Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ulepszona metoda izolowania mitochondrialnych miejsc kontaktowych

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65444

⸱

16 czerwca 2023

 ,  , 
1Department of Cell Biology, Biomedical Center, Medical Faculty, Ludwig-Maximilians University Munich, 2Cardio-Metabolic Diseases, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Mitochondrialne miejsca kontaktu to kompleksy białkowe, które oddziałują z wewnętrznymi i zewnętrznymi białkami błony mitochondrialnej. Miejsca te są niezbędne do komunikacji między błonami mitochondrialnymi, a tym samym między cytozolem a macierzą mitochondrialną. W tym miejscu opisujemy metodę identyfikacji kandydatów kwalifikujących się do tej konkretnej klasy białek.

Streszczenie

Mitochondria są obecne praktycznie we wszystkich komórkach eukariotycznych i pełnią podstawowe funkcje, które wykraczają daleko poza produkcję energii, na przykład syntezę klastrów żelazowo-siarkowych, lipidów lub białek, buforowanie Ca2+ i indukcję apoptozy. Podobnie dysfunkcja mitochondriów prowadzi do poważnych chorób ludzkich, takich jak rak, cukrzyca i neurodegeneracja. Aby pełnić te funkcje, mitochondria muszą komunikować się z resztą komórki przez swoją otoczkę, która składa się z dwóch błon. Dlatego te dwie membrany muszą stale ze sobą współdziałać. Białka mają w tym względzie zasadnicze znaczenie dla miejsc kontaktu między błoną wewnętrzną i zewnętrzną mitochondriów. Do tej pory zidentyfikowano kilka miejsc kontaktowych. W opisanej tutaj metodzie mitochondria Saccharomyces cerevisiae są wykorzystywane do izolowania miejsc kontaktu, a tym samym do identyfikacji kandydatów, którzy kwalifikują się do białek w miejscu kontaktu. Użyliśmy tej metody do identyfikacji mitochondrialnego miejsca kontaktu i kompleksu systemu organizowania cristae (MICOS), jednego z głównych kompleksów tworzących miejsca kontaktu w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, która jest konserwowana od drożdży do ludzi. Ostatnio jeszcze bardziej udoskonaliliśmy tę metodę, aby zidentyfikować nowe miejsce kontaktu składające się z Cqd1 i kompleksu Por1-Om14.

Wprowadzenie

Mitochondria pełnią u eukariontów wiele różnych funkcji, z których najbardziej znaną jest produkcja ATP poprzez fosforylację oksydacyjną. Inne funkcje obejmują wytwarzanie klastrów żelazowo-siarkowych, syntezę lipidów, a u wyższych eukariontów sygnalizację Ca2+ oraz indukcję apoptozy1,2,3,4. Funkcje te są nierozerwalnie związane z ich złożoną ultrastrukturą.

Ultrastruktura mitochondriów została po raz pierwszy opisana za pomocą mikroskopii elektronowej5. Wykazano, że mitochondria są dość złożonymi organellami składającymi się z dwóch błon: zewnętrznej błony mitochondrialnej i mitochondrialnej błony wewnętrznej. W ten sposób błony te tworzą dwa przedziały wodne: przestrzeń międzybłonową i matrycę. Wewnętrzną błonę mitochondrialną można jeszcze bardziej podzielić na różne sekcje. Wewnętrzna błona graniczna pozostaje w bliskiej odległości od błony zewnętrznej, a grzebienie tworzą wgłębienia. Tak zwane połączenia crista łączą wewnętrzną błonę graniczną i cristae (Rysunek 1). Co więcej, mikrofotografie elektronowe osmotycznie skurczonych mitochondriów ujawniają, że istnieją miejsca, w których błony mitochondrialne są ściśle połączone6,7. Te tak zwane miejsca kontaktu są tworzone przez kompleksy białkowe obejmujące dwie błony (Rysunek 1). Uważa się, że te miejsca interakcji są niezbędne dla żywotności komórek ze względu na ich znaczenie dla regulacji dynamiki mitochondriów i dziedziczenia, a także transferu metabolitów i sygnałów między cytozolem a matrix8.

Kompleks MICOS w wewnętrznej błonie mitochondrialnej jest prawdopodobnie najlepiej scharakteryzowanym i najbardziej wszechstronnym kompleksem tworzącym miejsca kontaktu. MICOS został opisany w drożdżach w 2011 roku i składa się z sześciu podjednostek9,10,11: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 i Mic10. Tworzą one kompleks około 1,5 MDa, który lokalizuje się w crista junctions9,10,11. Usunięcie którejkolwiek z podjednostek rdzeniowych, Mic10 lub Mic60, prowadzi do braku tego kompleksu9,11, co oznacza, że te dwie podjednostki są niezbędne dla stabilności MICOS. Co ciekawe, MICOS tworzy nie tylko jedno, ale wiele miejsc kontaktu z różnymi mitochondrialnymi białkami i kompleksami błony zewnętrznej: TOM complex11,12, kompleks TOB/SAM9,12,13,14,15,16, kompleks Fzo1-Ugo19, Por110, OM4510 oraz Miro17. Wskazuje to wyraźnie, że kompleks MICOS bierze udział w różnych procesach mitochondrialnych, takich jak import białek, metabolizm fosfolipidów i wytwarzanie ultrastruktury mitochondriów18. Ta ostatnia funkcja jest prawdopodobnie główną funkcją MICOS, ponieważ brak kompleksu MICOS indukowany przez delecję MIC10 lub MIC60 prowadzi do nieprawidłowej ultrastruktury mitochondrialnej, która praktycznie całkowicie pozbawiona jest regularnych grzebienia. Zamiast tego gromadzą się pęcherzyki błony wewnętrznej bez połączenia z wewnętrzną błoną graniczną19, 20. Co ważne, MICOS jest zachowany pod względem formy i funkcji, od drożdży do human21. Związek mutacji w podjednostkach MICOS z ciężkimi chorobami człowieka również podkreśla jego znaczenie dla wyższych eukariontów22,23. Chociaż MICOS jest bardzo wszechstronny, muszą istnieć dodatkowe strony kontaktowe (na podstawie naszych niepublikowanych obserwacji). Rzeczywiście, zidentyfikowano kilka innych miejsc kontaktowych, na przykład maszynerie fuzji mitochondrialnej Mgm1-Ugo1/Fzo124,25,26 lub Mdm31-Por1, który bierze udział w biosyntezie specyficznej dla mitochondriów fosfolipidowej kardiolipiny27. Niedawno udoskonaliliśmy metodę, która doprowadziła nas do identyfikacji MICOS, aby zidentyfikować Cqd1 jako część nowego miejsca kontaktu utworzonego z kompleksu błony zewnętrznej Por1-Om1428. Co ciekawe, to miejsce kontaktowe wydaje się być również zaangażowane w wiele procesów, takich jak homeostaza błony mitochondrialnej, metabolizm fosfolipidów i dystrybucja koenzymu Q28,29.

Tutaj użyliśmy wariantu wcześniej opisanej frakcjonacji mitochondriów9,30,31,32,33. Osmotyczne traktowanie mitochondriów prowadzi do przerwania zewnętrznej błony mitochondrialnej i skurczenia się przestrzeni macierzy, pozostawiając obie błony tylko w bliskiej odległości w miejscach kontaktu. Pozwala to na wytwarzanie pęcherzyków, które składają się wyłącznie z zewnętrznej błony mitochondrialnej lub wewnętrznej błony mitochondrialnej lub w miejscach kontaktu obu błon poprzez łagodną sonikację. Ze względu na to, że wewnętrzna błona mitochondriów ma znacznie wyższy stosunek białka do lipidów, pęcherzyki mitochondrialnej błony wewnętrznej wykazują większą gęstość w porównaniu z pęcherzykami mitochondrialnej błony zewnętrznej. Różnica w gęstości może być wykorzystana do oddzielenia pęcherzyków błonowych poprzez wirowanie w gradiencie gęstości wyporu sacharozy. W ten sposób pęcherzyki mitochondrialnej błony zewnętrznej gromadzą się przy niskich stężeniach sacharozy, podczas gdy pęcherzyki błony wewnętrznej mitochondriów są wzbogacane przy wysokich stężeniach sacharozy. Pęcherzyki zawierające miejsca kontaktu koncentrują się w średnich stężeniach sacharozy (Ryc. 2). Poniższy protokół szczegółowo opisuje tę ulepszoną metodę, która wymaga mniej specjalistycznego sprzętu, czasu i energii w porównaniu z naszą poprzednio ustaloną klasą one32 i stanowi użyteczne narzędzie do identyfikacji możliwych białek w miejscu kontaktu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Bufory i roztwory zapasowe

  1. Przygotować 1 M roztwór kwasu 3-morfolinopropano-1-sulfonowego (MOPS) w wodzie dejonizowanej, pH 7,4. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować 500 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) w wodzie dejonizowanej, pH 8,0. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotować 2,4 M roztwór sorbitolu w wodzie dejonizowanej. Przechowywać w temperaturze pokojowej po autoklawowaniu.
  4. Przygotować 2,5 M roztwór sacharozy w wodzie dejonizowanej. Przechowywać w temperaturze pokojowej po autoklawowaniu.
  5. Przygotować 200 mM fluorek fenylometylosulfonylowy (PMSF) w izopropanolu. Przechowywać w temperaturze −20 °C.
    OSTRZEŻENIE: PMSF jest toksyczny w przypadku połknięcia oraz powoduje ciężkie oparzenia skóry i uszkodzenia oczu. Nie wdychać pyłu, używać rękawic ochronnych i okularów ochronnych.
  6. Przygotować 72% kwas trójchlorooctowy (TCA) w wodzie dejonizowanej. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    OSTRZEŻENIE: TCA może powodować podrażnienie dróg oddechowych, ciężkie oparzenia skóry i uszkodzenia oczu. Nie wdychać pyłu, używać rękawic ochronnych i okularów ochronnych.
  7. Przygotować bufor SM: 20 mM MOPS i 0,6 M sorbitol, pH 7,4.
  8. Przygotować bufor do pęcznienia (swelling buffer): 20 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF oraz koktajl inhibitorów proteaz, pH 7,4.
  9. Przygotować bufory do gradientu sacharozy: 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M oraz 1,3 M sacharozy w 20 mM MOPS i 0,5 mM EDTA, pH 7,4.
    UWAGA: Wszystkie bufory można przechowywać w temperaturze 4 °C; zaleca się jednak przechowywanie buforów zawierających sacharozę w temperaturze −20 °C, aby uniknąć wzrostu grzybów. Inhibitory proteaz należy dodawać bezpośrednio przed użyciem.

2. Generowanie pęcherzyków submitochondrialnych

  1. Wyizoluj świeże, surowe mitochondria drożdżowe zgodnie z uznanymi protokołami34,35.
    UWAGA: W tym eksperymencie mitochondria wyizolowano z Saccharomyces cerevisiae. Generowanie czystych gradientowo mitochondriów pozbawionych innych organelli nie jest konieczne.
  2. Resuspenderuj 10 mg świeżo wyizolowanych mitochondriów w 1,6 mL buforu SM (4 °C) poprzez pipetowanie (Rycina 2, krok 1).
  3. Przenieś zawiesinę mitochondrialną do schłodzonej wcześniej kolby Erlenmeyera o pojemności 100 mL.
  4. Powoli dodaj 16 mL buforu pęczniącego, używając szklanej pipety 20 mL. Podczas dodawania stosuj stałe, łagodne mieszanie w kąpieli lodowej. Ta obróbka osmotyczna prowadzi do poboru wody do przestrzeni macierzy. Pęcznienie wewnętrznej błony mitochondrialnej spowoduje przerwanie błony zewnętrznej. Jednak obie błony pozostaną w kontakcie w miejscach kontaktu9(Rycina 2, krok 2).
  5. Inkubuj próbki przez 30 min w kąpieli lodowej przy stałym, łagodnym mieszaniu.
  6. Powoli dodaj 5 mL 2,5 M roztworu sacharozy, używając szklanej pipety 5 mL, aby zwiększyć stężenie sacharozy w próbkach do około 0,55 M. Ta obróbka osmotyczna powoduje odpływ wody z macierzy36. Kurczenie się błony wewnętrznej ma na celu maksymalizację jej odległości od pozostałych fragmentów błony zewnętrznej. Zmniejsza to prawdopodobieństwo powstania sztucznych pęcherzyków hybrydowych z błon wewnętrznej i zewnętrznej podczas sonikacji (Rycina 2, krok 3).
  7. Inkubuj próbki przez 15 min w kąpieli lodowej przy łagodnym mieszaniu.
  8. Poddaj mitochondria sonikacji w celu wygenerowania pęcherzyków błony submitochondrialnej (Rycina 2, krok 4).
    1. Przenieś zawiesinę mitochondrialną do schłodzonej wcześniej komórki typu rosette.
    2. Sonikuj zawiesinę mitochondrialną przy amplitudzie 10% przez 30 s, chłodząc komórkę rosette w kąpieli lodowej.
    3. Pozostaw zawiesinę na 30 s w kąpieli lodowej.
    4. Powtórz krok 2.8.2 i krok 2.8.3 jeszcze trzy razy.
      UWAGA: Warunki sonikacji będą się różnić w zależności od użytego sonikatora. Konieczna będzie optymalizacja dla poszczególnych urządzeń. Zbyt intensywna sonikacja doprowadzi do sztucznego tworzenia pęcherzyków składających się z wewnętrznej i zewnętrznej błony mitochondrialnej.

3. Separacja pęcherzyków submitochondrialnych

  1. Oddziel wygenerowane pęcherzyki od pozostałych nienaruszonych mitochondriów poprzez wirowanie przy 20 000 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C. Nienaruszone mitochondria utworzą osad, natomiast pęcherzyki pozostaną w nadłożu.
  2. Skoncentruj mieszaninę pęcherzyków.
    1. Przenieś nadŁoże do świeżych probówek do ultrawirowania.
    2. Na dno probówki nanieś poduszkę z 0,3 mL 2,5 M roztworu sacharozy, używając strzykawki 1 mL wyposażonej w kaniulę 0,8 mm x 120 mm.
    3. Wiruj przy 118 000 x g przez 100 min w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: W tym przypadku zastosowano rotor z koszyczkami o maksymalnym promieniu 153,1 mm. Warunki wirowania są silnie zależne od rotora i muszą zostać dostosowane w przypadku użycia innego rotora.
  3. Po wirowaniu pęcherzyki pojawią się w postaci dysku na górze poduszki sacharozowej. Odrzuć około 90% nadłożu. Następnie zbierz skoncentrowane pęcherzyki, resuspendując je w pozostałym buforze zawierającym 2,5 M sacharozę poprzez pipetowanie w górę i w dół. Przenieś zawiesinę do schłodzonego do temperatury lodu homogenizatora Dounce'a.
  4. Zhomogenizuj zawiesinę, wykonując co najmniej 10 pociągnięć za pomocą tłoka z politetrafluoroetylenu.
  5. Przygotuj gradient sacharozowy.
    1. W przypadku 11 mL gradientu skokowego z pięcioma stopniami (1,3 M, 1,13 M, 1,02 M, 0,96 M i 0,8 M sacharozy w 20 mM MOPS i 0,5 mM EDTA, pH 7,4), każda warstwa zawiera 2,2 mL roztworu sacharozy.
      UWAGA: Do pomiaru i dostosowania stężeń sacharozy zaleca się użycie refraktometru, choć nie jest on niezbędny. Nanieś 10 µL buforu na refraktometr i odczytaj odpowiednie współczynniki załamania światła. Obliczenie stężenia sacharozy przebiega następująco:
      Równanie współczynnika załamania światła dla analizy stężenia sacharozy w eksperymentach optycznych.
      Wartość 1,3333 reprezentuje współczynnik załamania światła wody. Wartość 0,048403 jest specyficznym dla sacharozy wskaźnikiem konwersji otrzymanym z liniowego skalowania refrakcyjności molowej do stężenia sacharozy w roztworach wodnych 37.
    2. Dodaj najwyższe stężenie sacharozy do probówki do wirowania i umieść probówkę w temperaturze −20 °C. Odczekaj do całkowitego zamrożenia warstwy przed naniesieniem kolejnej. Postępuj w ten sposób, aż do dodania ostatniej warstwy, a następnie przechowuj gradienty w temperaturze −20 °C.
      UWAGA: Pamiętaj o przeniesieniu zamrożonych gradientów do temperatury 4 °C przed rozpoczęciem eksperymentu, aby umożliwić ich rozmrożenie. Zajmie to około 3 h. Do wirowania w tej procedurze użyto rotora z koszyczkami o pojemności 13,2 mL. W przypadku użycia innego rotora objętość stopni gradientu musi zostać odpowiednio dostosowana.
  6. Zmierz stężenie sacharozy w próbkach za pomocą refraktometru. W przypadku braku dostępu do refraktometru można alternatywnie przyjąć, że stężenie sacharozy wynosi 2 M. To założone stężenie sacharozy będzie podstawą do następnego kroku.
  7. Dostosuj stężenie sacharozy do 0,6 M poprzez dodanie odpowiedniej ilości 20 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF i koktajlu inhibitorów proteaz, pH 7,4. Jeśli stężenie sacharozy zostało oszacowane na 2 M zamiast zmierzone, zaleca się sprawdzenie, czy po dostosowaniu stężenie jest wystarczająco niskie. Nanieś niewielką alikwot próbki (ok. 50 µL) na 200 µL 0,8 M sacharozy w probówce. Próbka musi pozostać nad warstwą 0,8 M sacharozy.
  8. Nanieś próbki (około 1 mL) na górę gradientu sacharozowego (zachowaj 10% do późniejszej referencji). Ważne jest ostrożne pipetowanie, aby uniknąć zaburzenia gradientu (Rysunek 2, krok 5).
  9. Rozdziel pęcherzyki poprzez wirowanie przy 200 000 x g w temperaturze 4 °C przez 12 h. Jeśli to możliwe, ustaw wirówkę na wolne przyspieszanie i zwalnianie, aby uniknąć zaburzenia gradientu (Rysunek 2, krok 6).
    UWAGA: W tym przypadku zastosowano rotor z koszyczkami o maksymalnym promieniu 153,1 mm. Warunki wirowania są silnie zależne od rotora i muszą zostać dostosowane w przypadku użycia innego rotora.
  10. Zbierz gradient od góry do dołu w frakcjach po 700 µL, używając pipety 1 mL. Pozwoli to na uzyskanie 17 frakcji, co zapewnia wystarczającą rozdzielczość.

4. Analiza pęcherzyków submitochondrialnych

  1. Skoncentruj białka, poddając każdą frakcję dwóm sekwencyjnie wykonanym precypitacjom TCA38 w celu przygotowania próbek do SDS-PAGE.
    1. Do poszczególnych frakcji dodaj 200 µL 72% TCA i mieszaj do uzyskania homogennego roztworu. Inkubuj frakcje przez 30 min na lodzie, a następnie odwiruj wytrącone białka w wirowce przy 20,000 x g i 4 °C przez 20 min. Odlej nadsącz, dodaj 500 µL 28% roztworu TCA, dokładnie wymieszaj i powtórz etap wirowania.
    2. Przemyj osady 1 mL acetonu (−20°C) i wiruj przez 10 min przy 20,000 x g i 4 °C. Odlej nadsącz i pozostaw osady do wyschnięcia na powietrzu. Resuspenduj osady w 60 µL buforu do próbek SDS i inkubuj próbki przez 5 min w temperaturze 95 °C.
      UWAGA: Po pierwszej precypitacji TCA pozostanie duża ilość sacharozy, szczególnie w frakcjach o wysokiej gęstości. Zostanie ona usunięta podczas dodatkowej precypitacji TCA.
  2. Przeanalizuj 20 µL każdej frakcji za pomocą SDS-PAGE39 oraz immunoblottingu40,41,42,43.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rozdzielenie wewnętrznej i zewnętrznej błony mitochondrialnej jest stosunkowo łatwe. Jednakże generowanie i oddzielanie pęcherzyków zawierających miejsca kontaktu jest znacznie trudniejsze. Naszym zdaniem kluczowe i niezbędne są dwa etapy: warunki sonikacji oraz zastosowany gradient.

Zazwyczaj uważa się, że gradienty liniowe mają lepszą rozdzielczość w porównaniu z gradientami schodkowymi. Jednak ich powtarzalne wytwarzanie jest żmudne i wymaga specjalistycznego sprzętu. W związku z tym opraco...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Subfrakcjonowanie mitochondriów to skomplikowany eksperyment składający się z kilku bardzo złożonych etapów. W związku z tym naszym celem było dalsze ulepszanie i do pewnego stopnia uproszczenie naszej ustalonej metody32. Tutaj wyzwaniem było zapotrzebowanie na skomplikowane i wysoce specjalistyczne urządzenia, które często są indywidualnymi konstrukcjami oraz ogromne zużycie czasu i energii. W tym celu staraliśmy się usunąć pompy i poszczególne konstrukcje używane do odlewania i zbierania gradien...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów.

Podziękowania

M.E.H. dziękuje Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), projekt numer 413985647, za wsparcie finansowe. Autorzy dziękują dr. Michaelowi Kieblerowi z Uniwersytetu Ludwika i Maksymiliana w Monachium za hojne i szerokie wsparcie. Jesteśmy wdzięczni Walterowi Neupertowi za jego wkład naukowy, pomocne dyskusje i nieustającą inspirację. J.F. dziękuje Graduate School Life Science Munich (LSM) za wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
13,2 mL, Otwarta cienkościenna ultraprzezroczysta tuba, 14 x 89 mmBeckman Instruments, Niemcy344059
50 mL, Otwarta grubościenna rurka z poliwęglanu Open-Top, 29 x 104 mmBeckman Instruments, Niemcy363647
A-25.50 Wirnik stałokątowy - aluminium, 8 x 50 mL, 25 000 obr./min, 75 600 x gBeckman Instruments, Niemcy363055
Refraktometr AbbegoZeiss, Niemcywycofane,
można używać dowolnego refraktometru Abbego
accu-jet pro Kontroler pipetBrandtech, USABR26320wycofany,
wystarczy dowolny kontroler pipet
Zlewka 1000 mlDWK Life Science, NiemcyC118.1
Branson  Cyfrowy sonifier W-250 DBranson Ultrasonics, Stany ZjednoczoneFIS15-338-125
Branson Ultradźwiękowy 3mm STOŻKOWA MIKROKOŃCÓWKABranson Ultrasonics, USA101-148-062
Branson Ultrasonics Sonizery 200- i 400-watowe: Rozetowa komórka chłodzącaBranson Ultrasonics, USA15-338-70
Wirówka Avanti JXN-26Beckman Instruments, NiemcyB37912
Wirówka Optima XPN-100 ultraBeckman Instruments, Niemcy8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-CocktailRoche, Szwajcaria11697498001
D-SorbitRoth, Niemcy6213
EDTA (dwuwodian soli disodowej kwasu etyleno-tetraoctowego)Roth, Niemcy8043
Kolba Erlenmeyera, 100 mlRoth, NiemcyPipeta miarowa X747.1
, Kl. B, 25:0, 0,1Hirschmann, NiemcyPipeta
, Kl. B, 5:0, 0,05Hirschmann, Niemcy1180153
kąpieli lodowejneoLab, Niemcy  S12651
Mieszadło magnetyczne RCT basicIKA-Werke GmbH, NiemcyZ645060GB-1EA
MOPS (kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy)Gerbu, Niemcy1081
MyPipetman Select P1000Gilson, Stany ZjednoczoneFP10006S
MyPipetman Select P20Gilson, Stany ZjednoczoneFP10003S
MyPipetman Select P200Gilson, Stany Zjednoczone
Omnifix 1 mlBraun, Niemcy4022495251879
Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)Serva, Niemcy32395.03
Kaniula STERICAN 21 Gx4 4/5 0,8x120 mmBraun, Niemcy4022495052414
mieszadło, 15 mmVWR, USA442-0366
SacharozaMerck, NiemcyS8501
SW 41 Ti Rotor z łyżką wahadłowąBeckman Instruments, Niemcy331362
ProbówkiEppendorf, Niemcy3810X
Młynki do tkanek, typ Potter-Elvehjem, szklane naczynie 2 mlVWR, USA432-0200
Młynki do tkanek typu Potter-Elvehjem, tłok 2 ml z ząbkowaną końcówkąVWR, USA432-0212
Kwas trichlorooctowy ( TCA)Sigma Aldrich, Niemcy33731wycofane,
każdy TCA wystarczy (CAS: 73-03-9)
TRISRoth, Niemcy4855
miarowa 1180170FP10005S

Bibliografia

  1. Braymer, J. J., Freibert, S. A., Rakwalska-bange, M., Lill, R. BBA - Molecular Cell Research Mechanistic concepts of iron-sulfur protein biogenesis in Biology * General concepts of FeS protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1868 (1), 118863(2021).
  2. Osman, C., Merkwirth, C., Langer, T. Prohibitins and the functional compartmentalization of mitochondrial membranes. Journal of Cell Science. 122 (21), 3823-3830 (2009).
  3. Smaili, S. S., Hsu, Y., Youle, R. J., Russell, J. T. Mitochondria in Ca 2 %. Signaling and Apoptosis. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 32 (1), (2000).
  4. Rolland, S. G., Conradt, B. New role of the BCL2 family of proteins in the regulation of mitochondrial dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 22 (6), 852-858 (2011).
  5. Palade, G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. The journal of histochemistry and cytochemistry: official journal of the Histochemistry Society. 1 (4), 188-211 (1953).
  6. Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of cell biology. 30 (2), 269-297 (1966).
  7. Hackenbrock, C. R. Chemical and physical fixation of isolated mitochondria in low-energy and high-energy states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 598-605 (1968).
  8. Reichert, A. S., Neupert, W. Contact sites between the outer and inner membrane of mitochondria - Role in protein transport. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1592 (1), 41-49 (2002).
  9. Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO Journal. 30 (21), 4356-4370 (2011).
  10. Hoppins, S., et al. A mitochondrial-focused genetic interaction map reveals a scaffold-like complex required for inner membrane organization in mitochondria. Journal of Cell Biology. 195 (2), 323-340 (2011).
  11. vonder Malsburg, K., et al. Dual Role of Mitofilin in Mitochondrial Membrane Organization and Protein Biogenesis. Developmental Cell. 21 (4), 694-707 (2011).
  12. Bohnert, M., et al. Role of mitochondrial inner membrane organizing system in protein biogenesis of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 23 (20), 3948-3956 (2012).
  13. Darshi, M., et al. ChChd3, an inner mitochondrial membrane protein, is essential for maintaining Crista integrity and mitochondrial function. Journal of Biological Chemistry. 286 (4), 2918-2932 (2011).
  14. Körner, C., et al. The C-terminal domain of Fcj1 is required for formation of crista junctions and interacts with the TOB/SAM complex in mitochondria. Molecular Biology of the Cell. 23 (11), 2143-2155 (2012).
  15. Xie, J., Marusich, M. F., Souda, P., Whitelegge, J., Capaldi, R. A. The mitochondrial inner membrane protein Mitofilin exists as a complex with SAM50, metaxins 1 and 2, coiled-coil-helix coiled-coil-helix domain-containing protein 3 and 6 and DnaJC11. FEBS Letters. 581 (18), 3545-3549 (2007).
  16. Zerbes, R. M., et al. Role of MINOS in mitochondrial membrane architecture: Cristae morphology and outer membrane interactions differentially depend on mitofilin domains. Journal of Molecular Biology. 422 (2), 183-191 (2012).
  17. Modi, S., et al. Miro clusters regulate ER-mitochondria contact sites and link cristae organization to the mitochondrial transport machinery. Nature Communications. 10 (1), 4399(2019).
  18. Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
  19. John, G. B., et al. The mitochondrial inner membrane protein mitofilin controls cristae morphology. Molecular Biology of the Cell. 16 (3), 1543-1554 (2005).
  20. Rabl, R., et al. Formation of cristae and crista junctions in mitochondria depends on antagonism between Fcj1 and Su e/g. Journal of Cell Biology. 185 (6), 1047-1063 (2009).
  21. Alkhaja, A. K., et al. MINOS1 is a conserved component of mitofilin complexes and required for mitochondrial function and cristae organization. Molecular Biology of the Cell. 23 (2), 247-257 (2012).
  22. Eramo, M. J., Lisnyak, V., Formosa, L. E., Ryan, M. T. The "mitochondrial contact site and cristae organising system" (MICOS) in health and human disease. Journal of Biochemistry. 167 (3), 243-255 (2020).
  23. Ikeda, A., Imai, Y., Hattori, N. Neurodegeneration-associated mitochondrial proteins, CHCHD2 and CHCHD10-what distinguishes the two. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1-12 (2022).
  24. Sesaki, H., Southard, S. M., Yaffe, M. P., Jensen, R. E. Mgm1p, a dynamin-related GTPase, is essential for fusion of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 14 (6), 2342-2356 (2003).
  25. Fritz, S., Rapaport, D., Klanner, E., Neupert, W., Westermann, B. Connection of the mitochondrial outer and inner membranes by Fzo1 is critical for organellar fusion. Journal of Cell Biology. 152 (4), 683-692 (2001).
  26. Wong, E. D., et al. The intramitochondrial dynamin-related GTPase, Mgm1p, is a component of a protein complex that mediates mitochondrial fusion. Journal of Cell Biology. 160 (3), 303-311 (2003).
  27. Miyata, N., Fujii, S., Kuge, O. Porin proteins have critical functions in mitochondrial phospholipid metabolism in yeast. Journal of Biological Chemistry. 293 (45), 17593-17605 (2018).
  28. Khosravi, S., et al. The UbiB family member Cqd1 forms a novel membrane contact site in mitochondria. J Cell Sci. , (2023).
  29. Kemmerer, Z. A., et al. UbiB proteins regulate cellular CoQ distribution in Saccharomyces cerevisiae. Nature Communications. 12 (1), 4769(2021).
  30. Pon, L., Moll, T., Vestweber, D., Marshallsay, B., Schatz, G. Protein import into mitochondria: ATP-dependent protein translocation activity in a submitochondrial fraction enriched in membrane contact sites and specific proteins. Journal of Cell Biology. 109, 2603-2616 (1989).
  31. Lithgow, T., Timms, M., Hj, P. B., Hoogenraad, N. J. Identification of a GTP-binding protein in the contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 180 (3), 1453-1459 (1991).
  32. Harner, M. Isolation of contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Methods in Molecular Biology. 1567, 43-51 (2017).
  33. Adams, V., Bosch, W., Schlegel, J., Wallimann, T., Brdiczka, D. Further characterization of contact sites from mitochondria of different tissues: topology of peripheral kinases. BBA - Biomembranes. 981 (2), 213-225 (1989).
  34. Izawa, T., Unger, A. K. Isolation of mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 1567, 33-42 (2017).
  35. Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments. (30), 17-19 (2009).
  36. Beavis, A. D., Brannan, R. D., Garlid, K. D. Swelling and Contraction of the Mitochondrial Matrix I. A structural interpretation of the relationship between light scattering and matrix volume. Journal of Biological Chemistry. 260 (25), 13424-13433 (1985).
  37. Born, M., Wolf, E. Principles of optics electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (1999).
  38. Koontz, L. TCA precipitation. Methods in Enzymology. 541, 3-10 (2014).
  39. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  40. Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: A method for studying antibody specificity and antigen structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3116-3120 (1979).
  41. Al-Tubuly, A. A. SDS-PAGE and Western Blotting. Methods Mol Med. 40, 391-405 (2000).
  42. Kurien, B. T., Hal Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. Western Blotting: Methods and Protocols. (3), 1(2015).
  43. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. (16), (2008).
  44. Sherman, F. Getting Started with Yeast. Methods in Enzymology. 194, 3-21 (1991).
  45. Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comparative and Functional Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
  46. Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: More tags and improved practical routines. Yeast. 15, 963-972 (1999).
  47. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
  48. Tsai, P. I., et al. PINK1 Phosphorylates MIC60/Mitofilin to Control Structural Plasticity of Mitochondrial Crista Junctions. Molecular Cell. 69 (5), 744-756 (2018).
  49. Xiao, T., et al. Identification of CHCHD10 Mutation in Chinese Patients with Alzheimer Disease. Molecular Neurobiology. 54 (7), 5243-5247 (2017).
  50. Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).
  51. Chaussenot, A., et al. Screening of CHCHD10 in a French cohort confirms the involvement of this gene in frontotemporal dementia with amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 35 (12), 1-4 (2014).
  52. Chiò, A., et al. CHCH10 mutations in an Italian cohort of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 36 (4), 3-6 (2015).
  53. Genin, E. C., et al. CHCHD 10 mutations promote loss of mitochondrial cristae junctions with impaired mitochondrial genome maintenance and inhibition of apoptosis. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 58-72 (2016).
  54. Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja mitochondriówpęcherzyki submitochondrialnegradient sacharozymitochondria drożdżowekompleks MICOSarchitektura błonyłagodna sonikacjaSDS-PAGEimmunoblotting
Ulepszona metoda izolowania mitochondrialnych miejsc kontaktowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.