Artykuł metodologiczny

Ulepszona metoda izolowania mitochondrialnych miejsc kontaktowych

DOI:

10.3791/65444

⸱

16 czerwca 2023

 ,  , 
1Department of Cell Biology, Biomedical Center, Medical Faculty, Ludwig-Maximilians University Munich, 2Cardio-Metabolic Diseases, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondrialne miejsca kontaktu to kompleksy białkowe, które oddziałują z wewnętrznymi i zewnętrznymi białkami błony mitochondrialnej. Miejsca te są niezbędne do komunikacji między błonami mitochondrialnymi, a tym samym między cytozolem a macierzą mitochondrialną. W tym miejscu opisujemy metodę identyfikacji kandydatów kwalifikujących się do tej konkretnej klasy białek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria są obecne praktycznie we wszystkich komórkach eukariotycznych i pełnią podstawowe funkcje, które wykraczają daleko poza produkcję energii, na przykład syntezę klastrów żelazowo-siarkowych, lipidów lub białek, buforowanie Ca2+ i indukcję apoptozy. Podobnie dysfunkcja mitochondriów prowadzi do poważnych chorób ludzkich, takich jak rak, cukrzyca i neurodegeneracja. Aby pełnić te funkcje, mitochondria muszą komunikować się z resztą komórki przez swoją otoczkę, która składa się z dwóch błon. Dlatego te dwie membrany muszą stale ze sobą współdziałać. Białka mają w tym względzie zasadnicze znaczenie dla miejsc kontaktu między błoną wewnętrzną i zewnętrzną mitochondriów. Do tej pory zidentyfikowano kilka miejsc kontaktowych. W opisanej tutaj metodzie mitochondria Saccharomyces cerevisiae są wykorzystywane do izolowania miejsc kontaktu, a tym samym do identyfikacji kandydatów, którzy kwalifikują się do białek w miejscu kontaktu. Użyliśmy tej metody do identyfikacji mitochondrialnego miejsca kontaktu i kompleksu systemu organizowania cristae (MICOS), jednego z głównych kompleksów tworzących miejsca kontaktu w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, która jest konserwowana od drożdży do ludzi. Ostatnio jeszcze bardziej udoskonaliliśmy tę metodę, aby zidentyfikować nowe miejsce kontaktu składające się z Cqd1 i kompleksu Por1-Om14.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria pełnią u eukariontów wiele różnych funkcji, z których najbardziej znaną jest produkcja ATP poprzez fosforylację oksydacyjną. Inne funkcje obejmują wytwarzanie klastrów żelazowo-siarkowych, syntezę lipidów, a u wyższych eukariontów sygnalizację Ca2+ oraz indukcję apoptozy1,2,3,4. Funkcje te są nierozerwalnie związane z ich złożoną ultrastrukturą.

Ultrastruktura mitochondriów została po raz pierwszy opisana za pomocą mikroskopii elektronowej5. Wykazano, że mitochondria....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. i roztwory podstawowe

  1. Przygotować 1 M roztwór kwasu 3-morfolinopropan-1-sulfonowego (MOPS) w wodzie dejonizowanej o pH 7,4. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować 500 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w wodzie dejonizowanej, pH 8,0. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotuj 2,4 M sorbitol w wodzie dejonizowanej. Przechowywać w temperaturze pokojowej po sterylizacji w autoklawie.
  4. Przygotuj 2,5 M sacharozy w wodzie dejonizowanej. Przechowywać w temperaturze pokojowej po sterylizacji w autoklawie.
  5. Przygotować 200 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) w izopropanolu. Przechow....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stosunkowo łatwo jest oddzielić wewnętrzne i zewnętrzne błony mitochondrialne. Jednak wytwarzanie i oddzielanie pęcherzyków zawierających miejsce kontaktu jest znacznie trudniejsze. Naszym zdaniem dwa etapy są krytyczne i niezbędne: warunki sonikacji i zastosowany gradient.

Zazwyczaj, gradienty liniowe są uważane za lepsze w porównaniu do gradientów krokowych. Jednak ich powtarzalna produkcja jest żmudna i wymaga specjalnego sprzętu. W związku z tym opracowaliśmy metodę generowania gradientu k.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Subfrakcjonowanie mitochondriów to skomplikowany eksperyment składający się z kilku bardzo złożonych etapów. W związku z tym naszym celem było dalsze ulepszanie i do pewnego stopnia uproszczenie naszej ustalonej metody32. Tutaj wyzwaniem było zapotrzebowanie na skomplikowane i wysoce specjalistyczne urządzenia, które często są indywidualnymi konstrukcjami oraz ogromne zużycie czasu i energii. W tym celu staraliśmy się usunąć pompy i poszczególne konstrukcje używane do odlewania i zbierania gradien.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.E.H. dziękuje Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), projekt numer 413985647, za wsparcie finansowe. Autorzy dziękują dr. Michaelowi Kieblerowi z Uniwersytetu Ludwika i Maksymiliana w Monachium za hojne i szerokie wsparcie. Jesteśmy wdzięczni Walterowi Neupertowi za jego wkład naukowy, pomocne dyskusje i nieustającą inspirację. J.F. dziękuje Graduate School Life Science Munich (LSM) za wsparcie.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
13,2 mL, Otwarta cienkościenna ultraprzezroczysta tuba, 14 x 89 mmBeckman Instruments, Niemcy344059
50 mL, Otwarta grubościenna rurka z poliwęglanu Open-Top, 29 x 104 mmBeckman Instruments, Niemcy363647
A-25.50 Wirnik stałokątowy - aluminium, 8 x 50 mL, 25 000 obr./min, 75 600 x gBeckman Instruments, Niemcy363055
Refraktometr AbbegoZeiss, Niemcywycofane,
można używać dowolnego refraktometru Abbego
accu-jet pro Kontroler pipetBrandtech, USABR26320wycofany,
wystarczy dowolny kontroler pipet
Zlewka 1000 mlDWK Life Science, NiemcyC118.1
Branson  Cyfrowy sonifier W-250 DBranson Ultrasonics, Stany ZjednoczoneFIS15-338-125
Branson Ultradźwiękowy 3mm STOŻKOWA MIKROKOŃCÓWKABranson Ultrasonics, USA101-148-062
Branson Ultrasonics Sonizery 200- i 400-watowe: Rozetowa komórka chłodzącaBranson Ultrasonics, USA15-338-70
Wirówka Avanti JXN-26Beckman Instruments, NiemcyB37912
Wirówka Optima XPN-100 ultraBeckman Instruments, Niemcy8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-CocktailRoche, Szwajcaria11697498001
D-SorbitRoth, Niemcy6213
EDTA (dwuwodian soli disodowej kwasu etyleno-tetraoctowego)Roth, Niemcy8043
Kolba Erlenmeyera, 100 mlRoth, NiemcyPipeta miarowa X747.1
, Kl. B, 25:0, 0,1Hirschmann, NiemcyPipeta
, Kl. B, 5:0, 0,05Hirschmann, Niemcy1180153
kąpieli lodowejneoLab, Niemcy  S12651
Mieszadło magnetyczne RCT basicIKA-Werke GmbH, NiemcyZ645060GB-1EA
MOPS (kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy)Gerbu, Niemcy1081
MyPipetman Select P1000Gilson, Stany ZjednoczoneFP10006S
MyPipetman Select P20Gilson, Stany ZjednoczoneFP10003S
MyPipetman Select P200Gilson, Stany Zjednoczone
Omnifix 1 mlBraun, Niemcy4022495251879
Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)Serva, Niemcy32395.03
Kaniula STERICAN 21 Gx4 4/5 0,8x120 mmBraun, Niemcy4022495052414
mieszadło, 15 mmVWR, USA442-0366
SacharozaMerck, NiemcyS8501
SW 41 Ti Rotor z łyżką wahadłowąBeckman Instruments, Niemcy331362
ProbówkiEppendorf, Niemcy3810X
Młynki do tkanek, typ Potter-Elvehjem, szklane naczynie 2 mlVWR, USA432-0200
Młynki do tkanek typu Potter-Elvehjem, tłok 2 ml z ząbkowaną końcówkąVWR, USA432-0212
Kwas trichlorooctowy ( TCA)Sigma Aldrich, Niemcy33731wycofane,
każdy TCA wystarczy (CAS: 73-03-9)
TRISRoth, Niemcy4855
miarowa 1180170FP10005S

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Braymer, J. J., Freibert, S. A., Rakwalska-bange, M., Lill, R. BBA - Molecular Cell Research Mechanistic concepts of iron-sulfur protein biogenesis in Biology * General concepts of FeS protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1868 (1), 118863(2021).
  2. Osman, C., Merkwirth, C., Langer, T.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja mitochondri wp cherzyki submitochondrialnegradient sacharozymitochondria dro d owekompleks MICOSarchitektura b onyagodna sonikacjaSDS PAGEimmunoblotting

Powiązane artykuły