Podejście oparte na widzeniu maszynowym do procesów pracy związanych z transmisyjną mikroskopią elektronową, analizą wyników i zarządzaniem danymi

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący oprogramowanie do widzenia maszynowego do stabilizacji dynamicznych procesów podczas obrazowania TEM, przy jednoczesnym indeksowaniu wielu strumieni metadanych do każdego obrazu na osi czasu, w której można nawigować. Pokazujemy, w jaki sposób platforma ta umożliwia automatyczną kalibrację i mapowanie dawki elektronów w trakcie eksperymentu.

Streszczenie

Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) umożliwia użytkownikom badanie materiałów w ich podstawowej, atomowej skali. Złożone eksperymenty rutynowo generują tysiące obrazów z wieloma parametrami, które wymagają czasochłonnej i skomplikowanej analizy. AXON synchronicity to oprogramowanie do synchronizacji wizji maszynowej (MVS) zaprojektowane w celu rozwiązania problemów związanych z badaniami TEM. Po zainstalowaniu na mikroskopie umożliwia ciągłą synchronizację obrazów i metadanych generowanych przez mikroskop, detektor i systemy in situ podczas eksperymentu. Łączność ta umożliwia zastosowanie algorytmów widzenia maszynowego, które stosują kombinację korekcji przestrzennych, wiązkowych i cyfrowych w celu wyśrodkowania i śledzenia obszaru zainteresowania w polu widzenia oraz zapewniają natychmiastową stabilizację obrazu. Oprócz znacznej poprawy rozdzielczości zapewnianej przez taką stabilizację, synchronizacja metadanych umożliwia zastosowanie algorytmów obliczeniowych i analizy obrazu, które obliczają zmienne między obrazami. Te obliczone metadane mogą służyć do analizowania trendów lub identyfikowania kluczowych obszarów zainteresowania w zestawie danych, co prowadzi do nowych szczegółowych informacji i rozwoju bardziej zaawansowanych funkcji widzenia maszynowego w przyszłości. Jednym z takich modułów, który opiera się na tych obliczonych metadanych, jest kalibracja dawki i zarządzanie nią. Moduł dawki zapewnia najnowocześniejszą kalibrację, śledzenie i zarządzanie zarówno fluencją elektronów (e^-/Ų·^s-1), jak i dawką skumulowaną (e^-/Ų), która jest dostarczana do określonych obszarów próbki na zasadzie piksel po pikselu. Umożliwia to kompleksowy przegląd interakcji między wiązką elektronów a próbką. Analiza eksperymentów jest usprawniona dzięki dedykowanemu oprogramowaniu analitycznemu, w którym zestawy danych składające się z obrazów i odpowiadających im metadanych można łatwo wizualizować, sortować, filtrować i eksportować. W połączeniu narzędzia te ułatwiają efektywną współpracę i analizę eksperymentalną, zachęcają do eksploracji danych i zwiększają możliwości korzystania z mikroskopii.

Wprowadzenie

Mikroskopy elektronowe transmisyjne (TEM) oraz ich możliwości znacznie rozwinęły się dzięki postępom w dziedzinie kamer, detektorów, uchwytów próbek i technologii obliczeniowych. Jednak postępy te są utrudnione przez rozproszone strumienie danych, ograniczenia operatora oraz uciążliwą analizę danych^1,2. Ponadto eksperymenty in situ i operando przekształcają mikroskopy TEM w nanolaboratoria działające w czasie rzeczywistym, co umożliwia badanie próbek w środowiskach gazowych lub ciekłych przy jednoczesnym stosowaniu szeregu bodźców zewnętrznych^3,4,5. Przyjęcie tak złożonych schematów pracy jedynie pogłębiło te ograniczenia, a wynikający z tego wzrost rozmiaru i złożoności strumieni danych budzi coraz większy niepokój. W związku z tym kładzie się coraz większy nacisk na wykorzystanie możliwości przetwarzania maszynowego w celu wyszukiwania, uzyskiwania dostępu, interoperacyjności i ponownego wykorzystania danych, co określa się jako zasady FAIR⁶. Publikowanie danych badawczych zgodnie z koncepcją zasad FAIR zyskało uznanie agencji rządowych na całym świecie^7,8, a zastosowanie zasad FAIR przy użyciu oprogramowania do komputerowego rozpoznawania obrazu jest kluczowym krokiem w ich wdrażaniu.

Platforma oprogramowania do synchronizacji wizji maszynowej (MVS) została opracowana w odpowiedzi na konkretne trudności związane z przeprowadzaniem i analizowaniem złożonych eksperymentów TEM z dużą ilością metadanych (w szczególności eksperymentów in situ oraz operando)⁹. Po zainstalowaniu w TEM, oprogramowanie MVS łączy się, integruje i komunikuje z kolumną mikroskopu, detektorami oraz zintegrowanymi systemami in situ. Umożliwia to ciągłe gromadzenie obrazów i dopasowywanie ich do powiązanych metadanych eksperymentalnych, tworząc kompleksową, przeszukiwalną bazę danych, czyli oś czasu eksperymentu od początku do końca (Ryc. 1). Ta łączność pozwala oprogramowaniu MVS na stosowanie algorytmów, które inteligentnie śledzą i stabilizują obszar zainteresowania (ROI), nawet gdy próbki ulegają zmianom morfologicznym. Oprogramowanie wprowadza korekty położenia stolika, wiązki oraz korekcje cyfrowe w razie potrzeby, aby ustabilizować ROI za pomocą funkcji Drift Control (kontrola dryftu) i Focus Assist (pomoc w ogniskowaniu). Oprócz wzbogacania obrazów o surowe metadane generowane przez różne systemy eksperymentalne, oprogramowanie może tworzyć nowe metadane obliczeniowe przy użyciu algorytmów analizy obrazu w celu obliczenia zmiennych między obrazami, co pozwala na automatyczną korekcję dryftu próbki lub zmian ostrości.

Obrazy TEM oraz powiązane z nimi metadane zebrane za pomocą oprogramowania MVS są zorganizowane w formie osi czasu eksperymentu, którą każdy może otworzyć i przeglądać za pomocą bezpłatnej, offline'owej wersji oprogramowania analitycznego Studio (dalej nazywanego oprogramowaniem analitycznym)¹⁰. Podczas eksperymentu oprogramowanie MVS synchronizuje i zapisuje trzy rodzaje obrazów z kamery lub detektora mikroskopu, które są wyświetlane na górze osi czasu poniżej przeglądarki obrazów: pojedyncze akwizycje (indywidualne obrazy pojedynczej akwizycji pozyskane bezpośrednio z oprogramowania TEM), obrazy surowe (raw) (obrazy z transmisji na żywo z detektora/kamery, w których nie zastosowano żadnych cyfrowych korekcji dryftu; obrazy te mogły zostać skorygowane fizycznie poprzez ruch stolika lub przesunięcie wiązki) oraz obrazy z korekcją dryftu (obrazy z transmisji na żywo z detektora/kamery, w których dryft został skorygowany cyfrowo). Dane zebrane podczas eksperymentu lub sesji mogą zostać dalej podzielone na mniejsze sekcje lub fragmenty danych, znane jako kolekcje, bez utraty osadzonych metadanych. Z oprogramowania analitycznego obrazy, stosy obrazów i metadane można bezpośrednio eksportować do różnych otwartych formatów obrazów i typów arkuszy kalkulacyjnych w celu analizy przy użyciu innych narzędzi i programów.

Struktura sterowania mikroskopem, stabilizacji i integracji metadanych, możliwa dzięki oprogramowaniu MVS, pozwala również na implementację dodatkowych programów lub modułów wizji maszynowej, zaprojektowanych w celu wyeliminowania ograniczeń w obecnych przepływach pracy TEM. Jednym z pierwszych modułów opracowanych z wykorzystaniem tej platformy synchronizacji jest kalibracja dawki elektronów oraz śledzenie przestrzenne obszarów próbki naświetlonych wiązką. Wszystkie obrazy TEM powstają w wyniku oddziaływania między próbką a wiązką elektronów. Oddziaływania te mogą jednak prowadzić do negatywnych, nieuniknionych skutków dla próbki, takich jak radioliza i uszkodzenia typu knock-on^11,12, co wymaga zachowania ostrożnej równowagi między zastosowaniem dawki elektronów wystarczająco wysokiej do wygenerowania obrazu a minimalizacją wynikających z tego uszkodzeń spowodowanych wiązką^13,14.

Choć wielu użytkowników polega na pomiarach prądu ekranu w celu oszacowania dawki elektronów, wykazano, że metoda ta w znacznym stopniu zaniża rzeczywisty prąd wiązki¹⁵Można uzyskać jakościowe wartości dawki poprzez prąd ekranu na tym samym mikroskopie przy tych samych ustawieniach, jednak odtworzenie tych warunków dawki przy użyciu innych mikroskopów lub ustawień jest wysoce subiektywne. Ponadto wszelkie korekty parametrów obrazowania wprowadzone przez użytkownika w trakcie eksperymentu, takie jak rozmiar plamki, apertura, powiększenie lub intensywność, wymagają oddzielnego pomiaru prądu ekranu w celu obliczenia wynikającej z nich dawki. Użytkownicy muszą albo rygorystycznie ograniczyć warunki obrazowania stosowane podczas danego eksperymentu, albo skrupulatnie mierzyć i zapisywać każdy użyty stan soczewek, co znacząco komplikuje i wydłuża eksperyment ponad to, co jest wykonalne w ramach normalnej eksploatacji mikroskopu^16,17.

Dose, określany w tym protokole jako oprogramowanie Dose, to moduł oprogramowania do kalibracji dawki, który wykorzystuje dedykowany uchwyt kalibracyjny zaprojektowany w celu umożliwienia zautomatyzowanych pomiarów natężenia prądu. W końcówce uchwytu kalibracyjnego zintegrowany jest kubek Faradaya, będący złotym standardem w dokładnej kalibracji prądu wiązki¹⁵. Oprogramowanie MVS przeprowadza serię kalibracji natężenia prądu i pola wiązki dla każdego stanu soczewek i osadza te wartości na obrazach na poziomie piksela.

W niniejszym artykule wideo przedstawiono protokoły oprogramowania MVS zaprojektowane w celu usprawnienia wszystkich etapów pracy z TEM, wykorzystując reprezentatywne próbki nanomateriałów. Próbka wrażliwych na wiązkę nanocząsteczek zeolitu¹⁴ służy do zademonstrowania protokołów kalibracji oraz zarządzania dawką. Przeprowadzamy reprezentatywny eksperyment grzania in situ z użyciem nanokatalitystora Au/FeO_x^18,19, który ulega znacznym zmianom morfologicznym podczas podgrzewania. Ten eksperyment in situ podkreśla działanie algorytmów stabilizacji oprogramowania oraz jego zdolność do zestawiania wielu strumieni metadanych, co stanowi immanentne wyzwanie w badaniach in situ i operando. Choć nie opisano go w protokole, ze względu na unikalną wrażliwość na dawkę elektronów, omawiamy reprezentatywne przykłady użyteczności oprogramowania w badaniach liquid-EM (których protokoły zostały wcześniej opisane w literaturze^20,21,22) oraz sposób, w jaki techniki te mogą zostać zastosowane w celu lepszego zrozumienia wpływu dawki na eksperymenty liquid-EM. Na koniec pokazujemy, jak analiza danych jest usprawniana dzięki oprogramowaniu do analizy offline, które umożliwia wizualizację, filtrowanie i eksport różnorodnych plików obrazów, wideo i danych do innych dostępnych formatów.

Rycina 1: Przykłady interfejsu użytkownika dla MVS oraz oprogramowania analitycznego. (A) Panel sterowania i okno wyświetlania obrazów w oprogramowaniu do synchronizacji. Połączenie między TEM a oprogramowaniem do synchronizacji jest ustanawiane poprzez aktywację przycisku Connect, co umożliwia przesyłanie obrazów i metadanych z mikroskopu do oprogramowania do synchronizacji. Z poziomu przeglądarki obrazów operator może wykonywać różnorodne operacje wspomagane przez system wizyjny, takie jak Drift Correct oraz Focus Assist. Oprogramowanie umożliwia również stosowanie funkcji Tag Images oraz Review Session bez przerywania procesu gromadzenia danych. (B) Zrzut ekranu oprogramowania do analizy obrazu z zaznaczonym położeniem okna podglądu obrazu (Image View Port), osi czasu (Timeline) oraz paneli metadanych (Metadata) i analizy (Analysis). Dostęp do oprogramowania analitycznego można uzyskać w dowolnym momencie eksperymentu, aby przejrzeć obrazy pozyskane do danego momentu czasowego za pomocą przycisku Review Session. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Protokół

1. Metoda 1: Kalibracja dawki transmisyjnego mikroskopu elektronowego dla trybów obrazowania TEM i skaningowego TEM (STEM)

1. Włączyć pikoamperomierz i pozostawić go do rozgrzania przez co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem kalibracji dawki. Załaduj uchwyt do kalibracji dawki do TEM i podłącz uchwyt kalibracyjny do pikoamperomierza za pomocą szybkiego połączenia.
2. Gdy mikroskop jest w trybie TEM, otwórz zawory kolumny i zlokalizuj otwór odniesienia 35 μm w uchwycie dawki (Rysunek 2). Uruchom aplikację MVS i wybierz Dawka (Automatyzacja kalibracji) z opcji eksperymentu.
   UWAGA: Lokalizacja otworu odniesienia jest zapisywana przez oprogramowanie po wstępnej kalibracji, dzięki czemu oprogramowanie automatycznie lokalizuje swoją pozycję na potrzeby przyszłych kalibracji.
3. Kliknij ikonę Connect (Rysunek 1A) i wybierz mikroskop, aby aktywować połączenie między TEM a oprogramowaniem MVS. Po nawiązaniu połączenia obrazy z kamery/detektora będą widoczne w przeglądarce obrazów oprogramowania.
   UWAGA: Nie jest konieczna optymalizacja wysokości eucentrycznej, a krawędź otworu referencyjnego może wydawać się rozmyta ze względu na grubość końcówki. Nie będzie to miało wpływu na bieżące pomiary.
4. Przejdź do zakładki Dawka, a następnie do opcji Kalibracja dawki. Wybierz proces kalibracji obszaru dawki, postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania i wprowadź żądane wartości konfigurowane przez użytkownika (takie jak ustawienia przysłony i monochromatora). Po zakończeniu kalibracji obszaru dawki wybierz proces kalibracji prądu dawki i postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania.
5. Powtórz proces kalibracji (krok 1.4) dla każdego rozmiaru plamki, apertury lub ustawienia monochromatora, które mogą być wykorzystane podczas eksperymentu.
6. Po zakończeniu procesu kalibracji w trybie TEM skalibruj dawkę elektronów dla trybu STEM, powtarzając krok 1.4.
   UWAGA: Tryb STEM nie wymaga przeprowadzenia kalibracji obszaru dawki.
7. Po zakończeniu wszystkich żądanych kalibracji kliknij przycisk Zamknij sesję, wyjmij uchwyt kalibracji dawki i wróć do ekranu startowego oprogramowania MVS.

2. Metoda 2: Określenie progu dawki za pomocą MVS i oprogramowania dawkującego

1. Załaduj standardową siatkę TEM z próbką (w tym przykładzie użyto dostępnych na rynku nanocząstek zeolitu ZSM-5) do standardowego uchwytu TEM. Włóż uchwyt do TEM i zlokalizuj obszar zainteresowania (krystaliczne nanocząstki zeolitu).
2. Otwórz aplikację MVS i wybierz Inne.
   UWAGA: Dodatkowe informacje o próbce (np. identyfikator i opis próbki, nazwa operatora i uwagi dotyczące eksperymentu) można dodać do pola parametrów eksperymentalnych.
3. Powtórz krok 1.3, aby połączyć się z oprogramowaniem MVS i przejdź do zakładki metadanych obrazu w interfejsie oprogramowania MVS, aby wybrać następujące metadane do nałożenia na strumień obrazu pokazany na wyświetlaczu na żywo: Powiększenie, Maksymalna dawka i Dawka. Inne metadane mogą zostać dołączone, jeśli użytkownik sobie tego życzy. Zrzut ekranu interfejsu oprogramowania MVS przedstawiający elementy sterujące zarządzania dawką znajduje się w pliku uzupełniającym 1.
4. Otwórz kartę Dawka i wybierz Zarządzanie dawką i Włącz monitorowanie dawki, aby aktywować automatyczne śledzenie dawki elektronów. Wybierz opcję Pokaż warstwę dawki, aby wyświetlić nakładkę koloru dozy.
5. Ustaw wartości dla wysokiego poziomu dawki i wysokiej dawki i naciśnij Zapisz (w tym przykładzie użyto odpowiednio wartości 60 000 e^-/Ų i 500 e^-/Ų·s).
6. Przejdź do zakładki Ustawienia, wybierz opcję Dawka i ustaw wartości Krycie mapy nawigacji po dawce i Krycie nakładki obrazu dawki (w tym przykładzie użyto odpowiednio wartości 0,50 i 0,30).
7. W oknie Live Image Viewer aktywuj korekcję dryfu, klikając opcję Drift Correct.
8. Przejdź do karty Widok danych i wykreśl wartości metadanych Defocus i Focus Quotient na osi Y.
   UWAGA: Dowolne z dostępnych wartości metadanych mogą być wykreślane w czasie rzeczywistym podczas eksperymentu z tabeli widoku danych.
9. Aktywuj funkcję Focus Assist, a następnie wybierz opcję Kalibruj ostrość, aby uruchomić automatyczną kalibrację wspomagania ustawiania ostrości. Po zakończeniu procedury kalibracji ostrości zamknij kartę Widok danych.
10. Otwórz zakładkę Image Analysis (Analiza obrazu) w oprogramowaniu MVS i aktywuj opcje Live FFT oraz Quadrants 1 i 2.
11. Korzystając z elementów sterujących oprogramowania mikroskopu, dostosuj warunki wiązki tak, aby strumień elektronów wynosił ~500 e^-/Ų·s. i przejdź do nowego obszaru w próbce i wyśrodkuj zwrot z inwestycji próbki w podglądzie na żywo w oprogramowaniu MVS.
    UWAGA: Podczas wykonywania dużych ruchów scenicznych, kontrola dryfu i wspomaganie ostrości zostaną automatycznie wyłączone i muszą zostać ponownie włączone po wybraniu nowego ROI.
12. Zanotuj warunki dawkowania w oprogramowaniu za pomocą funkcji Tag. Podświetl ikonę Znacznik i wprowadź żądany tekst, aby oznaczyć określoną serię obrazów na osi czasu. Obrazy będą oznaczane tym tekstem, dopóki ikona Tag nie zostanie odznaczona.
13. Utrzymuj stałą szybkość dawki, jednocześnie stale obrazując ten sam zwrot z inwestycji, aż do zniknięcia pików odpowiadających strukturze atomowej na wykresie FFT.
14. Zmniejsz powiększenie, otwórz kartę Dose Management (Zarządzanie dawką) i aktywuj opcję Show Dose Layer (Pokaż warstwę dawki), aby nałożyć na nią mapę dawek oznaczoną kolorami.
    UWAGA: Ta funkcja zapewnia wizualne odniesienie do obszarów próbki, które zostały wystawione na działanie wiązki elektronów i ich względnej ekspozycji na dawkę. Podświetlenie tych obszarów na poszczególnych obrazach kursorem wskaże odpowiednie wartości dawki.
15. Rozłącz i zakończ sesję, usuwając zaznaczenie opcji Połącz, a następnie wybierz pozycję Zamknij sesję. Zapisz kopię danych sesji w źródle zewnętrznym, aby zapobiec nadpisaniu danych zapisanych w oprogramowaniu MVS podczas kolejnych eksperymentów (plik uzupełniający 2).

3. Metoda 3: Analiza metadanych i trendów oraz eksport danych za pomocą oprogramowania analitycznego

1. Uruchom oprogramowanie analityczne (oprogramowanie offline do przeglądania w pełni zsynchronizowanych zestawów danych) i otwórz plik sesji eksperymentu, wybierając go z biblioteki plików.
   UWAGA: Użytkownicy mogą również uzyskać dostęp do oprogramowania analitycznego za pomocą ikony Review Session (Sesja przeglądu) w oprogramowaniu MVS podczas eksperymentu.
2. Wyświetl obrazy z korekcją dryfu, aktywując kartę DC poniżej portu widoku obrazu i wybierz żądane nakładki danych, zaznaczając odpowiednie pola Dane nakładki na karcie Metadane obrazu (w tym przykładzie Mikroskop, Data/Godzina, Dawka maksymalna, Dawka maksymalna i Powiększeniezostały użyte). Inne metadane mogą być wykreślane zgodnie z życzeniem użytkownika.
3. Zaznacz pole Oś czasu dla Dawki maksymalnej i Dawki dawki, aby dodać wykres graficzny tych wartości do osi czasu. Podświetl lub przewiń te wykresy graficzne, aby zaktualizować obraz wyświetlany w rzutni. Uzyskaj dostęp do różnych narzędzi za pośrednictwem kart Notatki, Analiza obrazu, Przybornik i Widok danych.
   1. Uzyskaj dostęp do FFT dla każdego obrazu za pomocą karty Analiza obrazu i kliknij Live FFT, aby zaktualizować FFT podczas przewijania obrazów.
   2. Użyj zanikania pików FFT, aby określić punkt czasowy, w którym struktura zeolitu traci krystaliczność. Zapisz maksymalną wartość dawki zarejestrowaną na tym obrazie.
4. Użyj opcji Filtruj, aby łatwo filtrować duże zestawy danych do mniejszych, które można udostępniać, bez utraty skojarzonych z nimi metadanych. Otwórz panel filtrów i dostosuj suwaki tak, aby wybrane były tylko dane o mocy dawki równej lub wyższej niż ~500 e^-/^{Å 2}·s, a następnie zapisz nową kolekcję pod nazwą Dose Threshold Study.
   UWAGA: Filtry mogą być stosowane do dowolnego z powiązanych typów metadanych.
5. Eksportuj obrazy i metadane z sesji do innych typów plików wzbogaconych o paski skali i nakładki metadanych.
   1. Wyróżnij kolekcję w okienku biblioteki i wybierz opcję Publikuj, klikając zaznaczenie prawym przyciskiem myszy. W oknie Publikowanie wybierz żądane opcje eksportu typu pliku.
   2. Wybierz zakładkę danych skorygowanych dryfu i zastosuj nakładki dowolnych metadanych i FFT (ustaw nakładkę FFT zgodnie z potrzebami; przykłady obrazów wyeksportowanych za pomocą FFT są pokazane w Rysunek 3).
6. Wyeksportuj serię obrazów jako plik filmowy, korzystając z tej samej opcji Publikuj. Wybierz obrazy, podświetlając je na osi czasu, korzystając z opcji filtrowania lub eksportując pełny plik bazy danych. Wybierz żądany format filmu, liczbę klatek na sekundę i lokalizację pliku. Film przedstawiający doświadczenie degradacji zeolitu uzyskany przy użyciu TEM 200 kV znajduje się w pliku uzupełniającym 3.
7. Wyeksportuj metadane oddzielnie od pobranych obrazów jako plik CSV, wybierając opcję Metadane (CSV) podczas publikowania.
   UWAGA: Obrazy RAW i obrazy z korekcją dryfu są eksportowane jako osobne pliki CSV (plik uzupełniający 4 i plik uzupełniający 5).

4. Metoda 4: Badanie ogrzewania in situ złota na nanocząstkach tlenku żelaza

1. Umieść nanokatalizator (Au/FeO_x) zawieszony w etanolu na chipie elektronicznym podgrzewacza in situ, mikoelektromechanicznym nośniku próbki (MEM) i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Zamontuj próbkę w uchwycie grzewczym in situ, włóż uchwyt z próbką do TEM i podłącz uchwyt do zasilania za pomocą dostarczonego. Zlokalizuj przykładowy zwrot z inwestycji za pomocą kontrolek TEM.
   UWAGA: W tym eksperymencie wykorzystano uchwyt grzewczy, który jest w pełni zintegrowany z oprogramowaniem MVS, umożliwiając osadzanie metadanych temperatury na obrazach.
2. Wybierz odpowiednią opcję przepływu pracy w oprogramowaniu MVS (w tym przykładzie użyto Fusion Workflow, ale można użyć uchwytów grzewczych innych producentów, wybierając opcję Inne).
3. Postępuj zgodnie z instrukcjami przepływu pracy, aby potwierdzić połączenie elektryczne między uchwytem a e-chipem grzewczym, ładując plik kalibracyjny i przeprowadzając kontrolę urządzenia.
4. Podłącz mikroskop do oprogramowania MVS, jak pokazano wcześniej w krokach 2.3-2.10 (w tym przykładzie wybrano wartości metadanych dla szybkości dawki, dawki maksymalnej, korelacji dopasowania, szybkości dryftu i temperatury kanału A) i wyśrodkuj zwrot z inwestycji próbki w polu view.
5. Otwórz zakładkę Fusion AX, a następnie skonfiguruj i zastosuj temperaturę.
6. Kliknij przycisk Ustawienia kanału A, aby uzyskać dostęp do ustawień kontroli temperatury. Wybierz funkcję Temperatura i Tryb sterowania ręcznego.
7. Kliknij przycisk Eksperyment, aby uzyskać dostęp do eksperymentalnych elementów sterujących. Ustaw szybkość narastania na 10 °C/s, a cel na 600 °C. Kliknij Zastosuj, aby rozpocząć eksperyment.
   UWAGA: Eksperyment można wstrzymać lub zatrzymać w dowolnym momencie za pomocą przycisków szybkiego dostępu w prawym dolnym rogu oprogramowania MVS, bez otwierania zakładki Fusion AX.
8. Po osiągnięciu ustawionej temperatury 600 °C otwórz zakładkę Fusion AX i wybierz Eksperyment. Zmień szybkość narastania na 2 °C, a cel na 800 °C. Kliknij Zastosuj, aby rozpocząć eksperyment.
   UWAGA: Procedura stosowania rampy grzewczej zależy od zastosowanego systemu ogrzewania na miejscu. Kroki wyróżnione powyżej w celu zastosowania rampy temperatury mają zastosowanie do systemu użytego w tym przykładzie.
9. Wyróżnij wszystkie wydarzenia lub interesujące miejsca podczas eksperymentu za pomocą funkcji tagowania, jak pokazano w kroku 2.10. Kontynuuj obrazowanie próbki i dostosuj profil temperatury zgodnie z potrzebami. Po zakończeniu kliknij przycisk Zakończ sesję i zapisz plik danych za pomocą oprogramowania analitycznego (część pliku bazy danych omówionego w reprezentatywnych wynikach jest dostarczana jako plik uzupełniający 6).
10. Otwórz oprogramowanie analityczne, aby przejrzeć sesję. Wykreśl temperaturę, matrycowy współczynnik morfingu, szybkość dawki i dawkę skumulowaną na osi czasu. Eksportuj obrazy i filmy zgodnie z potrzebami, wykonując czynności opisane w krokach 3.6 i 3.7. Obrazy i filmy mogą być eksportowane z nakładkami mapy dawek lub bez nich (Rysunek 4).

Wyniki

Niniejsza praca podkreśla użyteczność akwizycji danych przy użyciu oprogramowania MVS w obrazowaniu TEM oraz eksperymentach in situ. Ustawienie osiomocowania mikroskopu oraz konfiguracja warunków zostały przeprowadzone i wybrane za pomocą domyślnych sterowników producenta TEM. Po wstępnej konfiguracji protokoły przedstawione w tym artykule wideo były realizowane za pomocą oprogramowania MVS. Do wszystkich eksperymentów przedstawionych w protokole wideo oraz w danych reprezentatywnych wykorzystano TEM o napięciu 300 kV, z wyjątkiem danych porównawczych dla zeolitów, które pozyskano przy użyciu zimnego FEG o napięciu 200 kV (Rycina 3D-F oraz Tabela 1). Wszystkie metadane zostały zebrane i automatycznie przypisane do odpowiednich obrazów przez oprogramowanie MVS.

Po uruchomieniu oprogramowania i wybraniu odpowiedniego procesu z menu, połączenie z mikroskopem zostaje nawiązane poprzez aktywację przycisku Connect na pasku narzędzi po lewej stronie przeglądarki obrazów, jak pokazano na Rysunku 1A. Gdy przycisk Connect jest podświetlony, obrazy i powiązane metadane z mikroskopu są automatycznie przesyłane do oprogramowania MVS i pojawiają się w panelu podglądu obrazu. Obrazy te oraz ich metadane są zapisywane chronologicznie na osi czasu, którą można otwierać, przeglądać i analizować bez przerywania rejestracji nowych danych (Rysunek 1B). Przesyłanie danych może zostać w dowolnym momencie przerwane przez użytkownika poprzez dezaktywację ikony Connect.

Po aktywacji połączenia można uzyskać dostęp do innych przepływów pracy zależnych od środowiska oprogramowania MVS. W przykładach przedstawionych w tym protokole wideo przed wykorzystaniem pozostałych funkcji oprogramowania MVS należy przeprowadzić kalibrację dawki. Kalibracja dawki jest zautomatyzowanym procesem sterowanym przez oprogramowanie MVS; wykorzystuje ona dedykowany uchwyt do kalibracji dawki z kubkiem Faradaya w celu pomiaru natężenia i pola wiązki dla danej kombinacji parametrów. Uchwyt kalibracyjny z kubkiem Faradaya, przedstawiony na Rysunku 2, jest podłączony do zewnętrznego pikoamperomierza, który precyzyjnie mierzy natężenie wiązki. Po umieszczeniu uchwytu w mikroskopie, otwór wyrównawczy jest centrowany, a w oprogramowaniu wprowadza się pożądane warunki wiązki do kalibracji (rozmiary plamki, apertury i powiększenia). Oprogramowanie wykonuje serię kroków kalibracyjnych dla każdej kombinacji wybranych warunków. Podczas kalibracji dawki uchwyt automatycznie przemieszcza się pomiędzy zintegrowanym kubkiem kolektora prądu Faradaya a otworem przelotowym. Pomiar natężenia dla każdej kombinacji warunków soczewek jest dokonywany na kubku Faradaya przez pikoamperomierz. Następnie oprogramowanie przesuwa stolik, aby wycentrować wiązkę w otworze przelotowym, a pole wiązki jest wyznaczane za pomocą algorytmów wizji maszynowej. Ta seria pomiarów tworzy profil zależności między intensywnością/jasnością a polem wiązki. Umożliwia to oprogramowaniu ekstrapolację pola wiązki podczas regulacji ustawień intensywności/jasności w trakcie eksperymentu, niezależnie od pola widzenia. Wartości dawki skumulowanej i szybkości dawkowania są obliczane na podstawie tych pomiarów natężenia i pola wiązki, a następnie generowany jest plik kalibracji dawki. Proces ten w zasadzie definiuje „odcisk palca” dawki dla TEM i poszczególnych warunków soczewek. Po skalibrowaniu dawki dla TEM użytkownik może pracować normalnie i swobodnie regulować powiększenie oraz intensywność bez utraty informacji o dawce i bez konieczności prowadzenia manualnych notatek¹⁷. Po zakończeniu kalibracji uchwyt kalibracyjny jest usuwany, co umożliwia standardowe wprowadzenie próbki. Proces kalibracji dla trybów TEM i STEM zazwyczaj trwa mniej niż 10 min.

Po skalibrowaniu warunków dawkowania, komercyjnie zakupioną próbkę nanocząsteczek zeolitu (ZSM-5) obrazowano w warunkach wysokiej szybkości dawkowania, aby określić próg dawki (skumulowanej), przy której próbka ulega zbyt silnemu uszkodzeniu, by dostarczać informacji strukturalnych. Nanocząsteczki ZSM-5 zawieszono w etanolu i naniesiono metodą dropcastingu na konwencjonalną miedzianą siatkę TEM. Obrazowano je w sposób ciągły przy napięciu 300 kV w trybie TEM, stosując rozmiar plamki (spot size) 3 oraz 100 µm apertura kondensora. Moc dawki odczytana przez oprogramowanie MVS w warunkach wysokiej mocy dawki wyniosła 519 e^-/Ų·Nanocząstki w polu widzenia obrazowano w sposób ciągły do momentu zaniku pików w FFT, co wskazywało na degradację struktury krystalicznej, jak pokazano w Rycina 3A-C i Plik uzupełniający 3Na obrazach TEM zastosowano nakładki (które można dodać w trakcie eksperymentu lub później w oprogramowaniu do analizy), aby wskazać datę i godzinę, szybkość dawki, maksymalną dawkę (skumulowaną) oraz powiększenie. Szybkość dawki pozostawała stała podczas eksperymentów, a dawka skumulowana (dawka maksymalna) wzrastała w funkcji czasu. Piki FFT zaczęły zanikać po 42 s ciągłego obrazowania (Rycina 3B). W 1 minucie i 20 sekundzie, przy skumulowanej dawce wynoszącej ok. 60 000 e^-/Ųpiki FFT całkowicie zniknęły (Rysunek 3C).

Aby wykazać, że ta metoda kalibracji generuje ilościowe pomiary dawki, które można zastosować do innych mikroskopów pracujących w różnych ustawieniach, ten sam proces kalibracji oraz eksperyment degradacji zeolitu przeprowadzono przy użyciu TEM z zimną gunem emisji polowej (FEG) 200 kV i rozmiarze plamki (spot size) wynoszącym 1. Mikroskop ten skalibrowano zgodnie z procedurą opisaną w Metodzie 1, a następnie przeprowadzono ten sam eksperyment opisany w Metodzie 2, stosując nowe ustawienia rozmiaru plamki i apertury. Ustawienia wiązki zostały dostosowane tak, aby różnica w zastosowanej szybkości dawki między dwoma eksperymentami była pomijalna (499 e^-/Ų·s vs. 519 e^-/Ų·s). Jak pokazano na Rysunku 3D-F i podsumowano w Tabeli 1, punkty FFT całkowicie zanikają po 1 min i 50 s ciągłego obrazowania i skumulowanej dawce 58 230 e^-/Ų, co jest zgodne z wartościami uzyskanymi w pierwszym eksperymencie.

Przykład korzyści, jakie oprogramowanie MVS może przynieść w eksperymentach in situ, zaprezentowano poprzez przeprowadzenie eksperymentu z ogrzewaniem. Jako przykładowy układ wybrano reprezentatywną próbkę nanokatalizatora Au/FeO_x (zsyntezowaną zgodnie z opublikowaną procedurą¹⁹), ponieważ ulega on dynamicznym zmianom morfologicznym i strukturalnym w wysokich temperaturach. Ta indukowana temperaturą mobilność sprawia, że utrzymanie ROI w centrum pola widzenia jest trudne ze względu na ruchy samej próbki oraz rozszerzalność cieplną nośnika próbki podczas zmian temperatury¹⁸. Przy włączonych funkcjach Drift Correct oraz Focus Assist, obrazowanie próbki trwało około 30 s w temperaturze 800 °C. W podwyższonych temperaturach nanocząstki złota w Au/FeO_x migrowały wzdłuż powierzchni nośnika z tlenku żelaza i spiekały się, tworząc większe cząstki, co przedstawiono na Ryc. 4 oraz w filmie w Pliku uzupełniającym 7. Ryc. 5 przedstawia serię migawek TEM (Ryc. 5A-F) porowatego obszaru w nanokatalizatorze Au/FeO_x, zarejestrowanych w różnych punktach czasowych (Ryc. 5G) podczas eksperymentu z ogrzewaniem in situ. Wartość dryfu współrzędnych ROI była automatycznie obliczana przez oprogramowanie. Wartości dryfu współrzędnych i temperatury dla obrazów w trakcie całej serii przedstawiono graficznie na Ryc. 5G. Zgodnie z oczekiwaniami, dryf współrzędnych próbki wzrasta wraz ze wzrostem profilu temperatury, od szybkości ~9 nm/min do ~62 nm/min, a następnie zaczyna spadać i stabilizować się, gdy temperatura zostaje utrzymana na stałym poziomie. Pomimo tak wysokiej szybkości dryfu oraz zmian w morfologii próbki, podczas wzrostu temperatury łatwo uzyskuje się obrazy o wysokiej rozdzielczości, ujawniające ruch w obrębie porowatego obszaru, co pokazano w Pliku uzupełniającym 8. Instrukcje pobierania oraz specyfikację komputerową znajdują się w Pliku uzupełniającym 9.

Rysunek 2: Kalibracja i monitorowanie dawki elektronów. (A) Dawka jest kalibrowana przy użyciu specjalnego uchwytu na próbkę, który zawiera kolektor prądu umieszczony w płaszczyźnie próbki do pomiarów natężenia wiązki. (B) Ilustracja cech konstrukcji końcówki: Lewo: kubek Faradaya; Środek: otwór referencyjny; Prawo: otwór przelotowy (C). Przyłożoną dawkę elektronów można zwizualizować w oprogramowaniu za pomocą map kolorystycznych, które oznaczają różne poziomy ekspozycji na dawkę w obrębie obrazu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 3: Degradacja nanocząstek zeolitu (ZSM-5) indukowana dawką elektronów. (A-C) Migawki wykonane w okresie 1 min i 20 s, przedstawiające dane dotyczące degradacji uzyskane przy użyciu FEG 300 kV i zmierzonej szybkości dawkowania 519 e^-/Ų·s; zeolit ulega degradacji w ciągu 1 min i 20 s. (D-E) Migawki wykonane w okresie 1 min i 50 s, przedstawiające dane dotyczące degradacji uzyskane przy użyciu zimnego TEM FEG 200 kV i szybkości dawkowania elektronów 499 e^-/Ų·s; wstawki pokazują zanikanie plamek FFT w czasie. Pasek skali wynosi 60 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 4: AXON synchronicity wykorzystuje algorytmy komputerowego rozpoznawania obrazu do śledzenia i stabilizacji dynamicznie ewoluujących próbek. Metadane generowane podczas eksperymentu mogą być naniesione na oś czasu, co pozwala użytkownikowi na szybkie sparowanie obrazu z powiązanymi z nim metadanymi podczas przewijania serii obrazów utworzonych w trakcie eksperymentu. (A-H) Obrazy próbki nanokatalizatora (Au/FeO_x) w temperaturze 800 °C zarejestrowane w ciągu 28 s zarówno z (A-D), jak i bez (E-H) nałożonej mapy dawki. Czerwone obszary na nakładce wskazują regiony wysokiej skumulowanej ekspozycji na dawkę, a żółte obszary wskazują regiony o niższej ekspozycji. Podświetlenie pojedynczego piksela wskazuje skumulowaną dawkę dla tego piksela. Białe strzałki na panelach E-H wskazują dwie cząstki, które łączą się podczas eksperymentu, a pomarańczowa strzałka wskazuje trajektorię poruszającej się cząstki złota. (I) Oś czasu eksperymentu wygenerowana przez oprogramowanie analityczne dla serii obrazów pokazanej w A-H. Pomarańczowe kropki na górze osi czasu oznaczają obrazy surowe (niekorygowane cyfrowo), a niebieskie kropki oznaczają obrazy skorygowane pod kątem dryfu. Pomarańczowe pionowe paski wskazują punkty na osi czasu odpowiadające obrazom przedstawionym na panelach A-H. Pasek skali wynosi 40 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 5: Obrazy TEM obszaru porowatego w nanokatalizatorze Au/FeOx w różnych punktach czasowych. Oprogramowanie MVS stabilizuje i centruje próbkę nawet przy wysokich prędkościach dryftu, takich jak te występujące podczas rampy temperaturowej, poprzez zastosowanie korekcji stolika, przesunięcia wiązki oraz korekcji cyfrowych, zgodnie ze wskazaniami algorytmów wizji maszynowej. (A-F) Obrazy TEM obszaru porowatego w nanokatalizatorze Au/FeOx, zarejestrowane w różnych (G) punktach czasowych podczas eksperymentu ogrzewania in situ. Prędkość dryftu ROI jest automatycznie obliczana i rejestrowana podczas eksperymentu przez oprogramowanie MVS. Jak przedstawiono na wykresie (G), wraz ze zmianą profilu temperatury (linia niebieska), prędkość dryftu (linia pomarańczowa) rośnie wraz ze wzrostem temperatury i maleje, gdy temperatura jest utrzymywana na stałym poziomie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Typ mikroskopu	TEM z emiterem polowym (FEG) 300 kV	TEM z zimną katodą FEG 200 kV
Wielkość plamki/apertura przysłony kondensora 2	3/100 µm	1/100 µm
Moc dawki	519 e-/A2•s1	499 e-/A2•s1
Pomiar utraty struktury za pomocą FFT (Dawka skumulowana)	60 270 e-/A2	58 230 e-/A2

Tabela 1: Porównawcze podsumowanie wyników degradacji zeolitów uzyskanych przy użyciu różnych mikroskopów.

Plik uzupełniający 1: Zrzut ekranu interfejsu oprogramowania MVS z otwartą kartą zarządzania dawką. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Plik bazy danych oprogramowania MVS z eksperymentu degradacji zeolitu indukowanej wiązką. To oprogramowanie do wizualizacji i analizy jest dostępne do bezpłatnego pobrania. Instrukcje pobierania oraz specyfikację komputerową można znaleźć w Pliku uzupełniającym 9. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Film przedstawiający degradację zeolitu indukowaną wiązką. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: plik CSV 1 (degradacja zeolitu: surowe dane [wyłącznie korekcja mechaniczna]) Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: plik CSV (degradacja zeolitu: korekta dryftu [korekcja mechaniczna + cyfrowa]) Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 6: Plik bazy danych oprogramowania MVS dla eksperymentu ogrzewania nanokatalizatora in situ. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 7: Film przedstawiający nanokatalizator w temperaturze 800 °C z nałożonymi mapami dawek. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 8: Film przedstawiający nanokatalizator podczas rampy temperaturowej ze skoordynowanymi wartościami dryftu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 9: Instrukcje pobierania bezpłatnego oprogramowania analitycznego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Interpretacja wyników eksperymentów TEM często zależy od wielu powiązanych ze sobą parametrów eksperymentalnych, takich jak ustawienia mikroskopu, warunki obrazowania, a w przypadku eksperymentów operando lub in situ – zmiany w środowisku lub bodźce^1,23. Dokładna analiza dużych zbiorów danych TEM, w których parametry te mogą być stale modyfikowane, wymaga od operatora szczególnej uwagi w celu precyzyjnego zapisywania każdego warunku i ustawienia dla każdego obrazu w dzienniku laboratoryjnym lub innym zewnętrznym źródle dokumentacji. Wraz ze wzrostem rozmiaru i złożoności zbiorów danych TEM, ręczne prowadzenie zapisów staje się niewykonalne, a kluczowe informacje mogą zostać pominięte lub błędnie odnotowane. Opisane tutaj oprogramowanie MVS konsoliduje metadane generowane podczas eksperymentu przez mikroskop, detektor/kamerę oraz inne systemy (takie jak uchwyty próbek in situ) i przypisuje je do odpowiednich obrazów.

Oprócz konsolidacji metadanych, oprogramowanie stosuje algorytmy wizji maszynowej w celu śledzenia i stabilizacji pola widzenia poprzez kombinację korekcji przestrzennych, wiązki i cyfrowych, wykorzystując funkcje Drift Correct oraz Focus Assist. Po uruchomieniu funkcji Drift Correct generowany jest „szablon” obrazu korelacji wzajemnej, wykorzystując pierwszy obraz zaimportowany do oprogramowania MVS. Szablon ten jest następnie porównywany z kolejnymi obrazami w celu obliczenia kierunku i wielkości dryfu lub przemieszczenia próbki. Na podstawie tych informacji oprogramowanie MVS automatycznie wprowadza niezbędne korekty, aby utrzymać cechy obrazu w tym samym miejscu, regulując przynajmniej jeden z trzech parametrów: położenie stolika, przesunięcie wiązki lub obrazu oraz cyfrową korekcję obrazu. Funkcja Focus Assist wykorzystuje kombinację algorytmów do przypisania każdej klatce wartości ostrości, zwanej wynikiem ostrości (focus score); wyniki te są porównywane, aby określić wielkość i kierunek korekty rozostrzania niezbędnej do utrzymania ostrości próbki. W trybie obrazowania STEM oprogramowanie MVS dąży do maksymalizacji kontrastu poprzez zastosowanie autorskiej wersji znormalizowanej wariancji w celu przypisania wyniku ostrości. W trybie TEM obliczana jest radialna suma natężenia w FFT, która służy do wyznaczenia wyniku ostrości. Ograniczenia możliwości optymalizacji ostrości przez oprogramowanie MVS występują w sytuacjach, gdy nie jest ono w stanie dokładnie obliczyć prawidłowego wyniku ostrości dla obrazu. Zdarza się to zazwyczaj, gdy mikroskop jest źle skalibrowany lub próbka jest znacząco nieostra podczas kalibracji, co uniemożliwia oprogramowaniu poprawne obliczenie początkowej wartości wyniku ostrości. Oprogramowanie MVS może mieć trudności z obliczeniem wyniku ostrości dla próbek z wyraźnymi prążkami sieci krystalicznej, ponieważ prążki te w FFT mogą „zdominować” algorytm oceny ostrości; w konsekwencji, jeśli próbka straci ostrość, wynik ostrości może nie odzwierciedlać tej zmiany w sposób dokładny. I odwrotnie, praca przy niskich powiększeniach lub z próbką o niskim sygnale FFT może również utrudniać obliczenie prawidłowego wyniku ostrości. Aby zniwelować te trudności, oprogramowanie MVS zawiera szereg dodatkowych algorytmów obliczania wyniku ostrości, które użytkownik może wybrać, jeśli ustawienia domyślne są nieodpowiednie dla danej próbki. Muszą być one testowane i stosowane indywidualnie, aby dobrać najlepsze algorytmy dla konkretnego eksperymentu.

Zmiany morfologiczne w strukturze próbki w czasie są uwzględniane przy użyciu czynnika morfingu szablonu. Filtr ten jest regulowany przez operatora, dzięki czemu algorytmy rejestracji uwzględniają zmiany morfologiczne w czasie. Dodatkowo oprogramowanie monitoruje obraz ciągły, ustawienia mikroskopu oraz ustawienia kamery lub detektora, aby automatycznie aktualizować szablon w przypadku zmian w strukturze próbki oraz po wszelkich wprowadzonych przez operatora zmianach parametrów mikroskopu, kamery lub detektora. Jak pokazano na Rysunku 4, Rysunku 5, w Pliku uzupełniającym 7 oraz Pliku uzupełniającym 8, oprogramowanie MVS zapewnia skuteczną i natychmiastową stabilizację, umożliwiając obrazowanie w wysokiej rozdzielczości dynamicznie poruszających się lub zmieniających się próbek. Chociaż oprogramowanie jest w stanie kontrolować bardzo wysokie tempo dryfu lub ruchu próbki, takie jak te występujące podczas stosowania rampy grzewczej w eksperymencie in situ, istnieją ograniczenia dotyczące maksymalnych korekt stolika lub przesunięć wiązki, które oprogramowanie może kontrolować, jeśli próbka porusza się lub dryfuje bardzo szybko. Limit ten jest funkcją szybkości aktualizacji obrazu, rozmiaru pola widzenia oraz szybkości dryfu. Dla danego pola widzenia i szybkości aktualizacji obrazu istnieje maksymalna szybkość dryfu, którą można skorygować, a jeśli ruchy mechaniczne nie nadążą za procesem, może on zostać przerwany lub stać się niestabilny. Na podstawie szablonów rejestracji generowanych podczas stosowania funkcji takich jak Drift Correct, można wygenerować dodatkowe obliczone metadane. Na przykład Match Correlation jest numerycznym zapisem zakresu zmian między szablonami w serii i jest używany do identyfikacji punktów w osi czasu eksperymentu, w których nastąpiła zmiana próbki. Wysoka wartość korelacji dopasowania odpowiada próbce, która przeszła zmiany morfologiczne, a niska wartość korelacji dopasowania odpowiada próbce, której struktura pozostaje stosunkowo statyczna. Korelacja dopasowania jest szczególnie cenna w badaniach in situ, ponieważ można ją przedstawić graficznie, co pozwala użytkownikowi szybko wskazać obrazy w serii odpowiadające znaczącej zmianie próbki. Ważne jest jednak zrozumienie, że wysokie wartości korelacji dopasowania mogą również odpowiadać zmianom w warunkach obrazowania, takim jak przesuwanie stolika lub zmiana powiększenia, jeśli czynności te są wykonywane podczas gdy funkcja Drift Correction pozostaje aktywna.

Przedstawiony tutaj proces kalibracji wykorzystuje unikalny uchwyt kalibracyjny oraz półautomatyczną procedurę kalibracji w celu dokładnej kalibracji wiązki przy różnych warunkach soczewek przy minimalnej ingerencji operatora. Dostęp do procedury kalibracji dawki odbywa się poprzez oprogramowanie MVS zainstalowane na TEM. Oprogramowanie MVS automatycznie odczytuje odpowiednie ustawienia mikroskopu, aby zapisać wszystkie pomiary jako referencje dla późniejszych eksperymentów. W niektórych mikroskopach TEM odczyt ustawień apertury lub monochromatora nie jest możliwy, w związku z czym muszą one zostać wprowadzone do ustawień oprogramowania MVS przez operatora podczas kalibracji oraz w trakcie użytkowania. W oprogramowaniu wbudowano przypomnienia, które pomagają aktualizować te ustawienia wprowadzane przez operatora zgodnie z poleceniami programu. Opracowanie uchwytu z wbudowanym kolektorem prądu, zamiast polegania na kolektorze zintegrowanym w innym miejscu kolumny mikroskopu, było świadomym wyborem projektowym. Pozwala to na umieszczenie kolektora prądu w tej samej płaszczyźnie co próbka, co eliminuje błędy w pomiarze prądu spowodowane odchyleniem wiązki lub różnicami w absorpcji elektronów przez apertury w różnych pozycjach wiązki. Oprogramowanie MVS realizuje zautomatyzowaną procedurę pomiaru natężenia prądu wiązki i jej pola dla dowolnej kombinacji warunków soczewek. Następnie oprogramowanie może powiązać te zmierzone wartości kalibracyjne z prądem kamery lub ekranu i ekstrapolować wszelkie zmiany powiększenia itp. na pole wiązki podczas eksperymentu. Po wygenerowaniu pliki kalibracyjne te mogą być używane natychmiast i są automatycznie zapisywane do późniejszego wykorzystania, jeśli oprogramowanie wykryje zastosowanie tych samych ustawień podczas przyszłej sesji. Choć trwałość pliku kalibracyjnego różni się w zależności od mikroskopu, autorzy stwierdzili, że mogą oni korzystać z tych samych plików kalibracyjnych przez kilka miesięcy bez obserwowania istotnych zmian wartości prądu. Wbudowane procedury monitorujące profil emisji dział są pomocne w utrzymaniu aktualności tych kalibracji, szczególnie w przypadku dział z zimną emisją FEG.

Normalizacja pomiarów dawki między mikroskopami oraz zautomatyzowane śledzenie ekspozycji próbki na wiązkę są krytycznymi funkcjami oprogramowania MVS, ponieważ umożliwiają one ilościowe porównania warunków dawkowania pomiędzy eksperymentami przeprowadzonymi na różnych systemach mikroskopowych. Degradacja próbki zeolitu (ZSM-5) indukowana dawką, uzyskana podczas identycznych eksperymentów z użyciem różnych mikroskopów, skutkuje całkowitym zanikiem plamek FFT po maksymalnej dawce skumulowanej lub progowej elektronów (~60.000 e^-/Ų przy zastosowaniu szybkości dawkowania ~500 e^-/Ų·s) dla obu konfiguracji. Te porównawcze wyniki wykazują, że oprogramowanie do dawkowania ułatwia powtarzalne, ilościowe pomiary dawki. Niewielka różnica w dawce skumulowanej, przy której obserwuje się całkowity zanik plamek FFT w każdym eksperymencie, jest prawdopodobnie wynikiem różnych napięć przyspieszających stosowanych przez oba mikroskopy, przy czym niższe napięcia przyspieszające prowadzą do większej liczby ścieżek uszkodzeń radiacyjnych, a wyższe napięcia przyspieszające zazwyczaj skutkują większymi uszkodzeniami typu knock-on²⁴. Wyniki literaturowe dla dawki krytycznej nanocząstek ZSM-5 wynoszą od 9,000-14,000 e^-/Ų w oparciu o pierwsze zaniki plamek FFT, a nie całkowity zanik wszystkich plamek FFT^25,26. W naszych wynikach pierwszy zanik plamek FFT odpowiada dawce skumulowanej rzędu 25,000 e^-/Ų. Poprzednie badania opierały się na pomiarach prądu uzyskiwanych za pomocą ekranu fosforowego, o którym dobrze wiadomo, że niedoszacowuje on pomiarów prądu wiązki w porównaniu z czarką Faradaya¹⁵. Wyznaczona dawka krytyczna może różnić się dwukrotnie lub więcej, w zależności od tego, który pik FFT jest używany do śledzenia dawki. Wskazuje to na to, że wyższe częstotliwości przestrzenne ulegają degradacji w pierwszej kolejności i może to prowadzić do różnych wartości w zależności od osi strefowej użytej podczas pomiarów (nasze wyniki koncentrowały się na plamkach FFT z całego kryształu zeolitu, a nie na konkretnych cechach strukturalnych)^25,26. Te różnice w technikach i kalibracji prądu wyjaśniają różnice w wartościach pomiędzy dwoma eksperymentami opisanymi w naszych wynikach a poprzednimi badaniami literaturowymi.

Choć oddziaływania związane z dawką elektronów stanowią istotny czynnik w wielu eksperymentach TEM, badania in situ, a w szczególności liquid-EM, są szczególnie podatne na ich efekty. Radioliza cieczy wywołana wiązką elektronów prowadzi do powstania kaskady chemicznie reaktywnych gatunków, które mogą oddziaływać z próbką, co komplikuje analizę. Zarówno szybkość dawkowania lub fluencja stosowana podczas eksperymentu liquid-EM, jak i dawka skumulowana mogą wpływać na stężenie gatunków rodnikowych generowanych w wyniku radiolizy cieczy^27,28. Zatem gromadzenie i rejestrowanie metadanych dotyczących zarówno dawki skumulowanej, jak i szybkości dawkowania w trakcie całego eksperymentu pozwala na bezpośrednią korelację obrazów z historią dawkowania próbki i stanowi bardziej precyzyjny sposób wyjaśnienia oraz kontrolowania wpływu wiązki elektronów w tych badaniach. Choć nie jest to opisane w niniejszym protokole, przykład użyteczności funkcji zarządzania dawką w liquid-EM przedstawiono na Rysunku 6.

Rycina 6: Wzrost nanocząstek złota indukowany wiązką podczas eksperymentu liquid-EM in situ. (A) Przegląd STEM przy małym powiększeniu obrazujący wynikowy wzrost cząstek z nałożoną kolorystycznie mapą dawki skumulowanej w badanym obszarze. Czerwone obszary na nałożonej mapie wskazują regiony wysokiej skumulowanej dawki ekspozycji, a obszary żółte wskazują regiony niższej ekspozycji. Zaznaczenie pojedynczego piksela kursorem lub narysowanie ramki wokół obszaru za pomocą dołączonych narzędzi rysunkowych wskazuje skumulowaną dawkę dla danego piksela lub obszaru. Pasek skali wynosi 2 µm. (B,C) Obrazy STEM przy większym powiększeniu obszarów zaznaczonych pomarańczowymi ramkami (b,c) na rysunku A. Obszar b, narażony na wyższą skumulowaną dawkę (10.811 e^-/Ų), zawiera większe cząstki niż te znalezione w obszarze c, który był narażony na niższą skumulowaną dawkę (0.032 e^-/Ų). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wzbogacone metadane dotyczące mocy dawki oraz dawki skumulowanej upraszczają analizę zależnych od dawki ścieżek wzrostu i degradacji nanomateriałów. Rycina 6 przedstawia indukowaną wiązką redukcję roztworu jonów chlorku złota(III) (HAuCl₃) w wodzie podczas eksperymentów z wykorzystaniem ciekłej mikroskopii elektronowej (liquid-EM). Na podstawie nałożonej kolorystycznej mapy dawek na Rycini 6A łatwo można zauważyć, że skumulowana dawka elektronów wpływa na końcowy rozmiar i kształt nanocząstek^29,30,31,32. Przegląd STEM przy niskim powiększeniu pokazuje obszary narażone na wysoką (czerwony) i niską (żółty) dawkę skumulowaną. Cząstki w obszarze narażonym na wyższe dawki są większe niż te w obszarach narażonych na niższe dawki skumulowane. Ponieważ metadane dotyczące dawki są bezpośrednio osadzone w każdym obrazie na poziomie pikseli, złożone efekty dawki elektronów w eksperymentach liquid-EM mogą być teraz systematycznie analizowane w sposób, który wcześniej nie był możliwy do osiągnięcia.

W niniejszym protokole wykazaliśmy, że oprogramowanie MVS stanowi kompleksowe rozwiązanie do kalibracji, monitorowania i śledzenia zarówno dawki elektronów, jak i całkowitej dawki dostarczonej do próbki w skali każdego piksela. Możliwość ta otwiera nowy paradygmat obrazowania próbek wrażliwych na dawkę oraz rozumienia oddziaływań wiązki elektronów. Jest to szczególnie obiecujące w przypadku eksperymentów z wykorzystaniem ciekłej EM, ponieważ pozwoli na bardziej efektywne badanie roli, jaką odgrywa dawka elektronów, oraz poprawi powtarzalność eksperymentalną. Mamy nadzieję, że te nowe ramy pozwolą na dokładne gromadzenie informacji o mocy dawki i dawce skumulowanej, ułatwią udostępnianie tych danych społeczności naukowej w celu dokładniejszej interpretacji wyników TEM oraz przyczynią się do rozwoju współpracy naukowej i wymiany danych poprzez umożliwienie raportowania i analizy zgodnie z zasadami FAIR.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ARM200F Transmisyjny	JEOL		(200 kV)
Uchwyt do kalibracji AXON DOSE	Protochips, Inc.	AXA-FC-TFS	Pakiet sprzętowy do kalibracji i zarządzania dawką dla oprogramowania ThermoFisher ScientificTEM
AXON DOSE:  Wersja 10.6.5.3	Protochips, Inc.	AX-MOD-DOSE-01-1YR	Oprogramowanie do kalibracji i zarządzania dawką
Oprogramowanie AXON Studio: wersja 10.6.5.3	Protochips, Inc.	Brak numeru części. Dostępne do pobrania pod adresem  success.protochips.com	Oprogramowanie do analizy offline dla zestawów danych AXON.  Bezpłatna kopia oprogramowania AXON Studio jest dostępna do pobrania pod adresem:   success.protochips.com
AXON Synchronicity Core	Protochips, Inc.	AXON-CORE	Komponent sprzętowy oprogramowania do synchronizacji.
Oprogramowanie do synchronizacji AXON:  Wersja 10.6.5.3	Protochips, Inc.	AX-MOD-SYNCPRO-01-1YR	Oprogramowanie do synchronizacji
Fusion In-Situ Heating E-chip	Protochips, Inc.	E-FHDC-VO-10	Sample Support E-chip z folią węglową.  Używany z systemem grzewczym in situ
Fusion Select In Situ Heating System	Protochips, Inc.	FFAD-6200-EXP	System grzewczy MEMs in-situ dla ThermoFisher Scientific TEM.
Hydrat chlorku złota(III) (50% na bazie złota) 50790	Sigma Aldrich	27988-77-8	Służy do przygotowania nanokatalizatora Au/FeOx.  Procedura syntezy koprecipitacji zastosowana w C. Sze et al. Materials Letters. 36 (1– 4), 11– 16 (1998)
Tlenek żelaza (III) 310050 (Fe2O3)	Sigma Aldrich	1309-37-1	Służy do przygotowania nanokatalizatora Au/FeOx.  Procedura syntezy koprecipitacji zastosowana w C. Sze et al. Materials Letters. 36 (1– 4), 11– 16 (1998)
Titan ChemiSTEM	ThermoFisher Naukowy		transmisyjny mikroskop elektronowy (300 kV)
Zeolit ZSM-5	Zeolyst	CBV 8014	Próbka nanokatalizatora:  80 SiO2/Al2O3 Stosunek molowy

mikroskop elektronowy CFEG