Artykuł metodologiczny

Przezźrenicowe przeszczepienie przeztwardówkowe przeszczepów podsiatkówkowych w mysim modelu zwyrodnienia siatkówki

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65448

⸱

26 stycznia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Wilmer Eye Institute, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Genetic Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia przezźrenicowe, sterowane widzeniem podejście przeztwardówkowe do bezpiecznego i precyzyjnego dostarczania przeszczepów komórkowych podsiatkówkowych, z niskim wskaźnikiem powikłań chirurgicznych, u myszy, biorców ze zwyrodnieniem siatkówki lub bez.

Streszczenie

Transplantacja komórek fotoreceptorowych i komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) stanowi potencjalną terapię chorób zwyrodnieniowych siatkówki. Podsiatkówkowe przeszczepienie terapeutycznych komórek dawcy do biorców myszy jest trudne ze względu na ograniczoną przestrzeń chirurgiczną, na którą pozwala mała objętość oka myszy. Opracowaliśmy platformę do chirurgicznego przeszczepu przeztwardówkowego z bezpośrednią kontrolą widzenia przezźrenicowego, aby ułatwić podsiatkówkowe dostarczanie komórek egzogennych u biorców myszy. Platforma została przetestowana przy użyciu zawiesin komórek siatkówki i trójwymiarowych arkuszy siatkówki pobranych od bogatych w pręciki myszy Rho::EGFP i bogatych w czopki OPN1LW-EGFP; Myszy NRL-/-, odpowiednio. Test żywych/martwych komórek wykazał niską śmiertelność komórek w obu formach komórek dawcy. Przeszczepy siatkówki z powodzeniem dostarczono do przestrzeni podsiatkówkowej mysiego modelu zwyrodnienia siatkówki, Rd1/NS, z minimalnymi powikłaniami chirurgicznymi wykrytymi za pomocą multimodalnego konfokalnego skaningowego obrazowania laserowego oftalmoskopu (cSLO). Dwa miesiące po przeszczepie, barwienie histologiczne wykazało dowody na zaawansowane dojrzewanie przeszczepów siatkówki do "dorosłych" pręcików i czopków (odpowiednio przez silną ekspresję Rho::EGFP, S-opsyna i OPN1LW:EGFP) w przestrzeni podsiatkówkowej. W tym przypadku zapewniamy platformę chirurgiczną, która może umożliwić bardzo dokładny poród podsiatkówkowy przy niskim wskaźniku powikłań u biorców myszy. Ta technika zapewnia precyzję i względną łatwość nabywania umiejętności. Co więcej, technika ta może być wykorzystana nie tylko do badań nad przeszczepem komórek podsiatkówkowych, ale także do innych wewnątrzgałkowych badań terapeutycznych, w tym terapii genowych.

Wprowadzenie

Przeszczep komórek fotoreceptora i pigmentowego nabłonka siatkówki (RPE) zapewnia potencjalną terapię chorób zwyrodnieniowych siatkówki, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD), choroba Stargardta i barwnikowe zwyrodnienie siatkówki (RP)1,2,3,4,5,6, 7. Aby uzupełnić lub zastąpić chore fotoreceptory i komórki RPE w zdegenerowanych siatkówkach, przestrzeń podsiatkówkowa jest szczególnie dobrze przystosowana jako cel przeszczepu, biorąc pod uwagę laminarną anatomię fotoreceptorów gospodarza i komórek RPE. Podczas gdy chirurgiczne procedury przeszczepiania komórek RPE pod siatkówkę są dobrze znane u dużych zwierząt8,9,10 i badania kliniczne11,12,13, wyzwania stojące przed badaniami nad przeszczepami fotoreceptorów obejmują niedobór transgenicznych dużych modeli zwierzęcych i ograniczone zrozumienie dogłębnych badań Mechanizmy synaptogenezy związane między innymi z przeszczepem neuronów. Genetycznie zmodyfikowane modele mysie, z różnymi typami mutantów zwyrodnienia siatkówki, dostarczają użytecznych narzędzi do badania mechanizmów molekularnych w kontekście transplantacji i kierowania rozwojem skutecznych terapii wymiany komórek na etapie przedklinicznym14,15,16,17,18.

W przeciwieństwie do stosunkowo dużego oka i małej soczewki krystalicznej u dużych zwierząt (np. świni, małpy), mały rozmiar i duża krystaliczna soczewka oczu myszy sprawiają, że są one trudnym celem chirurgicznym, szczególnie w przypadku przeszczepów podsiatkówkowych, w których ograniczenia przestrzeni fizycznej i ograniczona bezpośrednia wizualizacja są głównymi wyzwaniami.

Obecne podejścia można podzielić na trzy główne typy w zależności od trasy iniekcji. Najpierw, w przypadku dostępu przezrogówkowego, igła jest wprowadzana przez rogówkę do jamy ciała szklistego, a następnie do przestrzeni podsiatkówkowej19,20. Za pomocą tej metody można osiągnąć pomyślny poród podsiatkówkowy, ale uszkodzenie struktur przedniego segmentu (tj. rogówki, tęczówki, soczewki) stanowi poważne ryzyko, które może poważnie utrudnić dalszą analizę in vivo. Po drugie, w przypadku dostępu przezszklistego, igła wchodzi do jamy ciała szklistego przez pars plana, a następnie do przestrzeni podsiatkówkowej21. Takie podejście jest szeroko stosowane u ludzi i dużych zwierząt. Istnieje jednak potencjalne ryzyko uszkodzenia soczewki u gryzoni, ponieważ soczewka zajmuje większą względną objętość jamy ciała szklistego. Warto zauważyć, że zarówno protokoły przezrogówkowe, jak i przezszkliste wymagają penetracji siatkówki nerwowej, aby dotrzeć do przestrzeni podsiatkówkowej, co powoduje uszkodzenie siatkówki gospodarza i zwiększa ryzyko refluksu komórek dawcy przez otwór penetracyjny. Po trzecie, w przypadku dostępu przeztwardówkowego22,23, igła przenika przez kompleks twardówkowo-naczyniówkowy-RPE i bezpośrednio wchodzi do przestrzeni podsiatkówkowej. Takie podejście zmniejsza potencjalny uraz struktur przedniego segmentu i jamy ciała szklistego. Jednak bez bezpośredniej wizualizacji dna ciała gospodarza często wykrywa się niepowodzenia chirurgiczne spowodowane nakłuciami przezsiatkówkowymi, odwarstwieniem RPE i krwotokiem naczyniówkowym.

Tutaj opracowaliśmy przeztwardówkową platformę chirurgiczną z bezpośrednimi wskazówkami dotyczącymi przezźrenicowego widzenia do przeszczepu podsiatkówkowego u myszy. Walidacja żywotności arkuszy siatkówki dawcy i zawiesin komórkowych przed wykonaniem przeszczepu. Potwierdzono pomyślne dostarczenie komórek dawcy do przestrzeni podsiatkówkowej mysiego modelu zwyrodnienia siatkówki. Wykryto jedynie rzadkie powikłania chirurgiczne. Ponadto przeszczepione fotoreceptory w przeszczepach siatkówki przeżyły i wykazywały dowody zaawansowanego dojrzewania do "dorosłych" pręcików i czopków dwa miesiące po przeszczepie.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (NIH Publications No. 8023, poprawione w 1978 roku) oraz Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa (zatwierdzenie M021M459).

1. Zwierzęta

  1. Użyj myszy Rho::EGFP (w wieku P3-P6) jako dawców zawiesin komórek siatkówki.
    UWAGA: Ta odmiana była miłym prezentem od dr T. Wensela z Baylor College of Medicine.
  2. Użyj OPN1LW-EGFP/NRL-/- myszy14 (w wieku P3) jako dawców arkuszy siatkówki.
  3. Użyj dorosłych myszy Rd1 / NS ze zwyrodnieniem siatkówki z niedoborem odporności (dowolnej płci) jako biorców.
  4. Trzymaj wszystkie myszy w klatkach w cyklu 12:12 godzin światło-ciemność z dostępem do wody i pożywienia w razie potrzeby.

2. Zbieraj siatkówkę neuronową (Rysunek 1)

UWAGA: Wszystkie poniższe kroki zostały wykonane w sterylnych warunkach. Informacje o dostawcach narzędzi badawczych i produktów znajdują się w Tabeli Materiałów.

  1. Przygotowanie myszy dawców: Poddaj eutanazji myszy dawców z przedawkowaniem dwutlenku węgla i potwierdź eutanazję ze zwichnięciem szyjki macicy.
  2. Odizoluj gałki oczne myszy. Aby to zrobić, wykonaj poniższe czynności.
    1. Ostrożnie otwórz powieki szczeniąt za pomocą mikronożyczek, aby odsłonić gałkę oczną.
    2. Użyj gładkich kleszczy, aby chwycić nerw wzrokowy i wyciągnij gałkę oczną za pomocą kleszczy.
  3. Izoluj siatkówkę nerwową
    UWAGA: Ten etap jest wykonywany pod mikroskopem preparacyjnym.
    1. Naciąć otwór w środku rogówki za pomocą sterylnej igły o masie 25 G.
    2. Przetnij rogówkę przez otwór na pół i powiększ nacięcie do twardówki i RPE, a następnie usuń twardówkę i RPE.
    3. Użyj kleszczyków z mikrozębami, aby delikatnie usunąć soczewkę i ciało szkliste, aby wyizolować siatkówkę nerwową.
    4. W razie potrzeby należy postępować zgodnie z sekcją 3 w celu przygotowania zawiesiny siatkówki dawcy lub sekcją 4 w celu przygotowania arkusza siatkówki dawcy.

3. Przygotowanie zawiesiny siatkówki dawcy (Rysunek 1)

  1. Inkubować siatkówkę nerwową w roztworze papainy w temperaturze 37 °C przez 20-30 minut, aż nie zostaną wykryte żadne grudki komórek.
    UWAGA: Delikatnie pipetować mieszaninę komórek 15 razy co 10 minut.
  2. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta zestawu do dysocjacji papainy, aby pobrać pojedyncze komórki.

4. Przygotuj arkusze siatkówki dawcy (Rysunek 1)

UWAGA: Ten krok następuje po sekcji 2 i jest wykonywany pod mikroskopem preparacyjnym.

  1. Umieść izolowany kubek siatkówki nerwowej na szalce Petriego o średnicy 35 mm ze wstępnie schłodzonym sterylnym PBS.
  2. Użyj mikronożyczek, aby pociąć miseczkę siatkówki nerwowej na wiele arkuszy siatkówki (około 1 mm x 2 mm).

5. Przygotuj myszy odbiorcy

  1. Znieczulić myszy biorców wstrzyknięciem dootrzewnowym ketaminy (100 mg/kg masy ciała) i chlorowodorku ksylazyny (20 mg/kg masy ciała).
  2. Potwierdź chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia, zapewniając utratę mrugania i odruchów bólowych, regularne oddychanie i oddychanie.
  3. Oceń głębokość znieczulenia na podstawie braku reakcji na uszczypnięcie ogona lub wycofanie odruchów pedałowania.
  4. Zawsze ponownie sprawdzaj głębokość znieczulenia podczas zabiegu operacyjnego i dostosuj głębokość znieczulenia, jeśli zwierzę reaguje na ból. Trzymaj myszy na rozgrzanym stole operacyjnym, aby zapobiec hipotermii.
  5. Rozszerz źrenice biorcy kroplami do oczu z tropikamidu 1% (wt/obj.) na 5 minut przed zabiegiem. Dobrze rozszerzona źrenica może ułatwić wizualizację przezźrenicową pod mikroskopem operacyjnym
    6. .
  6. Zdezynfekować operujące oko myszy i otaczające tkanki oka jodowidonem, przemyć wysterylizowanym PBS.
  7. Nałóż 0,5% chlorowodorek proparakainy na oko myszy w celu znieczulenia.

6. Podsiatkówkowy przeszczep przeszczepów siatkówki (Rysunek 2)

UWAGA: Wszystkie poniższe kroki zostały wykonane w warunkach aseptycznych. Narzędzia chirurgiczne były sterylizowane w autoklawie (użyj tacek na narzędzia, aby chronić końcówki narzędzi i wyjmij tłok z mikrostrzykawek, aby zapobiec ich utknięciu w świetle). Informacje o dostawcach narzędzi badawczych i produktów znajdują się w Tabeli Materiałów.

  1. Paracenteza przedniej komory: Penetruj obwodową rogówkę do przedniej komory za pomocą igły insulinowej, aby umożliwić bierne wydostawanie się cieczy wodnistej, aby zapobiec skokom ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP) podczas przeszczepu.
    UWAGA: Na udaną paracentezę wskazuje wypływ cieczy wodnistej przez otwór rogówki.
  2. Umieść kroplę hialuronianu sodu i szklane szkiełko nakrywkowe (o średnicy 5 mm) na rogówce, aby umożliwić przezźrenicową wizualizację dna oka pod kątem chirurgicznym.
  3. Za pomocą kleszczy zębatych należy odsłonić miejsce wstrzyknięcia (1 mm rąbek rogówki), naciskając górną lub dolną ścianę oka, zgodnie z wymaganiami eksperymentu, w kierunku środka widzenia przezźrenicowego.
  4. Użyj igły do mikroiniekcji, aby prostopadle wniknąć w twardówkę.
  5. Ostrożnie obrócić igłę stycznie, aby umożliwić pełną penetrację kompleksu twardówka-naczyniówka-RPE do przestrzeni podsiatkówkowej.
  6. Wbić igłę stycznie, aby uzyskać dostęp do końcowego miejsca wstrzyknięcia.
    UWAGA: Sprawdź pełne ustawienie skosu igły za pomocą wskazówek dotyczących widzenia przezźrenicowego. Użyj powierzchownych naczyń siatkówki jako anatomicznego odniesienia do dokładnego ułożenia igły w przestrzeni podsiatkówkowej.
  7. Wstrzyknąć przeszczepy siatkówki
    UWAGA: Obecność małych pęcherzyków wstępnie załadowanych do strzykawki może ułatwić walidację dokładnego położenia komórek dawcy w podsiatkówkówce. Podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe wynikające z wstrzyknięcia podsiatkówkowego zwiększa ryzyko refluksu komórek dawcy.
    1. Jeśli rogówka staje się mętna24,25, wskaźnik wysokiego ciśnienia wewnątrzgałkowego, trzymaj igłę w przestrzeni podsiatkówkowej przez co najmniej 3 minuty, aż rogówka się oczyści, co oznacza, że ciśnienie wewnątrzgałkowe wystarczająco się zmniejszyło.
      UWAGA: W rzadkich przypadkach normalizacja ciśnienia wewnątrzgałkowego może zająć więcej czasu i zaleca się trzymanie igły na miejscu do momentu przywrócenia przejrzystości rogówki, nawet jeśli zajęłoby to 8-10 minut. Obserwuj pod mikroskopem chirurgicznym, aby zapobiec uszkodzeniu struktur siatkówki.
  8. Chwyć krawędź otworu iniekcyjnego kleszczami z mikrozębami i szybko wyjmij igłę.
    UWAGA: Kryteriami pomyślnego dostarczenia podsiatkówkowego zawiesiny i arkusza komórek siatkówki są odpowiednio stały pęcherzyk i widoczny biały arkusz w przestrzeni podsiatkówkowej.
  9. Oczyść obszar operacyjny oka sztucznymi łzami i w razie potrzeby nałóż maść.
  10. Administracja pooperacyjna
    1. Umieść przeszczepione myszy we wstępnie ogrzanej (37 °C) czystej klatce regeneracyjnej i uważnie monitoruj, czy nie ma niepokoju.
    2. Nałóż kroplę 0,5% chlorowodorku proparakainy miejscowo na oko chirurgiczne 2-3 razy, jeśli wystąpi niepokój.
    3. Wróć myszy do klatki domowej, gdy myszy będą całkowicie czujne i mobilne. Umieść niewielką liczbę granulek jedzenia i kubek żelowy w klatce, jeśli myszy mają problemy z dotarciem do pojemnika na żywność.
      UWAGA: Utrzymuj powierzchnię oka wilgotną, dopóki znieczulenie nie ustąpi, aby zapobiec powstawaniu zaćmy.

7. Multimodalna konfokalna skaningowa laserowa oftalmoskopia obrazowa (cSLO)

  1. Dwa miesiące po przeszczepie znieczulić myszy biorcy Rd1/NS (n = 5) przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy (100 mg / kg masy ciała) i chlorowodorku ksylazyny (20 mg / kg masy ciała) do obrazowania.
  2. Rozszerz źrenice za pomocą 1% (wag./obj.) tropikamidowych kropli do oczu.
  3. Wykonaj standardowe obrazowanie multimodalne pod kątem 55° za pomocą konfokalnego skaningowego oftalmoskopu laserowego cSLO system22.
  4. Uzyskaj obrazy MR i SD-OCT przy użyciu 30 klatek uśredniania ART.

8. Barwienie histologiczne

  1. Przygotuj zamrożone preparaty z przeszczepionymi oczami myszy Rd1/NS, jak wcześniej zgłoszono 14.
  2. Zablokuj i przeniknij przez zamrożone szkiełka przeszczepionych siatkówk za pomocą mieszaniny 5% koziej surowicy i 1% Triton X100 w PBS.
  3. Próbki z przeciwciałami pierwszorzędowymi inkubować przez noc w temperaturze 4 °C i płukać w PBS (5 min, 3 razy). Pierwszorzędowe przeciwciała obejmują kozią anty-GFP-FITC (1:200), króliczą anty-rerecoverynę (1:1000) i króliczą anty-S-opsynę (1:500).
  4. Próbki inkubować z przeciwciałem drugorzędowym (kozie przeciwciało anty-królikowe Cy3, 1:500) i barwić przeciwwagowo za pomocą DAPI.
    UWAGA: Dostawcy przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych są wymienieni w tabeli materiałów.

Wyniki

Przeszczepy siatkówki zostały pomyślnie wprowadzone do przestrzeni podsiatkówkowej i przetrwały in vivo.
Wydajność naszej platformy transplantacji podsiatkówkowej oceniono u myszy biorców Rd1/NS w wieku 6-8 tygodni, w momencie gdy ich resztkowa siatkówka była silnie zmcieńczona z powodu niemal całkowitej degeneracji zewnętrznej warstwy jądrowej (ONL). Biorąc pod uwagę kruchość siatkówki, niedobór fotoreceptorów czopkowych oraz względnie niską żywotność komórek w zawiesinie w porównaniu z płatami tkankowymi, jako źródła płatów siatkówki bogatej w czopki wykorzystano myszy (OPN1LW-EGFP;NRL-/-)14, a jako dawców zawiesin komórkowych myszy bogate w pręciki (Rho::EGFP). Płaty siatkówki bogatej w czopki oraz zawiesiny komórek bogatych w pręciki zostały pomyślnie wprowadzone do przestrzeni podsiatkówkowej wszystkich myszy biorców przy użyciu naszej platformy chirurgicznej, co potwierdzono obecnością pęcherza podsiatkówkowego i białego płata widocznych podczas wizualizacji transpupilarnej bezpośrednio po iniekcji. Dwa miesiące po transplantacji przeprowadzono multimodalne obrazowanie cSLO, aby śledzić stan przeszczepów siatkówki in vivo. Przekrojowe skanowanie OCT wykazało, że przeszczepy siatkówki przetrwały w przestrzeni podsiatkówkowej i odtworzyły ONL u wszystkich myszy biorców (Rysunek 3A). Obrazowanie w podczerwieni nie wykryło wyraźnych katarakt we wszystkich przeszczepionych oczach (Rysunek 3B). Inne powikłania chirurgiczne, w tym krwotoki, były rzadko wykrywane w przeszczepionych siatkówkach (n = 1/10 oczu) podczas wielobarwnego obrazowania refleksyjnego dwa miesiące po transplantacji (Rysunek 3C). Przeprowadziliśmy barwienia histologiczne, aby dalej ocenić przeżywalność i stopień dojrzewania fotoreceptorów w przeszczepach siatkówki. W przeszczepionych płatach siatkówki zaobserwowano liczne fotoreceptory czopkowe wykazujące ekspresję OPN1LW:EGFP i S-opsyny. Podobnie, w przeszczepionych zawiesinach komórek siatkówki stwierdzono in vivo dużą proporcję fotoreceptorów Rec+, w tym liczne pręciki Rho::EGFP+ (Rysunek 3D). U myszy kontrolnych, które nie otrzymały przeszczepu, stwierdzono silną degenerację ONL z nielicznymi resztkowymi fotoreceptorami czopkowymi (Rec+). W nieprzeszczepionej siatkówce Rd1/NS nie wykryto sygnału EGFP (Rysunek 3D).

Schemat izolacji siatkówki myszy; etapy: sekcja, trawienie papainą, zawiesina komórek siatkówki.
Rycina 1: Schemat pozyskiwania płata siatkówki i zawiesin komórek od dawcy. Schematy przedstawiające kluczowe etapy pozyskiwania zawiesin komórek i płatów siatkówki od myszy dawców Rho::EGFP. Obrazowanie w polu jasnym i fluorescencyjnym przedstawia reprezentatywne obrazy zdysocjowanych komórek oraz wyizolowanego płata od myszy Rho::EGFP. Żółta przerywana linia: krawędź cięcia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Procedura okularna u myszy; schemat znieczulenia, rozszerzenia źrenic, analgezji oraz kroków dezynfekcji.
Rycina 2: Procedury subretinalnego przeszczepiania płatów siatkówki i zawiesiny komórek siatkówki u myszy Rd1/NS. (A) Schematy przygotowania myszy biorcy. (B) Kluczowe procedury chirurgiczne oraz odpowiadające im diagramy przedstawiające subretinalne przeszczepianie zawiesin komórek siatkówki i płatów siatkówki. Kroki chirurgiczne obejmują: 1. penetrację komory przedniej; 2. naniesienie hialuronianu sodu na rogówkę, a następnie umieszczenie szkiełka nakrywkowe na hialuronianie sodu w celu ułatwienia wizualizacji transpupilarnej; 3. penetrację zewnętrznych warstw ściany oka (kompleks twardówka-naczyniówka-RPE). Kąty penetracji igły znajdują się na prawym górnym panelu ilustracji; 4. wprowadzenie igły do wstrzykiwania; 5. wstrzyknięcie przeszczepów. Reprezentatywne obrazy pokazują pomyślne dostarczenie zawiesin komórek siatkówki oraz płata siatkówki odpowiednio u dwóch poszczególnych biorców. Gwiazdka: główka nerwu wzrokowego; Czerwone groty strzałek: naczynie krwionośne siatkówki; Biały grot strzałki: miejsce penetracji końcówki igły; Białe strzałki: przeszczepione zawiesiny lub płat siatkówki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

OCT pokazujący arkusz, zawiesinę, siatkówkę nietransplantowaną; mikroskopia dla analizy badania transplantacji.
Rycina 3: Skuteczne wprowadzenie przeszczepów siatkówki do przestrzeni podsiatkówkowej i przeżycie in vivo. (A) Reprezentatywne obrazy SD-OCT wykazały odpowiednio podsiatkówkowy rozkład transplantowanych arkuszy siatkówki i zawiesin komórkowych u dwóch poszczególnych myszy Rd1/NS. Jako kontrolę pobrano myszy Rd1/NS nietransplantowane. Obszar zainteresowania (ROI) zaznaczono żółtymi przerywanymi ramkami na obrazach dna oka w podczerwieni (IR). Wewnętrzną warstwę siatkówki oznaczono jako warstwy: warstwy komórek zwojowych siatkówki (RGC), wewnętrznej warstwy splotowatej (IPL) oraz wewnętrznej warstwy jądrowej (INL). (B) Reprezentatywny obraz w podczerwieni (IR) transplantowanej myszy Rd1/NS nie wykazał obecności zaćmy przez rozszerzoną źrenicę. (C) Reprezentatywne obrazy wielobarwnej refleksji (MR) oczu transplantowanych i nietransplantowanych myszy Rd1/NS. W oczach transplantowanych nie stwierdzono wyraźnych powikłań chirurgicznych, w tym krwawień. (D) Barwienie immunohistochemiczne (IHC) u myszy Rd1/NS transplantowanych (arkusz i zawiesina) oraz nietransplantowanych (kontrolnych). Dane wykazały liczne przeszczepione fotoreceptory wykazujące ekspresję specyficznych markerów fotoreceptorów (Rec), pręcików (Rho::EGFP), czopków L/M (OPN1LW:EGFP) oraz czopków S (S-opsin) dwa miesiące po transplantacji. Warstwy siatkówki biorcy zidentyfikowano za pomocą barwienia DAPI (kolor niebieski). Przeszczepy siatkówki zidentyfikowano za pomocą reportera EGFP (kolor zielony). Siatkówka myszy nietransplantowanych wykazała ciężką degenerację ONL z rzadkimi pozostałymi fotoreceptorami czopkowymi (Rec+). W siatkówkach nietransplantowanych myszy Rd1/NS nie wykryto sygnału EGFP. Powiększone obrazy przedstawiono na dwóch prawych panelach. Skróty: RGC: warstwa komórek zwojowych siatkówki; INL: wewnętrzna warstwa jądrowa; ONL: zewnętrzna warstwa jądrowa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Przeszczep podsiatkówkowy u myszy jest trudny technicznie ze względu na mały rozmiar oczu myszy. W tym badaniu opracowaliśmy prostą i powtarzalną platformę do przeszczepu podsiatkówkowego u biorców myszy. Platforma umożliwia konsekwentną ochronę żywotności dawcy, skuteczne dostarczanie podsiatkówkowe i zapewnia niski odsetek powikłań.

Przedstawiona tutaj technika przeszczepu podsiatkówkowego została opracowana w oparciu o drogę przeztwardówkową, w której igła iniekcyjna przenika przez zewnętrzne warstwy (kompleks twardówka-naczyniówka-RPE) ściany oka. W porównaniu z dostępem przezrogówkowym19,20 i przezszklistym 21,26,27, dostęp przeztwardówkowy bezpośrednio wchodzi do przestrzeni podsiatkówkowej bez penetracji struktur przedniego segmentu i siatkówki nerwowej, umożliwiając w ten sposób nieszkodliwy przeszczep i zmniejszając ryzyko refluksu komórek dawcy przez otwór penetrujący. Wyzwaniem związanym z podejściem przeztwardówkowym jest zapewnienie, że końcówka igły rozchodzi się wzdłuż przestrzeni podsiatkówkowej przed dotarciem do końcowego miejsca porodu, przy jednoczesnym uniknięciu potencjalnych zakłóceń sąsiednich warstw RPE i naczyniówki. Osiągnięcie tych celów za pomocą tradycyjnego podejścia przeztwardówkowego28,29 bez bezpośredniego wizualnego przewodnictwa jest wyzwaniem. W tym badaniu opracowaliśmy przezźrenicową platformę wizyjną przy użyciu mikroskopu chirurgicznego i zewnętrznego oświetlenia siatkówki, aby ułatwić przeszczep podsiatkówkowy w modelach mysich. Platforma umożliwia operatorowi śledzenie procesu chirurgicznego i stanu siatkówki biorcy, zapewniając wizualizację dna oka biorcy w czasie rzeczywistym pod mikroskopem operacyjnym. Na przykład, udana penetracja kompleksu twardówka-naczyniówka-RPE może być łatwo zweryfikowana przez stosunkowo jasne odbicie końcówki igły za pomocą wizualizacji przezźrenicowej. Co ważne, kierując się wizualizacją przezźrenicową, operator może precyzyjnie modulować kąt i głębokość iniekcji zgodnie ze względnym położeniem między igłą a strukturami anatomicznymi w siatkówce biorcy (np. naczyniami siatkówki i głową nerwu wzrokowego). Co więcej, dokładne podawanie materiałów przy użyciu tej techniki może zminimalizować RPE, uraz naczyniówki i inne powikłania chirurgiczne. Rzeczywiście, odkryliśmy, że krwotoki można zminimalizować, unikając manewrów w bliskiej odległości od naczyń krwionośnych siatkówki za pomocą wizualizacji przezźrenicowej.

Refluks komórek dawcy jest główną przyczyną niepowodzeń chirurgicznych po wstrzyknięciu 29,30. Istnieje wiele czynników zaangażowanych w promowanie refluksu komórek dawcy. Wysokie ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP) w oczach biorcy spowodowane wstrzykniętymi mieszaninami komórek dawcy jest ważnym czynnikiem sprzyjającym refluksowi komórek z oka. Nasz protokół zmniejsza ciśnienie wewnątrzgałkowe biorcy poprzez penetrację komory przedniej na początku operacji i umożliwia samoistne obniżenie ciśnienia wewnątrzgałkowego poprzez wydostawanie się płynu wodnistego przed wyciągnięciem igły do ciała szklistego z jamy ciała szklistego. Drugim czynnikiem jest nieuszczelniony tunel iniekcyjny w oczach biorców. Aby zapobiec cofaniu się przeszczepu z powrotem przez tunel iniekcyjny, używamy małej igły do mikroiniekcji (34G), aby utworzyć samouszczelniający się tunel podczas penetracji ściany oka i ząbkowanych mikrokleszczyków, aby przytrzymać krawędzie zewnętrznego otworu tunelu podczas wyciągania igły. W konwencjonalnym przeszczepie przeszczepy refluksowe są prawie niewykrywalne, ponieważ mogą wystąpić szybko lub szybko się rozproszyć. Hialuronian sodu, po nałożeniu szkiełka nakrywkowego, prawie zawsze zsuwa się z rogówki, pokrywając większość rąbka i twardówki, w tym miejsce sklerotomii. Po wstrzyknięciu komórek hialuronian sodu w miejscu sklerotomii może pomóc spowolnić przepływ luzem refluksowej zawartości, jeśli taka istnieje, i sprawić, że będą one wizualnie wykrywalne pod mikroskopem chirurgicznym. Co więcej, brak refluksu można również zweryfikować, śledząc stałość pęcherzyka podsiatkówkowego dla zawiesin komórkowych i wewnątrzgałkową lokalizację arkusza siatkówki za pomocą naszego protokołu, co może być przydatne w laboratoriach, w których optyczna tomografia koherentna (OCT) jest niedostępna.

Podczas gdy znaczna liczba komórek fotoreceptorowych przetrwała w przeszczepionych arkuszach siatkówki, nie można było wykryć żadnej dostrzegalnej orientacji komórkowej ani orientacji arkusza. Chociaż ustalono dostarczanie arkuszy siatkówki 3D dużym zwierzętom 26,31,32, przestrzeń podsiatkówkowa u myszy, w połączeniu z brakiem możliwości śródoperacyjnego obrazowania siatkówki, sprawia, że bardzo trudno jest zapewnić utrzymanie orientacji arkusza śródoperacyjnie, a także w bezpośrednim okresie pooperacyjnym, w którym przeszczepione komórki lub arkusze mogą stać się niestabilne, gdy mysz odzyskuje zdolność poruszania się.

Opisujemy przeztwardówkową platformę chirurgiczną z bezpośrednią kontrolą widzenia przezźrenicowego do przeszczepu podsiatkówkowego u biorców myszy. Platforma ta umożliwia wysoką dokładność iniekcji i niski odsetek powikłań chirurgicznych. Platforma ta umożliwia precyzyjne dostarczanie znanych dawek komórek, jest stosunkowo łatwa do opanowania i ułatwia dostarczanie podsiatkówkowe oprócz iniekcji do ciała dosiatkówkowego lub doszklistkowego dla różnych rodzajów środków terapeutycznych, w tym terapii genowej.

Oświadczenia

MSS jest/był płatnym doradcą dla Revision Therapeutics, Johnson & Johnson, Third Rock Ventures, Bayer Healthcare, Novartis Pharmaceuticals, W. L. Gore & Associates, Deerfield, Trinity Partners, Kala Pharmaceuticals i Acucela. MSS otrzymuje sponsorowane wsparcie badawcze od firmy Bayer. Ustalenia te zostały zweryfikowane i zatwierdzone przez Uniwersytet Johnsa Hopkinsa zgodnie z jego polityką dotyczącą konfliktu interesów. KVL jest wymieniony jako wynalazca we wnioskach patentowych na Uniwersytecie Kolorado. MSS i YVL są wymieniani jako wynalazcy we wnioskach patentowych na Uniwersytecie Johnsa Hopkinsa.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana z następujących funduszy: NEI R01EY033103 (MSS), Foundation Fighting Blindness (MSS), The Shulsky Foundation (MSS), Joseph Albert Hekimian Fund (MSS), Juliette RP Vision Foundation (YVL), Research to Prevent Blindness (nieograniczony grant dla Wilmer Eye Institute na Uniwersytecie Johnsa Hopkinsa i Cullen Eye Institute w Baylor College of Medicine). Dziękujemy dr Malii Edwards (Johns Hopkins University School of Medicine) za uprzejme przeprowadzenie szkolenia z obsługi mikroskopu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sztuczne łzyCareAllP31447-04
Szkiełka nakrywkowe (średnica 5mm)DeckglaserN/A
Koza anty-GFP (FITC)AbcamAb6662
Koza-anty-królik Cy3 InvitrogenA10520
Strzykawka insulinowa (30G)Easy Touch08496-3015-11
KetaminaVETone ZetamineAH2017J
Live Dead Viability KitThermo Fisher ScientificL3224
MikronożyczkiHarvard Apparatus72-8503
Mikro kleszczyki gładkieASICOAE-4360
Kleszczyki mikro zębateWorld Precision Instruments555041FT
Igła do mikroiniekcji (26G)Hamilton7804-03
Igła do mikroiniekcji (34G)
Hamilton7633-01
Zestaw do dysocjacji papainyLK003150biochemiczny Worthington
Szalka Petriego (35 mm)Thermo Fisher ScientificFB012920
Jod powidonu (10%)Roztwór betadynyN/A
Chlorowodorek proparakainy (0,5%)KeelerAX0500
Królik anty-rekupynaMilliporeAb5585
Królik anty-S-opsinMilliporeAb5407
Hialuronian soduJohnson & Wizja firmy Johnson 10-2400-11
Sterylne waciki bawełnianePuritan25-806 2PC
Sterylna igła (25G)Igła BD PrecisionGlide305122
Sterylne zasłony na ręcznikiDynarex4410
Materiały chirurgiczne/odczynniki
Tropicamid roztwór okulistycznyHenry Schein112-7192
XylazineAnaSed do wstrzykiwańNie dotyczy
Strzykawka do mikroiniekcji Hamilton 207434

Bibliografia

  1. Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
  2. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nat Biotechnol. 36 (4), 328-337 (2018).
  3. Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Sci Transl Med. 10 (435), (2018).
  4. Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
  5. Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
  6. Sharma, R., et al. Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs. Sci Transl Med. 11 (475), (2019).
  7. Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 1101-1106 (2013).
  8. Shirai, H., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in two primate models of retinal degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (1), E81-E90 (2016).
  9. Ghosh, F., Wong, F., Johansson, K., Bruun, A., Petters, R. M. Transplantation of full-thickness retina in the rhodopsin transgenic pig. Retina. 24 (1), 98-109 (2004).
  10. Klassen, H., et al. Progenitor cells from the porcine neural retina express photoreceptor markers after transplantation to the subretinal space of allorecipients. Stem Cells. 25 (5), 1222-1230 (2007).
  11. Das, T., et al. The transplantation of human fetal neuroretinal cells in advanced retinitis pigmentosa patients: results of a long-term safety study. Exp Neurol. 157 (1), 58-68 (1999).
  12. Humayun, M. S., et al. Human neural retinal transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (10), 3100-3106 (2000).
  13. Liu, Y., et al. Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 209(2017).
  14. Liu, Y. V., et al. Characterization and allogeneic transplantation of a novel transgenic cone-rich donor mouse line. Exp Eye Res. 210, 108715(2021).
  15. Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. 485 (7396), 99-103 (2012).
  16. Ortin-Martinez, A., et al. Photoreceptor nanotubes mediate the in vivo exchange of intracellular material. EMBO J. 40 (22), 107264(2021).
  17. Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205(2019).
  18. Singh, M. S., et al. Transplanted photoreceptor precursors transfer proteins to host photoreceptors by a mechanism of cytoplasmic fusion. Nat Commun. 7, 13537(2016).
  19. Qi, Y., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523(2015).
  20. Nickerson, J. M., et al. Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes. Methods Mol Biol. 884, 53-69 (2012).
  21. Fang, Y., et al. Safety evaluation of subretinal injection of trypan blue in rats. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 22 (10), 2923-2933 (2018).
  22. Liu, Y. V., et al. Quantifiable in vivo imaging biomarkers of retinal regeneration by photoreceptor cell transplantation. Transl Vis Sci Technol. 9 (7), 5(2020).
  23. Liu, Y. V., et al. Single-cell transcriptome analysis of xenotransplanted human retinal organoids defines two migratory cell populations of nonretinal origin. Stem Cell Reports. 18 (5), 1138-1154 (2023).
  24. Park, S., et al. Animal models of corneal endothelial dysfunction to facilitate development of novel therapies. Ann Transl Med. 9 (15), 1271(2021).
  25. Li, X., et al. Acute ocular hypertension disrupts barrier integrity and pump function in rat corneal endothelial cells. Sci Rep. 7 (1), 6951(2017).
  26. Chao, J. R., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal cells into the subretinal space of a non-human primate. Transl Vis Sci Technol. 6 (3), 4(2017).
  27. Singh, R. K., Occelli, L. M., Binette, F., Petersen-Jones, S. M., Nasonkin, I. O. transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in the subretinal space of the cat eye. Stem Cells Dev. 28 (17), 1151-1166 (2019).
  28. Zhao, C., et al. Development of a refined protocol for trans-scleral subretinal transplantation of human retinal pigment epithelial cells into rat eyes. J Vis Exp. (126), e55220(2017).
  29. Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J Vis Exp. (69), e4286(2012).
  30. Wongpichedchai, S., Weiter, J. J., Weber, P., Dorey, C. K. Comparison of external and internal approaches for transplantation of autologous retinal pigment epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (12), 3341-3352 (1992).
  31. Luo, Z., et al. Establishing a surgical procedure for rhesus epiretinal scaffold implantation with HiPSC-derived retinal progenitors. Stem Cells Int. 2018, 9437041(2018).
  32. Luo, Z., et al. Biodegradable scaffolds facilitate epiretinal transplantation of hiPSC-Derived retinal neurons in nonhuman primates. Acta Biomater. 134, 289-301 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Transplantacja podsiatkówkowaprzeszczepy siatkówkitransplantacja fotoreceptorównabłonek pigmentowy siatkówkiprowadzenie transpupilarnechirurgia transskleralnaoftalmoskopia konfokalnaoptyczna koherentna tomografiachirurgia oka myszy
Przezźrenicowe przeszczepienie przeztwardówkowe przeszczepów podsiatkówkowych w mysim modelu zwyrodnienia siatkówki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.