Podejście oparte na widzeniu maszynowym do procesów pracy związanych z transmisyjną mikroskopią elektronową, analizą wyników i zarządzaniem danymi

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący oprogramowanie do widzenia maszynowego do stabilizacji dynamicznych procesów podczas obrazowania TEM, przy jednoczesnym indeksowaniu wielu strumieni metadanych do każdego obrazu na osi czasu, w której można nawigować. Pokazujemy, w jaki sposób platforma ta umożliwia automatyczną kalibrację i mapowanie dawki elektronów w trakcie eksperymentu.

Streszczenie

Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) umożliwia użytkownikom badanie materiałów w ich podstawowej, atomowej skali. Złożone eksperymenty rutynowo generują tysiące obrazów z wieloma parametrami, które wymagają czasochłonnej i skomplikowanej analizy. AXON synchronicity to oprogramowanie do synchronizacji wizji maszynowej (MVS) zaprojektowane w celu rozwiązania problemów związanych z badaniami TEM. Po zainstalowaniu na mikroskopie umożliwia ciągłą synchronizację obrazów i metadanych generowanych przez mikroskop, detektor i systemy in situ podczas eksperymentu. Łączność ta umożliwia zastosowanie algorytmów widzenia maszynowego, które stosują kombinację korekcji przestrzennych, wiązkowych i cyfrowych w celu wyśrodkowania i śledzenia obszaru zainteresowania w polu widzenia oraz zapewniają natychmiastową stabilizację obrazu. Oprócz znacznej poprawy rozdzielczości zapewnianej przez taką stabilizację, synchronizacja metadanych umożliwia zastosowanie algorytmów obliczeniowych i analizy obrazu, które obliczają zmienne między obrazami. Te obliczone metadane mogą służyć do analizowania trendów lub identyfikowania kluczowych obszarów zainteresowania w zestawie danych, co prowadzi do nowych szczegółowych informacji i rozwoju bardziej zaawansowanych funkcji widzenia maszynowego w przyszłości. Jednym z takich modułów, który opiera się na tych obliczonych metadanych, jest kalibracja dawki i zarządzanie nią. Moduł dawki zapewnia najnowocześniejszą kalibrację, śledzenie i zarządzanie zarówno fluencją elektronów (e^-/Ų·^s-1), jak i dawką skumulowaną (e^-/Ų), która jest dostarczana do określonych obszarów próbki na zasadzie piksel po pikselu. Umożliwia to kompleksowy przegląd interakcji między wiązką elektronów a próbką. Analiza eksperymentów jest usprawniona dzięki dedykowanemu oprogramowaniu analitycznemu, w którym zestawy danych składające się z obrazów i odpowiadających im metadanych można łatwo wizualizować, sortować, filtrować i eksportować. W połączeniu narzędzia te ułatwiają efektywną współpracę i analizę eksperymentalną, zachęcają do eksploracji danych i zwiększają możliwości korzystania z mikroskopii.

Wprowadzenie

Transmisyjne mikroskopy elektronowe (TEM) i ich możliwości ogromnie skorzystały z postępów w dziedzinie kamer, detektorów, uchwytów na próbki i technologii obliczeniowych. Jednak te postępy są hamowane przez rozłączone strumienie danych, ograniczenia operacji człowieka i kłopotliwą analizę danych^1,2. Co więcej, eksperymenty in situ i operando adaptują TEM do laboratoriów w nanoskali w czasie rzeczywistym, umożliwiając badanie próbek w środowisku gazowym lub ciekłym przy jednoczesnym zastosowaniu szeregu bodźców zewnętrznych^3,4,5. Przyjęcie tak złożonych przepływów pracy tylko pogłębiło te ograniczenia, a wynikający z tego wzrost rozmiaru i złożoności tych strumieni danych jest obszarem rosnącego zaniepokojenia. W związku z tym coraz większy nacisk kładzie się na wykorzystanie możliwości działania maszynowego w celu wyszukiwania, uzyskiwania dostępu, współdziałania i ponownego wykorzystywania danych, praktyka znana jako zasady FAIR⁶. Publikowanie danych badawczych zgodnie z koncepcją zasad FAIR spotkało się z przychylnym zainteresowaniem agencji rządowych na całym świecie^7,8, a zastosowanie zasad FAIR przy użyciu oprogramowania do widzenia maszynowego jest kluczowym krokiem w ich przyjęciu.

Platforma oprogramowania do synchronizacji wizji maszynowej (MVS) została opracowana w odpowiedzi na specyficzne problemy związane z przeprowadzaniem i analizowaniem złożonych, obfitujących w metadane eksperymentów TEM (szczególnie eksperymentów in situ i operando)⁹. Po zainstalowaniu na TEM oprogramowanie MVS łączy, integruje się i komunikuje z kolumną mikroskopu, detektorami i zintegrowanymi systemami in situ. Dzięki temu może w sposób ciągły zbierać obrazy i dopasowywać je do ich metadanych eksperymentalnych, tworząc obszerną bazę danych z możliwością przeszukiwania, oś czasu eksperymentu od początku do końca (Rysunek 1). Ta łączność pozwala oprogramowaniu MVS na stosowanie algorytmów, które inteligentnie śledzą i stabilizują obszar zainteresowania (ROI), nawet gdy próbki przechodzą zmiany morfologiczne. Oprogramowanie stosuje korekty sceny, wiązki i korekt cyfrowych w razie potrzeby, aby ustabilizować zwrot z inwestycji dzięki funkcjom Drift Control i Focus Assist. Oprócz wzbogacania obrazów o surowe metadane uzyskane z różnych systemów eksperymentalnych, oprogramowanie może tworzyć nowe, obliczeniowe metadane przy użyciu algorytmów analizy obrazu do obliczania zmiennych między obrazami, co pozwala na automatyczną korektę dryfu próbki lub zmian ostrości.

Obrazy TEM i związane z nimi metadane zebrane za pomocą oprogramowania MVS są zorganizowane jako eksperymentalna oś czasu, która może być otwarta i przeglądana przez każdego za pośrednictwem bezpłatnej, offline wersji oprogramowania do analizy, Studio (zwanego dalej oprogramowaniem do analizy)¹⁰. Podczas eksperymentu oprogramowanie MVS synchronizuje i rejestruje trzy rodzaje obrazów z kamery lub detektora mikroskopu, które są wyświetlane w górnej części osi czasu poniżej przeglądarki obrazów: pojedyncza akwizycja (pojedyncze obrazy akwizycji uzyskane bezpośrednio z oprogramowania TEM), RAW (obrazy z detektora/kamery na żywo, do których nie zastosowano żadnych cyfrowych korekcji dryfu; obrazy te mogły zostać fizycznie skorygowane za pomocą ruch sceny lub przesunięcie wiązki) i korekcja dryfu (obrazy z detektora/kamery na żywo, które zostały cyfrowo przesunięte). Dane zebrane podczas eksperymentu lub sesji można dalej uściślać do mniejszych sekcji lub fragmentów danych, nazywanych kolekcjami, bez utraty osadzonych metadanych. Z poziomu oprogramowania analitycznego obrazy, stosy obrazów i metadane można bezpośrednio eksportować do różnych obrazów i typów arkuszy kalkulacyjnych w otwartym formacie w celu analizy przy użyciu innych narzędzi i programów.

Struktura kontroli mikroskopu, stabilizacji i integracji metadanych możliwa przez oprogramowanie MVS pozwala również na implementację dodatkowych programów lub modułów widzenia maszynowego, zaprojektowanych w celu złagodzenia ograniczeń w obecnych przepływach pracy TEM. Jednym z pierwszych modułów opracowanych w celu wykorzystania tej platformy synchronizacji jest kalibracja dawki elektronów i śledzenie przestrzenne obszarów naświetlonych wiązką w próbce. Wszystkie obrazy TEM powstają w wyniku interakcji między próbką a wiązką elektronów. Jednak te interakcje mogą również powodować negatywne, nieuniknione skutki dla próbki, takie jak radioliza i uszkodzenia efektu domina^11,12, i wymagają starannej równowagi między zastosowaniem wystarczająco wysokiej dawki elektronów do wygenerowania obrazu a zminimalizowaniem wynikowego uszkodzenia wiązki^13,14.

Chociaż wielu użytkowników polega na pomiarach prądu na ekranie w celu oszacowania dawki elektronów, wykazano, że ta metoda znacznie zaniża rzeczywisty prąd wiązki¹⁵. Jakościowe wartości dawki można uzyskać za pomocą prądu ekranowego na tym samym mikroskopie z tymi samymi ustawieniami, ale odtworzenie tych warunków dawki przy użyciu różnych mikroskopów lub ustawień jest wysoce subiektywne. Dodatkowo, wszelkie korekty parametrów obrazowania dokonane przez użytkownika podczas eksperymentu, takie jak rozmiar plamki, apertura, powiększenie czy intensywność, wymagają osobnego pomiaru prądu ekranu w celu obliczenia wynikowej dawki. Użytkownicy muszą albo rygorystycznie ograniczyć warunki obrazowania używane podczas danego eksperymentu, albo skrupulatnie mierzyć i rejestrować każdy użyty stan soczewki, co znacznie komplikuje i rozszerza eksperyment poza to, co jest wykonalne dla normalnej pracy mikroskopu^16,17.

Dozy, określana w tym protokole jako oprogramowanie do dozowania, jest modułem oprogramowania do kalibracji dawki, który wykorzystuje dedykowany uchwyt kalibracyjny przeznaczony do umożliwienia automatycznych pomiarów prądu. Kubek Faradaya, złoty standard dokładnej kalibracji prądu wiązki¹⁵, jest zintegrowany z końcówką uchwytu kalibracyjnego. Oprogramowanie MVS wykonuje serię kalibracji prądu wiązki i obszaru wiązki dla każdego stanu obiektywu i osadza te wartości na obrazach na poziomie pikseli.

W tym artykule wideo, protokoły oprogramowania MVS zaprojektowane w celu usprawnienia wszystkich obszarów przepływu pracy TEM są prezentowane przy użyciu reprezentatywnych próbek nanomateriałów. Wrażliwa na wiązkę próbka nanocząstek zeolitu¹⁴ służy do demonstracji procesów kalibracji i zarządzania dawką. Przeprowadzamy reprezentatywny eksperyment ogrzewania in situ przy użyciu nanokatalizatora Au/FeO_x^18,19 próbki, która po podgrzaniu ulega znaczącym zmianom morfologicznym. Ten eksperyment in situ podkreśla algorytmy stabilizacji oprogramowania i jego zdolność do zestawiania wielu strumieni metadanych, co jest nieodłącznym wyzwaniem dla badań in situ i operando. Chociaż nie zostało to opisane w protokole, ze względu na jego unikalną czułość na dawkę elektronów, omawiamy reprezentatywne przykłady użyteczności oprogramowania do badań ciekłego EM (dla których protokoły zostały wcześniej opisane w literaturze^20,21,22) oraz jak te techniki można zastosować w celu lepszego zrozumienia wpływu dawki na eksperymenty z cieczą-EM. Na koniec pokazujemy, w jaki sposób usprawnia się analizę danych za pomocą oprogramowania do analizy offline do wizualizacji, filtrowania i eksportowania różnych plików graficznych, wideo i danych do innych dostępnych formatów.

Rysunek 1: Przykłady interfejsu użytkownika dla MVS i oprogramowania analitycznego. (A) Panel podglądu obrazu oprogramowania do synchronizacji i panel sterowania. Połączenie między TEM a oprogramowaniem synchronizacyjnym jest nawiązywane poprzez aktywację przycisku Połącz, który przesyła obrazy i metadane z mikroskopu do oprogramowania synchronizującego. Z poziomu przeglądarki obrazów operator może wykonywać różne operacje wspomagane wizją maszynową, takie jak Drift Correct i Focus Assist. Zapewnia również możliwość stosowania obrazów tagów i sesji przeglądu bez zakłócania zbierania danych. (B) Zrzut ekranu przedstawiający oprogramowanie do analizy obrazu z zaznaczoną lokalizacją portu widoku obrazu, osi czasu oraz panelu Metadane i analiza. Dostęp do oprogramowania analitycznego można uzyskać w dowolnym momencie eksperymentu, aby przejrzeć obrazy uzyskane do tego momentu za pomocą przycisku Przeglądaj sesję. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

1. Metoda 1: Kalibracja dawki transmisyjnego mikroskopu elektronowego dla trybów obrazowania TEM i skaningowego TEM (STEM)

1. Włączyć pikoamperomierz i pozostawić go do rozgrzania przez co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem kalibracji dawki. Załaduj uchwyt do kalibracji dawki do TEM i podłącz uchwyt kalibracyjny do pikoamperomierza za pomocą szybkiego połączenia.
2. Gdy mikroskop jest w trybie TEM, otwórz zawory kolumny i zlokalizuj otwór odniesienia 35 μm w uchwycie dawki (Rysunek 2). Uruchom aplikację MVS i wybierz Dawka (Automatyzacja kalibracji) z opcji eksperymentu.
   UWAGA: Lokalizacja otworu odniesienia jest zapisywana przez oprogramowanie po wstępnej kalibracji, dzięki czemu oprogramowanie automatycznie lokalizuje swoją pozycję na potrzeby przyszłych kalibracji.
3. Kliknij ikonę Connect (Rysunek 1A) i wybierz mikroskop, aby aktywować połączenie między TEM a oprogramowaniem MVS. Po nawiązaniu połączenia obrazy z kamery/detektora będą widoczne w przeglądarce obrazów oprogramowania.
   UWAGA: Nie jest konieczna optymalizacja wysokości eucentrycznej, a krawędź otworu referencyjnego może wydawać się rozmyta ze względu na grubość końcówki. Nie będzie to miało wpływu na bieżące pomiary.
4. Przejdź do zakładki Dawka, a następnie do opcji Kalibracja dawki. Wybierz proces kalibracji obszaru dawki, postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania i wprowadź żądane wartości konfigurowane przez użytkownika (takie jak ustawienia przysłony i monochromatora). Po zakończeniu kalibracji obszaru dawki wybierz proces kalibracji prądu dawki i postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania.
5. Powtórz proces kalibracji (krok 1.4) dla każdego rozmiaru plamki, apertury lub ustawienia monochromatora, które mogą być wykorzystane podczas eksperymentu.
6. Po zakończeniu procesu kalibracji w trybie TEM skalibruj dawkę elektronów dla trybu STEM, powtarzając krok 1.4.
   UWAGA: Tryb STEM nie wymaga przeprowadzenia kalibracji obszaru dawki.
7. Po zakończeniu wszystkich żądanych kalibracji kliknij przycisk Zamknij sesję, wyjmij uchwyt kalibracji dawki i wróć do ekranu startowego oprogramowania MVS.

2. Metoda 2: Określenie progu dawki za pomocą MVS i oprogramowania dawkującego

1. Załaduj standardową siatkę TEM z próbką (w tym przykładzie użyto dostępnych na rynku nanocząstek zeolitu ZSM-5) do standardowego uchwytu TEM. Włóż uchwyt do TEM i zlokalizuj obszar zainteresowania (krystaliczne nanocząstki zeolitu).
2. Otwórz aplikację MVS i wybierz Inne.
   UWAGA: Dodatkowe informacje o próbce (np. identyfikator i opis próbki, nazwa operatora i uwagi dotyczące eksperymentu) można dodać do pola parametrów eksperymentalnych.
3. Powtórz krok 1.3, aby połączyć się z oprogramowaniem MVS i przejdź do zakładki metadanych obrazu w interfejsie oprogramowania MVS, aby wybrać następujące metadane do nałożenia na strumień obrazu pokazany na wyświetlaczu na żywo: Powiększenie, Maksymalna dawka i Dawka. Inne metadane mogą zostać dołączone, jeśli użytkownik sobie tego życzy. Zrzut ekranu interfejsu oprogramowania MVS przedstawiający elementy sterujące zarządzania dawką znajduje się w pliku uzupełniającym 1.
4. Otwórz kartę Dawka i wybierz Zarządzanie dawką i Włącz monitorowanie dawki, aby aktywować automatyczne śledzenie dawki elektronów. Wybierz opcję Pokaż warstwę dawki, aby wyświetlić nakładkę koloru dozy.
5. Ustaw wartości dla wysokiego poziomu dawki i wysokiej dawki i naciśnij Zapisz (w tym przykładzie użyto odpowiednio wartości 60 000 e^-/Ų i 500 e^-/Ų·s).
6. Przejdź do zakładki Ustawienia, wybierz opcję Dawka i ustaw wartości Krycie mapy nawigacji po dawce i Krycie nakładki obrazu dawki (w tym przykładzie użyto odpowiednio wartości 0,50 i 0,30).
7. W oknie Live Image Viewer aktywuj korekcję dryfu, klikając opcję Drift Correct.
8. Przejdź do karty Widok danych i wykreśl wartości metadanych Defocus i Focus Quotient na osi Y.
   UWAGA: Dowolne z dostępnych wartości metadanych mogą być wykreślane w czasie rzeczywistym podczas eksperymentu z tabeli widoku danych.
9. Aktywuj funkcję Focus Assist, a następnie wybierz opcję Kalibruj ostrość, aby uruchomić automatyczną kalibrację wspomagania ustawiania ostrości. Po zakończeniu procedury kalibracji ostrości zamknij kartę Widok danych.
10. Otwórz zakładkę Image Analysis (Analiza obrazu) w oprogramowaniu MVS i aktywuj opcje Live FFT oraz Quadrants 1 i 2.
11. Korzystając z elementów sterujących oprogramowania mikroskopu, dostosuj warunki wiązki tak, aby strumień elektronów wynosił ~500 e^-/Ų·s. i przejdź do nowego obszaru w próbce i wyśrodkuj zwrot z inwestycji próbki w podglądzie na żywo w oprogramowaniu MVS.
    UWAGA: Podczas wykonywania dużych ruchów scenicznych, kontrola dryfu i wspomaganie ostrości zostaną automatycznie wyłączone i muszą zostać ponownie włączone po wybraniu nowego ROI.
12. Zanotuj warunki dawkowania w oprogramowaniu za pomocą funkcji Tag. Podświetl ikonę Znacznik i wprowadź żądany tekst, aby oznaczyć określoną serię obrazów na osi czasu. Obrazy będą oznaczane tym tekstem, dopóki ikona Tag nie zostanie odznaczona.
13. Utrzymuj stałą szybkość dawki, jednocześnie stale obrazując ten sam zwrot z inwestycji, aż do zniknięcia pików odpowiadających strukturze atomowej na wykresie FFT.
14. Zmniejsz powiększenie, otwórz kartę Dose Management (Zarządzanie dawką) i aktywuj opcję Show Dose Layer (Pokaż warstwę dawki), aby nałożyć na nią mapę dawek oznaczoną kolorami.
    UWAGA: Ta funkcja zapewnia wizualne odniesienie do obszarów próbki, które zostały wystawione na działanie wiązki elektronów i ich względnej ekspozycji na dawkę. Podświetlenie tych obszarów na poszczególnych obrazach kursorem wskaże odpowiednie wartości dawki.
15. Rozłącz i zakończ sesję, usuwając zaznaczenie opcji Połącz, a następnie wybierz pozycję Zamknij sesję. Zapisz kopię danych sesji w źródle zewnętrznym, aby zapobiec nadpisaniu danych zapisanych w oprogramowaniu MVS podczas kolejnych eksperymentów (plik uzupełniający 2).

3. Metoda 3: Analiza metadanych i trendów oraz eksport danych za pomocą oprogramowania analitycznego

1. Uruchom oprogramowanie analityczne (oprogramowanie offline do przeglądania w pełni zsynchronizowanych zestawów danych) i otwórz plik sesji eksperymentu, wybierając go z biblioteki plików.
   UWAGA: Użytkownicy mogą również uzyskać dostęp do oprogramowania analitycznego za pomocą ikony Review Session (Sesja przeglądu) w oprogramowaniu MVS podczas eksperymentu.
2. Wyświetl obrazy z korekcją dryfu, aktywując kartę DC poniżej portu widoku obrazu i wybierz żądane nakładki danych, zaznaczając odpowiednie pola Dane nakładki na karcie Metadane obrazu (w tym przykładzie Mikroskop, Data/Godzina, Dawka maksymalna, Dawka maksymalna i Powiększeniezostały użyte). Inne metadane mogą być wykreślane zgodnie z życzeniem użytkownika.
3. Zaznacz pole Oś czasu dla Dawki maksymalnej i Dawki dawki, aby dodać wykres graficzny tych wartości do osi czasu. Podświetl lub przewiń te wykresy graficzne, aby zaktualizować obraz wyświetlany w rzutni. Uzyskaj dostęp do różnych narzędzi za pośrednictwem kart Notatki, Analiza obrazu, Przybornik i Widok danych.
   1. Uzyskaj dostęp do FFT dla każdego obrazu za pomocą karty Analiza obrazu i kliknij Live FFT, aby zaktualizować FFT podczas przewijania obrazów.
   2. Użyj zanikania pików FFT, aby określić punkt czasowy, w którym struktura zeolitu traci krystaliczność. Zapisz maksymalną wartość dawki zarejestrowaną na tym obrazie.
4. Użyj opcji Filtruj, aby łatwo filtrować duże zestawy danych do mniejszych, które można udostępniać, bez utraty skojarzonych z nimi metadanych. Otwórz panel filtrów i dostosuj suwaki tak, aby wybrane były tylko dane o mocy dawki równej lub wyższej niż ~500 e^-/^{Å 2}·s, a następnie zapisz nową kolekcję pod nazwą Dose Threshold Study.
   UWAGA: Filtry mogą być stosowane do dowolnego z powiązanych typów metadanych.
5. Eksportuj obrazy i metadane z sesji do innych typów plików wzbogaconych o paski skali i nakładki metadanych.
   1. Wyróżnij kolekcję w okienku biblioteki i wybierz opcję Publikuj, klikając zaznaczenie prawym przyciskiem myszy. W oknie Publikowanie wybierz żądane opcje eksportu typu pliku.
   2. Wybierz zakładkę danych skorygowanych dryfu i zastosuj nakładki dowolnych metadanych i FFT (ustaw nakładkę FFT zgodnie z potrzebami; przykłady obrazów wyeksportowanych za pomocą FFT są pokazane w Rysunek 3).
6. Wyeksportuj serię obrazów jako plik filmowy, korzystając z tej samej opcji Publikuj. Wybierz obrazy, podświetlając je na osi czasu, korzystając z opcji filtrowania lub eksportując pełny plik bazy danych. Wybierz żądany format filmu, liczbę klatek na sekundę i lokalizację pliku. Film przedstawiający doświadczenie degradacji zeolitu uzyskany przy użyciu TEM 200 kV znajduje się w pliku uzupełniającym 3.
7. Wyeksportuj metadane oddzielnie od pobranych obrazów jako plik CSV, wybierając opcję Metadane (CSV) podczas publikowania.
   UWAGA: Obrazy RAW i obrazy z korekcją dryfu są eksportowane jako osobne pliki CSV (plik uzupełniający 4 i plik uzupełniający 5).

4. Metoda 4: Badanie ogrzewania in situ złota na nanocząstkach tlenku żelaza

1. Umieść nanokatalizator (Au/FeO_x) zawieszony w etanolu na chipie elektronicznym podgrzewacza in situ, mikoelektromechanicznym nośniku próbki (MEM) i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Zamontuj próbkę w uchwycie grzewczym in situ, włóż uchwyt z próbką do TEM i podłącz uchwyt do zasilania za pomocą dostarczonego. Zlokalizuj przykładowy zwrot z inwestycji za pomocą kontrolek TEM.
   UWAGA: W tym eksperymencie wykorzystano uchwyt grzewczy, który jest w pełni zintegrowany z oprogramowaniem MVS, umożliwiając osadzanie metadanych temperatury na obrazach.
2. Wybierz odpowiednią opcję przepływu pracy w oprogramowaniu MVS (w tym przykładzie użyto Fusion Workflow, ale można użyć uchwytów grzewczych innych producentów, wybierając opcję Inne).
3. Postępuj zgodnie z instrukcjami przepływu pracy, aby potwierdzić połączenie elektryczne między uchwytem a e-chipem grzewczym, ładując plik kalibracyjny i przeprowadzając kontrolę urządzenia.
4. Podłącz mikroskop do oprogramowania MVS, jak pokazano wcześniej w krokach 2.3-2.10 (w tym przykładzie wybrano wartości metadanych dla szybkości dawki, dawki maksymalnej, korelacji dopasowania, szybkości dryftu i temperatury kanału A) i wyśrodkuj zwrot z inwestycji próbki w polu view.
5. Otwórz zakładkę Fusion AX, a następnie skonfiguruj i zastosuj temperaturę.
6. Kliknij przycisk Ustawienia kanału A, aby uzyskać dostęp do ustawień kontroli temperatury. Wybierz funkcję Temperatura i Tryb sterowania ręcznego.
7. Kliknij przycisk Eksperyment, aby uzyskać dostęp do eksperymentalnych elementów sterujących. Ustaw szybkość narastania na 10 °C/s, a cel na 600 °C. Kliknij Zastosuj, aby rozpocząć eksperyment.
   UWAGA: Eksperyment można wstrzymać lub zatrzymać w dowolnym momencie za pomocą przycisków szybkiego dostępu w prawym dolnym rogu oprogramowania MVS, bez otwierania zakładki Fusion AX.
8. Po osiągnięciu ustawionej temperatury 600 °C otwórz zakładkę Fusion AX i wybierz Eksperyment. Zmień szybkość narastania na 2 °C, a cel na 800 °C. Kliknij Zastosuj, aby rozpocząć eksperyment.
   UWAGA: Procedura stosowania rampy grzewczej zależy od zastosowanego systemu ogrzewania na miejscu. Kroki wyróżnione powyżej w celu zastosowania rampy temperatury mają zastosowanie do systemu użytego w tym przykładzie.
9. Wyróżnij wszystkie wydarzenia lub interesujące miejsca podczas eksperymentu za pomocą funkcji tagowania, jak pokazano w kroku 2.10. Kontynuuj obrazowanie próbki i dostosuj profil temperatury zgodnie z potrzebami. Po zakończeniu kliknij przycisk Zakończ sesję i zapisz plik danych za pomocą oprogramowania analitycznego (część pliku bazy danych omówionego w reprezentatywnych wynikach jest dostarczana jako plik uzupełniający 6).
10. Otwórz oprogramowanie analityczne, aby przejrzeć sesję. Wykreśl temperaturę, matrycowy współczynnik morfingu, szybkość dawki i dawkę skumulowaną na osi czasu. Eksportuj obrazy i filmy zgodnie z potrzebami, wykonując czynności opisane w krokach 3.6 i 3.7. Obrazy i filmy mogą być eksportowane z nakładkami mapy dawek lub bez nich (Rysunek 4).

Wyniki

Ta praca podkreśla użyteczność pozyskiwania danych za pomocą oprogramowania MVS do obrazowania TEM i eksperymentów in situ. Wyrównanie mikroskopu i ustawienie warunków zostało wykonane i wybrane za pomocą domyślnych elementów sterujących producenta TEM. Po wstępnej konfiguracji protokoły przedstawione w tym artykule wideo zostały przeprowadzone za pomocą oprogramowania MVS. We wszystkich eksperymentach przedstawionych w protokole wideo i danych reprezentatywnych zastosowano TEM 300 kV, z wyjątkiem danych porównawczych zeolitu, które uzyskano przy użyciu zimnego FEG 200 kV (Rysunek 3D-F i Tabela 1). Wszystkie metadane zostały automatycznie zebrane i wyrównane do odpowiednich obrazów przez oprogramowanie MVS.

Po uruchomieniu oprogramowania i wybraniu odpowiedniego przepływu pracy z menu, połączenie z mikroskopem jest nawiązywane poprzez aktywację przycisku Połącz na pasku narzędzi po lewej stronie przeglądarki obrazów, jak pokazano na Rysunek 1A. Gdy przycisk Połącz jest podświetlony, obrazy i powiązane metadane z mikroskopu są automatycznie przesyłane strumieniowo do oprogramowania MVS i wyświetlane w okienku widoku obrazu. Te obrazy i związane z nimi metadane są zapisywane chronologicznie na osi czasu, którą można otwierać, przeglądać i analizować bez przerywania zapisywania nowych danych na osi czasu (Rysunek 1B). Przesyłanie strumieniowe może zostać przerwane przez użytkownika w dowolnym momencie, dezaktywując ikonę Połącz.

Po aktywacji połączenia, można uzyskać dostęp do innych przepływów pracy, które są zależne od struktury oprogramowania MVS. W przykładach pokazanych w tym protokole wideo kalibracja dawki musi zostać przeprowadzona przed rozpoczęciem korzystania z innych funkcji oprogramowania MVS. Kalibracja dawki jest zautomatyzowanym procesem kontrolowanym przez oprogramowanie MVS; wykorzystuje dedykowany uchwyt do kalibracji dawki kubka Faradaya do pomiaru prądu i powierzchni wiązki dla kombinacji parametrów. Uchwyt do kalibracji kubka Faradaya, pokazany na Rysunek 2, łączy się z zewnętrznym pikoamperomierzem, który precyzyjnie mierzy prąd wiązki. Po włożeniu do mikroskopu otwór wyrównujący odniesienia jest centrowany, a żądane warunki wiązki do kalibracji (rozmiary plamek, apertury i powiększenia) są wprowadzane do oprogramowania. Oprogramowanie wykonuje szereg kroków kalibracji dla każdej kombinacji wybranych warunków. Podczas kalibracji dawki uchwyt automatycznie przesuwa się między zintegrowanym kubkiem odbieraka prądu Faradaya a otworem przelotowym. Aktualny pomiar dla każdej kombinacji warunków soczewek jest mierzony na miseczce Faradaya za pomocą pikoamperomierza. Następnie oprogramowanie przekształca stolik, aby wyśrodkować belkę w otworze przelotowym, a powierzchnia belki jest określana za pomocą algorytmów widzenia maszynowego. Ta seria pomiarów buduje profil zależności między intensywnością/jasnością a obszarem wiązki. Dzięki temu oprogramowanie może ekstrapolować obszar wiązki, ponieważ ustawienie intensywności/jasności jest regulowane podczas eksperymentu, niezależnie od pola widzenia. Na podstawie tych pomiarów prądu wiązki i powierzchni wiązki obliczane są wartości dawki skumulowanej i szybkości dawki, a następnie generowany jest plik kalibracji dawki. Proces ten zasadniczo określa "odcisk palca" dawki dla TEM i jego indywidualnych warunków soczewki. Po skalibrowaniu dawki dla TEM użytkownik jest w stanie normalnie pracować i swobodnie regulować powiększenie i intensywność bez utraty informacji o dawce lub ręcznego robienia notatek¹⁷. Po zakończeniu kalibracji wyjmuje się uchwyt do kalibracji dawki, co pozwala na wprowadzenie próbki w normalny sposób. Proces kalibracji zarówno w trybie TEM, jak i STEM trwa zwykle mniej niż 10 minut.

Po kalibracji warunków dawki, zakupiona na rynku próbka nanocząstki zeolitu (ZSM-5) została zobrazowana w warunkach wysokiej dawki w celu określenia progowej (skumulowanej) dawki, przy której próbka jest zbyt uszkodzona, aby dostarczyć informacji strukturalnych. Nanocząstki ZSM-5 zawieszono w etanolu i odlewano metodą dropcast na konwencjonalnej miedzianej siatce TEM. Były one obrazowane w sposób ciągły przy napięciu 300 kV w trybie TEM przy użyciu plamki o rozmiarze 3 i aperturze kondensatora 100 μm. Szybkość dawki odczytana przez oprogramowanie MVS w warunkach wysokiej dawki wynosiła 519 e^-/^{Å 2}·s. Nanocząstki w polu widzenia były obrazowane w sposób ciągły, aż do zniknięcia pików w FFT, co wskazuje na degradację struktury krystalicznej, jak pokazano w Rysunek 3A-C i plik uzupełniający 3. Nakładki (które można dodać podczas eksperymentu na żywo lub później w oprogramowaniu do analizy) zostały zastosowane do obrazów TEM, aby pokazać datę i godzinę, dawkę maksymalną, maksymalną (skumulowaną) dawkę i powiększenie. Szybkość dawki była utrzymywana na stałym poziomie podczas eksperymentów, przy czym dawka skumulowana (dawka maksymalna) wzrastała w funkcji czasu. Piki FFT zaczęły zanikać po 42 s ciągłego obrazowania (Ryc. 3B). Po 1 minucie i 20 sekundach oraz skumulowanej dawce ~60 000 e^-/Ų, piki FFT całkowicie zniknęły (Ryc. 3C).

Aby pokazać, że ta metoda kalibracji generuje ilościowe pomiary dawki, które mogą być stosowane do innych mikroskopów działających w różnych ustawieniach, ten sam proces kalibracji i eksperyment degradacji zeolitu został przeprowadzony przy użyciu pistoletu emisyjnego 200 kV (FEG) TEM i wielkości plamki 1. Mikroskop ten został skalibrowany przy użyciu tej samej procedury opisanej w Metodzie 1, a ten sam eksperyment opisany w Metodzie 2 został przeprowadzony przy użyciu nowego rozmiaru plamki i ustawień apertury. Ustawienia wiązki dostosowano tak, aby różnica w zastosowanej dawce między dwoma eksperymentami była znikoma (499 e^-/Ų·s vs. 519 e^-/Ų·s). Jak pokazano w Rysunek 3 D-F i podsumowane w Tabeli 1, plamki FFT całkowicie znikają po 1 minutach i 50 sekundach ciągłego obrazowania i skumulowanej dawce 58 230 e^-/A², co jest zgodne z wartościami uzyskanymi w pierwszym eksperymencie.

Przykład tego, jak oprogramowanie MVS może przynieść korzyści w eksperymentach in situ, został pokazany poprzez przeprowadzenie eksperymentu z ogrzewaniem. Reprezentatywna próbka nanokatalizatora, Au/FeO_x (zsyntetyzowana zgodnie z opublikowaną procedurą¹⁹), została wybrana jako przykładowy system, ponieważ ulega dynamicznym zmianom morfologicznym i strukturalnym w wysokich temperaturach. Ta ruchliwość spowodowana temperaturą sprawia, że trudno jest utrzymać ROI wyśrodkowany w polu widzenia ze względu na własny ruch próbki i rozszerzalność cieplną próbki podczas zmian temperatury¹⁸. Przy włączonych funkcjach Drift Correct i Focus Assist próbka była obrazowana przez okres ~30 s w temperaturze 800 °C. W podwyższonych temperaturach nanocząstki złota w Au / FeO_x migrowały wzdłuż powierzchni nośnika tlenku żelaza i spiekały się, tworząc większe cząstki, jak pokazano na Rysunek 4 i jako film w pliku uzupełniającym 7. Rysunek 5 pokazuje serię migawek TEM (Rysunek 5A-F) porowatego obszaru wewnątrz nanokatalizatora Au/FeO_x, zarejestrowanych w różnych punktach czasowych (Rysunek 5G) podczas eksperymentu z ogrzewaniem in situ. Skoordynowana wartość dryftu zwrotu z inwestycji została automatycznie obliczona przez oprogramowanie. Skoordynowane wartości dryfu i temperatury obrazów w trakcie serii są pokazane graficznie w Rysunek 5G. Zgodnie z oczekiwaniami, skoordynowany dryft próbki zwiększa się wraz ze wzrostem profilu temperatury, od szybkości ~9 nm/min do ~62 nm/min, i zaczyna spadać w kierunku wyrównania, gdy temperatura jest utrzymywana na stałym poziomie. Pomimo tak wysokiego tempa dryftu i zmian w morfologii próbki, obrazy o wysokiej rozdzielczości są łatwo uzyskiwane podczas wzrostu temperatury, ujawniając ruch w porowatym obszarze, jak pokazano w pliku uzupełniającym 8. Zapoznaj się z plikiem uzupełniającym 9, aby uzyskać instrukcje pobierania i specyfikacje komputera.

Rysunek 2: Kalibracja i śledzenie dawki elektronów. (A) Dawka jest kalibrowana za pomocą dedykowanego uchwytu na próbkę, który zawiera kolektor prądu umieszczony na płaszczyźnie próbki do pomiarów prądu wiązki. (B) Ilustracja cech konstrukcji końcówki: Po lewej: kubek Faradaya; Środek: otwór odniesienia; Po prawej: otwór przelotowy (C). Zastosowaną dawkę elektronów można zobrazować w oprogramowaniu za pomocą map oznaczonych kolorami, aby oznaczyć różne ekspozycje dawki na obrazie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Degradacja nanocząstek zeolitu (ZSM-5) wywołana dawką elektronów. (A-C) Migawki wykonane w okresie 1 minuty i 20 s pokazujące dane degradacji uzyskane przy 300 kV FEG i zmierzonej mocy dawki 519 e^-/Ų·s; zeolit ulega degradacji w ciągu 1 minuty i 20 s. (D-E) Migawki wykonane w okresie 1 minuty i 50 s przedstawiające dane degradacji uzyskane przy zimnym FEG TEM 200 kV i szybkości dawki elektronów 499 e^-/Ų·s; wstawki pokazują, że plamka FFT blaknie z czasem. Podziałka wynosi 60 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Synchronizacja AXON wykorzystuje algorytmy widzenia maszynowego do śledzenia i stabilizacji dynamicznie zmieniających się próbek. Metadane wygenerowane podczas eksperymentu można wykreślić wzdłuż osi czasu, co pozwala użytkownikowi szybko sparować obraz z powiązanymi z nim metadanymi podczas przewijania serii obrazów wygenerowanych podczas eksperymentu. (A-H) Obrazy próbki nanokatalizatora (Au/FeO_x) w temperaturze 800 °C zarejestrowane w okresie 28 s zarówno z (A-D), jak i bez (E-H) nałożoną mapą dawek. Czerwone obszary w nakładce wskazują obszary o wysokim skumulowanym narażeniu na dawkę, a żółte obszary oznaczają obszary o niższej ekspozycji. Wyróżnienie pojedynczego piksela wskazuje łączną dawkę dla tego piksela. Białe strzałki w panelach E-H wskazują dwie cząstki, które łączą się podczas eksperymentu, a pomarańczowa strzałka wskazuje trajektorię poruszającej się cząstki złota. (I) Oś czasu eksperymentu wygenerowana przez oprogramowanie analityczne dla serii obrazów pokazanych w A-H. Pomarańczowe kropki u góry osi czasu oznaczają obrazy nieprzetworzone (nieskorygowane cyfrowo), a niebieskie kropki oznaczają obrazy z korekcją dryfu. Pomarańczowe pionowe paski wskazują punkty na osi czasu odpowiadające obrazom pokazanym w panelach A-H. Podziałka wynosi 40 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Migawki TEM porowatego obszaru w nanokatalizatorze Au/FeOx w różnych punktach czasowych. Oprogramowanie MVS stabilizuje i centruje próbkę nawet podczas wysokich prędkości dryftu, takich jak te, które występują podczas wzrostu temperatury, poprzez zastosowanie stolika, przesunięcia wiązki i poprawek cyfrowych, zgodnie ze wskazaniami algorytmów widzenia maszynowego. (A-F) Migawki TEM porowatego obszaru w nanokatalizatorze Au/FeOx, zarejestrowane w różnych punktach czasowych (G) podczas eksperymentu ogrzewania in situ. Współczynnik dryftu zwrotu z inwestycji jest automatycznie obliczany i rejestrowany podczas eksperymentu przez oprogramowanie MVS. Jak pokazano na wykresie (G), wraz ze zmianą profilu temperatury (niebieska linia), szybkość dryftu (pomarańczowa linia) wzrasta wraz ze wzrostem temperatury i maleje, gdy temperatura jest utrzymywana na stałym poziomie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Typ mikroskopu	300 kV FEG TEM	200 kV Zimny FEG TEM
Rozmiar plamki/kondensor 2 Przysłona	3/100 μm	1/100 μm
Szybkość dawki	519 e-/A2•s1	499 e-/A2•s1
Utrata struktury mierzona za pomocą FFT (Dawka skumulowana)	60 270 e-/a2	58 230 e-/A2

Tabela 1: Podsumowanie wyników degradacji zeolitu uzyskanych z różnych mikroskopów.

Plik uzupełniający 1: Zrzut ekranu interfejsu oprogramowania MVS z otwartą zakładką zarządzania dawką. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: plik bazy danych oprogramowania MVS eksperymentu z degradacją zeolitu wywołanego wiązką. To oprogramowanie do przeglądania/analizy jest dostępne do pobrania za darmo. Zapoznaj się z plikiem uzupełniającym 9, aby uzyskać instrukcje pobierania i specyfikacje komputera. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Film przedstawiający degradację zeolitu wywołaną wiązką. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: plik CSV 1 (degradacja zeolitu: surowe dane [tylko korekta mechaniczna]) Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: plik CSV (degradacja zeolitu: korekta dryfu [korekta mechaniczna + cyfrowa]) Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 6: Plik bazy danych oprogramowania MVS eksperyment z ogrzewaniem nanokatalizatora in situ. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 7: Film przedstawiający nanokatalizator w temperaturze 800 °C z nakładkami dawek. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 8: Film przedstawiający nanokatalizator podczas narastania temperatury ze skoordynowanymi wartościami dryftu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 9: Instrukcje dotyczące pobierania darmowego oprogramowania analitycznego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Interpretacja wyników eksperymentów TEM jest często uzależniona od wielu powiązanych ze sobą parametrów eksperymentalnych, takich jak ustawienia mikroskopu, warunki obrazowania, a w przypadku eksperymentów operando lub in situ, zmiany środowiska lub bodźców ^1,23. Dokładna analiza dużych zbiorów danych TEM, w których parametry te mogą być stale modyfikowane, wymaga od operatora znacznej uwagi, aby dokładnie zarejestrować każdy warunek i ustawienie dla każdego obrazu w dzienniku laboratoryjnym lub innym zewnętrznym źródle dokumentacji. Wraz ze wzrostem rozmiaru i złożoności zbiorów danych TEM ręczne prowadzenie dokumentacji staje się niemożliwe, a kluczowe informacje mogą zostać pominięte lub niedokładnie zarejestrowane. Opisane tutaj oprogramowanie MVS konsoliduje metadane wygenerowane podczas eksperymentu z mikroskopu, detektora/kamery i innych systemów (takich jak uchwyty na próbki in situ) i dopasowuje je do odpowiednich obrazów.

Oprócz konsolidacji metadanych, oprogramowanie stosuje algorytmy widzenia maszynowego do śledzenia i stabilizacji pola widzenia poprzez kombinację korekcji przestrzennych, wiązkowych i cyfrowych za pomocą funkcji Drift Correct i Focus Assist . Gdy włączona jest funkcja Drift Correct , generowany jest obraz "szablonu" korelacji krzyżowej przy użyciu pierwszego obrazu pobranego do oprogramowania MVS. Szablon jest następnie porównywany z przychodzącymi obrazami w celu obliczenia kierunku i wielkości dryfu lub ruchu próbki. Dzięki tym informacjom oprogramowanie MVS automatycznie stosuje niezbędne korekcje, aby utrzymać cechy obrazu w tym samym miejscu, dostosowując co najmniej jeden z trzech parametrów: położenie stolika, przesunięcie wiązki lub obrazu oraz cyfrową korekcję obrazu. Funkcja Focus Assist wykorzystuje kombinację algorytmów do przypisywania każdemu obrazowi wartości ostrości, zwanej wynikiem ostrości, a wyniki te są porównywane w celu określenia wielkości i kierunku regulacji rozmycia, które należy zastosować, aby utrzymać ostrość próbki. W trybie obrazowania STEM oprogramowanie MVS próbuje zmaksymalizować kontrast za pomocą zastrzeżonej wersji znormalizowanej wariancji w celu przypisania wyniku ostrości. W trybie TEM promieniowa suma intensywności jest obliczana w FFT i używana do obliczenia wyniku ostrości. Ograniczenia zdolności oprogramowania MVS do optymalizacji ostrości występują, gdy nie może ono dokładnie obliczyć prawidłowego wyniku ostrości obrazu. Zwykle dzieje się tak, gdy mikroskop jest źle ustawiony lub próbka jest znacznie nieostra podczas kalibracji, co uniemożliwia oprogramowaniu prawidłowe obliczenie prawidłowej początkowej wartości ostrości. Oprogramowanie MVS może mieć trudności z obliczeniem wyniku ostrości dla próbek z dobrze zdefiniowanymi prążkami kratowymi, ponieważ prążki kratowe w FFT mogą "przytłoczyć" algorytm punktacji ostrości; W związku z tym, jeśli próbka przesunie się poza ostrość, wynik ostrości może nie odzwierciedlać dokładnie zmiany ostrości. I odwrotnie, praca przy małych powiększeniach lub z próbką, która ma niski sygnał FFT, może również utrudnić obliczenie dobrego wyniku ostrości. Aby złagodzić te trudności, oprogramowanie MVS zawiera szereg dodatkowych algorytmów, które mogą być wybrane przez użytkownika do obliczenia wyniku ostrości, jeśli ustawienia domyślne są nieodpowiednie dla próbki. Muszą one być testowane i stosowane indywidualnie dla każdego przypadku, aby określić najlepsze algorytmy dla danego eksperymentu.

Zmiany morfologiczne w strukturze próbki w czasie są uwzględniane za pomocą matrycowego współczynnika morfingu. Ten filtr jest dostrajany przez operatora, dzięki czemu algorytmy rejestracji uwzględniają zmiany morfologiczne w czasie. Dodatkowo oprogramowanie monitoruje ciągły obraz, ustawienia mikroskopu oraz ustawienia kamery lub detektora, aby automatycznie aktualizować szablon po wywołaniu zmian w strukturze próbki i po wszelkich zmianach parametrów mikroskopu, kamery lub detektora spowodowanych przez operatora. Jak pokazano na rysunku 4, rysunku 5, pliku uzupełniającym 7 i pliku uzupełniającym 8, oprogramowanie MVS zapewnia skuteczną, natychmiastową stabilizację, umożliwiając obrazowanie w wysokiej rozdzielczości dynamicznie poruszających się lub zmieniających się próbek. Chociaż oprogramowanie jest w stanie kontrolować bardzo wysokie prędkości dryftu lub ruchu próbki, takie jak te, które występują podczas stosowania rampy grzewczej podczas eksperymentu in situ , istnieją ograniczenia dotyczące maksymalnych poprawek stopnia lub przesunięć wiązki, które oprogramowanie może kontrolować, jeśli próbka porusza się lub dryfuje bardzo szybko. Limit ten jest funkcją szybkości aktualizacji obrazu, rozmiaru pola widzenia i współczynnika dryfu. Dla danego pola widzenia i szybkości aktualizacji obrazu istnieje maksymalna szybkość dryfu, którą można skorygować, a jeśli ruchy fizyczne nie nadążają, proces może się zakończyć lub stać się niestabilny. Na podstawie szablonów rejestracji generowanych po zastosowaniu funkcji, takich jak Drift Correct , można wygenerować dodatkowe obliczone metadane. Na przykład korelacja dopasowania jest numerycznym zapisem zakresu zmian między szablonami w serii i służy do identyfikowania punktów na osi czasu eksperymentu, w których zmieniła się próbka. Wysoka wartość korelacji dopasowania odpowiada próbce, która uległa zmianom w morfologii, a niska wartość korelacji dopasowania odpowiada próbce, której struktura pozostaje względnie statyczna. Korelacja dopasowania jest szczególnie cenna w badaniach in situ , ponieważ można ją wykreślić graficznie, co umożliwia użytkownikowi szybkie wskazanie obrazów w serii odpowiadających znaczącej zmianie próby. Ważne jest jednak, aby zrozumieć, że wysokie wartości korelacji dopasowania mogą również odpowiadać zmianom warunków obrazowania, takim jak przesuwanie stolika lub zmiana powiększenia, jeśli działania te są wykonywane, gdy funkcja korekcji dryfu pozostaje aktywna.

Przedstawiony tutaj proces kalibracji wykorzystuje unikalny uchwyt kalibracyjny i półautomatyczną procedurę kalibracji w celu dokładnej kalibracji wiązki w różnych warunkach obiektywu przy minimalnej interwencji operatora. Dostęp do procedury kalibracji dawki można uzyskać za pośrednictwem oprogramowania MVS zainstalowanego w TEM. Oprogramowanie MVS automatycznie odczytuje odpowiednie ustawienia mikroskopu, aby zapisać wszystkie pomiary do wykorzystania w późniejszych eksperymentach. W niektórych TEMach nie jest możliwe odczytanie ustawień przysłony lub monochromatora, które muszą być wprowadzone do ustawień oprogramowania MVS przez operatora podczas kalibracji i podczas użytkowania. W oprogramowaniu wbudowane są przypomnienia, które pomagają aktualizować te ustawienia wprowadzone przez operatora, postępując zgodnie z instrukcjami programu. Opracowanie oprawki z wbudowanym odbierakiem prądu, zamiast polegania na oprawce zintegrowanej w innym miejscu kolumny mikroskopu, jest świadomym wyborem projektowym. Umożliwia to ustawienie odbieraka prądu w tej samej płaszczyźnie co próbka, eliminując błędy w pomiarze prądu spowodowane ugięciem wiązki lub różnicami w absorpcji elektronów przez otwory w różnych pozycjach wiązki. Oprogramowanie MVS postępuje zgodnie ze zautomatyzowaną procedurą pomiaru prądu i powierzchni wiązki dla dowolnej kombinacji warunków soczewki. Oprogramowanie może następnie skorelować te zmierzone kalibracje z prądem kamery lub ekranu i ekstrapolować wszelkie zmiany powiększenia itp. na obszar wiązki podczas eksperymentu. Po wygenerowaniu te pliki kalibracyjne mogą być natychmiast używane i są automatycznie zapisywane do późniejszego wykorzystania, jeśli oprogramowanie wykryje, że te same ustawienia są używane podczas przyszłej sesji. Chociaż trwałość pliku kalibracyjnego różni się w zależności od mikroskopu, autorzy odkryli, że są w stanie używać tych samych plików kalibracyjnych przez kilka miesięcy, nie obserwując istotnych zmian w obecnych wartościach. Istnieją wbudowane procedury monitorowania profilu emisji pistoletów, aby pomóc w utrzymaniu adekwatności tych kalibracji, szczególnie w przypadku zimnych pistoletów z emisją FEG.

Normalizacja pomiarów dawki między mikroskopami i automatyczne śledzenie ekspozycji wiązki próbki są kluczowymi funkcjami oprogramowania MVS, ponieważ umożliwiają ilościowe porównania warunków dawki między eksperymentami na różnych systemach mikroskopowych. Indukowana dawką degradacja próbki zeolitu (ZSM-5), uzyskana podczas identycznych eksperymentów przy użyciu różnych mikroskopów, powoduje całkowite zaniknięcie plamek FFT po maksymalnej skumulowanej lub progowej dawce elektronów (~60.000 e^-/Ų przy zastosowaniu dawki ~500 e^-/Ų·s) dla obu układów. Te wyniki porównawcze pokazują, że oprogramowanie do pomiaru dawki ułatwia powtarzalne, ilościowe pomiary dawki. Niewielka różnica w skumulowanej dawce, przy której obserwuje się pełne zanik plamki FFT dla każdego eksperymentu, jest prawdopodobnie wynikiem różnych napięć przyspieszenia stosowanych przez dwa mikroskopy, przy czym niższe napięcia przyspieszenia skutkują większą liczbą ścieżek uszkodzeń promieniowania, a wyższe napięcia przyspieszenia zwykle skutkują większymi uszkodzeniami typu knock-on²⁴. Wyniki literatury dla dawki krytycznej nanocząstek ZSM-5 wahają się od 9 000 do 14 000 e^-/Ų przy użyciu pierwszych plamek FFT, a nie całkowitego zniknięcia wszystkich plamek FFT^25,26. W naszych wynikach pierwsze zniknięcie plamki FFT odpowiada skumulowanej dawce około 25 000 e^-/A². Poprzednie badania opierały się na pomiarach prądu uzyskanych za pomocą ekranu fosforowego, który jest dobrze udokumentowany, aby zaniżyć pomiary prądu wiązki w porównaniu z kubkiem Faradaya¹⁵. Określona dawka krytyczna może różnić się dwukrotnie lub więcej, w zależności od tego, który szczyt FFT jest używany do śledzenia dawki. Wskazuje to, że wyższe częstotliwości przestrzenne ulegają degradacji jako pierwsze i mogą skutkować różnymi wartościami w zależności od dostępu do strefy użytego podczas pomiarów (nasze wyniki koncentrowały się na plamkach FFT z całego kryształu zeolitu, a nie na konkretnych cechach strukturalnych)^25,26. Te różnice w technikach i obecnej kalibracji odpowiadają za różnicę w wartościach między dwoma eksperymentami przedstawionymi w naszych wynikach i poprzednich badaniach literaturowych.

Chociaż oddziaływania dawki elektronów są istotnym czynnikiem w wielu eksperymentach TEM, badania in situ, a w szczególności badania ciekłego EM są szczególnie wrażliwe na jego skutki. Radioliza cieczy przez wiązkę elektronów powoduje powstanie kaskady chemicznie reaktywnych gatunków, które mogą wchodzić w interakcje z próbką, komplikując analizę. Zarówno szybkość dawki lub fluencja zastosowana podczas eksperymentu z cieczą EM, jak i dawka skumulowana mogą mieć wpływ na stężenie rodników powstałych w wyniku radiolizy cieczy^27,28. W związku z tym gromadzenie i rejestrowanie zarówno metadanych dawki skumulowanej, jak i szybkości dawki w całym eksperymencie umożliwia bezpośrednią korelację między obrazami a historią dawek próbki i jest dokładniejszym sposobem wyjaśniania i kontrolowania wpływu wiązki elektronów w tych eksperymentach. Chociaż nie zostało to uwzględnione w niniejszym protokole, przykład użyteczności funkcji zarządzania dawką dla ciekłego EM przedstawiono na rysunku 6.

Rysunek 6: Indukowany wiązką wzrost nanocząstek złota podczas eksperymentu in situ ciekłego EM. (A) Przegląd STEM w małym powiększeniu wynikowego wzrostu cząstek z kolorowym nałożeniem mapy dawki skumulowanej w całym regionie. Czerwone obszary w nakładce wskazują obszary o wysokiej skumulowanej ekspozycji na dawkę, a żółte obszary wskazują obszary o niższym narażeniu. Podświetlenie pojedynczego piksela kursorem lub narysowanie ramki nad obszarem za pomocą dołączonych narzędzi do rysowania wskazuje skumulowaną dawkę dla tego piksela lub obszaru. Podziałka skali wynosi 2 μm. (B,C) Obrazy STEM w większym powiększeniu obszarów oznaczonych pomarańczowymi ramkami (b,c) w A. Obszar b, narażony na wyższą dawkę skumulowaną (10,811 e^-/²) zawiera większe cząstki niż te znajdujące się w obszarze c, który był narażony na niższą dawkę skumulowaną (0,032 e^-/^A2). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wzbogacona szybkość dawki i metadane dawki skumulowanej upraszczają analizę zależnych od dawki szlaków wzrostu i degradacji nanomateriałów. Rysunek 6 przedstawia indukowaną wiązką redukcję roztworu jonów chlorku złota aury (HAuCl₃) w wodzie podczas eksperymentów z ciekłym EM. Z nałożonej mapy dawki kolorów na rysunku 6A łatwo jest zwizualizować, że skumulowana dawka elektronów wpływa na wynikowy rozmiar i kształt nanocząstek 29,30,31,32. Przegląd STEM w małym powiększeniu pokazuje obszary narażone na wysoką (czerwoną) i niską (żółtą) dawkę skumulowaną. Cząstki w regionie narażonym na wyższe dawki są większe niż te w regionach narażonych na niższe dawki skumulowane. Ponieważ metadane dawki są bezpośrednio osadzone w każdym obrazie na poziomie pikseli, złożone efekty dawki elektronów w eksperymentach z ciekłym EM mogą być teraz systematycznie analizowane w sposób, który nigdy wcześniej nie był osiągalny.

W tym protokole wykazaliśmy, że oprogramowanie MVS zapewnia kompleksowe rozwiązanie do kalibracji, monitorowania i śledzenia zarówno dawki elektronów, jak i dawki całkowitej dostarczanej do próbki na zasadzie piksel po pikselu. Ta zdolność otwiera nowy paradygmat obrazowania próbek wrażliwych na dawkę i zrozumienia oddziaływań wiązki elektronów. Jest to szczególnie ekscytujące w przypadku eksperymentów z ciekłym EM, ponieważ pozwoli na bardziej efektywne badanie roli, jaką odgrywa dawka elektronów i poprawi odtwarzalność eksperymentalną. Mamy nadzieję, że te nowe ramy umożliwią dokładne gromadzenie informacji o dawkach i skumulowanych dawkach, ułatwią dzielenie się tymi danymi ze społecznością w celu dokładniejszej interpretacji wyników TEM oraz przyspieszą współpracę naukową i wymianę danych, umożliwiając raportowanie i analizę w ramach FAIR.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ARM200F Transmisyjny	JEOL		(200 kV)
Uchwyt do kalibracji AXON DOSE	Protochips, Inc.	AXA-FC-TFS	Pakiet sprzętowy do kalibracji i zarządzania dawką dla oprogramowania ThermoFisher ScientificTEM
AXON DOSE:  Wersja 10.6.5.3	Protochips, Inc.	AX-MOD-DOSE-01-1YR	Oprogramowanie do kalibracji i zarządzania dawką
Oprogramowanie AXON Studio: wersja 10.6.5.3	Protochips, Inc.	Brak numeru części. Dostępne do pobrania pod adresem  success.protochips.com	Oprogramowanie do analizy offline dla zestawów danych AXON.  Bezpłatna kopia oprogramowania AXON Studio jest dostępna do pobrania pod adresem:   success.protochips.com
AXON Synchronicity Core	Protochips, Inc.	AXON-CORE	Komponent sprzętowy oprogramowania do synchronizacji.
Oprogramowanie do synchronizacji AXON:  Wersja 10.6.5.3	Protochips, Inc.	AX-MOD-SYNCPRO-01-1YR	Oprogramowanie do synchronizacji
Fusion In-Situ Heating E-chip	Protochips, Inc.	E-FHDC-VO-10	Sample Support E-chip z folią węglową.  Używany z systemem grzewczym in situ
Fusion Select In Situ Heating System	Protochips, Inc.	FFAD-6200-EXP	System grzewczy MEMs in-situ dla ThermoFisher Scientific TEM.
Hydrat chlorku złota(III) (50% na bazie złota) 50790	Sigma Aldrich	27988-77-8	Służy do przygotowania nanokatalizatora Au/FeOx.  Procedura syntezy koprecipitacji zastosowana w C. Sze et al. Materials Letters. 36 (1– 4), 11– 16 (1998)
Tlenek żelaza (III) 310050 (Fe2O3)	Sigma Aldrich	1309-37-1	Służy do przygotowania nanokatalizatora Au/FeOx.  Procedura syntezy koprecipitacji zastosowana w C. Sze et al. Materials Letters. 36 (1– 4), 11– 16 (1998)
Titan ChemiSTEM	ThermoFisher Naukowy		transmisyjny mikroskop elektronowy (300 kV)
Zeolit ZSM-5	Zeolyst	CBV 8014	Próbka nanokatalizatora:  80 SiO2/Al2O3 Stosunek molowy