanka dNTPClontech639210
Eosin YThermo Scientific7111
Bufor elucyjnyQiagen 19086
Etanol (200 dowodów)Decon Laboratories2716
Excel Microsoft 
FWDGEX 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3'
FWDHTS 5'-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3'
GexSeqS (5' AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3'Oczyszczony HPLC
GraphPad PrismDotmatics
Harris HematoxylinFisherbrand245-677
Illumina HiScanSQIllumina, San Diego, CANie dotyczy
Paraformaldehydu (4%)Thermo ScientificJ19943-K2
PLUS Odczynnik do transfekcjiThermo Scientific11514015
Odczynnik do transfekcji polibrenuMillipore SigmaTR1003G
PureLink Zestaw do szybkiego oczyszczania PCRInvitrogenK310001
Qiagen Buffer P1Qiagen 19051
Zestaw do ekstrakcji żelu QiagenQiagen28704
RevGEX 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3'
RevHTS1 5'-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3'
Polimeraza tytanowa TaqClontech639210
Oprogramowaniewww.usadellab.org
Nie dotyczy dekonwolucyjne Rurki stożkowe C30010009 Trimmomatic

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathol. 123 (3), 321-348 (2012).
  2. Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. Recent Advances in the Diagnosis and Pathogenesis of Neurofibromatosis Type 1 (NF1)-associated Peripheral Nervous System Neoplasms. Adv Anat Pathol. 25 (5), 353-368 (2018).
  3. Longo, J. F., Carroll, S. L. The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options. Adv Cancer Res. 153, 305-341 (2022).
  4. Birindelli, S., et al. Rb and TP53 pathway alterations in sporadic and NF1-related malignant peripheral nerve sheath tumors. Lab Invest. 81 (6), 833-844 (2001).
  5. Legius, E., et al. TP53 mutations are frequent in malignant NF1 tumors. Genes Chromosomes Cancer. 10 (4), 250-255 (1994).
  6. Menon, A. G., et al. Chromosome 17p deletions and p53 gene mutations associated with the formation of malignant neurofibrosarcomas in von Recklinghausen neurofibromatosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (14), 5435-5439 (1990).
  7. Upadhyaya, M., et al. Germline and somatic NF1 gene mutation spectrum in NF1-associated malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs). Hum Mutat. 29 (1), 74-82 (2008).
  8. Kourea, H. P., Orlow, I., Scheithauer, B. W., Cordon-Cardo, C., Woodruff, J. M. Deletions of the INK4A gene occur in malignant peripheral nerve sheath tumors but not in neurofibromas. Am J Pathol. 155 (6), 1855-1860 (1999).
  9. Nielsen, G. P., et al. Malignant transformation of neurofibromas in neurofibromatosis 1 is associated with CDKN2A/p16 inactivation. Am J Pathol. 155 (6), 1879-1884 (1999).
  10. Gregorian, C., et al. PTEN dosage is essential for neurofibroma development and malignant transformation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (46), 19479-19484 (2009).
  11. Lee, W., et al. PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1227-1232 (2014).
  12. Zhang, M., et al. Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1170-1172 (2014).
  13. Varela, I., et al. Somatic structural rearrangements in genetically engineered mouse mammary tumors. Genome Biol. 11 (10), 100(2010).
  14. Johnson, R. A., et al. Cross-species genomics matches driver mutations and cell compartments to model ependymoma. Nature. 466 (7306), 632-636 (2010).
  15. Kim, M., et al. Comparative oncogenomics identifies NEDD9 as a melanoma metastasis gene. Cell. 125 (7), 1269-1281 (2006).
  16. Zender, L., et al. Identification and validation of oncogenes in liver cancer using an integrative oncogenomic approach. Cell. 125 (7), 1253-1267 (2006).
  17. Uren, A. G., et al. Large-scale mutagenesis in p19(ARF)- and p53-deficient mice identifies cancer genes and their collaborative networks. Cell. 133 (4), 727-741 (2008).
  18. Starr, T. K., et al. A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer. Science. 323 (5922), 1747-1750 (2009).
  19. Dupuy, A. J., et al. A modified sleeping beauty transposon system that can be used to model a wide variety of human cancers in mice. Cancer Res. 69 (20), 8150-8156 (2009).
  20. Carroll, S. L. The Challenge of Cancer Genomics in Rare Nervous System Neoplasms: Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors as a Paradigm for Cross-Species Comparative Oncogenomics. Am J Pathol. 186 (3), 464-477 (2016).
  21. Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. J Neurosci. 23 (19), 7269-7280 (2003).
  22. Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. Am J Pathol. 182 (3), 646-667 (2013).
  23. Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropathol. 127 (4), 573-591 (2014).
  24. Hart, T., Brown, K. R., Sircoulomb, F., Rottapel, R., Moffat, J. Measuring error rates in genomic perturbation screens: gold standards for human functional genomics. Mol Syst Biol. 10 (7), 733(2014).
  25. Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens. G3. 7 (8), Bethesda. 2719-2727 (2017).
  26. Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Sci Rep. 11 (1), 5690(2021).
  27. Maser, R. S., et al. Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers. Nature. 447 (7147), 966-971 (2007).
  28. Rahrmann, E. P., et al. Forward genetic screen for malignant peripheral nerve sheath tumor formation identifies new genes and pathways driving tumorigenesis. Nat Genet. 45 (7), 756-766 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Genetic ProfilingDropout ScreeningMalignant Peripheral Nerve Sheath TumorMouse Tumor ModelsshRNA ScreeningWhole Exome SequencingFunctional GenomicsLentiviral TransductionCell Proliferation AssayTherapeutic Target Identification

Powiązane artykuły