Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Niefrakcjonowana masowa hodowla mięśni szkieletowych myszy w celu podsumowania spoczynku niszy i komórek macierzystych

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65433

⸱

2 czerwca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Univ Paris Est Creteil, INSERM, IMRB, F-94010 Creteil, France, 2Ecole nationale vétérinaire d'Alfort, IMRB, F-94700 Maisons-Alfort, France, 3EFS, IMRB, F-94010 Creteil, France, 4AP-HP, Hopital Mondor, Service d'histologie, F-94010 Creteil, France

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Mięśnie szkieletowe składają się z wielu typów komórek, w tym rezydentnych komórek macierzystych, z których każda ma szczególny wkład w homeostazę i regenerację mięśni. W tym miejscu opisano hodowlę 2D komórek macierzystych mięśni i niszy komórek mięśniowych w warunkach ex vivo, które zachowują wiele cech fizjologicznych, in vivo i środowiskowych.

Streszczenie

Mięśnie szkieletowe to największa tkanka ciała i spełnia wiele funkcji, od lokomocji po kontrolę temperatury ciała. Jego funkcjonalność i rekonwalescencja po urazach zależą od wielu typów komórek oraz od sygnałów molekularnych między rdzennymi komórkami mięśniowymi (włóknami mięśniowymi, komórkami macierzystymi mięśni) a ich niszą. Większość warunków eksperymentalnych nie zachowuje tego złożonego fizjologicznego mikrośrodowiska, ani też nie pozwala na badanie ex vivo komórek macierzystych mięśni w stanie spoczynku, który jest dla nich kluczowy. W tym miejscu przedstawiono protokół hodowli ex vivo komórek macierzystych mięśni ze składnikami komórkowymi ich niszy. Poprzez mechaniczny i enzymatyczny rozkład mięśni uzyskuje się mieszaninę typów komórek, którą umieszcza się w hodowli 2D. Barwienie immunologiczne pokazuje, że w ciągu 1 tygodnia w hodowli pojawia się wiele komórek niszowych wraz z włóknami mięśniowymi i, co ważne, komórkami Pax7-dodatnimi, które wykazują cechy komórek macierzystych mięśni w stanie spoczynku. Te unikalne właściwości sprawiają, że protokół ten jest potężnym narzędziem do amplifikacji komórek i generowania komórek macierzystych przypominających stan spoczynku, które można wykorzystać do rozwiązywania podstawowych i translacyjnych pytań.

Wprowadzenie

Ruch, oddychanie, metabolizm, postawa ciała i utrzymanie temperatury ciała zależą od mięśni szkieletowych, a nieprawidłowe działanie mięśni szkieletowych może powodować wyniszczające patologie (np. miopacie, dystrofie mięśniowe, itp.)1. Ze względu na swoje podstawowe funkcje i obfitość, mięśnie szkieletowe przyciągnęły uwagę laboratoriów badawczych na całym świecie, które starają się zrozumieć kluczowe aspekty, które wspierają prawidłowe funkcjonowanie mięśni i mogą służyć jako cele terapeutyczne. Ponadto mięśnie szkieletowe są szeroko stosowanym modelem do badania regeneracji i funkcji komórek macierzystych, ponieważ zdrowe mięśnie mogą w pełni samonaprawiać się po całkowitym urazie i zwyrodnieniu, głównie dzięki rezydującym komórkom macierzystym2; Są one również nazywane komórkami satelitarnymi i są zlokalizowane pod blaszką podstawną na obrzeżach włókien mięśniowych3.

Podstawowymi komórkami dorosłego mięśnia szkieletowego są włókna mięśniowe (długie syncytialne komórki wielojądrzaste) i komórki satelitarne (komórki macierzyste o potencjale miogennym, które pozostają w stanie spoczynku, dopóki uraz ich nie aktywuje). Te ostatnie komórki są centralnymi komórkami regeneracji mięśni, a proces ten nie może zachodzić pod ich nieobecność4,5,6,7. W ich bezpośrednim mikrośrodowisku istnieje wiele typów komórek i czynników molekularnych, które wysyłają im sygnały. Ta nisza jest stopniowo ustanawiana przez cały okres rozwoju i aż do dorosłości8. Dorosły mięsień zawiera wiele typów komórek (komórki śródbłonka, perycyty, makrofagi, fibro-adipogenne komórki progenitorowe-FAP, regulatorowe limfocyty T itp.)9,10 i składniki macierzy zewnątrzkomórkowej (lamininy, kolageny, fibronektyna, fibryliny, periostyna itp.)11, które oddziałują ze sobą i z komórkami satelitarnymi w kontekście zdrowia, choroby i regeneracji.

Zachowanie tej skomplikowanej niszy w warunkach eksperymentalnych jest fundamentalne, ale trudne. Równie trudne jest utrzymanie lub powrót do stanu spoczynku, stanu komórki, który jest krytyczny dla komórek satelitarnych9. Aby częściowo poradzić sobie z tymi wyzwaniami, wprowadzono kilka metod, z których każda ma swoje zalety i wady (szczegółowo opisane w części poświęconej dyskusji). W tym miejscu przedstawiono metodę, która może częściowo pokonać te dwie bariery. Mięśnie są początkowo zbierane, a następnie rozkładane mechanicznie i enzymatycznie, zanim heterogeniczna mieszanina komórek zostanie wprowadzona do hodowli. W trakcie hodowli wykrywa się wiele typów komórek niszy i obserwuje się komórki satelitarne, które powróciły do stanu spoczynku. Jako ostatni etap protokołu przedstawiono etapy immunofluorescencji, które pozwalają na wykrycie każdego typu komórek za pomocą powszechnie akceptowanych markerów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty były zgodne z francuskimi i unijnymi przepisami dotyczącymi zwierząt w Institut Mondor de Recherche Biomédicale (INSERM U955), w szczególności z dyrektywą 2010/63/UE. Zwierzęta były utrzymywane w kontrolowanym i wzbogaconym środowisku w zwierzętnikach z numerami certyfikatów A94 028 379 oraz D94-028-028; były one obsługiwane wyłącznie przez uprawnionych badaczy i opiekunów zwierząt, a personel odpowiedzialny za zakwaterowanie zwierząt przeprowadzał regularne inspekcje wzrokowe pod kątem oznak dyskomfortu w trakcie ich życia. Eutanazję przeprowadzono poprzez zwichnięcie karku przed sekcją. W trakcie życia zwierząt nie wykonywano żadnych procedur interwencyjnych, w związku z czym uzyskanie zgody na procedurę od Komitetu Etyki oraz francuskiego Ministerstwa Szkolnictwa Wyższego, Badań i Innowacji nie było konieczne. Rzeczywiście, zgodnie z dyrektywą 2010/63/UE, eutanazja i sekcja pośmiertna nie wymagają zgody komisji etycznej. Wyniki przedstawione w niniejszym manuskrypcie pochodzą z linii typu dzikiego C57BL/6NRj (patrz Tabela materiałów) oraz linii transgenicznej Tg:Pax7-nGFP12 (hodowanej przez nasz zespół). Protokół zastosowano u myszy samców i samic w wieku od 8 do 12 tygodni.

1. Przygotowanie odczynników i sprzętu przed trawieniem

  1. Spryskaj narzędzia do sekcji (nożyczki proste i zakrzywione, pęsety, patrz Tabela materiałów) 70% etanolem i osusz je papierem. Okładkę korkową pokryj folią aluminiową i przygotuj w pobliżu szalki Petriego o średnicy 10 cm (jedna na zwierzę). Przygotuj papier oraz 70% etanol w zasięgu ręki.
    UWAGA: Po zakończeniu sekcji opłucz narzędzia wodą, następnie spryskaj je 70% etanolem i osusz papierem.
  2. Ustaw rotacyjną łaźnię wodną na 37 °C i przygotuj mieszaninę do trawienia (20 mL/zwierzę), łącząc DMEM z 1% penicyliną-streptomycyną, 0,5 U/mL kolagenazą, 3 U/mL dispazą (patrz Tabela materiałów) oraz 0,2% BSA w probówce(ach) o pojemności 50 mL.
  3. Przefiltruj mieszaninę do trawienia przez filtr 0,22 µm w komorze do hodowli komórek.
    UWAGA: Zaleca się każdorazowe przygotowywanie świeżej mieszaniny do trawienia.

2. Przygotowanie odczynników i sprzętu po trawieniu

  1. Po trawieniu mieszaninę można zamrozić lub poddać hodowli. Do zamrażania należy przygotować roztwór 10% DMSO i 90% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz zestaw krioprotek (1 mL zawiesiny komórkowej na każdą krioprotubkę o pojemności 2 mL). Do hodowli należy przygotować pożywkę hodowlaną (DMEM uzupełniony o 1% pencylyny-streptomycyny, 4 ng/mL bFGF oraz 20% FBS) oraz zestaw płytek 8-dołkowych. Płytki muszą zostać pokryte odpowiednią warstwą przed wysianiem komórek (szczegóły znajdują się w kroku 7.1).
  2. Do barwienia należy przygotować 4% paraformaldehyd (PFA) w buforze fosforanowym (PBS) (0,15 mL/dołek płytki 8-dołkowej) oraz roztwór blokujący (5% albuminy surowicy bydlęcej [BSA] bez IgG w PBS; 0,15 mL/dołek płytki 8-dołkowej).
    OSTROŻNIE: Nie wdychać proszku PFA; należy go przygotowywać i obchodzić się z nim pod wyciągiem chemicznym.

3. Disekcja

  1. Spryskaj uśpione zwierzę 70% etanolu. Wykonaj dużymi nożyczkami poziome nacięcie (od lewej do prawej strony ciała) na wysokości brzucha, a następnie przetnij skórę wokół talii. Odsuń skórę z kończyn tylnych, aby odsłonić mięśnie (Rysunek 1A).
  2. Umieść zwierzę na korkowej płytce pokrytej folią aluminiową i przypnij przeciwległą kończynę przednią oraz tylną. Szybko usuń wszystkie mięśnie kończyny tylnej (przednie i tylne) do 10 cm płytki Petriego umieszczonej na lodzie (Rysunek 1B,C). Zachowaj szczególną ostrożność podczas usuwania tkanki tłuszczowej z obszarów wokół mięśnia czworogłowego i mięśni tylnych. Na tym etapie można również usunąć powięź, nerwy i ścięgna, o ile nie wydłuży to całkowitego czasu sekcji.
    UWAGA: Optymalny czas sekcji obu kończyn tylnych powinien wynosić około 15-20 min. Zaleca się, aby czas sekcji nie przekroczył 30 min.
  3. Od czasu do czasu dodawaj krople DMEM do mięśni, aby utrzymać ich wilgotność, ale nie w nadmiarze, ponieważ utrudni to rozdrabnianie. Powtórz czynność dla drugiej kończyny tylnej. Gdy wszystkie mięśnie jednego zwierzęcia znajdą się w płytce Petriego (Rysunek 1D), siekaj je drobno nożyczkami przez 7-10 min, aż do uzyskania gładkiego homogenatu (Rysunek 1E).
    UWAGA: W niniejszym protokole zastosowano DMEM uzupełniony o L-glutaminę, pirowinian oraz 4,5 g/L D-glukozy.

Zdjęcia z sekcji przedstawiające ekstrakcję i przetwarzanie tkanek do analizy biologicznej; obejmuje próbki na lodzie.
Rycina 1: Przygotowanie mięśni przed hodowlą. (A) Usunięcie skóry w celu odsłonięcia mięśni kończyny tylnej, zgodnie z opisem w kroku 3.1. (B,C) Pobranie wszystkich mięśni kończyny tylnej (B) wokół oraz (C) pomiędzy kości, zgodnie z opisem w kroku 3.2. (D) Pobrane mięśnie umieszczono w szalce Petriego o średnicy 10 cm na lodzie z kroplami DMEM w celu utrzymania ich wilgotności, zgodnie z opisem w kroku 3.3. (E) Mięśnie są drobno siekane nożyczkami aż do uzyskania gładkiej papki o konsystencji przedstawionej na zdjęciu. (F) Obraz osadu po końcowym wirowaniu; niebieska strzałka wskazuje osad znajdujący się przy ściance probówki, pod przerywaną niebieską linią. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Trawienie

UWAGA: Pod koniec procesu trawienia do sekcji 5 będą potrzebne: wirówka ustawiona na 4 °C, wiadro z lodem, trzy sitka do komórek (100 um, 70 um, 40 um) oraz trzy probówki 50 mL (na zwierzę).

  1. Przygotować i przefiltrować mieszaninę trawienną zgodnie z opisem w kroku 1.2. Mieszaninę przechowywać w lodzie.
  2. Po posiekaniu wszystkich mięśni, umieścić homogenat w probówce o pojemności 50 mL z 20 mL mieszaniny trawiennej. Brzegi zakrętki owinąć folią elastyczną, aby zapobiec wyciekom, a następnie umieścić probówkę w wytrząsanej kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przy niskiej lub średniej prędkości (50 rpm).
  3. Po 1 h w temperaturze 37 °C otworzyć zakrętkę i wymieszać zawartość, delikatnie pipetując siedem razy w górę i w dół za pomocą pipety 10 mL, aby uzyskać jednorodną mieszaninę. Ponownie owinąć zakrętkę folią i umieścić probówkę z powrotem w wytrząsanej kąpieli wodnej. Po kolejnej 1 h wyjąć probówkę i wyłączyć kąpiel wodną.
    UWAGA: W przypadku hodowli wykorzystać ten czas inkubacji na pokrycie płytek zgodnie z opisem w kroku 7.1 przed przejściem do sekcji 5.

5. Filtracja

  1. Napełnić probówkę do trawienia zimnym DMEM (uzupełnionym o 1% penicyliny-streptomycyny) do poziomu 50 mL. Wymieszać, odwracając probówkę trzy razy. Przechowywać DMEM w wiadrze z lodem do kolejnych etapów.
  2. Umieścić sitko komórkowe 100 µm na nowej probówce 50 mL. Przesiać trawioną mieszaninę przez sitko do nowej probówki. Odwirować przy 600 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Odlać nadsącz do pojemnika na odpady płynne.
  3. Resuspendować osad w 1 mL zimnego DMEM (uzupełnionego o 1% penicyliny-streptomycyny). Dopełnić probówkę do 50 mL tym samym DMEM. UWAGA: Jeśli pominiemy wirowanie, kolejny osad będzie trudniejszy do zidentyfikowania i utrzymania.
  4. Umieścić sitko komórkowe 70 µm na nowej probówce 50 mL. Przesiać odwirowaną/resuspendowaną mieszaninę przez sitko do nowej probówki. Odwirować przy 80 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Ten krok nie jest obowiązkowy, ale jest zalecany w celu usunięcia szczątków komórkowych.
  5. Umieścić sitko komórkowe 40 µm na nowej probówce 50 mL. Przesiać nadsącz przez sitko do nowej probówki. Odwirować przy 600 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C, odlać nadsącz do pojemnika na odpady płynne i resuspendować osad w FBS pod dygestorium. Na tym etapie osad jest bardzo mały (Rycina 1F).
    UWAGA: Filtrowanie przez sitko 40 µm usuwa zanieczyszczenia, które mogłyby generować nieswoisty sygnał podczas późniejszego barwienia kultur.

6. (Opcjonalnie) Mrożenie

UWAGA: Sekcja 6 jest opcjonalna. Protokół można przerwać po filtracji, jednak może to zmniejszyć przeżywalność komórek i sukces hodowli.

  1. Dodać DMSO, aby uzyskać stosunek 10% DMSO:90% FBS, a następnie przenieść do kryoprobówek (1 mL resuspenderowanego osadu na każdą probówkę o pojemności 2 mL).
  2. Umieścić kryoprobówkę w temperaturze −80 °C w pudełku polistyrenowym na noc. Następnego dnia przenieść do temperatury −150 °C w celu długoterminowego przechowywania.
    UWAGA: Możliwe jest również krótkoterminowe przechowywanie w temperaturze −80 °C.
  3. Przy rozpoczynaniu hodowli szybko rozmrozić kryoprobówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż zawiesina komórkowa zostanie całkowicie rozmrożona. W dygestorium wymieszać z 4 mL DMEM. Wirować przy 600 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Odpipetować supernatant i kontynuować zgodnie z opisem w kroku 7.2.

7. Hodowla

UWAGA: Można oczekiwać, że zamrożone lub świeże zawiesiny komórkowe wypełnią 24–32 studzienki w trzech lub czterech płytkach 8-dołkowych.

  1. Pokryj płytki 8-dołkowe roztworem do powlekania, który należy rozmrozić w temperaturze 4 °C lub na lodzie (roztwór zapasowy do powlekania jest zazwyczaj przechowywany w temperaturze −20 °C). Dodaj 0,4 mL roztworu do jednego dołka, a następnie przenoś go pipetą z dołka do dołka. Po przeniesieniu roztworu do wszystkich dołków można go zebrać i ponownie zamrozić do przyszłych hodowli. Inkubuj powlekane płytki w temperaturze 37 °C przez 30 min przed wysianiem komórek.
  2. Dodaj DMEM (uzupełniony o 1% penicyliny-streptomycyny) z dodatkiem 4 ng/mL bFGF (patrz Tabela materiałów) do zawiesiny komórek w FBS, aby uzyskać stosunek 20% FBS:80% DMEM.
    UWAGA: Chociaż dodatek bFGF może być korzystny w pierwotnych hodowlach mioblastów i przy produkcji komórek podobnych do satelitarnych w hodowlach masowych, jego dodatek jest opcjonalny, ponieważ pominięcie go w hodowlach masowych trwających ok. 7 dni nie wpływa znacząco na wydajność komórkową.
  3. Wysiej 0,4 mL zawiesiny (z kroku 7.2) na dołek w powlekanych płytkach 8-dołkowych.
    UWAGA: Oblicz 30 cm2 hodowli na jedno zwierzę dla preparatów mrożonych i świeżych.
  4. Inkubuj hodowle w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez maksymalnie 10 dni, wymieniając medium codziennie, gdy hodowla zacznie zmieniać kolor na żółtawy (zazwyczaj po 5-7 dniach).
    UWAGA: Aby zmierzyć ilość komórek w fazie S cyklu komórkowego13, dodaj 10 µM EdU na 2 h przed utrwaleniem. Aby uchwycić pierwszą fazę S, dodaj 10 µM EdU podczas wysiewania i utrwal po 40 h hodowli.

8. Fixacja

UWAGA: Etapy 8-10 należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.

  1. Odessać pożywkę hodowlaną i utrwalić komórki za pomocą 4% PFA (0,15 mL/studzienkę).
    OSTRZEŻENIE: PFA należy dodawać pod wyciągiem chemicznym.
    UWAGA: Jeśli wszystkie studzienki są utrwalane w tym samym czasie, inkubować z PFA w temperaturze pokojowej przez 10 min. Jeśli studzienki są utrwalane w różnych punktach czasowych, dodać PFA do studzienek przeznaczonych do utrwalenia i przechowywać płytkę w inkubatorze w 37 °C przez 5 min.
  2. Odessać PFA i dodać PBS na 10 s (0,15 mL/studzienkę). Odessać PBS i dodać świeży PBS na 5 min (0,15 mL/studzienkę).
    UWAGA: Jeśli wszystkie studzienki są utrwalane w tym samym czasie, inkubować z PBS w temperaturze pokojowej. Jeśli studzienki są utrwalane w różnych punktach czasowych, dodać PBS do utrwalonych studzienek i przechowywać płytkę w inkubatorze w 37 °C przez 5 min. Następnie dodać 0,4 mL PBS i przechowywać płytkę w inkubatorze do 1 tygodnia.

9. Permeabilizacja i blokowanie

  1. Przed przystąpieniem do barwienia odessać PBS i przeprowadzić permeabilizację przy użyciu 0,5% TritonX 100 w PBS (0,15 mL/dołek) przez 8 min. Odessać TritonX 100, wypłukać PBS przez 10 s (0,15 mL/dołek), odessać PBS i przemyć PBS przez 5 min (0,15 mL/dołek).
  2. Zablokować próbki, stosując 5% BSA bez IgG w PBS przez 30-60 min (0,15 mL/dołek).

10. Barwienie

  1. Odssać BSA i dodać mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w PBS (0,15 mL/dołek) (patrz Tabela materiałów; rozcieńczenia: anti-CD31 1:100, anti-FOSB 1:200, anti-GFP 1:1,000, anti-KI67 1:1,000, anti-MyHC 1:400, anti-MYOD 1:200, anti-MYOG 1:150, anti-PAX7 1:100, anti-PDGFRa 1:50) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Po inkubacji z przeciwciałami zebrać mieszaninę przeciwciał, dodać azydek sodu i przechowywać w temperaturze 4 °C lub −20 °C (zgodnie z instrukcjami producenta przeciwciał) do ponownego użycia.
  2. Odssać mieszaninę przeciwciał, wypłukać PBS przez 10 s (0,15 mL/dołek), odessać PBS i przemyć PBS przez 5 min (0,15 mL/dołek).
  3. Odssać PBS użyty do mycia, dodać mieszaninę przeciwciał wtórnych (kozie anty-mysie Alexa Fluor 488, kozie anty-królicze Alexa Fluor 555, kozie anty-szczurze Alexa Fluor 647, kozie anty-mysie Alexa Fluor 555, kozie anty-kurze Alexa Fluor 488, wszystkie stosowane w rozcieńczeniach od 1:500 do 1,000) oraz marker jąder komórkowych (np. DAPI) rozcieńczone w PBS (0,15 mL/dołek) (patrz Tabela materiałów) i inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
  4. Odssać mieszaninę przeciwciał wtórnych, wypłukać PBS przez 10 s (0,15 mL/dołek), odessać PBS, przemyć PBS przez 5 min (0,15 mL/dołek), odessać PBS i zamontować preparat.
    UWAGA: W przypadku użycia płytek 8-dołkowych z wyjmowanymi separatorami, należy usunąć separatory przed montowaniem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół umożliwia hodowlę komórek mięśniowych przy jednoczesnym zachowaniu komórek satelitarnych i większości komórek w ich endogennej niszy. Rysunek 2 przedstawia podsumowanie głównych etapów protokołu, natomiast kluczowe części sekcji i trawienia zaprezentowano na Rysunku 1. Zaleca się sekcję mięśni kończyny tylnej (Rysunek 1A-C), ponieważ grupa ta jest dobrze przebadana i wykazuje wspó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Funkcjonowanie mięśni szkieletowych u dorosłych osób opiera się na precyzyjnie zaaranżowanym zestawie interakcji komórkowych i sygnałów molekularnych. W tym miejscu przedstawiono metodę, która pozwala na badanie tych parametrów w warunkach ex vivo , które bardzo przypominają fizjologiczne mikrośrodowisko.

Kilka grup opisało metody in vitro do hodowli komórek miogennych. Metody te miały na celu wyizolowanie komórek satelitarnych w celu zbadania ich miogennych właściwości proge...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dla rysunku 2 użyto szablonów z Servier Medical Art (https://smart.servier.com/). Laboratorium FR jest wspierane przez Association Française contre les Myopathies - AFM za pośrednictwem TRANSLAMUSCLE (granty 19507 i 22946), Fondation pour la Recherche Médicale - FRM (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), Agence Nationale pour la Recherche - ANR (ANR-21-CE13-0006-02, ANR-19-CE13-0010, ANR-10-LABX-73) oraz La Ligue Contre le Cancer (IP/SC-17130). Wyżej wymienieni fundatorzy nie odegrali żadnej roli w projektowaniu, gromadzeniu, analizie, interpretacji lub raportowaniu tego badania lub pisaniu tego manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
anty-CD31BD550274rozcieńczenie 1:100
anty-FOSBSanta Cruzsc-7203rozcieńczenie 1:200
anty-GFPAbcamab13970rozcieńczenie 1:1000
anty-Ki67Abcamab16667rozcieńczenie 1:1000
anty-MyHCDSHBMF20-crozcieńczenie 1:400
anty-MYODAktywny motyw39991rozcieńczenie 1:200
anty-MYOGSanta Cruzsc-576rozcieńczenie 1:150
anty-Pax7Santa Cruzsc-81648rozcieńczenie 1:100
anty-PDGFR&alfa;InvitrogenPA5-16571rozcieńczenie 1:50
b-FGFPeprotech450-33stężenie 4 ng/ml
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) – stosowana do trawienia Sigma AldrichA7906-1006stężenie 0,2%
BSA Bez IgG, bez proteaz – używany do barwieniaJackson ImmunoResearch001-000-162stężenie 5%
Sitko do komórek 40 umDominique Dutscher352340
Sitko do komórek 70 umDominique Dutscher352350
Sitko do komórek 100 umDominique Dutscher352360
KolagenazaRoche10103586001stężenie 0,5 U/ml
Płytka hodowlanaSarstedt94.6140.802
Dimetylosulfotlenek (DMSO)EuromedexUD8050-05-A
Stężenie 4942078001 DyspazyRoche3 U/ml
Kleszcze preparacyjne rozmiar 5Narzędzia do nauki precyzyjnej91150-20
Kleszcze preparacyjne rozmiar 55Fine Science Tools11295-51
Nożyczki do preparowania (duże, proste)Fine Science Tools9146-11idealne do siekania
Nożyczki do rozwarstwiania (małe, zakrzywione)Fine Science Tools15017-10
Nożyczki do preparowania (małe, proste)Fine Science Tools14084-08
Zmodyfikowany Dulbecco Eagle's Medium (DMEM)ThermoFisher41966-029
Zestaw EdU Click-iTThermoFisherC10340
Surowica bydlęca dla płodu – opcja 1EurobioCVF00-01
Surowica bydlęca dla płodu – opcja 2Gibco10270-106 
MatrigelCorning Life Sciences354234roztwór do powlekania
ParafilmDominique Dutscher090261elastyczna folia
Paraformaldehyd – opcja 1PanReac AppliChem ITW Odczynniki211511.1209stężenie 4%
Paraformaldeyde – opcja 2ThermoFisher28908stężenie 4%
Penicylina streptomycynaGibco15140-122
Kąpiel wodna z wytrząsaniemThermoFisherTSSWB27
TritonX100Sigma AldrichT8532-500 MLstężenie 0,5%
Myszy typu dzikiegoJanvierC57BL/6NRj

Bibliografia

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Forcina, L., Cosentino, M., Musarò, A. Mechanisms regulating muscle regeneration: Insights into the interrelated and time-dependent phases of tissue healing. Cells. 9 (5), 1297(2020).
  3. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
  4. Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
  5. McCarthy, J. J., et al. Effective fiber hypertrophy in satellite cell-depleted skeletal muscle. Development. 138 (17), 3657-3666 (2011).
  6. Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
  7. Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
  8. Hicks, M. R., Pyle, A. D. The emergence of the stem cell niche. Trends in Cell Biology. 33 (22), 112-123 (2022).
  9. Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692(2021).
  10. Gama, J. F. G., et al. Role of regulatory T cells in skeletal muscle regeneration: A systematic review. Biomolecules. 12 (6), 817(2022).
  11. Loreti, M., Sacco, A. The jam session between muscle stem cells and the extracellular matrix in the tissue microenvironment. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 16(2022).
  12. Sambasivan, R., et al. Distinct regulatory cascades govern extraocular and pharyngeal arch muscle progenitor cell fates. Developmental Cell. 16 (6), 810-821 (2009).
  13. Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
  14. Bismuth, K., Relaix, F. Genetic regulation of skeletal muscle development. Experimental Cell Research. 316 (18), 3081-3086 (2010).
  15. Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite cells and the muscle stem cell niche. Physiological Reviews. 93 (1), 23-67 (2013).
  16. Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
  17. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: From the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
  18. Abou-Khalil, R., Le Grand, F., Chazaud, B. Human and murine skeletal muscle reserve cells. Stem Cell Niche. 1035, 165-177 (2013).
  19. Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2011).
  20. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  21. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
  22. Qu, Y., Edwards, K., Barrow, J. Isolation, culture, and use of primary murine myoblasts in small-molecule screens. STAR Protocols. 4 (2), 102149(2023).
  23. Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: Background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2011).
  24. Saclier, M., Theret, M., Mounier, R., Chazaud, B. Effects of macrophage conditioned-medium on murine and human muscle cells: analysis of proliferation, differentiation, and fusion. Methods in Molecular Biology. 1556, 317-327 (2017).
  25. Giordani, L., et al. High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations. Molecular Cell. 74 (3), 609-621 (2019).
  26. Tabula Muris Consortium et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  27. Brunetti, J., Koenig, S., Monnier, A., Frieden, M. Nanopattern surface improves cultured human myotube maturation. Skeletal Muscle. 11 (1), 12(2021).
  28. Denes, L. T., et al. Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation. Skeletal Muscle. 9 (1), 17(2019).
  29. LaFramboise, W. A., et al. Effect of muscle origin and phenotype on satellite cell muscle-specific gene expression. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (10), 1307-1318 (2003).
  30. Azhar, M., Wardhani, B. W. K., Renesteen, E. The regenerative potential of Pax3/Pax7 on skeletal muscle injury. Journal of Generic Engineering and Biotechnology. 20 (1), 143(2022).
  31. Hardy, D., et al. Comparative study of injury models for studying muscle regeneration in mice. PLoS One. 11 (1), e0147198(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kultura mięśnia szkieletowegokomórki macierzyste mięśnikomórki satelitarnenisza mięśniowakultura ex vivoimmunobarwienieamplifikacja komórekfluorescencyjne sortowanie komórek aktywowane laseremsekwencjonowanie pojedynczych komórek
Niefrakcjonowana masowa hodowla mięśni szkieletowych myszy w celu podsumowania spoczynku niszy i komórek macierzystych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.