Artykuł metodologiczny

Test jednostkowy tworzenia mikrokolonii do oceny skuteczności szczepionek przeciwko gruźlicy

3.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65447

⸱

28 lipca 2023

 , 
1Faculty of Medicine, Universidade Católica Portuguesa, 2Center for Interdisciplinary Research in Health, Universidade Católica Portuguesa, 3Host-Pathogen Interactions Unit, Research Institute for Medicines, iMed-ULisboa, Faculty of Pharmacy, Universidade de Lisboa

W tym artykule

Podsumowanie

Oznaczanie jednostek tworzących kolonie (CFU) jest złotym standardem w ilościowym oznaczaniu bakterii, w tym Mycobacterium tuberculosis, które mogą potrzebować tygodni na utworzenie widocznych kolonii. W tym miejscu opisujemy mikro-CFU do oznaczania CFU ze zwiększoną wydajnością czasową, zmniejszoną przestrzenią laboratoryjną i kosztami odczynników oraz skalowalnością do eksperymentów o średniej i wysokiej przepustowości.

Streszczenie

Gruźlica (TB), główna przyczyna zgonów na świecie z powodu czynnika zakaźnego, zabiła 1,6 miliona ludzi w 2022 roku, wyprzedzając ją tylko przez COVID-19 podczas pandemii 2019-2021. Choroba jest wywoływana przez bakterię Mycobacterium tuberculosis (M.tb). Szczep Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), jedyna szczepionka przeciwko gruźlicy, jest najstarszą licencjonowaną szczepionką na świecie, nadal używaną. Obecnie w badaniach klinicznych znajduje się 12 szczepionek, a kilkadziesiąt szczepionek jest w fazie rozwoju przedklinicznego. Metodą z wyboru stosowaną do oceny skuteczności szczepionek przeciw gruźlicy w badaniach przedklinicznych jest oznaczanie liczby kolonii bakteryjnych za pomocą testu jednostek tworzących kolonie (CFU). Ten czasochłonny test trwa od 4 do 6 tygodni, wymaga dużej przestrzeni laboratoryjnej i inkubatora, ma wysokie koszty odczynników i jest podatny na zanieczyszczenie. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną metodę oznaczania liczby kolonii, mikro-CFU (mCFU), która oferuje proste i szybkie rozwiązanie do analizy wyników skuteczności szczepionki M.tb. Test mCFU wymaga dziesięciokrotnie mniej odczynników, trzykrotnie skraca okres inkubacji, który trwa od 1 do 2 tygodni, zmniejsza przestrzeń laboratoryjną i koszt odczynnika oraz minimalizuje zagrożenia dla zdrowia i bezpieczeństwa związane z pracą z dużą liczbą M.tb. Ponadto, aby ocenić skuteczność szczepionki przeciwko gruźlicy, próbki można uzyskać z różnych źródeł, w tym z tkanek pochodzących od zaszczepionych zwierząt zakażonych prątkami. Opisujemy również zoptymalizowaną metodę wytwarzania jednokomórkowej, jednolitej i wysokiej jakości kultury prątków do badań nad infekcjami. Wreszcie, proponujemy, aby metody te były powszechnie stosowane w badaniach przedklinicznych nad określeniem skuteczności szczepionek, co ostatecznie doprowadziłoby do skrócenia czasu opracowywania szczepionek przeciwko gruźlicy.

Wprowadzenie

Gruźlica (TB) jest główną przyczyną zgonów na całym świecie spowodowana pojedynczym czynnikiem zakaźnym, bakterią Mycobacterium tuberculosis (M.tb), zabijającą więcej ludzi niż jakikolwiek inny patogen. W 2021 r. gruźlica była odpowiedzialna za 1,6 mln zgonów i została wyprzedzona przez COVID-19 podczas pandemii 2019-2021 1. Co więcej, zgodnie z globalnym raportem Światowej Organizacji Zdrowia na temat gruźlicy z 2022 r., pandemia COVID-19 była odpowiedzialna za wzrost liczby nowych przypadków gruźlicy. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) informuje również o dużych spadkach liczby osób, u których zdiagnozowano gruźlicę w tym okresie, co może jeszcze bardziej zwiększyć liczbę przypadków gruźlicy1.

Bacillus Calmette-Guérin (BCG) to żywy atenuowany szczep patogennego Mycobacterium bovis, użyty po raz pierwszy jako szczepionka ponad 100 lat temu. Jest to jedyna szczepionka przeciwko gruźlicy i jest to najstarsza licencjonowana szczepionka na świecie, która jest nadal w użyciu2,3. Obecnie istnieje 12 szczepionek w różnych fazach badań klinicznych4, a dziesiątki szczepionek są w fazie rozwoju przedklinicznego5,6. Przedkliniczna ocena szczepionek przeciwko gruźlicy obejmuje ocenę bezpieczeństwa i immunogenności7, które można uzyskać w różnych modelach zwierzęcych, takich jak danio pręgowany, myszy, świnki morskie, króliki, bydło i naczelne inne niż ludzie8,9,10. Dodatkowo, ocena zdolności szczepionki do indukowania ochrony przed zakażeniem i/lub przenoszeniem M.tb, tj. skuteczności szczepionki, wymaga prowokacji M.tb in vivo5,11. Co ciekawe, szczepienie BCG wywołuje niespecyficzne efekty, które wpływają na przeżywalność innych patogenów bakteryjnych i wirusowych12,13 poprzez mechanizm wytrenowanej odporności14. Aby określić ilościowo żywotne obciążenie bakteryjne u zakażonego zwierzęcia, metodą z wyboru jest wyliczenie kolonii bakteryjnych za pomocą testu jednostek tworzących kolonie (CFU)5,15. CFU to jednostka, która szacuje liczbę mikroorganizmów (bakterii lub grzybów), które tworzą kolonie w określonych warunkach wzrostu. CFU pochodzą od żywotnych i replikacyjnych mikroorganizmów, a bezwzględna liczba żywych mikroorganizmów w każdej kolonii jest trudna do oszacowania. Nie ma pewności, czy kolonia powstała z jednego czy więcej mikroorganizmów. Jednostka CFU odzwierciedla tę niepewność, stąd można zaobserwować dużą zmienność w powtórzeniach tej samej próbki. Ten czasochłonny test wymaga wyspecjalizowanych techników przeszkolonych do pracy w obiekcie o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL3), dużej przestrzeni laboratoryjnej i inkubatorze, trwa od 4 do 6 tygodni i jest podatny na zanieczyszczenie.

W tym badaniu opisujemy zoptymalizowaną metodę oznaczania liczby kolonii, mikro-CFU (mCFU), oraz oferujemy proste i szybkie rozwiązanie do analizy wyników15,16,17,18,19,20. Test mCFU wymaga dziesięciokrotnie mniej odczynników, trzykrotnie skraca okres inkubacji, który trwa od 1 do 2 tygodni, zmniejsza przestrzeń laboratoryjną i koszt odczynnika oraz minimalizuje zagrożenia dla zdrowia i bezpieczeństwa związane z pracą z dużą liczbą M.tb. Proponujemy, aby metoda ta była powszechnie stosowana w badaniach przedklinicznych nad określeniem skuteczności szczepionek, co ostatecznie doprowadziłoby do skrócenia czasu opracowywania szczepionek przeciwko gruźlicy. Wreszcie, ta zoptymalizowana metoda liczenia CFU została wykorzystana do ilościowego określenia nie tylko prątków, ale także innych bakterii, takich jak Escherichia coli i Ralstonia solanacearum21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Opisany tutaj protokół dotyczy BCG, ale może zostać zastosowany do dowolnych prątków (Mycobacteria). BCG może służyć jako bakteria zastępcza w eksperymentach dotyczących gruźlicy (TB), gdy dostępne nie są zapleczności poziomu BSL322. Poniższe procedury z użyciem BCG powinny być wykonywane w laboratorium poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2), zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego oraz dobrą praktyką laboratoryjną w zakresie manipulacji mikroorganizmami grupy zagrożenia 2.

1. Przygotowanie pożywek hodowlanych

  1. Przygotować bulion Middlebrook 7H9 uzupełniony o 10% (v/v) wzbogacenia OADC (kwas oleinowy, albumina, dekstroza i katalaza), zgodnie z instrukcjami dostawcy. Uzupełnić bulion o 0,05% (v/v) tyloxapolu.
    UWAGA: Tyloxapol jest niejonowym polimerem w cieczy, który jest stosowany jako surfaktant w celu zapobiegania tworzeniu się grudek bakteryjnych16.
  2. Przygotować stałą pożywkę Middlebrook 7H10 uzupełnioną o 10% (v/v) wzbogacenia OADC zgodnie z instrukcjami dostawcy.
  3. Rozlać 40 mL pożywki do kwadratowych szalek Petriego (120 mm x 120 mm). Pozostawić szalki do wyschnięcia, aby zminimalizować kondensację na powierzchni agaru.
    UWAGA: Ten konkretny rozmiar szalki Petriego jest kluczowy, aby umożliwić bezpośrednie przeniesienie co najmniej 96 kropli z płytki 96-dołkowej. Skuteczne osuszenie szalek ułatwi późniejszy wysiew małych kropli zawiesiny bakteryjnej i zapobiegnie ich rozprzestrzenianiu się.
  4. Przygotować pożywkę Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI 1640) lub Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w celu sporządzenia pożywki do infekcji. W obu przypadkach uzupełnić pożywkę o 10% płodowej surowicy cielęcej, 1% L-glutaminy i 1 mM pirogronianu sodu. Do pożywki nie dodawać penicyliny i streptomycyny.

2. Przygotowanie próbek

  1. Pozyskać próbki z różnych źródeł. Zazwyczaj, aby określić liczbę CFU w celu oceny skuteczności szczepionki przeciw gruźlicy (TB), należy pobrać próbki z tkanek zwierząt szczepionych i nieszczepionych. Przykładowo: płuco i śledziona myszy11 lub płuco, węzły chłonne klatki piersiowej i obwodowe, śledziona, wątroba, skóra, krew, szpik kostny oraz płukanina z przemywania pęcherzyków płucnych makaka23. Alternatywnie można pobrać próbki z kultur in vitro makrofagów/komórek dendrytycznych/neutrofili zainfekowanych BCG18,19,20, 24,25,26.

3. Przygotowanie hodowli BCG

UWAGA: W badaniach in vivo nad szczepionkami przeciwko gruźlicy celem jest poprawa skuteczności BCG. Dlatego grupy zaszczepione BCG są zazwyczaj stosowane jako kontrola. Szczepy BCG wykorzystywane do szczepień ludzi są idealne do testów w modelach zwierzęcych. W takim przypadku hodowlę BCG należy zrekonstytuować zgodnie z instrukcjami dostawcy27. Jednakże hodowlę BCG do badań in vivo można również przygotować we własnym laboratorium11. Produkcja jednokomórkowej, jednorodnej i wysokiej jakości hodowli BCG do protokołów zakażeń in vitro została przeprowadzona z dużym sukcesem w kilku badaniach11, 16, 18,19,20, 26, 28, 29, przy użyciu następującego protokołu, który może być również stosowany w badaniach nad zakażaniem zwierząt.

  1. Hodować 50 mL BCG w bulionie 7H9 w temperaturze 37 °C, przy wytrząsaniu z prędkością 200 rpm. Dostosować objętość do potrzeb eksperymentu.
  2. Codziennie, przez 8-10 dni, pobierać 100 µL hodowli i rozcieńczać ją, dodając 900 µL PBS do kuwety o pojemności 1 mL. Następnie zmierzyć gęstość optyczną bakterii (OD przy λ=600 nm; OD600) za pomocą spektrofotometru. Na podstawie uzyskanych wartości wykreślić krzywą wzrostu. Wyznaczyć środkową fazę logarytmiczną hodowli (moment, w którym wartość OD podwaja się regularnie w jednostce czasu).
  3. Przygotować kolejną hodowlę i inkubować ją do czasu osiągnięcia środkowej/późnej fazy wzrostu logarytmicznego, analogicznie do kroków 3.1 i 3.2. Jako wytyczne wykorzystać wartości uzyskane w poprzednim kroku. Należy dopilnować, aby hodowla nie osiągnęła stacjonarnej fazy wzrostu (momentu, w którym OD zaczyna się stabilizować), aby zachować wysoką jakość hodowli żywych bakterii.
  4. Pobrać hodowlę w środkowej/późnej fazie wzrostu logarytmicznego. Wirować przy 3000 x g przez 10 min. Usunąć nadsącz.
  5. Dodać 10 mL PBS w celu przemycia bakterii. Wirować przy 3000 x g przez 10 min. Usunąć nadsącz.
  6. Resuspendować bakterie w 5 mL medium do infekcji. Umieścić probówkę w kąpieli ultradźwiękowej na 15 min, przy pełnej mocy i częstotliwości 80 Hz.
  7. Wirować przy 1000 x g przez 10 min. Zebrać nadsącz, unikając pobrania osadu, ponieważ jest on bogaty w agregaty bakteryjne, których należy unikać w wysokiej jakości hodowli BCG; osad odrzucić.
  8. Zmierzyć OD nadsączu. W tym przypadku hodowle w fazie wzrostu wykładniczego z OD600 wynoszącą 0,1 odpowiadają stężeniu 1 x 107 CFU/mL.
    UWAGA: Każde laboratorium powinno opracować własne krzywe wzrostu BCG przed rozpoczęciem eksperymentów, aby ustanowić regresję liniową między OD600 a CFU przy użyciu posiadanego spektrofotometru. Należy pamiętać, że spektrofotometry mają różne długości drogi optycznej, co może wpływać na odczyty uzyskane dla tej samej próbki.
  9. Przeprowadzić proste obliczenia, aby ustalić liczbę bakterii do dodania do każdej hodowli komórek gospodarza. Liczba bakterii na jedną komórkę gospodarza to wielokrotność infekcji (MOI). Przyjąć MOI wynoszącą 10 bakterii na komórkę gospodarza, co jest najczęstszym MOI stosowanym w eksperymentach z infekcją BCG.

4. Test tworzenia mikrokolonii (MFU)

UWAGA: Po zakończeniu eksperymentu z infekcją in vivo lub in vitro, enumerację bakterii można przeprowadzić za pomocą mCFU. W badaniach in vivo próbki muszą zostać najpierw zhomogenizowane w homogenizatorze kulkowym (bead beater) lub innym homogenizatorze tkanek. W przypadku kultur in vitro makrofagów/komórek dendrytycznych/neutrofili zainfekowanych BCG, próbki muszą zostać poddane lizie z użyciem detergentu niejonowego (np. 0,05% roztworu niejonowego, niedenaturującego detergentu).

  1. Rozcieńczanie seryjne przy użyciu płytki 96-dołkowej: przeprowadź 10-krotne rozcieńczenia seryjne lizatów w sterylnej płytce 96-dołkowej zgodnie ze schematem na Rysunku 1A. Rozdziel lizaty w rzędach A i E. Dla każdej płytki maksymalna liczba próbek i/lub powtórzeń wynosi 24.
  2. Do pozostałych dołków dodaj 180 µL dH2O w celu wykonania rozcieńczenia seryjnego.
  3. Używając pipety 12-kanałowej, resuspenduj lizaty w rzędzie A i przenieś 20 µL do rzędu B (20 µL lizatu + 180 µL dH2O). Dokładnie homogenizuj. Powtarzaj ten krok sekwencyjnie dla rzędów B i C, aż do osiągnięcia ostatniego rozcieńczenia w rzędzie D.
    UWAGA: Zazwyczaj wykonujemy trzy rozcieńczenia (100, 101, 102, 103), wykorzystując tym samym 4 rzędy płytki (A-D lub E-H) dla każdego zestawu 12 próbek i/lub powtórzeń.
  4. Wysiew mikrokropelkowy: użyj wielokanałowej pipety o zakresie 0,5-10 µL (zalecane są cienkie końcówki), aby przenieść 5 µL z każdego rzędu płytki 96-dołkowej na kwadratową płytkę z podłożem stałym, zgodnie z Rysunkiem 1B.
  5. Podczas powolnego pipetowania kropel o objętości 5 µL, pozwól im lekko dotknąć agaru. Pomoże to oderwać kroplę od końcówki w stronę agaru i zmniejszy możliwość zatrzymania cieczy wewnątrz końcówki.
  6. Pozostaw krople do wyschnięcia, zamknij płytkę z agarem i inkubuj ją w temperaturze 37 °C, monitorując wzrost bakterii. Opcjonalnie można inkubować płytki z agarem w szczelnie zamkniętym worku plastikowym, aby zapobiec ich wysychaniu.
  7. Zliczanie mikrokolonii: po około 6-10 dniach inkubacji sprawdź obecność pojedynczych kolonii widocznych gołym okiem (Rysunek 2).
  8. Zlicz kolonie, używając obiektywu o najmniejszym powiększeniu (4x lub mniejszym) w odwróconym mikroskopie optycznym lub lupy. Odczyty należy przeprowadzać w rozcieńczeniach, w których liczba kolonii mieści się w przedziale od 30 do 300. Alternatywnie można użyć kamery, aby zrobić zdjęcie kropli i ręcznie zliczyć kolonie na komputerze lub użyć oprogramowania takiego jak ImageJ w celu automatyzacji zliczania kolonii.
  9. Aby wyrazić liczbę komórek w CFU/mL, zastosuj następujące równanie:
    Wzór na stężenie bakterii, CFU/mL = C × 1000/V × 1/Dil; równanie do zliczania kolonii.
    Gdzie C = liczba zliczonych kolonii, V = objętość wysiana w µL, a Dil = rozcieńczenie, w którym zliczono kolonie (100, 101, 102, 103). Na przykład, jeśli w kropli 5 µL w rozcieńczeniu 102 zliczono 30 kolonii, to:
    Wzór na obliczanie stężenia bakterii, CFU/mL, schemat edukacyjny, analiza mikrobiologiczna.

Metoda rozcieńczeń seryjnych, przedstawiona na schemacie z płytką mikrotitracyjną i pipetą, do analizy lizatu.
Rysunek 1. Schematyczny przebieg protokołu mCFU. (A) Seryjne rozcieńczenia 10-krotne lizatów zawierających BCG w płytce 96-dołkowej. (B) Kwadratowa szalka Petri z treściwym podłożem hodowlanym, na którą naniesiono 96 kropli o objętości 5 µL każda. Krople są przenoszone bezpośrednio z płytki 96-dołkowej za pomocą pipety wielokanałowej. Utworzone za pomocą BioRender.com. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Seria rozcieńczeń kolonii bakteryjnych na płytce agarowej; ilustracja rozcieńczeń seryjnych; eksperyment mikrobiologiczny.
Rycina 2. Jednostki tworzące mikrokolonie BCG po 10 dniach inkubacji. Po lewej stronie zdjęcie kwadratowej szalki Petriego z naniesionymi 96 kroplami o objętości 5 µL każda, zgodnie z wcześniejszym przedstawieniem na Rycinie 1B. Po prawej stronie pojedyncze zdjęcia 3 kropli odpowiadające lizatowi wyjściowemu (100) oraz dwóm rozcieńczeniom (101, 102). Zdjęcia wykonano aparatem DSLR wyposażonym w obiektyw zoom 18-55 mm (płytka) lub obiektyw makro 105 mm (krople). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

5. Zliczanie jednostek tworzących mikrokolonie w programie Fiji (ImageJ)

UWAGA: Metoda mCFU umożliwia kwantyfikację CFU dla dużych zestawów próbek. Zdjęcia kropel mogą zostać zarejestrowane do późniejszej analizy, aby ułatwić liczenie kolonii. Kilka rodzajów urządzeń fotograficznych pozwala na uzyskanie obrazów o wystarczającej do tego celu jakości. Należą do nich aparaty cyfrowe, kamerki internetowe, mikroskopy i lupy z zamontowanym aparatem oraz telefony komórkowe. Bezpłatne oprogramowanie do analizy obrazu, takie jak ImageJ, oferuje możliwość ręcznego lub zautomatyzowanego liczenia kolonii na takich obrazach. W celu zademonstrowania obu metod zostanie użyty program Fiji, który jest dystrybucją ImageJ zawierającą zestaw narzędzi do naukowej analizy obrazu30. Program Fiji można pobrać ze strony https://fiji.sc/.

  1. Metoda liczenia ręcznego
    1. Otwórz w programie Fiji obraz zawierający mCFU. Wybierz Plugins > Analyze > Cell Counter.
    2. W menu Cell Counter wybierz Initialize, a następnie wybierz licznik (np. Type 1).
    3. Przejdź do zaznaczania każdej kolonii poprzez klikanie w nią. Każde kliknięcie zostanie wyświetlone na zdjęciu i zaktualizuje licznik (Rysunek 3). Aby cofnąć przypadkowe kliknięcia, wybierz Delete.
    4. Zapisz wartość wyświetloną na liczniku. Kliknij przycisk Reset, aby zresetować liczenie i otwórz nowy obraz w celu przeliczenia kolejnych próbek.
      UWAGA: Dalsze instrukcje dotyczące tej wtyczki można znaleźć pod adresem https://imagej.net/plugins/cell-counter.
  2. Metoda liczenia zautomatyzowanego
    1. Otwórz w programie Fiji obraz zawierający mCFU. Wybierz Image > Type > 8-bit. Spowoduje to konwersję obrazu na 8-bitowy obraz w skali szarości.
    2. Wybierz narzędzie Oval na pasku narzędzi i narysuj owal wokół obszaru z koloniami (Rysunek 4A). Owal można dostosować po jego narysowaniu.
    3. Wybierz Edit > Clear Outside, aby usunąć wszelkie zakłócenia z obszaru zewnętrznego (Rysunek 4B). Wybierz Image > Adjust > Threshold.
    4. Przesuwaj suwaki w menu progowania (threshold), aż kolonie pojawią się na czerwono, a szum w tle zostanie zminimalizowany (Rysunek 4C).
    5. Wybierz Apply i zamknij okno progowania. Zostanie wygenerowany obraz czarno-biały (Rysunek 4D).
    6. Wybierz Analyze > Analyze Particles. W oknie Analyze Particles określ zakres pola powierzchni kolonii (od 1 do nieskończoności, mierzony w pikselach kwadratowych) oraz kolistość (od 0 do 1, gdzie 1 oznacza idealne koło; Rysunek 4E).
    7. W menu rozwijanym „show” wybierz Outlines. Zaznacz Display Results, aby wyświetlić szczegółowe pomiary dla każdej kolonii w oknie wyników. Zaznacz Clear Results, aby usunąć poprzednie pomiary. Zaznacz pole Summarize, aby wyświetlić podsumowanie wyników pomiarów (Rysunek 4E).
    8. Uruchom analizator, wybierając OK. Pojawi się nowe okno wyświetlające wszystkie wykryte i przeliczone obrysowane kolonie. Okno wyników wyświetla szczegóły dla każdej kolonii, a okno z podsumowaniem pokazuje całkowitą liczbę przeliczonych kolonii (Rysunek 4F).
      UWAGA: Ustawienia rozmiaru i kolistości będą się różnić w zależności od rozdzielczości i powiększenia obrazu oraz rozmiaru i kształtu kolonii. Powtórz proces kilka razy, aż zostaną znalezione optymalne ustawienia wykrywające wszystkie kolonie. Dalsze instrukcje dotyczące wtyczki Analyze Particles można znaleźć pod adresem https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html#ap.

Analiza liczenia komórek przy użyciu oprogramowania ImageJ; obraz mikroskopowy z interfejsem licznika komórek.
Rysunek 3. Metoda ręcznego liczenia mCFU przy użyciu wtyczki cell counter w oprogramowaniu Fiji. Niebieskie kropki wskazują kolonie, które zostały już zaznaczone przez użytkownika. Menu po prawej stronie wyświetla liczbę policzonych do tej pory kolonii (licznik wskazuje 41). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Schemat analizy cząstek, etapy przetwarzania obrazu, progowanie, wybór obszaru, ekstrakcja danych, diagramy.
Rysunek 4. Zautomatyzowana metoda zliczania mCFU przy użyciu oprogramowania Fiji. (A, B) Obszar zainteresowania z koloniami jest zaznaczany za pomocą narzędzia do zaznaczania owalnego, a obszar zewnętrzny jest usuwany za pomocą polecenia „clear outside”. (C, D) Czarno-biały obraz kolonii jest generowany za pomocą narzędzia do progowania (threshold). (E, F) Liczba kolonii jest kwantyfikowana za pomocą narzędzia „analyze particles”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisana tutaj metoda mCFU zwiększa ilość informacji, jakie można uzyskać z jednej szalki Petriego, co najmniej 96-krotnie. Rysunek 5 przedstawia porównanie dwóch metod dostarczania leku w ramach repurposingu sakwinawiru (SQV)31,32 jako leku skierowanego przeciwko gospodarzowi w leczeniu gruźlicy. W tym teście do zakażenia pierwotnych ludzkich makrofagów wykorzystano cztery różne szczepy Mycobacterium tuberculosis. Były to sz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Gruźlica jest poważnym problemem zdrowia publicznego o rosnącym znaczeniu, szczególnie w krajach o niskich i średnich dochodach. Zakłócenia w funkcjonowaniu placówek opieki zdrowotnej w celu diagnozowania i leczenia gruźlicy podczas pandemii COVID-19 miały negatywny wpływ na częstość występowania nowych przypadków1. Ponadto w celu opanowania tej epidemii należy pilnie zająć się wielolekowymi i w znacznym stopniu lekoopornymi szczepami M.tb oraz jednoczesnym zakażeniem M.tb i HIV<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

DP i PJGB oświadczają, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez wewnętrzne fundusze z Wydziału Lekarskiego, Universidade Católica Portuguesa, oraz zewnętrzne fundusze z Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), w ramach grantów UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 i EXPL/SAU-INF/0742/2021.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytki 96-dołkoweVWR734-2781
DSLR Obiektyw 15-55 mmNikonAF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR NikonD3400
DSLR obiektyw makroSigmaMACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
Surowica cielęca płoduGibco10270106
Fiji Softwarehttps://fiji.sc/Fidżi to oprogramowanie typu open source wspierane przez kilka laboratoriów, instytucji i osób prywatnych. W zestawie znajdują się wszystkie wymagane wtyczki.
Igepal CA-630Sigma-Aldrich18896
L-glutaminaGibco25030-081
Middlebrook 7H10BD262710
Middlebrook 7H9BD271310
Pipeta wielokanałowa (0,5 - 10 &mikro; l)Pipeta wielokanałowa GilsonFA10013
(20 - 200 &mikro; l)GilsonFA10011
Mycobacterium bovis BCG American Type Culture CollectionATCC35734szczep TMC 1011 [BCG Pasteur]
Wzbogacanie OADCBD211886
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)NZYTechMB25201
RPMI 1640 mediumGibco21875091
Pirogronian soduGibco11360-070
Spektrofotometr UV-6300PCVWR634-6041
Kwadratowa szalka Petriego 120 x 120 mmCorningBP124-05
TyloxapolSigma-AldrichT8761
Kąpiel ultradźwiękowa Elma P 30 HVWR142-0051

Bibliografia

  1. World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2022. , World Health Organization. Geneva. (2022).
  2. Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O. 100 years of the Bacillus Calmette-Guérin vaccine. Vaccine. 39 (50), 7221-7222 (2021).
  3. Bettencourt, P. J. G. The 100th anniversary of bacille Calmette-Guérin (BCG) and the latest vaccines against COVID-19. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 25 (8), 611-613 (2021).
  4. Scriba, T. J., Netea, M. G., Ginsberg, A. M. Key recent advances in TB vaccine development and understanding of protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Seminars in Immunology. 50, 101431(2020).
  5. McShane, H., Williams, A. A review of preclinical animal models utilised for TB vaccine evaluation in the context of recent human efficacy data. Tuberculosis. 94 (2), 105-110 (2014).
  6. Voss, G., et al. Progress and challenges in TB vaccine development. F1000Research. 7, 199(2018).
  7. Satti, I., McShane, H. Current approaches toward identifying a correlate of immune protection from tuberculosis. Expert Review of Vaccines. 18 (1), 43-59 (2019).
  8. Young, D. Animal models of tuberculosis. European Journal of Immunology. 39 (8), 2011-2014 (2009).
  9. Pedroza-Roldán, C., Flores-Valdez, M. A. Recent mouse models and vaccine candidates for preventing chronic/latent tuberculosis infection and its reactivation. Pathogens and disease. 75 (6), (2017).
  10. Gong, W., Liang, Y., Wu, X. Animal Models of Tuberculosis Vaccine Research: An Important Component in the Fight against Tuberculosis. BioMed Research International. 2020, 1-21 (2020).
  11. Bettencourt, P., et al. Identification of antigens presented by MHC for vaccines against tuberculosis. NPJ vaccines. 5 (1), 2(2020).
  12. Moorlag, S. J. C. F. M., Arts, R. J. W., van Crevel, R., Netea, M. G. Non-specific effects of BCG vaccine on viral infections. Clinical Microbiology and Infection. 25 (12), 1473-1478 (2019).
  13. Wilkie, M., et al. Functional in-vitro evaluation of the non-specific effects of BCG vaccination in a randomised controlled clinical study. Scientific Reports. 12 (1), 7808(2022).
  14. Netea, M. G., et al. Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease. Science. 352 (6284), aaf1098(2016).
  15. Bettencourt, P., Pires, D., Carmo, N., Anes, E. Application of Confocal Microscopy for Quantification of Intracellular Mycobacteria in Macrophages. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. 1, 614-621 (2010).
  16. Bettencourt, P., Carmo, N., Pires, D., Timóteo, P., Anes, E. Mycobacterial infection of macrophages: the effect of the multiplicity of infection. Antimicrobial research: Novel bioknowledge and educational programs. , 651-664 (2017).
  17. Pires, D., Bettencourt, P., Carmo, N., Niederweis, M., Anes, E. Role of Mycobacterium tuberculosis outer-membrane porins in bacterial survival within macrophages. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1113 (2010).
  18. Pires, D., et al. Mycobacterium tuberculosis Modulates miR-106b-5p to Control Cathepsin S Expression Resulting in Higher Pathogen Survival and Poor T-Cell Activation. Frontiers in immunology. 8 (DEC), 1819(2017).
  19. Pires, D., et al. Role of Cathepsins in Mycobacterium tuberculosis Survival in Human Macrophages. Scientific reports. 6 (August), 32247(2016).
  20. Bettencourt, P., et al. Actin-binding protein regulation by microRNAs as a novel microbial strategy to modulate phagocytosis by host cells: the case of N-Wasp and miR-142-3p. Frontiers in cellular and infection microbiology. 3 (June), 19(2013).
  21. Bhuyan, S., et al. Microliter spotting and micro-colony observation: A rapid and simple approach for counting bacterial colony forming units. Journal of Microbiological Methods. 207, 106707(2023).
  22. Jackson, S., McShane, H. Challenges in Developing a Controlled Human Tuberculosis Challenge Model. Current topics in microbiology and immunology. , 1-27 (2022).
  23. Darrah, P. A., et al. Prevention of tuberculosis in macaques after intravenous BCG immunization. Nature. 577 (7788), 95-102 (2020).
  24. Madura Larsen, J., et al. BCG stimulated dendritic cells induce an interleukin-10 producing T-cell population with no T helper 1 or T helper 2 bias in vitro. Immunology. 121 (2), 276-282 (2007).
  25. Bickett, T. E., et al. Characterizing the BCG-Induced Macrophage and Neutrophil Mechanisms for Defense Against Mycobacterium tuberculosis. Frontiers in immunology. 11, 1202(2020).
  26. Pires, D., et al. Interference of Mycobacterium tuberculosis with the endocytic pathways on macrophages and dendritic cells from healthy donors: role of cathepsins. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1112 (2010).
  27. Betts, G., et al. Optimising Immunogenicity with Viral Vectors: Mixing MVA and HAdV-5 Expressing the Mycobacterial Antigen Ag85A in a Single Injection. PLoS ONE. 7 (12), e50447(2012).
  28. Tanner, R., et al. The influence of haemoglobin and iron on in vitro mycobacterial growth inhibition assays. Scientific reports. 7 (1), 43478(2017).
  29. McNeill, E., et al. Regulation of mycobacterial infection by macrophage Gch1 and tetrahydrobiopterin. Nature communications. 9 (1), 5409(2018).
  30. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  31. Pereira, M., Vale, N. Saquinavir: From HIV to COVID-19 and Cancer Treatment. Biomolecules. 12 (7), 944(2022).
  32. Pires, D., et al. Repurposing Saquinavir for Host-Directed Therapy to Control Mycobacterium Tuberculosis Infection. Frontiers in immunology. 12, 647728(2021).
  33. Pires, D., et al. Liposomal Delivery of Saquinavir to Macrophages Overcomes Cathepsin Blockade by Mycobacterium tuberculosis and Helps Control the Phagosomal Replicative Niches. International journal of molecular sciences. 24 (2), (2023).
  34. Maartens, G., Wilkinson, R. J. Tuberculosis. The Lancet. 370 (9604), 2030-2043 (2007).
  35. Matarazzo, L., Bettencourt, P. J. G. mRNA vaccines: a new opportunity for malaria, tuberculosis and HIV. Frontiers in Immunology. 14, 1172691(2023).
  36. Young, D., Dye, C. The Development and Impact of Tuberculosis Vaccines. Cell. 124 (4), 683-687 (2006).
  37. Kommareddi, S., Abramowsky, C. R., Swinehart, G. L., Hrabak, L. Nontuberculous mycobacterial infections: Comparison of the fluorescent auramine-o and Ziehl-Neelsen techniques in tissue diagnosis. Human Pathology. 15 (11), 1085-1089 (1984).
  38. Sabiiti, W., et al. A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA). Journal of visualized experiments: JoVE. (158), e60460(2020).
  39. Somoskövi, A., et al. Comparison of Recoveries of Mycobacterium tuberculosis Using the Automated BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460 TB System, and Löwenstein-Jensen Medium. Journal of Clinical Microbiology. 38 (6), 2395-2397 (2000).
  40. Tanner, R., et al. The in vitro direct mycobacterial growth inhibition assay (MGIA) for the early evaluation of TB vaccine candidates and assessment of protective immunity: a protocol for non-human primate cells. F1000Research. 10, 257(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza mikro CFUszczepionki przeciwgru liczejednostki tworz ce kolonieMycobacterium tuberculosisszczepionka BCGrozcie czenia seryjneinkubacja na p ytkach agarowychautomatyczne liczenie koloniianaliza ImageJocena skuteczno ci szczepionki

Powiązane artykuły