Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Manipulacja Tuina w celu zmniejszenia stanu zapalnego i utraty chrząstki u szczurów z chorobą zwyrodnieniową stawu kolanowego

3.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65451

⸱

30 czerwca 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół manipulacji Tuina wykonywanej na szczurach z chorobą zwyrodnieniową stawu kolanowego wywołaną gipsem. Na podstawie wstępnych wyników zasugerowano, że skuteczność metody zależy od zmniejszenia stanu zapalnego i utraty chrząstki.

Streszczenie

Badania kliniczne sugerują, że manipulacja Tuina jest skuteczna w leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego (KOA), podczas gdy potrzebne są dalsze badania, aby odkryć jej mechanizm. Dlatego manipulacja modelami zwierzęcymi choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego ma kluczowe znaczenie. Protokół ten zapewnia standardowy proces manipulacji Tuina na szczurach KOA i wstępne zbadanie mechanizmu Tuina dla KOA. Metodę manipulacji wyciskaniem i ugniataniem (rodzaj manipulacji Tuina, która odnosi się do uciskania i ugniatania określonego obszaru powierzchni ciała) nakłada się na 5 punktów akupunkturowych wokół stawu kolanowego szczurów. Siła i częstotliwość manipulacji zostały ustandaryzowane za pomocą zapisów nacisku palca, a pozycja szczura podczas manipulacji jest szczegółowo opisana w protokole. Efekt manipulacji można zmierzyć za pomocą testów zachowania bólu i wyników mikroskopowych w chrząstce maziowej i chrząstce. Szczury KOA wykazały znaczną poprawę zachowań bólowych. Naciek zapalny tkanki maziowej był zmniejszony w grupie Tuina, a ekspresja czynnika martwicy nowotworu (TNF)-α była znacznie niższa. W porównaniu z grupą kontrolną, apoptoza chondrocytów była mniejsza w grupie Tuina. Badanie to dostarcza ustandaryzowanego protokołu manipulacji Tuina na szczurach KOA i wstępnego dowodu na to, że efekty terapeutyczne Tuina mogą być związane ze zmniejszeniem zapalenia błony maziowej i opóźnioną apoptozą chondrocytów.

Wprowadzenie

Choroba zwyrodnieniowa stawu kolanowego (KOA) jest chorobą zwyrodnieniową objawiającą się głównie bólem stawów. Zwłóknienie, pękanie, owrzodzenie i utrata chrząstki stawowej są głównymi przyczynami tej choroby1. KOA ma wysoką częstość występowania i może mieć głęboki wpływ na codzienne życie pacjentów, powodując niepełnosprawność w ciężkich przypadkach. Wśród osób w wieku 45-84 lat częstość występowania KOA wzrasta wraz z wiekiem, a częstość występowania wśród osób w wieku 85 lat i starszych wynosi 15%, z przewagą kobiet2,3. Ponadto KOA może stanowić poważne obciążenie ekonomiczne zarówno dla jednostki, jak i społeczeństwa. Ankieta wykazała, że bezpośrednie koszty opieki zdrowotnej na KOA na mieszkańca sięgały do 8 858 USD ± 5 120 USD rocznie4. Wraz ze starzeniem się społeczeństwa, KOA stała się ogólnoświatowym problemem zdrowotnym i poważnym problemem społecznym, a także aktualnym zagadnieniem dla badań naukowych.

Badania oparte na dowodach wykazały skuteczność manipulacji Tuina w leczeniu KOA5. Manipulacja Tuina może złagodzić ból i poprawić dysfunkcję u pacjentów z KOA, której mechanizm jest związany z działaniem przeciwzapalnym6,7. Naukowcy odkryli, że manipulacja Tuina skutecznie hamowała ekspresję czynników zapalnych interleukiny (IL)-β i 5-hydroksytryptaminy oraz spowalniała degenerację chrząstki stawowej u królika KOA model8. Sugerowało to, że Tuina może promować krążenie krwi i metabolizm w miejscu uszkodzenia, co pomogło usunąć czynniki zapalne, takie jak IL-1, IL-6 i czynnik martwicy nowotworu (TNF)-α, łagodząc w ten sposób objawy kliniczne KOA9. Ponadto bierny ruch stawu poprzez manipulację Tuina może sprzyjać penetracji i dyfuzji mazi stawowej do chrząstki stawowej i poprawia metabolizm składników odżywczych w tkankach10. Inne badania sugerowały, że manipulacja Tuina może skutecznie poprawić wskaźniki biomechaniczne u pacjentów z KOA11. Manipulacje stosowane na tkankach miękkich mogą poprawić rozkład naprężeń w kończynach i poprawić funkcję równowagi12,13. Jednocześnie, przy niektórych manipulacjach związanych z regulacją stawów, można również dostosować ustawienie kończyn dolnych w celu skorygowania nieprawidłowych chodów14,15.

Mechanizm działania manipulacji Tuina w leczeniu KOA pozostaje do zbadania, dlatego konieczne jest przeprowadzenie eksperymentalnych badań. Kluczem do zastosowania Tuiny u zwierząt doświadczalnych jest standaryzacja modelowania, fiksacji zwierząt i metod interwencji16. Metoda modelowania określa, czy zwierzę doświadczalne może wykazywać cechy choroby. Tymczasem odpowiednie metody utrwalania mogą ułatwić interwencję w manipulację Tuina i lepiej odzwierciedlić efekt Tuiny. Standaryzacja metod interwencji jest najtrudniejszą częścią manipulacji Tuina. W 2010 roku podstawowy system chińskich standardów akupunktury wspomniał o standardach punktów akupunkturowych dla zwierząt doświadczalnych, zapewniając możliwość wykonywania akupunktury i Tuiny w eksperymentach na zwierzętach17. Jednak nadal istnieją trudności w standaryzacji manipulacji Tuiną. Istnieje wiele rodzajów manipulacji Tuina18. Wybór konkretnej manipulacji zależy głównie od choroby, która ma być leczona, oraz teorii terapeutycznych, które preferuje wykonawca. W badaniach nad Tuiną dla KOA więcej uwagi poświęcono manipulacji polegającej na wyciskaniu punktowym (uciskanie określonych punktów akupunkturowych kciukiem lub łokciem), manipulacji pchaniem Yizhichan (manipulacja pchaniem poprzez poruszanie kciukiem) oraz manipulacji wyciskaniem i ugniataniem (która odnosi się do naciskania i ugniatania określonego obszaru powierzchni ciała palcem lub dłonią)19. Manipulacja wyciskaniem i ugniataniem jest jedną z najczęściej stosowanych manipulacji Tuina, która łączy prasowanie i ugniatanie w celu poruszenia tkanki podskórnej20. Manipulacja wyciskaniem i ugniataniem zastosowana na punktach akupunkturowych może promować krążenie krwi i łagodzić ból oraz reprezentuje terapeutyczny efekt Tuiny na KOA19.

W tym protokole, operacja manipulacji wyciskaniem i ugniataniem na szczurach KOA zostanie szczegółowo opisana, włączając w to wybrane punkty akupunkturowe, intensywność i częstotliwość manipulacji oraz pozycję ciała szczura, aby zapewnić punkt odniesienia dla przyszłych badań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie to przeszło przegląd etyczny dotyczący zwierząt, przeprowadzony przez komisję etyki ds. zwierząt doświadczalnych w Szpitalu Yueyang Medycyny Zintegrowanej Tradycyjnej Medycyny Chińskiej i Medycyny Zachodniej, stowarzyszonym z Uniwersytetem Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Szanghaju (YYLAC-2022-166).

1. Przygotowanie i grupowanie zwierząt doświadczalnych

  1. Przygotowanie zwierząt
    1. Hodować łącznie 10 zdrowych samic szczurów SD klasy SPF o masie 200-220 g w temperaturze pokojowej (18-21 °C), przy wilgotności 40%-50%, w 12-godzinnym cyklu dobowym światła i ciemności. Eksperymenty zwierzęce związane z bólem należy przeprowadzać w ścisłej zgodności z odpowiednimi postanowieniami wytycznych etycznych dotyczących zwierząt.
  2. Podział zwierząt na grupy
    1. Losowo podzielić szczury na grupę Tuina oraz grupę kontrolną. Szczury z grupy Tuina poddać manipulacjom w postaci ucisku i ugniatania przez 21 dni po wytworzeniu modelu. Szczury z grupy kontrolnej umieścić w tym samym pomieszczeniu Tuina i jednocześnie z grupą leczoną włożyć do czarnych materiałowych woreczków.

2. Modelowanie zwierzęce

  1. Znieczulenie zwierzęcia
    1. Do znieczulenia gazowego należy użyć izofluranu. Umieść szczura w komorze indukcyjnej przy stężeniu indukcyjnym 3%. Po ułożeniu zwierzęcia delikatnie potrząśnij komorą; znieczulenie uznaje się za skuteczne, gdy szczur przewróci się na bok i nie podejmuje prób powrotu do pozycji brzusznej.
    2. Wyjmij szczura z komory indukcyjnej i umieść jego nos w masce anestezjologicznej. Ustaw stężenie izofluranu na 2%, aby podtrzymać znieczulenie. Potwierdź wystąpienie znieczulenia, sprawdzając brak reakcji szczura na uciśnięcie łap. Nałóż szczurom maść do oczu, aby zapobiec ich wysuszeniu podczas znieczulenia, gdy powieki nie mogą zostać zamknięte.
  2. Metoda modelowania21​
    1. Użyj maszynki do golenia, aby usunąć owłosienie z prawej tylnej kończyny. Umieść medyczny wacik bawełniany między prawym stawem skokowym a stawem biodrowym szczura. Unieruchom prawy staw kolanowy w 180° równomiernie nałożyć 5-6 warstw mokrego bandaża gipsowego. Owijać bandaż gipsowy spiralnie, zaczynając od kostki i zakrywając 1/3 poprzedniej warstwy. Do wysuszenia i utwardzenia gipsu użyć suszarki do włosów.
    2. Po wyschnięciu i stwardnieniu gipsu owinąć go z zewnątrz materiałem na bazę protetyczną, aby utrwalić gips i zapobiec jego ścieraniu.
    3. Wymieszać materiały na bazę protezy do uzyskania lepkości, a następnie nanieść mieszaninę na zewnętrzną stronę gipsu (mieszanina nie powinna wystawać poza krawędź opaski, Rycina 1). Po stwardnieniu mieszaniny należy wyłączyć aparat do znieczulania i poczekać, aż zwierzę naturalnie się obudzi. Należy nadzorować szczury, aby zapobiec wypadkom związanym ze znieczuleniem przed ich pełnym przebudzeniem.
    4. Odpowiednio przymocuj gips do prawej tylnej kończyny szczura, ponieważ zbyt ciasne unieruchomienie ogranicza krążenie krwi, natomiast zbyt luźne ma tendencję do odpadania. Obserwuj krążenie krwi w dystalnej części kończyny. W przypadku stwierdzenia obrzęku dystalnego odcinka lub sinicy (fioletowego zabarwienia), bezzwłocznie odetnij część gipsu, aby pomóc w przywróceniu krążenia. Nałóż gips ponownie, jeśli ulegnie on uszkodzeniu i nie będzie utrzymywał wyprostu kończyny dolnej.
    5. Usuń gips po 3 tygodniach ciągłej immobilizacji. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby odciąć materiał bazy protezy znajdujący się na zewnątrz oraz bandaż gipsowy. Przepłucz kończynę dolną szczura solą fizjologiczną i osusz ją gazą. W przypadku wystąpienia miejscowych uszkodzeń skóry należy przeprowadzić sterylizację jodoforem.
  3. Weryfikacja modelu22
    1. Weryfikacja w oparciu o promieniowanie rentgenowskie
      1. Wykonaj badanie rentgenowskie prawego kolana 1 dzień po zakończeniu modelowania. Wykonaj zdjęcia w projekcji przednio-tylnej w pozycji leżącej z zgiętym stawem biodrowym pod kątem 30°, wyprost kolana przy 0°, oraz odwodzenie w stawie biodrowym przy 15°Utrzymać rzepkę bezpośrednio przed kolanem i umieścić rurkę radiatora w odległości 110 mm od stawu kolanowego.
      2. Wykonaj radiogramy boczne w pozycji bocznej prawej z zgięciem prawego stawu biodrowego pod kątem 30° or wyprost prawego kolana przy 0°Wykonaj zgięcie w stawie biodrowym lewej kończyny w kącie 70°oraz zgięcie kolana przy 45°oraz umieść lampę rentgenowską w odległości 110 mm od stawu kolanowego. Ustaw parametry detekcji: napięcie ekspozycji 50 kV, natężenie prądu 250 mA, dawkę ekspozycyjną 32 mAs oraz czas ekspozycji 128 ms.
      3. Porównaj z obrazem RTG szczurów zdrowych i sprawdź, czy modelowany obraz RTG kolana wykazuje zwężenie szczeliny stawowej wraz z hiperplazją osteofitów na krawędzi.
    2. punktacja Osteoarthritis Research Society International (OARSI)23
      1. Umieść szczura w komorze do eutanazji i przeprowadź perfuzję CO2 z szybkością od 30% do 70% objętości klatki na minutę. Przerwać perfuzję CO2 po stwierdzeniu, że szczur jest nieruchomy, nie oddycha, a jego źrenice są rozszerzone. Obserwować przez kolejne 2 min w celu potwierdzenia zgonu.
        UWAGA: Zwichnięcie stawów obręczy szyjnej można przeprowadzić po CO2eutanazja oparta na [metodzie] jako wtórna forma potwierdzenia zgonu. Unieruchomić szczura na stole i chwycić go jedną ręką za ogon. Drugą ręką, kciukiem i palcem wskazującym, mocno docisnąć głowę szczura. Zgon potwierdza się w momencie usłyszenia trzasku, przy jednoczesnym ustaniu ruchów i bicia serca szczura.
      2. Ustabilizuj szczura w pozycji grzbietnej na płytce piankowej za pomocą igły strzykawki, z prawą tylną kończyną zgiętą w odwodzeniu i rotacji zewnętrznej. Chwyć skórę wokół stawu kolanowego nożyczkami chirurgicznymi. Odsłoń mięśnie wokół stawu kolanowego poprzez nacięcie skóry, a następnie przecięcie powięzi podskórnej.
      3. Odciąć trzon kości udowej i piszczelowej nożyczkami do kości i usunąć prawy staw kolanowy. Ostrożnie usunąć nadmiar tkanek miękkich, takich jak mięśnie i więzadła, znajdujących się poza stawem.
      4. Utrwalić staw w 4% paraformaldehydzie przez 24–48 h w temperaturze 4 °CDekalcyfikować staw w 10% roztworze kwasu mrówkowego przez 3 dni, aż tkanka kostna będzie można łatwo przebić igłą.
      5. Umieść odwapnioną tkankę w dygestorium, przytnij ją, a następnie przenieś do pojemnika w urządzeniu do dehydratacji. Przeprowadź dehydratację i klarowanie w wosku zgodnie z następującym schematem: 75% etanol przez 4 h, 90% etanol przez 2 h, 95% etanol przez 1 h, etanol bezwodny przez 30 min, ponowna inkubacja w świeżym etanolu bezwodnym przez 30 min, mieszanina alkohol-benzen przez 5–10 min, ksylen przez 5–10 min, ponowna inkubacja w świeżym ksylenie przez 5–10 min, wosk przez 1 h, kolejna inkubacja w świeżym wosku przez 1 h oraz końcowa inkubacja w świeżym wosku przez 1 h.
      6. Następnie umieść tkankę w urządzeniu do zatapiania. Pokrój blok woskowy na plastry woskowe o 4 µm po zastygnięciu parafiny wygładzić skrawek w ciepłej wodzie. Umieścić skrawek na szkiełku przedmiotowym i wysuszyć. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
      7. Obserwuj próbkę chrząstki i oceń ją zgodnie ze skalą oceny histopatologicznej chrząstki w OA (Tabela 1)23Jeśli wynik uzyskany przez szczury po modelowaniu jest istotnie wyższy niż wynik szczurów z grupy kontrolnej, oznacza to, że modelowanie przebiegło pomyślnie.

Tabela 1. Ocena stopnia histopatologicznego chrząstki w OA. Stopień określa głębokość progresji w chrząstce. Wynik całkowity = stopień x stadium. 0 dla stawów prawidłowych, 24 dla ciężkiego zapalenia stawów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Eksperyment laboratoryjny; zdyssekowane gryzonie; badanie anatomiczne; badania naukowe nad ssakami.
Rysunek 1. Szczury unieruchomione w gipsie. Po znieczuleniu szczurów ich prawe kończyny dolne owinięto bandażami gipsowymi, utrwalono w pozycji przeprostowania i pokryto od zewnątrz warstwą materiałów do protez zgryzowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Manipulacja Tuina

  1. Obszar aplikacji
    1. Wybierz łącznie 5 punktów akupunkturowych na prawej kończynie tylnej szczurów, w tym ST34, ST35, SP10, EX-LE4 oraz BL40 (Rycina 2). Zlokalizuj punkty akupunkturowe zgodnie z zasadami wyznaczania punktów opisanymi w 24.
  2. Pozycja do aplikacji
    1. Wytnij z czarnego materiału worek o wymiarach 9 cm x 15 cm z otworem z jednej strony i zaciśnij otwór sznurkiem. Przed manipulacją Tuina delikatnie pociągnij szczura za ogon, aby wpełzł do worka, wystawiając kończyny tylne na zewnątrz.
    2. Jedną ręką utrzymaj szczura w pozycji brzusznej, trzymając go za ogon i tylną nogę, podczas gdy drugą ręką wykonuj uciskanie i ugniatanie konkretnego punktu akupunkturowego (Rycina 3).
  3. Manipulacja Tuina
    1. Wykonuj uciskanie i ugniatanie na 5 punktach akupunkturowych prawej kończyny tylnej przez 2 min każdego z nich. Umieść kciuk wykonującego zabieg na wybranym punkcie akupunkturowym i wykonuj rytmiczne uciskanie oraz ugniatanie, przesuwając skórę wraz z tkanką podskórną w ruchu okrężnym.
    2. Użyj pomiarów nacisku palca (jednostki w Newtonach), aby zapewnić stałą intensywność i częstotliwość manipulacji. Utrzymuj intensywność w zakresie 3-5 N oraz częstotliwość na poziomie 2 Hz (Rycina 4). Stosuj manipulację raz dziennie przez 21 dni.

Nakładka anatomiczna gryzonia z zaznaczonymi punktami akupunkturowymi; schemat szkieletowy do celów badawczych i edukacyjnych.
Rysunek 2. Położenie punktów akupunkturowych. SP10 znajduje się 5 mm powyżej wewnętrznego stawu kolanowego u szczurów. ST34 znajduje się 5 mm powyżej zewnętrznego stawu kolanowego u szczurów. EX-LE4 znajduje się po stronie przyśrodkowej więzadła kolanowego u szczurów. ST35 znajduje się po stronie bocznej więzadła kolanowego u szczurów. BL40 znajduje się w połowie poprzecznego paska podkolanowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Procedura obsługi zwierząt przedstawiająca dłoń w rękawiczce, szczura i unieruchomienie; warunki laboratoryjne.
Rysunek 3. Manipulacja Tuina stosowana u szczurów. Szczury umieszczono w czarnej torbie z odsłoniętymi kończynami tylnymi. Wykonawca trzymał ogon szczura lewą ręką, podczas gdy prawą ręką wykonywał manipulację. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Układ do pomiaru tętna z czujnikiem, interfejsem danych i wyświetlaczem kardiogramu do analizy częstości akcji serca.
Rysunek 4. Rejestracja nacisku palca. Urządzenie rejestrujące siłę i częstotliwość nacisku palca jest wykorzystywane do informacji zwrotnej w czasie rzeczywistym na temat intensywności i częstotliwości w procesie manipulacji Tuina. (A) Czujnik nacisku i sprzęt transmisyjny. (B) Rejestracje nacisku palca. (C) Siła zarejestrowana podczas manipulacji Tuina. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Testy zachowań bólowych

  1. Przeprowadź testy zachowań bólowych przed i po modelowaniu oraz 1 dzień po (D1), 7 dni po (D7), 14 dni po (D14) i 21 dni po (D21) manipulacji Tuina, w tym testy progu wycofania mechanicznego oraz czasu utajenia wycofania łapy.
  2. Próg wycofania mechanicznego (MWT)
    1. Umieść szczury w przezroczystej kabinie z hartowanego szkła o wymiarach 20 cm x 10 cm x 20 cm, znajdującej się na podwyższeniu o wysokości 40 cm, wykonanym z drucianej kratki o oczkach 10 mm x 10 mm. Utrzymuj temperaturę w pomieszczeniu na poziomie 23 °C ± 2 °C.
    2. Pozostaw szczury w laboratorium behawioralnym przez co najmniej 2 h dziennie podczas fazy testów behawioralnych, aby uniknąć zakłóceń wyników testów wynikających z braku adaptacji zwierząt do środowiska na początku właściwego badania. Umieść szczury w laboratorium behawioralnym na 30 min przed rozpoczęciem właściwego testu, aby ułatwić im adaptację do otoczenia i zredukować czynniki rozpraszające.
    3. Do pomiaru MWT użyj elektronicznych włókien Von Frey. Stymuluj szczura włóknem w centralnej części stopy i wycofaj włókno, gdy szczur wykaże wyraźne reakcje, takie jak podniesienie nogi i unikanie. Urządzenie może automatycznie zarejestrować maksymalną wartość nacisku (N) w tym momencie.
    4. Kolejną stymulację u tego samego szczura rozpocznij co najmniej 15 s po poprzedniej. Czas każdej stymulacji nie powinien przekraczać 5 s, aby zapobiec uwrażliwieniu na bodźce dotykowe w łapach szczurów. Powtórz test 5x, aż różnica między trzema kolejnymi pomiarami stanie się nieistotna (w granicach 10 N).
    5. Odrzuć wartości o dużych odchyleniach (wartość maksymalną i minimalną) i oblicz średnią z trzech pozostałych wartości jako próg wycofania mechanicznego.
  3. Czas utajenia wycofania łapy (PWL)
    1. Umieść szczury w niewielkim przedziale z przezroczystego hartowanego szkła o wymiarach 20 cm x 10 cm x 20 cm. Przykryj górę przedziału przezroczystą szklaną pokrywą z otworami wentylacyjnymi. Utrzymuj temperaturę przezroczystej szklanej płyty, na której ustawiono przedział, w zakresie 28-30 °C.
    2. Pozostaw szczury w tym środowisku przez co najmniej 30 min w celu aklimatyzacji przed rozpoczęciem każdego właściwego testu. Jeśli szczury oddadzą mocz lub kał do przedziału, niezwłocznie oczyść go za pomocą papieru chłonnego, aby uniknąć wpływu zanieczyszczeń na późniejszy przekaz ciepła przez promieniowanie świetlne.
    3. Skieruj wiązkę światła punktowego na środek stopy szczura i naciśnij przycisk Start. Naciśnij przycisk Stop, gdy szczur wykaże wyraźne zachowania, takie jak cofnięcie stopy lub lizanie łapy, i zarejestruj czas w tym momencie. Czas naświetlania światłem punktowym nie powinien przekraczać 20 s, aby uniknąć uszkodzenia skóry szczura.
    4. Kolejne naświetlanie u tego samego szczura przeprowadź po co najmniej 10 min, aby zapobiec uwrażliwieniu. Wykonaj 5 pomiarów u każdego szczura.
    5. Odrzuć wartości o dużych odchyleniach (wartość maksymalną i minimalną). Oblicz średnią z pozostałych wartości jako PWL.

5. Przygotowanie próbek

  1. Przeprowadzić eutanazję myszy zgodnie z opisem w punkcie 2.3.2.1.
  2. Przygotowanie błony maziowej
    1. Utrwalić szczura w pozycji na plecach za pomocą igły strzykawki na tablicy piankowej, z prawą tylną kończyną zgiętą w odwiedzeniu i rotacji zewnętrznej. Chwycić skórę wokół stawu kolanowego nożyczkami chirurgicznymi i odsłonić mięśnie wokół stawu kolanowego szczura, nacinając skórę, a następnie przecinając powięź podskórną.
    2. Przyjąć więzadło rzepki jako punkt orientacyjny, aby oddzielić grupy mięśni powyżej więzadła rzepki. Ostrożnie naciąć koniec więzadła rzepki (na guzcie piszczelowym) i odnaleźć błonę maziową, odciągając więzadło do góry od dołu.
    3. Ostrożnie wyciąć tkankę maziową nożyczkami okulistycznymi i wypłukać krew oraz płyn stawowy schłodzoną solą fizjologiczną. Utrwalić błonę maziową w 4% paraformaldehydzie przez co najmniej 48 h po osuszeniu powierzchni tkanki czystą gazą.
    4. Przygotować próbkę zgodnie z krokami 2.3.2.5–2.3.2.6. Przeprowadzić ocenę zgodnie z krokiem 2.3.2.7.
  3. Wykonanie barwienia hematoksyliną i eozyną
    1. Odparafinizować do wody w ksylenie przez 20 min, wymienić na świeży ksylen na kolejne 20 min, następnie traktować bezwodnym etanolem przez 5 min, wymienić na świeży bezwodny etanol przez 5 min, następnie dodać etanol 90% objętościowo przez 5 min, etanol 80% objętościowo przez 5 min, etanol 70% objętościowo przez 5 min i na koniec wodę destylowaną przez 5 min.
    2. Zanurzyć preparat w roztworze barwiącym hematoksyliną na 3–8 min. Wyjąć preparat i wypłukać barwnik wodą destylowaną. Przenieść do płynu różnicującego (1% alkoholowy roztwór kwasu solnego) na prawie 30 s, aż preparat wyblaknie do jasnoniebieskiego koloru. Wypłukać wodą destylowaną i umieścić w roztworze barwiącym eozyną na 1–3 min.
    3. Odwodnić preparat w etanolu o frakcji objętościowej 95% przez 5 min, wymienić na świeży etanol 95% przez 5 min, następnie w bezwodnym etanolu przez 5 min, wymienić na świeży bezwodny etanol przez 5 min.
    4. Uczynić preparat przezroczystym, dodając ksylen na 5 min, wymienić na świeży ksylen na kolejne 5 min, a następnie zamknąć neutralną żywicą.
  4. Metoda TUNEL (Terminal-deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling) w chrząstce
    1. Odwodnić próbkę chrząstki w bezwodnym etanolu, etanolu 90%, etanolu 85% i etanolu 75% aż do zakończenia hydratacji po odparafinizowaniu. Namoczyć w PBS przez 5 min. Dodawać kroplami 3% H2O2 przez 10 min.
    2. Dodawać kroplami gotowy roztwór proteinazy K i trawić w 37 °C przez 10 min. Dodać 20 µL buforu znakującego na każdy skrawek, aby utrzymać go w wilgoci, i odprowadzić nadmiar cieczy po przygotowaniu roztworu roboczego. Dodać 20 µL roztworu roboczego do każdego preparatu i inkubować przez 2 h w 37 °C w wilgotnej komorze.
    3. Dodawać kroplami 50 µL roztworu zamykającego i pozostawić na 30 min. Następnie dodawać kroplami 50 µL rozcieńczonego biotynylowanego przeciwciała anty-digoksyny (rozcieńczenie 1:100) i inkubować w 37 °C przez 2 h w wilgotnej komorze. Dodawać kroplami 10 µL rozcieńczalnika przeciwciał SABC (rozcieńczenie 1:100) i inkubować w 37 °C przez 2 h w wilgotnej komorze.
    4. Dodawać kroplami roztwór wywołujący barwę DAB (po 50 µL odczynników A, B i C w 1000 µL wody destylowanej) przez 10–15 min. Wywoływanie barwy kończy się, gdy pojawi się brunatno-żółta ziarnistość.
    5. Ponownie zabarwić hematoksyliną przez 3 s. Po odwodnieniu gradientowym i utrwaleniu przezroczystym wysuszyć w temperaturze pokojowej i ostrożnie zamknąć preparat neutralną gumą. Należy zadbać o to, aby nie pozostały pęcherzyki powietrza i aby klej nie wypłynął poza obszar.
  5. Analiza immunohistochemiczna IL-1β i TNF-α
    1. Odparafinizować preparaty rutynowo w ksylenie i hydratować w alkoholach gradientowych. Inaktywować endogenną peroksydazę w skrawkach za pomocą 3% H2O2. Umieścić uchwyt do preparatów w buforze cytrynianowym (pH 6.0) w 95 °C i inkubować w kąpieli wodnej powyżej 95 °C przez ponad 20 min. Wyjąć pojemnik z inkubacji i pozostawić w temperaturze pokojowej przez co najmniej 20 min.
    2. Inkubować 5% normalne surowicę kozią z PBS przez 10 min w 37 °C i odprowadzić nadmiar cieczy. Dodawać kroplami 150 µL przeciwciała I i pozostawić w 37 °C na 1 h, a następnie przechowywać przez noc w 4 °C. Następnego dnia ponownie ogrzać w 37 °C przez 45 min.
    3. Przemyć 3x w PBS po 5 min każde płukanie. Przykryć tkankę na preparacie 3% BSA i inkubować w 37 °C przez 30 min. Dodawać kroplami 150 µL przeciwciała II i pozostawić w temperaturze pokojowej na 1 h. Przemyć 3x w PBS po 5 min każde płukanie i dodawać kroplami 150 µL płynu wywołującego barwę DAB. Obserwować stopień barwienia pod mikroskopem, aż próbka stanie się brunatno-żółta, widoczna nawet gołym okiem.
    4. Natychmiast wypłukać w PBS przez 10 min. Ponownie zabarwić hematoksyliną, odwodnić w alkoholach gradientowych, uczynić preparaty przezroczystymi w ksylenie i zamknąć neutralną gumą.
  6. Analiza statystyczna
    1. Skrawki barwione immunohistochemicznie z pozytywną ekspresją powiązanego białka są żółte lub brunatno-żółte. Oceń intensywność pozytywnej ekspresji za pomocą oprogramowania Image J dla każdej grupy skrawków immunohistochemicznych, stosując kryteria oceny średniej gęstości optycznej (AOD), obliczanej jako IOD podzielone przez powierzchnię.
    2. Do analizy statystycznej wykorzystać oprogramowanie analityczne. Zastosować test t, jeśli dane były zgodne z rozkładem normalnym, oraz test chi-kwadrat i testy nieparametryczne, jeśli nie były zgodne z rozkładem normalnym. Dane z pomiarów powtarzanych analizować za pomocą uogólnionych równań estymacyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Testy zachowań bólowych
Wyniki MWT wykazały, że MWT prawej tylnej kończyny po modelowaniu było istotnie niższe niż przed (p<0.05). W porównaniu z grupą kontrolną, MWT szczurów uległo istotnemu podwyższeniu po zastosowaniu metody Tuina (p<0.05; Rycina 5 oraz Tabela 2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badanie to dostarcza protokołu manipulacji Tuina na szczurach KOA. Poprzez testy zachowania bólu i wyniki histomorfologiczne zasugerowały, że taka seria manipulacji Tuina zastosowana u szczurów KOA może zmniejszyć stan zapalny błony maziowej i apoptozę chrząstki, co może być odniesieniem do manipulacji Tuina na zwierzęcych modelach KOA.

Podczas trwania protokołu istnieje kilka krytycznych procedur. Po pierwsze, ważne jest, aby wybrać odpowiednią metodę indukcji modelu KOA. Istnieją różne metod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Shanghai Critical Clinical Specialties Construction Project (Numer grantu: Shslczdzk04001); program żeglarski Szanghajskiej Komisji Nauki i Technologii (numer grantu: 22YF1444300); Projekty w ramach budżetu Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Szanghaju (numer grantu: 2021LK091).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
etanol absolutnySupelcoPHR1070Do wytwarzania próbki
Aparatura pomiarowa ALMEMOAHLBORN2450-1Do testu mechanicznego progu wycofania
Przeciwciało anty-digoksynoweSigma-AldrichSAB4200669Do barwienia HE IHC lub TUNEL
Anti-IL-1beta abcamab283818Do barwienia HE IHC lub TUNEL
DAB Zestaw substratówSolarbioDA1010Do bejcy HE IHC lub TUNEL
Materiały bazowe do protezShanghai New Century 20000356Do modelarstwa
eozynybioswamp PAB180016 Do barwienia HE IHC lub TUNEL
Zapisy nacisku palcaSuzhou Changxian Technologia optoelektronicznaCX1003wDo manipulacji Tuina
roztwór kwasu mrówkowegoSigma-Aldrich695076Do odwapnienia
H2O2Sigma-Aldrich386790-MDo barwienia HE IHC lub TUNEL
biobagno hematoksyliny PAB180015Do barwie HE IHC lub TUNEL
IsofluraneShanghai Yuyan Scientific Instrument CompanyS10010533Do znieczulenia gazowego
żywice neutralnebioswamp PAB180017Do barwienia HE IHC lub TUNEL
Paraformaldehyd Fix SolutionSigma-Aldrich100496Do histologii
PBSSigma-AldrichP3813Do barwienia HE IHC lub TUNEL
Aparatura do badania podeszwyIITC Nauki przyrodnicze/Do badania opóźnienia wycofania łapy
gips z bandaża paryskiegoWANDE 20150023Do modelarstwa
Proteinaza KSigma-Aldrich124568Do barwienia HE IHC lub TUNEL
TNF Alfa Przeciwciało monoklonalneProteintech60291-1-IgDo barwienia HE IHC lub TUNEL
TUNEL ServicebioGDP1042Do bejcy HE IHC lub TUNEL
WoskSigma-Aldrich327204Do wykonania próbki
ksylenuShanghai Sinopharm Group100092Do wykonania próbki

Bibliografia

  1. Joint Surgery Group of Chinese Orthopaedic Association, Chinese Association of Orthopaedic Surgeons, National Clinical Research Center for Geriatric Diseases, Chinese Journal of Orthopaedics. Chinese Osteoarthritis Treatment Guidelines (2021 Edition). Chinese Journal of Orthopaedics. 41 (18), 24(2021).
  2. David, S., et al. Epidemiology of knee osteoarthritis in general practice: a registry-based study. BMJ Open. 10 (1), 031734(2020).
  3. Callahan, L. F., Cleveland, R. J., Allen, K. D., Golightly, Y. Racial/Ethnic, Socioeconomic, and Geographic Disparities in the Epidemiology of Knee and Hip Osteoarthritis. Rheumatic Disease Clinics of North America. 47 (1), 1-20 (2021).
  4. Wang, K., Dong, X., Lin, J. H. Investigation of Medical Costs of Disease In Patients With Osteoarthritis of the Knee Joint. National Medical Journal of China. 97 (1), 4(2017).
  5. Perlman, A., et al. Efficacy and Safety of Massage for Osteoarthritis of the Knee: a Randomized Clinical Trial. Journal of General Internal Medicine. 34 (3), 379-386 (2019).
  6. Xing, H., et al. Therapeutic massage for knee osteoarthritis: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of Acupuncture and Tuina Science. 19 (5), 354-363 (2021).
  7. Seo, B. R., et al. Skeletal muscle regeneration with robotic actuation-mediated clearance of neutrophils. Science translational medicine. 13 (614), (2021).
  8. Wu, J. H., Zhang, C., Dong, S. J., Yin, H. Effects of Massage with #34;Relaxing Tendons" Technique on the Interleukin-1B and 5-hydroxytryptamine Levels in the Joint Fluid of a Rabbit Knee Osteoarthritis Model. Chinese General Practice. 21 (6), 688-693 (2018).
  9. Luo, R. The effects of IL-1B,IL-6,IL-13,IL-26,TNF-a by patellar manipulations on rabbit knee osteoarthritis model. Guangxi University of Traditional Chinese Medicine. , (2017).
  10. Qiu, F., Li, C., Wu, X., Liu, Y., Zhang, X. Effect of Massage on the Function of Foot-Yangming Meridian-Muscle in Patients with Knee Osteoarthritis. Acta Chinese Medicine. 36 (3), 649-655 (2021).
  11. Yang, B., Li, S. Research Progress of Massage in Improving Biomechanical Indexes of Knee Osteoarthritis. Acta Chinese Medicine. 37 (12), 2571-2576 (2022).
  12. Li, C., Qiu, F., Ding, J., Hu, G., Zhang, X. Curative Observation of Retaining of Heated Needle at Trigger Points Combined with Manipulation for Muscles along Meridians in Treating Knee Osteoarthritis. Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine. 37 (11), 2157-2162 (2020).
  13. Ding, X., Zhang, X., Hou, Y., Zhao, Z., Ye, X. Effect of massage manipulation on joint stiffness of knee osteoarthritis patients based on "spine-pelvis-knee" holistic diagnosis and treatment pattern. Shanghai Journal of Traditional Chinese Medicine. 55 (08), 54-57 (2021).
  14. Fu, Y., Gong, L., Li, Y. The clinical studies of Rolling combined with Pulling Manipulation on Early and Middle-term. Jilin Journal of Chinese Medicine. 40 (07), 958-962 (2020).
  15. Jiang, J., Hu, X., Tang, R., Qiu, F., Huang, L. Change of lower limb force line in treating knee osteoarthritis with manipulation. Journal of Changchun University of Chinese Medicine. 34 (01), 129-132 (2018).
  16. Liang, Y., et al. Some issues on animal experiments standardization of acupuncture and moxibustion. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research. 25 (09), 2299-2300 (2014).
  17. Guo, Y., Liu, Y., Liu, Q., Chen, Z., Zhao, X. Basic System of Chinese Acupuncture Standard. Chinese Acupuncture & Moxibustion. 31 (6), 549-550 (2011).
  18. YAN, X., Yan, J. Study on the Standardization of Classification of Tuina Manipulation. Acta Chinese Medicine. 32 (5), 875-878 (2017).
  19. Aikebaier, G., Lu, X., Liu, J., Liu, l, Wang, S. Analysis on Manipulation and Acupoint Selection Laws of Massage for Treatment of Knee Osteoarthritis Based on Data Mining Technology. Chinese Journal of Information on Traditional Chinese Medicine. 29 (5), 23-29 (2022).
  20. Gong, L., Wuquan, S., Zhang, H., Chen, Z. Research of Yan Juntao's Academic Experiences of Differential Treatment and Manipulation for Treating of Knee Osteoarthritis. Chinese Journal of Traditional Medical Traumatology & Orthopedics. 24 (7), 16-19 (2016).
  21. Qian, J., Xing, X., Liang, J. Two Methods to Establish Rat Model of Osteoarthritis of the Knee. Research and Exploration in Laboratory. 33 (11), 23-27 (2014).
  22. Liu, J., et al. Experimental study of a modified Videman method for replicating knee osteoarthritis on rabbit. Rehabilitation Medicine. 30 (03), 212-219 (2020).
  23. Moskowitz, R. W. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 1-2 (2005).
  24. Shen, M., Li, Z., Shen, J. Preliminary Exploration of Experiment Teaching on Experiment Acupuncture Science. Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 7 (02), 130-131 (2009).
  25. Jeong, J., et al. Anti-osteoarthritic effects of ChondroT in a rat model of collagenase-induced osteoarthritis. BMC complementary and alternative medicine. 18 (1), 131(2018).
  26. Hulth, A., Lindberg, L., Telhag, H. Experimental osteoarthritis in rabbits. Preliminary report. Acta orthopaedica Scandinavica. 41 (5), 522-530 (1970).
  27. Tawonsawatruk, T., Sriwatananukulkit, O., Himakhun, W., Hemstapat, W. Comparison of pain behaviour and osteoarthritis progression between anterior cruciate ligament transection and osteochondral injury in rat models. Bone & Joint Research. 7 (3), 244-251 (2018).
  28. Zhou, Q., et al. Cartilage matrix changes in contralateral mobile knees in a rabbit model of osteoarthritis induced by immobilization. BMC musculoskeletal disorders. 16, 224(2015).
  29. Zeng, J., et al. Establishment and identification of experimental rabbit model of knee osteoarthritis. Chinese Journal of Clinical Research. 29 (5), 679-682 (2016).
  30. Shang, P., et al. Comparison with two kind osteoarthritis animal models reduced by plaster immobilization in extend excessive position and bend excessive position respectively. Orthopaedic Biomechanics Materials and Clinical Study. (1), 11-14 (2006).
  31. He, Y., et al. Evaluation of the effect of improved cast immobilization method on rabbit knee osteoarthritis model. Chinese Imaging Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 18 (2), 198-219 (2020).
  32. Pengfei, S., et al. Possible mechanism underlying analgesic effect of Tuina in rats may involve piezo mechanosensitive channels within dorsal root ganglia axon. Journal of Traditional Chinese Medicine. 38 (6), 834-841 (2018).
  33. Wang, Y. Mechanisms of Massage Mediating Chondrocyte Apoptosis in Knee Osteoarthritis Through Piezo 1/JAK2 Signaling Pathway. Shandong University of Traditional Chinese Medicine. , (2019).
  34. Liu, J. Effect of Massage on TLR4/MyD88 Signal Transduction Pathway in Rat Knee Osteoarthritis Model. Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine. , (2019).
  35. Yu, S., Zhou, J., Pang, X. Advances in induced animal models of knee osteoarthritis. Journal of Guangxi University of Chinese Medicine. 25 (5), 50-55 (2022).
  36. Tan, Q., et al. Acupuncture combined with moxibustion regulates the expression of circadian clock protein in the synovium of rats with osteoarthritis. Chinese Journal of Tissue Engineering Research. 26 (11), 1714-1719 (2022).
  37. Zhang, Z., et al. A Review of Massage Therapy for Knee Osteoarthritis. Henan Traditional Chinese Medicine. 39 (1), 146-149 (2019).
  38. Gong, L., Sun, W., Zhang, H., Chen, Z. Research of Yan Juntao's Academic Experiences of Differential Treatment and Manipulation for Treating of Knee Osteoarthritis. Chinese Journal of Traditional Medical Traumatology & Orthopedics. 24 (7), 16-19 (2016).
  39. Chen, C., Zhang, H. Research on the rules of acupoint selection for the treatment of knee osteoarthritis with massage based on data mining. Hainan Medical Journal. 29 (18), 2617-2619 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zapalenie błony maziowejtest zachowań bólowychlokalizacja punktów akupunkturowychapoptoza chondrocytówmechaniczna transdukcja sygnałumetoda uciskania i ugniataniaunieruchomienie szczura
Manipulacja Tuina w celu zmniejszenia stanu zapalnego i utraty chrząstki u szczurów z chorobą zwyrodnieniową stawu kolanowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.