Artykuł metodologiczny

Profilowanie polimerów w mikromacierzy (MAPP) do wysokoprzepustowej analizy glikanów

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65443

⸱

29 września 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biology, School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 2Institute of Microbiology and Infection, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 3Department of Plant and Soil Sciences, Faculty of Agriculture, Chiang Mai University

W tym artykule

Podsumowanie

Profilowanie polimerów w mikromatrycach (MAPP) to wysokoprzepustowa technika analizy składu glikanów w próbkach biologicznych.

Streszczenie

Profilowanie polimerów mikromatrycowych (MAPP) to solidne i powtarzalne podejście do systematycznego określania składu i względnej obfitości glikanów i glikokoniugatów w różnych próbkach biologicznych, w tym w tkankach roślinnych i glonowych, materiałach spożywczych oraz próbkach ludzkich, zwierzęcych i mikrobiologicznych. Technologia mikromacierzy stanowi podstawę skuteczności tej metody, zapewniając zminiaturyzowaną, wysokowydajną platformę przesiewową, umożliwiającą jednoczesne scharakteryzowanie tysięcy interakcji między glikanami a wysoce specyficznymi sondami molekularnymi skierowanymi na glikany, przy użyciu tylko niewielkich ilości analitów. Składniki glikanów są frakcjonowane chemicznie i enzymatycznie, a następnie sekwencyjnie ekstrahowane z próbki i bezpośrednio unieruchamiane na membranach nitrocelulozowych. Skład glikanów jest określany przez przyłączenie specyficznych sond molekularnych rozpoznających glikany do wymuszonych i wydrukowanych cząsteczek. MAPP jest uzupełnieniem konwencjonalnych technik analizy glikanów, takich jak analiza monosacharydów i sprzężeń oraz spektrometria mas. Jednak sondy molekularne rozpoznające glikany zapewniają wgląd w konfiguracje strukturalne glikanów, co może pomóc w wyjaśnieniu interakcji biologicznych i ról funkcjonalnych.

Wprowadzenie

Glikany są wszechobecne we wszystkich dziedzinach życia i wykazują niezrównaną różnorodność pod względem struktury i funkcji w porównaniu do innych makromolekuł1. Jednak ze względu na ich złożoność, zmienność biosyntezy i wiązań glikozydowych oraz niedostatek odpowiednich metod do preparowania struktur glikanów, nasze zrozumienie tej różnorodności struktur i funkcji jest stosunkowo ograniczone2.

Wiele technik analizy glikanów jest destrukcyjnych i wymaga rozkładu glikanów na ich składowe monosacharydy, co może zaciemniać istotne konteksty trójwymiarowe i biologiczne3. I odwrotnie, przeciwciała monoklonalne (mAb), moduły wiążące węglowodany (CBM), lektyny, aglutyniny wirusowe i adhezyny mikrobiologiczne, znane łącznie jako sondy molekularne rozpoznające glikany (GRMPs)4, rozpoznają i wiążą się z określonymi epitopami i mogą być używane jako narzędzia do wykrywania i rozróżniania glikanów w złożonych matrycach wieloglikanowych5,6.

Tutaj prezentujemy profilowanie polimerów mikromatrycowych (MAPP), szybką, wszechstronną i nieniszczącą metodę analizy glikanów, która ma zastosowanie do szerokiego spektrum próbek biologicznych. Metoda ma na celu zapewnienie solidnej i wysokowydajnej technologii do analizy glikanów z różnych systemów biologicznych i przemysłowych/komercyjnych. MAPP łączy w sobie specyficzność rozpoznawania sond molekularnych skierowanych na glikan z powtarzalną, wysokowydajną technologią badań przesiewowych mikromacierzy, aby umożliwić równoległe profilowanie tysięcy interakcji molekularnych. Wynikiem tego podejścia jest diagnostyczny wgląd w skład i względną obfitość glikanów w próbce lub tkance będącej przedmiotem zainteresowania.

MAPP może być używany jako niezależna, samodzielna metoda, lub w połączeniu z innymi technikami biochemicznymi, takimi jak mikroskopia immunofluorescencyjna7,8,9 i analiza monosacharydów lub sprzężeń10,11. Technika ta może być również wykorzystana do mapowania specyficzności epitopowej nowych GRMP przy użyciu tablic wydrukowanych z czystymi i strukturalnie dobrze zdefiniowanymi standardami oligosacharydów12. Główną przewagą MAPP nad innymi metodami, takimi jak test immunoenzymatyczny (ELISA), jest jego kompatybilność z małymi objętościami próbek13,14. Co więcej, MAPP oferuje znacznie wyższą przepustowość analizy15 i zapewnia efektywną formę konserwacji próbek, ponieważ wydrukowane próbki są suche i stabilne po unieruchomieniu na nitrocelulozie16.

Wiązanie GRMP jest generalnie zależne od obecności wielu sąsiadujących ze sobą reszt cukru, które wspólnie tworzą miejsce wiązania (epitop), które jest unikalne dla określonej klasy polisacharydów (ksylanu, mannanu, ksyloglukanu, itp.)17. W przeciwieństwie do tego, poszczególne reszty cukru (ksyloza, mannoza, glukoza), które są określane ilościowo za pomocą większości technik biochemicznych, na przykład składu monosacharydów lub analizy metylacji, mogą być składnikami wielu klas polisacharydów, a zatem trudne do przypisania18.

MAPP został opracowany w odpowiedzi na lukę technologiczną, a mianowicie możliwość szybkiej analizy wielu glikanów z różnych źródeł przy użyciu małych ilości materiału. MAPP czerpie korzyści z obszernego repertuaru GRMP, które zostały opracowane i scharakteryzowane w ciągu ostatnich trzech dekad12,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. Rozwój MAPP był procesem iteracyjnym, w którym technika była stale udoskonalana i optymalizowana. Obecnie istnieje obszerna literatura opisująca zastosowanie MAPP w różnych systemach naturalnych i przemysłowych, w których glikany odgrywają główną rolę 5,6,9,10,21,33,34,35,36,37,38,39. W tym miejscu opisujemy aktualny stan wiedzy w zakresie MAPP.

Protokół

Główne etapy eksperymentalne metody MAPP są podsumowane w Rysunek 1.

1. Przygotowanie próbek

UWAGA: Tutaj metoda jest stosowana do tkanek roślinnych w celach ilustracyjnych. Wybrano Coffea arabica, Allium sativum var. ophioscorodon i kilka tajskich odmian mango (Aokrong, Kam, Rad, Chokanan, Mamkamdang, Talabnak, Mahachanok i Nga). Rośliny zostały wybrane ze względu na ich znaczenie handlowe. Ich przetwarzanie do spożycia przez ludzi generuje obecnie niewykorzystane odpady rolno-przemysłowe, które mogą stanowić źródło produktów o wartości dodanej, w tym czystych glikanów. W związku z tym MAPP został zastosowany do scharakteryzowania składu glikanów w biomasie odpadów roślinnych do celów bioprospekcji.

  1. Podziel materiał roślinny na różne tkanki (np. korzeń, łodygę i liście).
  2. Suszyć tkanki roślinne w piecu z gorącym powietrzem w temperaturze 40 °C przez 12-24 godziny (zmniejszyć/zwiększyć czas zgodnie z próbką). Alternatywnie, zatrzaskowo zamroź próbki w ciekłym azocie, a następnie liofilizuj przez ~4 dni.
  3. Homogenizować próbki do postaci drobnego proszku za pomocą tłuczka i moździerza lub mechanicznego lizera tkanek (patrz tabela materiałów) z łożyskiem kulkowym w każdej probówce.
    UWAGA: W przypadku świeżej tkanki roślinnej zaleca się suszenie lub liofilizację przed homogenizacją. Ogólnie rzecz biorąc, homogenizacja za pomocą tłuczka i moździerza jest wystarczająca dla większości suchych próbek. W przypadku szczególnie odpornych próbek, takich jak zboża, rośliny strączkowe i przetworzone produkty spożywcze, takie jak makaron, szybkie zamrażanie w ciekłym azocie może zwiększyć szybkość i wydajność homogenizacji próbki. Odkryliśmy, że homogenizacja mechaniczna jest kompatybilna z prawie wszystkimi typami próbek, jest znacznie szybsza i mniej pracochłonna oraz skutecznie minimalizuje ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego próbki w wyniku wielokrotnego użycia tego samego sprzętu (tj. tłuczka i moździerza).

2. Przygotowanie pozostałości nierozpuszczalnej w alkoholu (POWIETRZE)

  1. Dodać 1,5 ml 70% (v/v) etanolu do 50-100 mg wysuszonego na powietrzu i homogenizowanego materiału próbki.
  2. Dokładnie zmieszać, aby wymieszać, a następnie odwirować przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić powstały supernatant za pomocą pipety i zachować osad.
  3. Do pozostałej osadki dodać 1,5 ml metanolu i chloroformu (1:1 [v/v]). Odwirować, odwirować i odrzucić supernatant, zgodnie z krokiem 2.2.
  4. Do pozostałej osadki dodaj 1,5 ml 100% acetonu. Odwirować, odwirować i odrzucić supernatant, zgodnie z krokiem 2.2.
  5. Powstały osad należy umieścić na noc w dygestorium, aby umożliwić odparowanie pozostałego acetonu lub w wirówce próżniowej do wyschnięcia.
    UWAGA: Materiał AIR może być przechowywany w temperaturze otoczenia do czasu, gdy będzie potrzebny.

3. Ekstrakcja glikanów

UWAGA: Jeśli to możliwe, wykonaj wszystkie etapy ekstrakcji w lizerze tkankowym z łożyskiem kulkowym w każdej probówce, aby ułatwić ponowne wywieszenie. Jeśli lizer tkankowy jest niedostępny, ekstrakcje można przeprowadzić zamiast tego z ciągłym mieszaniem lub wstrząsaniem. Jeśli nie jest to możliwe, może być konieczne wydłużenie czasu ekstrakcji.

  1. Do 10 mg materiału AIR dodać 30 μl/mg 50 mM kwasu cykloheksanodiaminotetraoctowego (CDTA; patrz tabela materiałów), pH 7,5.
  2. Wstrząsać z częstotliwością 27 Hz przez 2 minuty, a następnie z częstotliwością 10 Hz przez 2 godziny.
  3. Wirować przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zachować otrzymany supernatant, dodać go do sterylnej probówki do mikrowirówki i przechowywać w temperaturze 4 °C na wytrząsarce obrotowej.
  4. Do pozostałego osadu dodać 30 μL/mg 4 M NaOH + 0,1 % (w/v) NaBH4,
    UWAGA: NaBH4 jest toksyczny w przypadku połknięcia. Stosować środki ochrony osobistej (PPE). Uchwyt pod wyciągiem. Unikaj tworzenia się kurzu. Unikaj wdychania pyłu. Nie dopuścić do kontaktu produktu z wodą.
  5. Powtórz kroki od 3.2 do 3.3. Przemyć pozostałą osadkę dwa lub trzy razydH2O, aby usunąć resztki NaOH.
  6. Dodać 30 μl/mg celulazy (najlepiej endo-1,4-β-glukanazę GH5, w odpowiednim buforze enzymatycznym - zgodnie z zaleceniami producenta; patrz Tabela Materiałów) do osadu i inkubować w optymalnej dla enzymu temperaturze przez 16 godzin.
  7. Odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zachować supernatant, przenieść do czystych probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze 4 °C na wytrząsarce obrotowej. Po ekstrakcji próbki należy wydrukować tak szybko, jak to możliwe.
  8. Ponownie odwirować wszystkie przechowywane ekstrakty w temperaturze 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Próbki muszą być wolne od cząstek stałych i zanieczyszczeń. W razie potrzeby przepuść przez filtr wirowy 0,2 μm przed drukowaniem mikromacierzy. Szczególnie lepkie próbki są niekompatybilne z analizą mikromacierzy, ponieważ kapilary mikromacierzy i głowica drukująca mogą łatwo ulec zatkaniu. Zgodnie z ogólną zasadą, użytkownicy powinni być w stanie pipetować wszystkie próbki przeznaczone do drukowania za pomocą standardowej pipety o małej objętości.

4. Przygotowanie standardów

  1. Przygotować 1 mg/ml roztwory o określonych wzorcach glikanów (Tabela 1) w sterylnym dH2O. W przypadku stosowania pachymana jako wzorca, zamiast tego rozpuścić w 4 M NaOH i zneutralizować lodowatym kwasem octowym po rozpuszczeniu.
  2. Przygotowane wzorce należy przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce obrotowej, aby umożliwić całkowite rozpuszczenie.
  3. Odwirować wszystkie wzorce przez 10 minut w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C, aby rozdrobnić wszelkie zanieczyszczenia. Otrzymany supernatant jest używany do późniejszego drukowania.

5. Drukowanie mikromacierzy

  1. Przygotować rozcieńczenie 1:20 (v/v) czarnego tuszu indyjskiego/tuszu rysunkowego w buforze systemu glicerolowego (GSB; połączyć 47% glicerolu, 52,9%dH2O, 0,06% Triton X-100 i 0,04% biocydu [0,15%-0,17% azotanu miedzi i 1,4%-2,0% azotanu magnezu w wodzie] i wysterylizować filtr) (patrz tabela materiałów) i odwirować przez 10 minut w temperaturze 15 000 x g (temperatura pokojowa).
    UWAGA: Roztwór atramentu jest niezbędny do utworzenia górnej i dolnej krawędzi wokół drukowanych próbek, tak aby wydrukowane mikromatryce można było wizualnie wykryć na membranie. Jednak roztwór atramentu może zawierać osad. Wszystkie roztwory do drukowania muszą być wolne od cząstek stałych, dlatego należy unikać naruszania osadu podczas pipetowania. Wyrzuć i przygotuj świeże, gdy nie jest to już możliwe. Roztworu nie można łatwo przefiltrować w celu usunięcia cząstek stałych.
  2. Dodać 40 μl roztworu atramentu i GSB do pierwszej sekcji pierwszej płytki 384-dołkowej (Rysunek 2).
  3. Dodać 25 μl GSB do wszystkich studzienek do rozcieńczenia 1 (D1). Dodać 40 μl GSB do wszystkich studzienek rozcieńczonych 2, 3 i 4 (D2-D4).
  4. Rozcieńczyć wyekstrahowane próbki glikanów i zdefiniowane substraty glikanowe w stosunku 1:1 (v/v) za pomocą GSB, dodając 25 μl wyekstrahowanej próbki glikanu do studzienek D1 w kolejności.
  5. Każdą próbkę należy rozcieńczyć seryjnie czterokrotnie, pobierając 10 μl próbki z dołka D1 i dodając do dołka D2. Delikatnie zassać pipetą, aby wymieszać.
  6. Powtórzyć proces, pobierając 10 μl próbki z dołka D2 i dodając ją do dołka D3.
  7. Powtórz dla dołka D4. Po wymieszaniu wyrzucić 10 μl z dołka D4, tak aby każdy studzienka zawierał końcową objętość 40 μl.
  8. Dodać 40 μl roztworu atramentu i GSB do ostatniego bloku końcowej płytki.
  9. Przykryj płytki samoprzylepną pokrywą i odwiruj przez 10 minut w temperaturze 3 000 x g (temperatura pokojowa). Upewnij się, że po odwirowaniu nie pozostały żadne pęcherzyki i powtórz w razie potrzeby.
  10. Za pomocą bezdotykowego robota drukującego mikromacierz piezoelektryczne wydrukuj próbki na membranie nitrocelulozowej (patrz Tabela materiałów), wykonując poniższe czynności.
    UWAGA: Poniżej znajdują się działania zalecane w celu uzyskania optymalnej jakości druku; Jednak konkretne wymagane parametry będą ostatecznie zależeć od zastosowanego instrumentu. Zalecamy, aby użytkownicy skontaktowali się z producentem urządzenia w celu omówienia odpowiednich dostosowań i ustawień drukowania wymaganych dla ich urządzenia.
    1. Przed drukowaniem opróżnij zbiornik buforowy odpadów i w razie potrzeby napełnij czysty zbiornik buforowy czystym GSB. Włącz przyrząd i pozwól mu ustabilizować się przez >10 minut, jeśli ma zintegrowany system kontroli wilgotności i temperatury. Włącz mikromacierz i zainicjuj system.
      UWAGA: Zaleca się przeprowadzenie testu w celu określenia ciśnienia wewnętrznego przyrządu. Jeśli ciśnienie jest zbyt niskie, może być konieczne wykonanie przedmuchiwania pod wysokim ciśnieniem. Ponownie skontaktuj się z producentem przyrządu, aby omówić konkretne działanie konkretnego instrumentu.
    2. Kilkakrotnie wyczyść głowicę drukującą i kapilary za pomocą GSB, aby usunąć zanieczyszczenia i potencjalne zanieczyszczenia. Wykonaj próbny przebieg wydruku, ładując samą płytę GSB lub ustawiając urządzenie tak, aby drukowało bezpośrednio z czystego zbiornika buforowego, omijając aspirację próbki z załadowanej płyty.
      UWAGA: Nie ma konieczności wykonywania wydruku próbnego przy użyciu membrany nitrocelulozowej; Czyste szkiełka mikroskopowe są wystarczające i mają tę zaletę, że wielkość, kształt i jakość plamki można wizualnie ocenić przed wydrukowaniem próbki.
    3. Podczas drukowania wyekstrahowanych próbek glikanów należy zaprogramować system tak, aby przepłukiwał czystą próbką GSB między każdą próbką.
      UWAGA: Zazwyczaj objętość próbki na wydrukowaną plamkę wynosi od 100 pL do 10 nL, a wielkość plamki waha się od 20 μm do 100 μm, w zależności od wybranej objętości próbki. Wydrukowanie 100 mikromacierzy z jednej płytki 384-dołkowej z jednego źródła zajmuje około 40 minut, łącznie z płukaniem systemu. Powstałe mikromacierze będą miały wielkość około 1cm2. Dodatkowe płytki zwiększą długość tablicy o około 1 cm na płytę. Schemat drukowanej mikromacierzy jest pokazany w Rysunek 3. Po wydrukowaniu mikromacierze są natychmiast gotowe do użycia i mogą być przechowywane przez kilka lat. Jeśli z jakiegokolwiek powodu konieczne jest powtórzenie zadania drukowania ze względu na potencjalne odparowanie próbek podczas drukowania, zaleca się załadowanie nowej płytki próbnej i wyrzucenie oryginalnej płyty.
    4. Raz w tygodniu dokładnie wyczyść głowicę drukującą i kapilary. W tym celu należy załadować do 384-dołkowej płytki zawierającej rozcieńczenie stężonego NaOH w stosunku 1:20 do GSB i wykonać druk trwający od 40 minut do 1 godziny na szkiełkach mikroskopowych. Przed kontynuowaniem użytkownicy powinni upewnić się, że ten roztwór czyszczący jest kompatybilny z ich instrumentem.
  11. Zapisz unikalny plik siatki (plik .gal) utworzony dla drukowanej mikromacierzy gotowy do dalszej analizy.

6. Sondowanie mikromacierzy

  1. Wyciąć pojedyncze, identyczne wydrukowane mikromatryce z membrany nitrocelulozowej i umieścić je w naczyniu o odpowiedniej wielkości do sondowania (np. 12- lub 24-dołkowej płytce do mikromiareczkowania) (patrz Tabela materiałów). Tablica powinna leżeć płasko na podstawie naczynia. Na sondę wymagana jest jedna mikromacierz, która reprezentuje jedną replikę techniczną.
  2. Aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie, inkubować mikromacierze przez 1 godzinę w buforze blokującym MP-TBST (1x sól fizjologiczna buforowana Tris, pH 7,5, + 0,1% [v/v] TWEEN 20 [TBST] i uzupełniona 5% [w/v] odtłuszczonym mlekiem w proszku; patrz Tabela Materiałów) na obrotowo-kołyszącej się wytrząsarce. Upewnij się, że wolumin jest wystarczający do zanurzenia całej tablicy.
  3. Po inkubacji należy usunąć MP-TBST i zastąpić go nową objętością MP-TBST.
  4. Inkubować macierze z przeciwciałami monoklonalnymi (mAb) lub CBM znakowanymi His lub innymi GRMP (np. lektynami), rozcieńczonymi w stosunku 1:10-1:1,000 (zgodnie ze specyfikacją producenta; patrz tabela materiałów) w MP-TBST przez 2 godziny na obrotowej/kołyszącej się wytrząsarce.
  5. Po inkubacji wyjmij roztwór sondy molekularnej i przykryj matryce czystym TBST, upewniając się, że matryce są całkowicie zanurzone. Aby usunąć resztki roztworu sondy, natychmiast wyjmij TBST i zastąp go nową objętością. Umieść matryce na obrotowym/kołyszącym się wytrząsarce na 5 minut. Po 5 minutach wyjmij TBST, zastąp go nową objętością i umieść na obrotowym/kołyszącym się wytrząsarce na 5 minut.
    UWAGA: Proces ten należy powtórzyć trzy razy, nie wliczając początkowego dodawania i natychmiastowego usuwania TBST.
  6. Inkubować matryce z drugorzędowymi przeciwciałami sprzężonymi z fosfatazą alkaliczną (anty-mysim, anty-szczurzymi, anty-króliczym, anty-His, odpowiednio; patrz Tabela Materiałów) rozcieńczonymi w stosunku 1:1,000 w MP-TBST przez 2 godziny na kołyszącej/obracającej się wytrząsarce.
    UWAGA: Odpowiednie są również przeciwciała drugorzędowe sprzężone z peroksydazą chrzanową, stosowane w połączeniu z substratem tetrametylobenzydyny (TMB)/nadtlenku wodoru w celu uzyskania koloru.
  7. Po inkubacji powtórzyć procedurę mycia, jak w kroku 6.5, w celu usunięcia niespecyficznie związanych przeciwciał drugorzędowych.
  8. Pokryj matryce roztworem do wywoływania barwy tetrazolu (NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu (BCIP) nitro-niebieskiego (NBT) (patrz tabela materiałów) w celu chromogennego wykrywania wiązania przeciwciał. Pozostaw do momentu, aż w miejscach wiązania antygenu rozwiną się fioletowe plamki osadu (zwykle 5-30 minut, jednak tablice powinny być ściśle monitorowane, aby uniknąć przesycenia, ponieważ reakcja może zachodzić szybko).
    UWAGA: BCIP jest szkodliwy w kontakcie ze skórą i może powodować podrażnienie dróg oddechowych. Używaj środków ochrony indywidualnej. Unikaj tworzenia się kurzu. Unikaj wdychania pyłu.
  9. Aby zakończyć reakcję, zanurz matryce w czystej wodzie z kranu i dokładnie umyj.
  10. Umieść tablice między bibułą na noc w temperaturze otoczenia do wyschnięcia.
  11. Odrzuć tablice z oczywistymi defektami i powtórz protokół sondowania w takich przypadkach (Rysunek 4).

7. Analiza i kwantyfikacja

  1. Zeskanuj opracowane tablice w rozdzielczości 2 400 punktów na cal (dpi) za pomocą skanera biurkowego. Konwertuj obrazy na pliki TIFF, a następnie na negatywy.
  2. Korzystając z oprogramowania do analizy mikromacierzy (patrz Tabela materiałów), nałóż unikalny plik siatki .gal na każdy obraz mikromacierzy, aby obliczyć intensywność koloru plamki wytworzonej w każdym miejscu wiązania antygenu i odjąć lokalne tło.
  3. Wyeksportuj dane siatki jako plik .txt. Można je następnie ręcznie zaimportować do arkusza Excela w celu analizy.
  4. Wygeneruj średnią wartość intensywności sygnału punktowego dla każdej próbki, uśredniając intensywność sygnału plamki najpierw dla każdego rozcieńczenia próbki, a następnie dla wszystkich uwzględnionych kontrprób biologicznych.
  5. Przypisz wartość 100 do najwyższej średniej intensywności sygnału punktowego i odpowiednio znormalizuj pozostałe dane.
    UWAGA: Znormalizowane średnie intensywności sygnału punktowego można następnie przedstawić jako mapę cieplną względnej obfitości epitopów glikanów za pomocą funkcji formatowania warunkowego w Excel33 lub za pomocą funkcji geom_tile w R ggplot2 package40,41.

Wyniki

Metodę MAPP zastosowano w celu określenia składu glikanów odpadów z biomasy rolniczej, obejmujących skórki z mango kilku odmian z północnej Tajlandii, miąższ owoców Coffea arabica oraz odpady z przetwarzania ziaren kawy, a także tkanki korzeni, łodyg i liści tajskiego czarnego czosnku, Allium sativum var. ophioscorodon. Kilka polisacharydów pochodzenia roślinnego jest wykorzystywanych w przemyśle spożywczym jako składniki funkcjonalne42,43. Zatem celem niniejszego eksperymentu było ustalenie, czy te obfite i obecnie niewykorzystane materiały odpadowe z przemysłu rolno-spożywczego mogą stanowić źródło czystych polisacharydów o dodanej wartości.

Materiał AIR jest rutynowo stosowany do przygotowywania próbek przeznaczonych do analizy glikanów44. Stosowanie AIR wiąże się z kilkoma zaletami; traktowanie rozpuszczalnikami skutecznie usuwa endogenne CAZymes, metabolity, małe sacharydy, lipidy oraz pigmenty, co pozwala na uzyskanie próbek wzbogaconych w polisacharydy i białka strukturalne34. Ponadto otrzymywanie AIR jest szybkim i skutecznym sposobem na zwiększenie trwałości próbek, ponieważ jest on termostabilny i może być przechowywany przez kilka lat.

Trzy mieszane frakcje glikanów składowych zostały sekwencyjnie wyekstrahowane z materiału roślinnego AIR przy użyciu CDTA, NaOH i celulazy. CDTA chelatuje jony Ca2+, co umożliwia usunięcie usieciolonych jonami Ca2+ odesteryfikowanych pektyn ze ścian komórkowych roślin45. Warunki zasadowe pozwalają na uwolnienie przede wszystkim hemiceluloz, takich jak mannan, ksylan i β-glukan, na skutek przerwania wiązań wodorowych oraz saponifikacji wiązań estrowych odpowiednio między mikrofibryllami celulozy a hemicelulozą oraz między ligniną a hemicelulozą46. Rekombinowana endo-1,4-β-glukanaza z Bacillus spp. została wykorzystana do degradacji obszarów amorficznych strukturalnych mikrofibryll celulozy, co pozwoliło na uwolnienie pozostałych glikanów związanych z celulozą w obrębie ścian komórkowych47. Chociaż metoda ta skutecznie rozdziela glikany na te trzy szerokie grupy, należy zauważyć, że próbki nie są czyste; ze względu na samą naturę metody ekstrakcji, hemiceluloza, jeśli występuje w próbce, zostanie nieuchronnie wyekstrahowana, a następnie wykryta w różnym stopniu w frakcjach CDTA i celulazy. Podobnie, w ekstrakcji NaOH zostanie wykryta pewna ilość pektyny, jeśli jest ona obecna w próbce.

Do unieruchomienia wyekstrahowanych frakcji glikanów na nitrocelulozie poprzez wiązanie niekowalencyjne11 wykorzystano bezkontaktowego, piezoelektrycznego robota do drukowania mikrotablic, tworząc 300 identycznych mikrotablic. W wydrukowanych mikrotablicach uwzględniono również określone standardy glikanów (Tabela 1) jako kontrole pozytywne (Rysunek 5). Profil wiązania MAPP uzyskany dla wybranych standardów glikanów odpowiada wcześniej raportowanym swoistościom epitopów. Na przykład LM21 wykazywał silne wiązanie z wieloma polisacharydami mannanowymi (galaktomannanem i glukomannanem), podczas gdy LM22 wykazywał jedynie słabe wiązanie z galaktomannanem25. Podobnie, LM19 wiązał preferencyjnie odestryfikowany homogalakturonan48, a LM15 wiązał ksyloglukan z nasion tamaryndowca23.

Względna zawartość 16 epitopów, diagnostycznych dla niecelulozowych polisacharydów ścian komórkowych roślin, została określona poprzez wiązanie przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko glikanom (Tabela 2) z naniesionymi ekstraktami (Rysunek 6). Większość wyekstrahowanych glikanów wykryto w alkalicznej frakcji NaOH. Silne sygnały wiązania odnotowano dla przeciwciał mAb LM10 i LM11, reprezentujących ksylan/arabinoksylan, w skórkach wszystkich badanych odmian mango. W próbkach czosnku LM10 i LM11 wiązały się preferencyjnie z ekstraktem z tkanki korzenia (Garlic R) i wykazywały jedynie słabe wiązanie z ekstraktem z tkanki liścia (Garlic L). LM19, reprezentujące częściowo zmetylowany lub niezmetylowany homogalakturonan, wiązało się silnie z ekstraktami z niektórych odmian mango (Aokrong i Talabnak), natomiast wiązało się słabo lub wcale w innych odmianach (Chokanan, Mamkamdang, Mahachanok i Nga). Ponadto LM19 wiązało się tylko z frakcjami miąższu kawowca i nie wiązało się z odpadami z przetwarzania ziaren kawy, które wcześniej uważano za składające się z częściowo oczyszczonej pektyny kawowej (dane nieopublikowane).

Schemat procesu homogenizacji; ekstrakcja glikanów za pomocą CDTA, NaOH, celulazy; analiza mikroarray.
Rysunek 1: Główne etapy eksperymentalne w metodzie MAPP. (A) Próbki są homogenizowane w celu otrzymania drobnych proszków. (B) Zhomogenizowane próbki są przetwarzane w celu wyizolowania zawartych w nich AIR. (C) Składnikowe glikany są sekwencyjnie ekstrahowane przy użyciu dostosowanego schematu ekstrakcji. (D) Wyekstrahowane frakcje glikanów, tusz i GSB są przenoszone do płytek 384-dołkowych, zgodnie z układem płytki, w celu naniesienia na nitrocelulozę. (E) Naniesione mikroarray są sondowane wybranymi GRMP. (F) Wiązanie GRMP z naniesionymi frakcjami glikanów jest kwantyfikowane i analizowane przed przedstawieniem danych w formie mapy ciepła. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres wzoru dzierganego; kolorowa siatka z symbolami, rzędy A-P, kolumny 1-24; sekwencje oczek.
Rycina 2: Przykład układu płytki 384-dołkowej dla załadunku próbek, tuszu i GSB z czterema rozcieńczeniami na każdą próbkę/standard wyekstrahowanego glikanu. Różne kolory oznaczają próbki pochodzące z różnych odczynników do ekstrakcji, natomiast różne odcienie reprezentują rozcieńczenia seryjne. Pierwsza cyfra w kodzie oznacza numer próbki, a ostatnia cyfra oznacza numer rozcieńczenia (D1 oznacza rozcieńczenie pierwsze, D2 rozcieńczenie drugie itd.). Na przykład dołek oznaczony jako „12D3” reprezentuje próbkę glikanu nr 12, rozcieńczenie trzecie. Płytki dołkowe należy podzielić na osiem identycznych sekcji obejmujących sześć kolumn i osiem rzędów. Pierwsza sekcja pierwszej płytki powinna zawierać wyłącznie tusz i bufor i odpowiadać przykładowemu układowi płytki. Następnie próbki wyekstrahowanych glikanów można załadowywać do kolejnych sekcji płytki zgodnie z jej układem. Różne odczynniki do ekstrakcji nie powinny być załadowywane do tej samej sekcji płytki. Jeśli liczba próbek jest niewystarczająca do wypełnienia całej sekcji, należy wypełnić wszystkie pozostałe dołki w tej sekcji buforem; nie należy pozostawiać pustych dołków. W przypadku konieczności użycia wielu płytek, następna sekcja po załadowaniu wszystkich próbek powinna zawierać trzy naprzemienne kolumny tuszu i GSB – w zależności od liczby drukowanych próbek nie musi to być sekcja ósma. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat siatki macierzy; sekwencja numeryczna; edukacyjna reprezentacja danych; metoda analizy tabeli.
Rycina 3: Schematyczna reprezentacja projektu wydrukowanej macierzy mikroarray. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki elektroforezy żelowej; pionowy układ pasków; analiza fragmentacji DNA; schemat doświadczalny.
Rycina 4: Reprezentatywne mikromacierze. (A) Brak wiązania. (B) Sygnał wiązania jest przesłonięty przez wysoki sygnał tła. (C) Uogólnione niebiesko-fioletowe barwienie wynikające z przesycenia NBT/BCIP. (D) Wadliwa hybrydyzacja z powodu wysokiego stężenia substratu. (E) Wadliwy nadruk z powodu nieczystej głowicy drukującej. (F) Silne wiązanie w kilku próbkach. (G) Silne wiązanie w wielu próbkach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Mapa ciepła wiązania polisacharydów; schemat; sondy vs. węglowodany; skala kolorystyczna intensywności wiązania.
Rysunek 5: Wiązanie przeciwciał monoklonalnych do określonych standardów glikanowych, włączone w celu walidacji procesu drukowania i sondowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mapa ciepła wiązania polisacharydów ścian komórkowych roślin za pomocą immunoznakowania; ekstrakcja CDTA, NaOH, celulazą.
Rycina 6: MAPP glikanów ekstrahowanych z odpadów biomasy rolniczej. Próbki obejmują odpady z miąższu kawy (miąższ kawy i pektyna kawowa), skórki z mango kilku tajskich odmian (AO, Aokrong; KO, Kam; RD, Rad; CH, Chokanan; MA, Mamkamdang; TL, Talabnak; MH, Mahachanok; NG, Nga) oraz liście czosnku czarnego (Garlic L), łodygę (Garlic S), cebulę (Garlic BG) i korzenie (Garlic R), przy użyciu CDTA, NaOH i celulazy (Bacillus spp. celulaza 5A). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 1: Zdefiniowane komercyjne wzorce polisacharydowe użyte w analizie MAPP jako kontrole pozytywne. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko glikanom, wybrane do analizy mikrotablic glikanów ekstrahowanych z roślin. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Opisana tutaj technika MAPP jest obecnie dobrze znaną metodą analizy glikanów. Podstawowe zasady zostały po raz pierwszy opisane w 2007 roku11 , ale technika ta była stale rozwijana w celu wykorzystania najnowszych innowacji w technologii mikromacierzy, rozwoju sond molekularnych i postępów w naszym zrozumieniu biochemii glikanów. Ogólnie rzecz biorąc, glikany, zwłaszcza polisacharydy, są trudniejsze do analizy niż białka i nukleotydy ze względu na ich złożoność strukturalną i niejednorodność45, a także fakt, że nie można ich łatwo zsekwencjonować ani zsyntetyzować1. W wielu przypadkach żadna pojedyncza technika nie jest w stanie jednoznacznie rozszyfrować złożoności glikanów; w związku z tym MAPP jest często używany z innymi metodami. Jest to jeden z powodów, dla których przygotowanie AIR jest zwykle wybierane jako punkt wyjścia dla MAPP, ponieważ AIR jest kompatybilne z większością innych metod analizy glikanów34, co ułatwia późniejsze porównywanie zbiorów danych.

Ze względu na homogenizację próbki przed przygotowaniem AIR, niektóre informacje przestrzenne są niezmiennie tracone. Ponieważ jednak polisacharydy są sekwencyjnie uwalniane z próbek, obecność epitopów w otrzymanych frakcjach dostarcza informacji o architekturze molekularnej i składzie tej próbki17. W związku z tym wybór odpowiedniego reżimu ekstrakcji ma kluczowe znaczenie dla powodzenia metody. O przydatności metody ekstrakcji decyduje wiele parametrów: struktura komórkowa, czas, temperatura, pH, ciśnienie, siła jonowa rozpuszczalnika i stopień rozdrobnienia próbki cząstek stałych49. Zaleca się stosowanie szeregu coraz bardziej agresywnych rozpuszczalników w celu maksymalizacji prawdopodobieństwa pomyślnej ekstrakcji glikanów składowych i zbudowania reprezentatywnego obrazu składu próbki. W przypadku większości próbek CDTA, NaOH i celulaza są wystarczające do usunięcia polisacharydów z magazynowania i ścian komórkowych pochodzenia roślinnego 33,50,51,52. W przypadku niektórych próbek tkanek wykazano, że hybrydowy reżim ekstrakcji, który obejmuje również CaCl2, HCl i Na2CO3 3 jest skuteczny53, podczas gdy próbki mikroglonów morskich mogą wymagać dodania kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)10.

Mikromacierze powinny obejmować szereg czystych, określonych wzorców glikanów, które mają być stosowane jako kontrole dodatnie5. Uwzględnione normy powinny być modyfikowane w zależności od charakteru próbki. Po wydrukowaniu należy wybrać odpowiednie GRMP. Generowanie hybrydoma mAb do struktur polisacharydowych jest wyzwaniem54; Przeciwciała wiążące glikany są trudne do wyhodowania i mogą mieć niskie powinowactwo55. Na szczęście informacje o sekwencji genów dla CBM można uzyskać ze względną łatwością dla ekspresji rekombinowanej4 i inżynierii ich specyficzności wiązania56,57. Chociaż opracowano imponujący katalog GRMP, z których większość jest obecnie dostępna ze źródeł komercyjnych, w stosunku do różnorodności struktur glikanowych występujących w przyrodzie, tylko niewielka część z nich została wyprodukowana i pomyślnie scharakteryzowana58. Może to ograniczyć zdolność do wykrywania i rozróżniania niektórych struktur. Zaleca się przeprowadzenie wstępnego eksperymentu pomiarowego przy użyciu jednej lub dwóch sond reprezentatywnych dla każdej przewidywanej struktury glikanu, dla której specyficzność wiązania jest dobrze scharakteryzowana. W kolejnych eksperymentach sondujących lista sond może zostać rozszerzona, aby objąć szerszy zakres glikanów i zagłębić się w drobne struktury.

Chociaż jest to prozaiczne, zapewnienie, że mikromacierze są dokładnie myte po każdym etapie inkubacji, ma fundamentalne znaczenie dla powodzenia procedury sondowania. Nieskuteczne usuwanie niespecyficznie związanych sond prawdopodobnie zaciemni wynik, powodując wysoki sygnał tła po wywołaniu koloru. W takim przypadku konieczne jest powtórzenie procedury sondowania, zaczynając od nowej mikromacierzy. Ponadto tablice należy dotykać oszczędnie i tylko poprzez przytrzymywanie krawędzi kleszczami; Membrana nitrocelulozowa jest krucha i łatwo ulega uszkodzeniu. Roztwór do wywoływania kolorów zbiera się w pęknięciach i zagięciach, powodując przesycenie, co utrudnia analizę tablicy.

MAPP jest szybki, elastyczny i wygodny. Metoda ta jest kompatybilna z glikanami zwierzęcymi, mikrobiologicznymi lub roślinnymi pochodzącymi z dowolnego systemu biologicznego lub przemysłowego, o ile można je wyekstrahować i unieruchomić na nitrocelulozie i do których posiada się odpowiednie sondy molekularne. Wygenerowane dane dostarczają szczegółowych, częściowo ilościowych informacji na temat składu, których nie można łatwo uzyskać za pomocą innych metod analizy glikanów.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować ArrayJet za fachowe porady dotyczące robotyki mikromacierzowej. SS i JS pragną podziękować za wsparcie ze strony Fundamental Fund 2022 (FF65/004), Chiang Mai, University.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,3:1,4-β-D-glukan, porost (mech islandzki)MegazymeP-LICHN
1,4-β-D-MannanMegazymeP-MANCB
384-dołkowa płytka do mikromiareczkowaniaGreiner Bio-OneM1686
5-bromo-4-chloro-3-indolilo-fosforan (BCIP)MelfordB74100-1.0
AcetonSigma270725
Fosfataza alkaliczna AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-055-003
Fosfataza alkaliczna AffiniPure Goat Anti-Rat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch112-055-003
Fosfataza alkaliczna AffiniPure Rabbit Anti-His TagJackson ImmunoResearch300-055-240
Arabinoksylan (pszenica)MegazymeP-WAXYL
Array-Pro Analyzer OprogramowanieMedia CybernetykaWersja 6.3
Bacillus sp. Celulaza 5A (BCel5A)NZYTechCZ0564
BAM przeciwciałaSeaProbesRóżne
tusz do rysowania (tusz indyjski)Winsor & NewtonGWD030
Moduły wiążące węglowodanyNZYTechRóżne
przeciwciała CCRCCarboSourceRóżne
CDTASigma319945
ChloroformSigmaPHR1552
EtanolSigma1.11727
Galaktan (ziemniak)MegazymeP-GALPOT
Galaktomannan (chleb świętojański)MegazymeP-GALML
Roztwór gliceroluSigma49781-5L
Guma tragakant (rośliny strączkowe)Sigma-AldrichG1128
INCh przeciwciała INRARóżne
przeciwciała LM i JIMPlantProbesRóżne
Marathon Argus Microarray DrukarkaArrayJet
MetanolSigma 34860
Przeciwciała monoklonalneBiosupplies AustraliaRóżne
NaBH4Sigma452882
NaOHSigmaS5881
Nitro-niebieski tetrazolium (NBT)MelfordN66000-1.0
Membrana nitrocelulozowaThermo Fisher Scientific88018
Pektyna (stopień estryfikacji metylu 46%)DaniscoNA
ProClin 200Sigma48171-U
Rhamnogalacturonan (włókno pektynowe sojowe)MegazymeP-RHAGN
Mikser obrotowyFisher Scientific88-861-050
Shaker obrotowo-kołyszącyCole-Parmer
Odtłuszczone mleko w proszkuMarvel
Spin filterCostar Spin-X8160
Koraliki ze stali nierdzewnejQiagen69989
TissueLyser IIQiagen85300
TrisSigma93362
Triton X-100SigmaT8787-250ML
Tween 20SigmaP9416-100ML
Xylan (drewno bukowe)MegazymeP-XYLNBE
)MegazymeP-XYGLN
β-Glucan (owies)MegazymeP-BGOM
Xyloglukan (tamaryndowiec

Bibliografia

  1. Amicucci, M. J., et al. A nonenzymatic method for cleaving polysaccharides to yield oligosaccharides for structural analysis. Nature Communications. 11 (1), 3963(2020).
  2. Gagneux, P., Panin, V., Hennet, T., Aebi, M., Varki, A. Evolution of glycan diversity. Essentials of Glycobiology [Internet]. 4th edition. , (2022).
  3. Willats, W. G. T., McCartney, L., Knox, J. P. Pectin cell biology: complexity in context. Advances in Pectin and Pectinase Research. , Springer. Netherlands. 147-157 (2003).
  4. Cummings, R. D., et al. Glycan-recognizing probes as tools. Essentials of Glycobiology [Internet]. 4th edition. , (2022).
  5. Bakshani, C. R., et al. Analysis of glycans in a Burnt-on/Baked-on (BoBo) model food soil using Microarray Polymer Profiling (MAPP) and immunofluorescence microscopy. Food Chemistry. 410, 135379(2023).
  6. Salmeán, A. A., Willats, W. G. T., Ribeiro, S., Andersen, T. J., Ellegaard, M. Over 100-year preservation and temporal fluctuations of cell wall polysaccharides in marine sediments. Frontiers in Plant Science. 13, 785902(2022).
  7. Cid, M., et al. Recognition of the helical structure of β-1,4-galactan by a new family of carbohydrate-binding modules. Journal of Biological Chemistry. 285 (46), 35999-36009 (2010).
  8. Runavot, J. -L., et al. Non-cellulosic polysaccharides from cotton fibre are differently impacted by textile processing. PLoS One. 9 (12), e115150(2014).
  9. Ahl, L. I., et al. Analyses of aloe polysaccharides using carbohydrate microarray profiling. Journal of AOAC International. 101 (6), 1720-1728 (2018).
  10. Vidal-Melgosa, S., et al. Diatom fucan polysaccharide precipitates carbon during algal blooms. Nature Communications. 12 (1), 1150(2021).
  11. Moller, I., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant Journal. 50 (6), 1118-1128 (2007).
  12. Ruprecht, C., et al. A synthetic glycan microarray enables epitope mapping of plant cell wall glycan-directed antibodies. Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).
  13. Cummings, R. D., et al. Principles of glycan recognition. Essentials of Glycobiology [Internet]. 4th edition. , (2022).
  14. Gao, C., et al. Glycan microarrays as chemical tools for identifying glycan recognition by immune proteins. Frontiers in Chemistry. 7, 833(2019).
  15. Vidal-Melgosa, S., et al. A new versatile microarray-based method for high throughput screening of carbohydrate-active enzymes. Journal of Biological Chemistry. 290 (14), 9020-9036 (2015).
  16. Willats, W. G. T., Rasmussen, S. E., Kristensen, T., Mikkelsen, J. D., Knox, J. P. Sugar-coated microarrays: A novel slide surface for the high-throughput analysis of glycans. Proteomics. 2 (12), 1666-1671 (2002).
  17. Sørensen, I., et al. The charophycean green algae provide insights into the early origins of plant cell walls. The Plant Journal. 68 (2), 201-211 (2011).
  18. Liu, D., Tang, W., Yin, J. -Y., Nie, S. -P., Xie, M. -Y. Monosaccharide composition analysis of polysaccharides from natural sources: Hydrolysis condition and detection method development. Food Hydrocolloids. 116, 106641(2021).
  19. Pattathil, S., et al. A comprehensive toolkit of plant cell wall glycan-directed monoclonal antibodies. Plant Physiology. 153 (2), 514-525 (2010).
  20. Verhertbruggen, Y., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. The Plant Journal. 59 (3), 413-425 (2009).
  21. Rydahl, M. G., et al. Development of novel monoclonal antibodies against starch and ulvan - implications for antibody production against polysaccharides with limited immunogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 9326(2017).
  22. McCartney, L., Marcus, S. E., Knox, J. P. Monoclonal antibodies to plant cell wall xylans and arabinoxylans. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (4), 543-546 (2005).
  23. Marcus, S. E., et al. Pectic homogalacturonan masks abundant sets of xyloglucan epitopes in plant cell walls. BMC Plant Biology. 8, 60(2008).
  24. Pedersen, H. L., et al. Versatile high resolution oligosaccharide microarrays for plant glycobiology and cell wall research. The Journal of Biological Chemistry. 287 (47), 39429-39438 (2012).
  25. Marcus, S. E., et al. Restricted access of proteins to mannan polysaccharides in intact plant cell walls. The Plant Journal. 64 (2), 191-203 (2010).
  26. Smallwood, M., Martin, H., Knox, J. P. An epitope of rice threonine-and hydroxyproline-rich glycoprotein is common to cell wall and hydrophobic plasma-membrane glycoproteins. Planta. 196 (3), 510-522 (1995).
  27. Smallwood, M., Yates, E. A., Willats, W. G. T., Martin, H., Knox, J. P. Immunochemical comparison of membrane-associated and secreted arabinogalactan-proteins in rice and carrot. Planta. 198 (3), 452-459 (1996).
  28. Wisniewski, J. P., Rathbun, E. A., Knox, J. P., Brewin, N. J. Involvement of diamine oxidase and peroxidase in insolubilization of the extracellular matrix: implications for pea nodule initiation by Rhizobium leguminosarum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 13 (4), 413-420 (2000).
  29. Jones, L., Seymour, G. B., Knox, J. P. Localization of pectic galactan in tomato cell walls using a monoclonal antibody specific to (1[->]4)-β-D-galactan. Plant Physiology. 113 (4), 1405-1412 (1997).
  30. Willats, W. G., Marcus, S. E., Knox, J. P. Generation of a monoclonal antibody specific to (1→5)-α-L-arabinan. Carbohydrate Research. 308 (15), 149-152 (1998).
  31. Cornuault, V., et al. LM6-M: a high avidity rat monoclonal antibody to pectic α-1, 5-L-arabinan. BioRxiv. , 161604(2017).
  32. Sutherland, P., Hallett, I., Jones, M. Probing cell wall structure and development by the use of antibodies: a personal perspective. New Zealand Journal of Forestry Science. 39, 197-205 (2009).
  33. Mikkelsen, M. D., et al. Ancient origin of fucosylated xyloglucan in charophycean green algae. Communications Biology. 4 (1), 754(2021).
  34. Fangel, J. U., Jones, C. Y., Ulvskov, P., Harholt, J., Willats, W. G. T. Analytical implications of different methods for preparing plant cell wall material. Carbohydrate Polymers. 261, 117866(2021).
  35. Moore, J. P., et al. Analysis of plant cell walls using high-throughput profiling techniques with multivariate methods. The Plant Cell Wall: Methods and Protocols. , Springer. New York. 327-337 (2020).
  36. Gao, Y., Fangel, J. U., Willats, W. G. T., Moore, J. P. Tracking polysaccharides during white winemaking using glycan microarrays reveals glycoprotein-rich sediments. Food Research International. 123, 662-673 (2019).
  37. Solden, L. M., et al. Interspecies cross-feeding orchestrates carbon degradation in the rumen ecosystem. Nature Microbiology. 3 (11), 1274-1284 (2018).
  38. Fangel, J. U., et al. Tracking polysaccharides through the brewing process. Carbohydrate Polymers. 196, 465-473 (2018).
  39. Mravec, J., et al. Pea border cell maturation and release involve complex cell wall structural dynamics. Plant Physiology. 174 (2), 1051-1066 (2017).
  40. Wickham, H. ggplot2: elegant graphics for data analysis. , Springer. New York. NY. (2009).
  41. Gu, Z. Complex heatmap visualization. iMeta. 1 (3), 43(2022).
  42. Nasrollahzadeh, M., Nezafat, Z., Shafiei, N., Soleimani, F. Polysaccharides in Food Industry. , Elsevier. Iran. (2021).
  43. Shao, P., et al. Recent advances in improving stability of food emulsion by plant polysaccharides. Food Research International. 137, 109376(2020).
  44. Sanz, M. L., Martínez-Castro, I. Recent developments in sample preparation for chromatographic analysis of carbohydrates. Journal of Chromatography. A. 1153 (1-2), 74-89 (2007).
  45. Bethke, G., Glazebrook, J. Cyclohexane diamine tetraacetic acid (CDTA) extraction of plant cell wall pectin. Bio-Protocol. 4 (24), e1357(2014).
  46. Lu, Y., He, Q., Fan, G., Cheng, Q., Song, G. Extraction and modification of hemicellulose from lignocellulosic biomass: A review. Green Processing and Synthesis. 10 (1), 779-804 (2021).
  47. Jayasekara, S., Ratnayake, R. Microbial cellulases: an overview and applications. Cellulose. 22, 92(2019).
  48. Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., Ordaz-Ortiz, J. J., Knox, J. P. An extended set of monoclonal antibodies to pectic homogalacturonan. Carbohydrate Research. 344 (14), 1858-1862 (2009).
  49. Villares, A., Mateo-Vivaracho, L., Guillamón, E. Structural features and healthy properties of polysaccharides occurring in mushrooms. Agriculture. 2 (4), 452-471 (2012).
  50. Kračun, S. K., et al. Carbohydrate microarray technology applied to high-throughput mapping of plant cell wall glycans using comprehensive microarray polymer profiling (CoMPP). Methods in Molecular Biology. 1503, 147-165 (2017).
  51. Rajasundaram, D., et al. Understanding the relationship between cotton fiber properties and non-cellulosic cell wall polysaccharides. PLoS One. 9 (11), e112168(2014).
  52. Michalak, L., et al. Microbiota-directed fibre activates both targeted and secondary metabolic shifts in the distal gut. Nature Communications. 11 (1), 5773(2020).
  53. Salmeán, A. A., Hervé, C., Jørgensen, B., Willats, W. G., Mravec, J. Microarray glycan profiling reveals algal fucoidan epitopes in diverse marine metazoans. Frontiers in Marine Science. 4, 293(2017).
  54. Knox, J. P. Revealing the structural and functional diversity of plant cell walls. Current Opinion in Plant Biology. 11 (3), 308-313 (2008).
  55. Manimala, J. C., Roach, T. A., Li, Z., Gildersleeve, J. C. High-throughput carbohydrate microarray profiling of 27 antibodies demonstrates widespread specificity problems. Glycobiology. 17 (8), 17-23 (2007).
  56. Stephen, P., Tseng, K. -L., Liu, Y. -N., Lyu, P. -C. Circular permutation of the starch-binding domain: inversion of ligand selectivity with increased affinity. Chemical Communications. 48 (20), 2612-2614 (2012).
  57. Gunnarsson, L. C., Dexlin, L., Karlsson, E. N., Holst, O., Ohlin, M. Evolution of a carbohydrate binding module into a protein-specific binder. Biomolecular Engineering. 23 (2-3), 111-117 (2006).
  58. Moller, I., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchical clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25 (1), 37-48 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikromacierze glikanówwysokoprzepustowe przesiewanieskład glikanówprzeciwciała monoklonalneściana komórkowa roślinprofilowanie polisacharydówfrakcjonowanie enzymatycznemembrana nitrocelulozowa
Profilowanie polimerów w mikromacierzy (MAPP) do wysokoprzepustowej analizy glikanów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.