Celem tego manuskryptu jest zbadanie zastosowania testu na pośrednie przeciwciała fluorescencyjne przeciwko wściekliźnie do wykrywania przeciwciał IgG i IgM specyficznych dla wścieklizny.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie przeciwciał IgG i IgM przeciwko wściekliźnie za pomocą pośredniego testu fluorescencyjnego na przeciwciała przeciwko wściekliźnie
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Test na pośrednie przeciwciała fluorescencyjne przeciwko wściekliźnie (IFA) został opracowany do wykrywania różnych izotypów przeciwciał specyficznych dla wścieklizny w surowicy lub płynie mózgowo-rdzeniowym. Ten test zapewnia szybkie wyniki i może być stosowany do wykrywania przeciwciał przeciwko wściekliźnie w kilku różnych scenariuszach. Test IFA na wściekliznę jest szczególnie przydatny do szybkiego i wczesnego wykrywania przeciwciał w celu oceny odpowiedzi immunologicznej u pacjenta, u którego rozwinęła się wścieklizna. Chociaż inne metody diagnozowania wścieklizny antemortem mają pierwszeństwo, test ten może być wykorzystany do wykazania niedawnej ekspozycji na wirusa wścieklizny poprzez wykrywanie przeciwciał. Test IFA nie zapewnia miana przeciwciał neutralizujących wirusa (VNA), ale odpowiedź profilaktyki przedekspozycyjnej (PrEP) można ocenić na podstawie dodatniej lub ujemnej obecności przeciwciał. Ten test może być wykorzystywany w różnych sytuacjach i może dostarczyć wyników dla wielu różnych celów. W tym badaniu wykorzystaliśmy kilka sparowanych próbek surowicy od osób, które otrzymały PrEP i wykazały obecność przeciwciał przeciwko wściekliźnie w czasie za pomocą testu IFA.
Wprowadzenie
Test na pośrednie przeciwciała fluorescencyjne przeciwko wściekliźnie (IFA) służy do wykrywania różnych izotypów przeciwciał specyficznych dla wścieklizny w surowicach lub płynie mózgowo-rdzeniowym. Jest to jeden z arsenału dostępnych testów do monitorowania pacjenta z wścieklizną antemortem. Jest to szczególnie przydatne do wczesnego wykrywania przeciwciał w celu oceny odpowiedzi immunologicznej pacjenta na zakażenie wścieklizną. W połączeniu z innymi testami, historią przypadku i statusem szczepienia pacjenta, test IFA może pomóc w określeniu narażenia na wirusa wścieklizny lub szczepionkę1. Ponieważ test IFA mierzy IgM i/lub IgG, wartości swoistego przeciwciała mogą wskazywać przybliżone ramy czasowe od ekspozycji na antygen1. Ten test może być przydatny w wymienionych aplikacjach lub innych, które nie zostały jeszcze zbadane.
Dostępnych jest kilka testów serologicznych na wściekliznę. Szybki test hamowania ogniska fluorescencyjnego (RFFIT), test neutralizacji wirusa przeciwciał fluorescencyjnych (FAVN) lub ich modyfikacje są podstawowymi metodami pomiaru przeciwciał neutralizujących wirusa wścieklizny (RVNA)1. Jednak testy te nie różnicują przeciwciał IgM i IgG. Gdy różnicowanie izotypu przeciwciał jest ważne w monitorowaniu odpowiedzi immunologicznej wścieklizny, stosuje się testy IFA przeciwko wściekliźnie i test immunoenzymatyczny (ELISA) przeciwko wściekliźnie, ale nie mierzą one RVNA. Chociaż testy IFA i ELISA mogą być stosowane do określania obecności przeciwciał specyficznych dla wścieklizny w próbce, istnieją pewne różnice w sposobie ich wykonywania. Test IFA wykorzystuje żywego wirusa z hodowli komórkowej jako substrat antygenu, podczas gdy typowy test ELISA do wykrywania wścieklizny wykorzystuje jedno lub więcej białek wirusowych. W warunkach laboratoryjnych, w których można hodować wirusa wścieklizny, test IFA może być łatwiejszy do wykonania zamiast kupowania lub hodowli pojedynczych białek wirusowych do testu ELISA. Cel badania i informacje uzyskane na podstawie wyników wszelkich testów serologicznych na wściekliznę powinny być brane pod uwagę przy określaniu, który z nich wybrać2.
IgM jest pierwszym, który odpowiada, zwiększając się aż do momentu zaobserwowania zmiany klasy około 28 dnia, kiedy to IgG staje się dominującym krążącym przeciwciałem3. W związku z tym IgM można się spodziewać tylko przez ograniczony czas po ekspozycji na wirusa wścieklizny lub szczepieniu. Badanie zarówno surowicy, jak i płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) może wskazać, czy narażenie nastąpiło poprzez szczepienie, w którym przeciwciała byłyby widoczne tylko w surowicach, czy też z infekcji wirusowej, która potencjalnie wykazałaby przeciwciała w klasie CSF1.
Ustalono, że przeciwciała przeciwko wściekliźnie utrzymują się przez kilka lat po profilaktyce przedekspozycyjnej (PrEP)4. Test IFA może być użytecznym narzędziem do wykazania tego w różnych punktach czasowych po szczepieniu lub ekspozycji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Następujący protokół został zatwierdzony do etycznego wykorzystania próbek ludzkich przez New York State Department of Health Wadsworth Center do rozwoju testów, numer zatwierdzenia protokołu #03-019.
1. Bezpieczeństwo
- Załóż środki ochrony osobistej (PPE), minimalną ochronę oczu (okulary lub osłona twarzy), maskę chirurgiczną i rękawice nielateksowe.
- Upewnij się, że personel jest zaszczepiony przeciwko wściekliźnie i że w ciągu ostatnich 6 miesięcy wykazano miano ≥0,5 j.m./ml.
2. Przygotowanie preparatu antygenowego
UWAGA: Wykonuj wszystkie manipulacje wirusami, płynem mózgowo-rdzeniowym i surowicą w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC) stosując uniwersalne środki ostrożności.
- Przygotuj 20 ml mysich komórek neuroblastoma lub BHK-21 o stężeniu 3,0 x 105 komórek/ml w minimalnej pożywce Eagle uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (EGM) i trzymaj w chłodzie do momentu użycia.
- Przygotować wirusa CVS-11 przez rozcieńczenie w EGM do roboczego rozcieńczenia 1,0 x 106,5 50% dawki zakaźnej kultury tkankowej (TCID50) na mililitr i przechowywać w chłodzie, aż będzie gotowy do użycia.
UWAGA: TCID50 jest określany za pomocą metody Reeda i Muencha opublikowanej wcześniej5. - Wyczyść komorę szkiełka wilgotnościowego i szkiełka mikroskopowe pokryte politetrafluoroetylenem (PTFE) 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w BSC.
- Dodaj wodę destylowaną (dH2O) do pasków papieru chłonnego w komorze szkiełkowej, aby zapewnić stałą wilgotność przez cały czas trwania zabiegu.
- Za pomocą ołówka oznacz każde szkiełko numerem partii, datą, typem komórki i wszelkimi innymi informacjami identyfikacyjnymi wymaganymi do przechowywania, a następnie umieść w komorze na szkiełka.
UWAGA: Większość markerów, pisaków lub etykiet nie wytrzyma przyszłego etapu utrwalania acetonu (krok 2.9). - Nanieść 50 μl rozcieńczenia wirusa na każdą studzienkę na szkiełkach mikroskopowych za pomocą powtarzalnej pipety. Następnie nałóż 50 μl rozcieńczenia komórek do każdej studzienki, uważając, aby nie zanieczyścić końcówki pipety wirusem znajdującym się już na studzience.
- Zamknąć komorę szkiełka wilgotnościowego i umieścić ją w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 34-36 °C. Ocenić zakaźność komórek po 24 godzinach
UWAGA: Kroki 2.8-2.12 należy wykonać tylko na jednym slajdzie. - Wyjmij szkiełko z komory wilgotnościowej i ostrożnie zassaj supernatant. Umyj szkiełko w słoiku z kopliny wypełnionym solą fizjologiczną (PBS) przez 2 minuty, a następnie pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu.
- Umieść szkiełko w słoiku Coplin i zamocuj je w zimnym acetonie na co najmniej 1 godzinę w zamrażarce o temperaturze -20 °C dopuszczonej do materiałów łatwopalnych. Wszystkie procedury nalewania acetonu i suszenia na powietrzu należy wykonywać w dygestorium.
- Pozwól acetonowi odparować i przesuń do wyschnięcia. Bezpośredni koniugat fluorescencyjny (DFA) przeciwko wściekliźnie (DFA) przygotowany zgodnie z instrukcjami producenta należy nałożyć do dołków szkiełka i inkubować przez 30 minut w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 34-36 °C.
- Umyj szkiełko w słoikach Coplin PBS dwa razy po 2 minuty każdy. Wysuszyć szkiełko na powietrzu.
- Zamontuj szkiełko nakrywkowe z 0,05 M Tris, 0,15 M NaCl (pH 9,0) i 20% mocowaniem glicerolu i odczytaj szkiełko za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy 200-krotnym powiększeniu, aby ocenić zakaźność. Jeśli komórki nie są zainfekowane w około 50%, powtórz kroki 2.7-2.12 następnego dnia, aż do osiągnięcia pożądanej zakaźności.
UWAGA: Zakaźność komórek jest przybliżona na podstawie wizualnej oceny stosunku komórek ujemnych do komórek dodatnich przeciwko wściekliźnie na szkiełku. Komórki ujemne mają kolor czerwony, podczas gdy komórki dodatnie mają zielone barwienie fluorescencyjne. - Wyjmij pozostałe szkiełka z inkubatora i komory wilgotnościowej. Ostrożnie odessać supernatant z każdej studzienki, a następnie umieścić szkiełka w słoiku (słoikach) z Coplin z PBS na 1-2 minuty. Suszyć szkiełka na powietrzu przez około 30 minut. Przechowywać szkiełka w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będą gotowe do użycia.
3. Przygotowanie próbki
- Przygotować rozcieńczenia surowicy pacjenta lub próbki płynu mózgowo-rdzeniowego do badania. Przygotować koniugat niezbędny do uzyskania właściwego stężenia roboczego rozcieńczony w PBS 0,05% błękitem Evansa.
UWAGA: Trzymaj koniugat w ciemności, aby zachować integralność fluoroforu przed aplikacją
4. Procedura IFA
- Wyjąć niezbędną liczbę przygotowanych szkiełek antygenowych potrzebnych do każdego testu i pozostawić szkiełka do całkowitego rozmrożenia i wyschnięcia.
- Umieść szkiełka w słoiku (słoikach) Coplin i zamocuj je w zimnym acetonie na okres od 2 godzin do nocy w zamrażarce o temperaturze -20 °C dopuszczonej do materiałów łatwopalnych. Wyjmij szkiełka z acetonu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
- Umieść szkiełka w komorze wilgotnościowej wewnątrz BSC z paskami chłonnymi nasączonymi dH2O, aby utrzymać wilgotność. Nanieść 50 μl każdej próbki rozcieńczonej lub próbki kontrolnej lub PBS do wcześniej ustalonego dołka.
UWAGA: Każdy szkiełko musi zawierać odpowiednią liczbę studzienek na próbki pacjenta, kontrolę pozytywną, kontrolę ujemną i studzienkę kontrolną komórek PBS. - Umieścić zamkniętą komorę szkiełkową wilgotności w inkubatorze o temperaturze 37 °C, wilgotności 5% CO2 . Inkubować szkiełka przez 30 minut, a następnie wyjąć komorę szkiełka wilgotnościowego z inkubatora i umieścić ją w BSC.
- Użyj końcówki aspiratora, aby ostrożnie zassać supernatant z każdej studzienki, upewniając się, że nie naruszysz monowarstwy komórek. Użyj sterylnej pipety z zakraplaczem, aby nanieść jedną kroplę PBS na każdą studzienkę.
- Powtórz staranne aspirację, a następnie umieść każde szkiełko w słoiku z koplinu wypełnionym PBS i umyj dwukrotnie, łącznie przez 15 minut.
- Umieścić szkiełka z powrotem w komorze wilgotnościowej i nałożyć 50 μl odpowiedniego koniugatu przeciwciał antyludzkich do każdej studzienki. Powtórz kroki od 4.4 do 4.6.
- Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu, zamontuj szkiełko nakrywkowe z nośnikiem montażowym i odczytaj szkiełka pod mikroskopem fluorescencyjnym.
5. Analiza slajdów
- Klasyfikacja próbek na podstawie wzoru barwienia i intensywności fluorescencji w porównaniu z dodatnimi próbkami kontrolnymi z potwierdzonym wysokim mianem przeciwciał przeciwko wściekliźnie.
- Oceń próbki w skali negatywnej, 1+, 2+, 3+ i 4+, przy czym wynik ujemny nie wykazuje barwienia fluorescencyjnego, a 4+ oznacza fluorescencję koloru jasnozielonego jabłka ze wzorem barwienia podobnym do pozytywnych próbek kontrolnych1.
UWAGA: Kolor zielonego jabłka dotyczy tylko przeciwciał znakowanych FITC; Kolor różni się w zależności od wyboru fluoroforu. - Przypisz próbkom wartość punktu końcowego reprezentowaną przez współczynnik rozcieńczenia, przy którym próbka wykazuje stopień 1-2+. Badać próbki przy wyższym współczynniku rozcieńczenia, jeżeli punkt końcowy nie został osiągnięty w próbie początkowej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wszystkie próbki surowicy pobrano od pacjentów w podobnych odstępach czasu po zastosowaniu PrEP. Próbki od pięciu różnych pacjentów badano w następujących punktach czasowych: 2 tygodnie po ostatniej inokulacji szczepionką przeciwko wściekliźnie, 6 miesięcy po serii szczepień przeciwko wściekliźnie oraz 18 miesięcy po serii szczepień przeciwko wściekliźnie. Każdą próbkę surowicy rozcieńczano seryjnie i oceniano pod kątem obecności przeciwciał IgM oraz IgG, zgodnie z opisem w krokach protokołu 5.2 i 5.3. Przypisana wartość...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Test IFA wykorzystuje kompleks antygen-przeciwciało, co pozwala na wizualizację przeciwciał specyficznych dla wścieklizny w miejscu znakowania. Komórki nerwiaka zarodkowego lub BHK są wysiewane na wielodołkowych szkiełkach mikroskopowych pokrytych PTFE i zaszczepiane szczepem laboratoryjnym CVS-11 wirusa wścieklizny. Gdy monowarstwa zlewa się, a komórki osiągną pożądaną zakaźność około 50%, szkiełka są przechowywane do momentu przygotowania do użycia6.
Surowicę pacjenta...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni Centrum Wadsworth Departamentu Zdrowia Stanu Nowy Jork za wsparcie tego projektu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szkiełka nakrywkowe szklane 25x55mm | Dowolny | ||
| aceton | Dowolna | ||
| IgG Znakowana anty-ludzka IgG Sprzęgany | Sigma-Aldrich | F9512 | |
| Anty-Human IgM znakowany Koniugat | SeraCare | 5230-0286 | |
| Zasysająca końcówka do pipety | Dowolna | ||
| komórka BHK-21 | ATCC | CCL-10 | |
| BION IFA Rozcieńczalnik | MBL BION | DIL-9993 | |
| Woda do hodowli komórkowych | Sigma-Aldrich | W3500 | EGM |
| Słoiki z kopliną | Dowolna | ||
| płodowa surowica bydlęca | Sigma-Aldrich | F2442 | EGM |
| Mikroskop fluorescencyjny z filtrem FITC | Dowolna | ||
| glicerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| Odczynnik do inaktywacji IgM Gullsorb | Mountant Fisher Scientific | 23-043-158 | Odczynnik do inaktywacji IgG |
| L-Glutamina | Sigma-Aldrich | G-7513 | EGM |
| Minimum Essential Media Eagle – w/Earle' s sole, L-glutamina i aminokwasy endogenne, bez wodorowęglanu sodu | Sigma-Aldrich | M0643 | EGM |
| Mysie komórki nerwiaka zarodkowego | ATCC | CCL-131 | |
| Wielodołkowe szkiełka szklane z powłoką PTFE | Dowolne | ||
| PBS | Dowolne | pH 7,6 | |
| Penicylina | Sigma | P-3032 | EGM |
| Wścieklizna Bezpośredni koniugat przeciwciał fluorescencyjnych | Millipore Sigma | 5100, 5500, 6500, RU5100 lub RU5500 | |
| Wodorowęglan sodu | Sigma-Aldrich | S-5761 | EGM |
| Kryształy chlorku sodu | Sigma-Aldrich | S5886 | Mountant |
| Sterylny zakraplacz | Dowolny | ||
| Sól siarczanu streptomycyny | Sigma | S9137 | EGM |
| Wstępnie ustawione kryształy Trizma pH 9,0 | Sigma-Aldrich | S9693 | Mocowanie |
| Bulion z fosforanu tryptozy | BD | 260300 | EGM |
| Mieszanka witamin | Sigma-Aldrich | M6895 | EGM |
Bibliografia
- Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1. World Health Organization. , Geneva. 232-245 (2018).
- Moore, S. M. Challenges of rabies serology: defining context of interpretation. Viruses. 13 (8), 1516(2021).
- Zajac, M. D. Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera. Viruses. , 40-49 (2019).
- Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis. Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).
- Fooks, A. R., Jackson, A. C. Rabies: scientific basis of the disease and its management. , Academic Press. (2020).
- Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).
- Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).
- Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. Immunological aspects of rabies: a literature review. Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).
- Moore, S. M., Hanlon, C. A. Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595(2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
