Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie chromatyny locus genu z pojedynczą kopią u Saccharomyces cerevisiae

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65460

⸱

17 listopada 2023

 , 
1Institute of Epigenetics and Stem Cells, Helmholtz Zentrum München

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia metodę izolacji chromatyny specyficzną dla locus, opartą na rekombinacji specyficznej dla miejsca, w celu oczyszczenia interesującego miejsca pojedynczej kopii genu w jego natywnym kontekście chromatyny z pączkujących drożdży, Saccharomyces cerevisiae.

Streszczenie

Podstawową jednostką organizacyjną eukariotycznej chromatyny jest cząstka rdzenia nukleosomu (NCP), która składa się z DNA owiniętego ~1,7 razy wokół oktameru histonu. Chromatyna jest definiowana jako jednostka NCP i wielu innych kompleksów białkowych, w tym czynników transkrypcyjnych, enzymów przebudowujących chromatynę i modyfikujących ją. Nadal nie jest jasne, w jaki sposób te interakcje białko-DNA są organizowane na poziomie określonych loci genomowych na różnych etapach cyklu komórkowego. Wynika to przede wszystkim z obecnych ograniczeń technicznych, które utrudniają uzyskanie precyzyjnych pomiarów takich oddziaływań dynamicznych. W tym miejscu opisujemy ulepszoną metodę łączącą rekombinację specyficzną dla miejsca z wydajnym jednoetapowym protokołem oczyszczania powinowactwa w celu wyizolowania interesującego pojedynczej kopii genu w jego natywnym stanie chromatyny. Metoda ta pozwala na solidne wzbogacenie locus docelowego w stosunku do chromatyny genomowej, dzięki czemu technika ta jest skuteczną strategią identyfikacji i ilościowego określania interakcji białek w sposób bezstronny i systematyczny, na przykład za pomocą spektrometrii mas. W nawiązaniu do takich analiz składowych, natywna chromatyna oczyszczona tą metodą prawdopodobnie odzwierciedla sytuację in vivo dotyczącą pozycjonowania nukleosomów i modyfikacji histonów, a zatem jest podatna na dalsze analizy strukturalne i biochemiczne chromatyny pochodzącej z praktycznie dowolnego locus genomowego drożdży.

Wprowadzenie

Dynamiczna organizacja genomów eukariotycznych w chromatynę zagęszcza DNA tak, aby mieściło się w granicach jądra, zapewniając jednocześnie wystarczającą dynamikę dla ekspresji genów i dostępność dla czynników regulacyjnych. Częściowo ta wszechstronność jest pośredniczona przez nukleosom, podstawową jednostkę chromatyny, która składa się z cząstki rdzenia ze 147 pz DNA owiniętego ~1,7 razy wokół oktameru histonu1. Nukleosom jest strukturą wysoce dynamiczną pod względem składu, z licznymi wariantami histonów i modyfikacjami potranslacyjnymi (PTM) na N- i C-końcowych ogonach histonowych. Ponadto chromatyna eukariotyczna oddziałuje z wieloma innymi istotnymi składnikami, takimi jak czynniki transkrypcyjne, maszyneria przetwarzania DNA i RNA, białka architektoniczne, enzymy biorące udział w przebudowie i modyfikacji chromatyny oraz cząsteczki RNA związane z chromatyną. Te kluczowe mechanizmy zaangażowane w transkrypcję, replikację i naprawę wymagają dostępu do chromatyny, która służy jako naturalny substrat dla tych procesów. W związku z tym zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tych transakcji DNA wymaga precyzyjnego zdefiniowania zbiorowych zmian w strukturze chromatyny w określonych regionach genomu, w których zbiegają się te mechanizmy i ułatwiają reakcje biologiczne.

Pomimo identyfikacji wielu czynników chromatyny poprzez genetykę i badania interakcji białko-białko, przeprowadzanie bezpośrednich, bezstronnych i kompleksowych analiz interakcji chromatyny w poszczególnych miejscach genomowych pozostało istotną przeszkodą2,3. Początkowo można było wyizolować tylko bardzo liczne regiony genomu (tj. powtarzające się loci) lub plazmidy z wieloma kopiami w wystarczających ilościach i czystości do identyfikacji powiązanych białek metodą spektrometrii mas4,5,6,7. Szereg nowych podejść opartych na bezpośredniej hybrydyzacji sond wychwytujących z chromatyzowanym DNA, biotynylacji zbliżeniowej przy użyciu systemu CRISPR-dCas9 lub wiązaniu specyficznych dla sekwencji białek adapterowych z miejscem zainteresowania zaczęło odkrywać proteom loci pojedynczej kopii z genomów drożdży i ssaków8,9,10. Jednak wszystkie te metody wymagają sieciowania formaldehydu w celu ustabilizowania interakcji białko-DNA i sonikacji w celu rozpuszczenia chromatyny w celu późniejszego oczyszczenia. Obie manipulacje łącznie wykluczają możliwość późniejszych badań strukturalnych i funkcjonalnych oczyszczonej chromatyny.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, wcześniej opracowaliśmy metodologię, która wykorzystuje rekombinację specyficzną dla miejsca do ekstrakcji docelowych domen chromosomowych z drożdży11,12. W istocie, interesujący region genomowy jest otoczony miejscami rozpoznawania (RS) dla specyficznej dla miejsca R-rekombinazy z Zygosaccharomyces rouxi, jednocześnie włączając grupę trzech miejsc wiązania DNA dla prokariotycznego białka represora transkrypcji LexA (LexA) w tym samym regionie. Komórki drożdży zawierają kasetę ekspresyjną do jednoczesnej ekspresji R-rekombinazy i białka LexA połączonego ze znacznikiem tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP). Po indukcji R-rekombinazy enzym skutecznie wycina docelowy region z chromosomu w postaci kolistej domeny chromatyny. Domena ta może zostać oczyszczona za pomocą białka adapterowego LexA-TAP, które wiąże się z miejscami wiązania DNA LexA, a także ze wsparciem powinowactwa. Metoda ta została ostatnio wykorzystana do wyizolowania odrębnych domen chromatyny zawierających wybrane początki replikacji chromosomu III drożdży13.

Jedną z głównych zalet tego podejścia ex vivo jest to, że pozwala ono na analizę funkcjonalną wyizolowanego materiału. Na przykład domeny początkowe replikacji oczyszczone tą metodą można poddać testom replikacji in vitro w celu oceny skuteczności wypalania w probówce z natywnych matryc chromatyny złożonych in vivo. Ostatecznie charakterystyka biochemiczna i funkcjonalna wyizolowanego materiału może pozwolić na odtworzenie procesów jądrowych przy użyciu oczyszczonych białek wraz z natywną matrycą chromatyny. Podsumowując, metodologia ta otwiera ekscytującą drogę w badaniach nad chromatyną, ponieważ możliwe będzie śledzenie zbiorowych zmian składu i struktury chromatyny w określonym regionie genomu podlegającym określonej transakcji chromosomalnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Szczegóły dotyczące wszystkich materiałów i instrumentów wykorzystanych w tym protokole znajdują się w Tabeli materiałów. Listę użytych roztworów, buforów i pożywek zawiera Tabela 1.

1. Konstrukcja rekombinowanego szczepu drożdży

  1. Aby skonstruować szczep drożdży zdolny do rekombinacji, należy wprowadzić plazmid K238 trawiony enzymem SbfI do szczepu drożdży zintegrowanymi miejscami wiązania LexA i miejscami rekombinacji RS w badanym locus13,14.
    UWAGA: Wprowadzony fragment restrykcyjny SbfI zawiera niezbędną kasetę ekspresyjną do konstytutywnej ekspresji białka fuzyjnego LexA-TAP i rekombinazy R, wraz z sekwencjami homologicznymi do chromosomu I drożdży, co umożliwia integrację kasety ekspresyjnej z genomem poprzez rekombinację homologiczną (Rysunek 1).
  2. Aby skonstruować szczep kontrolny, należy użyć izogennego szczepu drożdży pozbawionego zintegrowanych miejsc RS i miejsc wiązania LexA, a następnie przeprowadzić transformację plazmidem K238 trawionym enzymem SbfI w tych samych warunkach, które zastosowano dla szczepu zdolnego do rekombinacji.
  3. Wyselekcjonować kompetentne komórki drożdży na podłożu agarowym SCD-LEU, wykorzystując marker selekcyjny LEU214.

2. Sprzęganie przeciwciał IgG z magnetycznymi kulkami aktywowanymi grupami epoksydowymi

UWAGA: Przeciwciała IgG należy sprzęgać z magnetycznymi kuleczkami aktywowanymi epoksydowo zgodnie z poniższym opublikowanym protokołem1.

  1. Zawiesić 30 mg kulek aktywowanych grupami epoksydowymi w 10 mL 50% acetonu (30 mg odpowiada ~5,1 × 1010 kulek) w probówce stożkowej o pojemności 50 mL. Energicznie wymieszać na wstrząsarzu vortex.
  2. Wirować probówkę z kulkami przy 820 × g i 4 °C przez 2 min. Usunąć supernatant.
  3. Przemyć kulki 3x przy użyciu 20 mL 0,1 M buforu fosforanowego sodu (pH 7,4). Po każdym etapie mycia usuwać supernatant poprzez wirowanie zgodnie z opisem w punkcie 2.2.
  4. Zawiesić kulki w 16 mL 0,1 M buforu fosforanowego sodu (pH 7,4) i delikatnie obracać w piecu do hybrydyzacji przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  5. Rozpuścić przeciwciała rabbit IgGs (10 mg) w 7 mL dH2O (stężenie końcowe: 14 mg/mL).
  6. Wirować zawiesinę IgG przy 13 0 × g i 4 °C przez 10 min w celu sklarowania zawiesiny.
  7. Przenieść 3,5 mL supernatantu (co odpowiada 50 mg rabbit IgGs) do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mL.
  8. Rozcieńczyć roztwór IgG za pomocą 9,85 mL 0,1 M buforu fosforanowego sodu (pH 7,4), a następnie powoli, kroplami dodać 6,65 mL 3 M siarczanu amonu w 0,1 M buforze fosforanowym sodu (pH 7,4) przy delikatnym mieszaniu.
    UWAGA: Należy unikać szybkiego dodawania siarczanu amonu do roztworu, ponieważ wysokie lokalne stężenie soli spowoduje wytrącenie rabbit IgGs.
  9. Wirować roztwór IgG przy 820 × g i 4 °C przez 3 min, a otrzymany supernatant dodać do zawiesiny kulek magnetycznych.
  10. Inkubować probówkę przez noc lub co najmniej przez 18 h w temperaturze 30 °C przy delikatnym obracaniu w piecu do hybrydyzacji.
  11. Usunąć supernatant zgodnie z opisem w punkcie 2.2.
  12. Przemyć kulki 20 mL 10 mM glicyny-HCl (pH 2,5). Szybko usunąć roztwór zgodnie z opisem w punkcie 2.2, aby uniknąć denaturacji polipeptydów IgG.
  13. Przemyć kulki raz 20 mL 10 mM Tris-HCl (pH 8,8). Odessać supernatant zgodnie z opisem w punkcie 2.2.
  14. Dodać 20 mL 0,1 M roztworu trietyloaminy na 5-10 min przy delikatnym obracaniu w celu inaktywacji pozostałych reaktywnych grup epoksydowych. Usunąć supernatant zgodnie z opisem w punkcie 2.2.
  15. Przemyć kulki 4x 20 mL PBS (pH 7,4) przez 5 min przy delikatnym obracaniu. Po każdym etapie mycia usuwać supernatant zgodnie z opisem w punkcie 2.2.
  16. Przemyć kulki 2x 20 mL PBS (pH 7,4) z 0,5% Triton X-10 (w/v) przez odpowiednio 5 min i 15 min przy delikatnym obracaniu w piecu do hybrydyzacji. Usunąć supernatant zgodnie z opisem w punkcie 2.2.
  17. Zawiesić kulki w końcowej objętości 16 mL PBS (pH 7,4) z 0,02% azotkiem sodu (w/v). Przechowywać w alikwotach po 1 mL w temperaturze 4 °C do czasu użycia.

3. Hodowla i zbieranie komórek drożdży

  1. Zaszczep kontrolne oraz kompetentne do rekombinacji szczepy drożdży z płytek YPD do 5 mL pożywki YPR i inkubuj przez noc w temperaturze 30 °C przy 20 rpm.
  2. Przenieś 2 mL tej kultury do 10 mL pożywki YPR i inkubuj przez noc w temperaturze 30 °C przy 20 rpm.
  3. Dla każdego szczepu odmierz 1 80 mL autoklawowanej pożywki YP oraz 20 mL autoklawowanego roztworu rafinozy (20% w/v) do każdej z dwóch kolb Erlenmeyera o pojemności 5 L (łącznie 4 L pożywki dla każdego szczepu, podzielone na dwie kolby).
  4. Zaszczep rosnące komórki drożdży przy OD60 0,2 w odpowiednich pożywkach i inkubuj zgodnie z opisem w punkcie 3.1 przez około 6 h lub do momentu, aż komórki osiągną pożądaną wartość OD60 wynoszącą 1,0. Aby upewnić się, że komórki rosną prawidłowo i są wolne od zanieczyszczeń, sprawdzaj wartość OD w odstępach 2-godzinnych.
  5. Dodaj 20 mL galaktozy (20% w/v), aby indukować rekombinację specyficzną dla miejsca.
  6. Dodaj 10 µL (50 ng/mL) YMFA (równocześnie z galaktozą, krok 3.5), aby zatrzymać komórki w fazie G1, i inkubuj przez 2 h.
    UWAGA: Dodanie YMFA do komórek zależy od warunków eksperymentalnych i stawianego pytania biologicznego. W tym konkretnym doświadczeniu komórki są zatrzymywane w fazie G1 w celu uzyskania jednorodnej populacji komórek z licencjonowanymi miejscami inicjacji replikacji; w tym procesie kompleks przedreplikacyjny wiąże się z miejscami inicjacji w fazie G1 przed rozpoczęciem replikacji DNA w fazie S.
  7. Przenieś zawiesinę komórkową do wirówek o pojemności 1 L i wiruj przy 6 0 × g w temperaturze 4 °C przez 10 min. Odlej nadsącz, a osady komórkowe resuspenduj w całkowitej objętości 10-15 mL dH2O.
  8. Zamknij strzykawkę o pojemności 25 mL korkiem Luer i umieść ją w probówce stożkowej o pojemności 50 mL wypełnionej wodą. Przenieś zawiesinę komórkową do zestawu ze strzykawką i wiruj przy 2 397 × g przez 10 min w temperaturze pokojowej. Odlej nadsącz.
  9. Wyjmij korek Luer ze strzykawki i wypchnij komórki do ciekłego azotu, aby utworzyć tzw. „spaghetti” komórkowe.
    UWAGA: Użycie 4 L pożywki pozwala na uzyskanie mokrej masy końcowych osadów komórkowych wynoszącej 7-10 g.
  10. Przenieś zamrożone „spaghetti” komórkowe do probówki stożkowej o pojemności 50 mL i przechowuj w temperaturze −80 °C do czasu dalszego użycia.

4. Oczyszczanie locus chromatyny

UWAGA: Schematyczny przegląd etapów objętych tym protokołem specyficznego dla locus oczyszczania chromatyny przedstawiono na Rysunku 2.

  1. Schłodź komercyjny młynek do kawy, mieląc 30–50 g suchego lodu przy energicznym wstrząsaniu młynka dwa razy po 30 s. Po schłodzeniu usunąć proszek z suchego lodu.
  2. Wymieszaj 3 g zamrożonych komórek drożdży (tzw. spaghetti) z około 30–50 g suchego lodu w schłodzonym młynku do kawy.
  3. Uszczelnić połączenie między nakrętką a młynkiem za pomocą parafilmu, aby zapobiec utracie proszku z komórek drożdży podczas mielenia.
  4. Miel mieszaninę komórek drożdży z suchym lodem 10 razy po 30 s każdorazowo, stosując 30-sekundowe przerwy między kolejnymi cyklami (szacowany czas całkowity: ~10 min). Aby zapobiec przywieraniu suchego lodu i proszku komórkowego do ścianek młynka do kawy, należy nieustannie opukiwać boki urządzenia podczas mielenia.
  5. Przenieś otrzymany proszek z komórek drożdżowych i suchego lodu do plastikowego zlewki, używając czystej i suchej szpatułki.
  6. Pozostawić zlewki w temperaturze pokojowej, aby odparować suchy lód.
  7. Po odparowaniu suchego lodu należy dodać 2,25 ml buforu MB z 1x inhibitorami proteaz i fosfataz (750 µL/g komórek drożdży) do proszku z komórek drożdży.
  8. Intensywnie pipetować mieszaninę komórek z buforem, aby zapewnić całkowite zawieszenie komórek w buforze, a następnie przenieść do 15 ml probówki stożkowej.
  9. Pobrać próbki do analizy DNA (0,1%) i białek (0,05%) z otrzymanej zawiesiny komórkowej (surowe ekstrakty komórkowe [CCE]). Przechowywać w temperaturze −20 °C do czasu dalszej obróbki (opisanej w sekcji 7).
  10. Przenieść zawiesinę komórkową do probówek reakcyjnych o pojemności 2 ml o niskim stopniu wiązania i odwirować z prędkością 21 130 × g przez 30 min w temperaturze 4 °C w celu oddzielenia szczątków komórkowych od surowego lizatu komórkowego.
  11. Zlać nadnadkliny ze wszystkich probówek do jednej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  12. Pobrać próbki z supernatantu (materiał wejściowy [IN]) do analizy DNA (0,1%) i białek (0,05%). Przechowywać w temperaturze −20 °C do dalszej obróbki (opisanej w sekcji 7).
  13. Równoważyć 500 µL zawiesiny magnetycznych kulek sprzęgniętych z IgG (dla każdego szczepu drożdży) poprzez dwukrotne przemycie 500 µL zimnego buforu MB z 1x inhibitorami proteaz i fosfataz przez 5 min każdy w temperaturze 4 °C podczas rotacji z prędkością 20 obr./min. Po każdym etapie płukania usuń supernatant z kulek, używając statywu magnetycznego.
  14. Inkubować magnetyczne kulki sprzężone z IgG w 500 µL zimnego buforu MB z inhibitorami proteaz i fosfataz w stężeniu 1x przez 1 h w temperaturze 4 °C przy obrotach 20 obr./min. Odciąć supernatant od kulek za pomocą statywu magnetycznego.
  15. Wymieszaj zrównoważoną zawiesinę kulek magnetycznych z lizatem komórkowym i inkubuj przy rotacji z prędkością 20 obr./min przez 2 h w temperaturze 4 °C.
  16. Przenieś całą zawiesinę kulek magnetycznych z lizatem komórek do probówek reakcyjnych o niskim stopniu wiązania.
  17. Oddziel kulki magnetyczne, zawierające teraz interesujące nas pierścienie chromatyny, od lizatu komórkowego przy użyciu statywu magnetycznego.
  18. Przenieś pozostałą frakcję przepływową (FT) z każdej probówki do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml, a następnie pobierz próbki do analizy DNA (0,1%) i białek (0,05%). Przechowywać w temperaturze −20 °C do czasu dalszej obróbki (opisanej w sekcji 7).
  19. Resuspenduj kulki magnetyczne z każdej probówki w 300 µL zimnego buforu MB, a następnie połączyć kuleczki w jednej probówce reakcyjnej. Przemywać 5 razy po 10 min każdorazowo za pomocą 750 µL zimnego buforu MB z 1x inhibitorami proteaz i fosfataz w temperaturze 4 °C przy obrotach 20 obr./min. Przeprowadzić końcowe płukanie za pomocą 750 µL zimnego buforu MB bez inhibitorów proteaz i fosfataz.
  20. Zawiesić kuleczki w 40 µL zimnego buforu MB bez inhibitorów proteaz i fosfataz.
    ​UWAGA: Końcową objętość eluatu można dostosować do planowanego dalszego zastosowania. Elucja TEV zazwyczaj przebiega efektywnie w zakresie 10-300 µL.

5. Elucja za pomocą proteazy TEV

  1. Aby uwolnić kompleksy pierścieni chromatynowych LexA-CBP z kulek, inkubować kulek z 2 µL rekombinowanej proteazy TEV z tagiem 6x His przez noc w temperaturze 4 °C przy 450 rpm w termomikserze.
  2. Oddzielić kulek od końcowego eluatu za pomocą statywu magnetycznego. Przenieść eluat zawierający rozszczepione pierścienie chromatynowe do nowej probówki reakcyjnej o objętości 1,5 mL.
  3. Ponownie umieścić probówki na statywie magnetycznym, aby oddzielić wszelkie pozostałe kulek od końcowego eluatu.
  4. Resuspendować kulek (TB) w 750 µL zimnego buforu AC i pobrać próbki do analizy DNA (0,1%) oraz białek (0,05%). Przechowywać w temperaturze −20 °C do dalszej obróbki (opisanej w sekcji 7).
  5. Z końcowego eluatu (TE) pobrać próbki do analizy DNA (0,5%) oraz białek (0,25%). Przechowywać w temperaturze −20 °C do dalszej obróbki (opisanej w sekcji 7).
    ​UWAGA: Ze względu na małą objętość końcowego eluatu, zwiększono procent pobranych próbek do analizy DNA i białek, aby uzyskać lepszą reprezentatywność zawartości białek i DNA podczas analizy.

6. Elucja denaturująca

  1. Przemyć kuleczki 2x w 750 µL zimnego buforu AC przez 20 min każdego razu w temperaturze 4 °C przy rotacji z prędkością 20 rpm.
  2. Aby wyekstrahować pozostałe związane kompleksy LexA-chromatyna, przeprowadzić elucję denaturacyjną poprzez dodanie 50 µL 0.5M NH4OH do kuleczek i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej.
  3. Oddzielić kuleczki od zawiesiny za pomocą statywu magnetycznego i przenieść eluat do probówki reakcyjnej o niskim wiązaniu.
  4. Ponownie inkubować kuleczki zgodnie z krokiem 6.2, aby odzyskać maksymalną liczbę loci chromatyny w eluacie.
  5. Oddzielić kuleczki od zawiesiny za pomocą statywu magnetycznego i połączyć otrzymany eluat w tej samej probówce, w której znajduje się eluat z kroku 6.3.
  6. Resuspendować kuleczki (DB) w 750 µL dH2O i pobrać próbki do analizy DNA (0.1%) oraz białek (0.05%).
  7. Z końcowego eluatu (DE) pobrać próbki do analizy DNA (0.5%) oraz białek (0.25%).

7. Analiza DNA i białek

  1. Analiza DNA
    1. Przygotowanie próbek
      1. Do próbek DNA dodać 10 µL buforu IRN i uzupełnić objętość dH2O do końcowej objętości 20 µL.
      2. Dodać 1 ng plazmidowego DNA spike-in K071.
      3. Dodać 1 µL RNAzy A (10 mg/mL) i inkubować w 37 °C przez 1 h.
      4. Dodać 5 µL proteinazy K (10 mg/mL) oraz 10 µL SDS (20%) i inkubować przez 1 h w 56 °C.
      5. Dodać 20 µL mieszaniny fenol/chloroform/alkohol izopropylowy (25:24:1) i dokładnie wymieszać na wortexie 2x po 10 s.
      6. Odwirować próbki przy 21 130 × g przez 7 min w celu rozdzielenia fazy organicznej i wodnej.
      7. Przenieść supernatant do nowych probówek 1,5 mL zawierających 1,5 µL glikogenu (5 mg/mL) i 2,5x 10% etanolu.
      8. Inkubować probówki w −20 °C przez minimum 2 h, maksymalnie przez noc, aby wytrącić DNA.
      9. Odwirować przy 21 130 × g, 4 °C przez 45 min. Usunąć supernatant.
      10. Dodać 150 µL 70% etanolu bez resuspensji osadu DNA i ponownie odwirować przy 21 130 × g w 4 °C przez 10 min.
      11. Osady DNA suszyć w temperaturze pokojowej przez 10-15 min, a następnie resuspender w 40 µL dH2O.
      12. Przeprowadzić trawienie enzymami restrykcyjnymi w celu linearyzacji DNA wyizolowanego w kroku 7.1.1.1 za pomocą endonukleazy restrykcyjnej HpaI. Dla mieszaniny reakcyjnej o objętości 50 µL inkubować 40 µL wyizolowanego DNA + 2 µL enzymu HpaI + 5 µL buforu do enzymów restrykcyjnych + 3 µL dH2O przez noc w 37 °C.
    2. Analiza qPCR
      1. Rozcieńczyć DNA po trawieniu restrykcyjnym w stosunku 1:5 (10 µL DNA po trawieniu z kroku 7.1.1.12 w 40 µL dH2O).
      2. Użyć par starterów zaprojektowanych dla regionu ARS316, PDC1 oraz plazmidowego DNA spike-in.
      3. Przeprowadzić qPCR zgodnie z programem podanym w Tabeli 2.
      4. Przeanalizować wyniki qPCR metodą kwantyfikacji względnej, przyjmując region ARS316 i plazmidowe DNA spike-in jako cele, a PDC1 (lub jakikolwiek inny gen lub region genomiczny) jako locus referencyjne.
      5. Ocenić procent odzysku locus ARS316 względem PDC1, normalizując wartości kwantyfikacji względnej starterów ARS316 i PDC1 przez procent objętości frakcji pobranej dla każdej próbki. Na przykład pomnożyć 0,1% dla przepływu (flow-through) przez współczynnik 1 00 oraz 0,5% dla eluatu TEV przez współczynnik 20.
      6. Znormalizować procenty odzysku ARS316 i PDC1 za pomocą wartości kwantyfikacji względnej plazmidowego DNA spike-in.
      7. Ocenić wzbogacenie locus ARS316 względem całkowitej chromatyny, analizując uzyskane wartości celu/referencji kwantyfikacji względnej zgodnie z równaniem (1).
        figure-protocol-1     (1)
    3. Analiza Southern blot
      1. Do 20 µL próbki DNA trawionego enzymami restrykcyjnymi dodać 5 µL barwnika do ładowania żelu.
      2. Rozdzielić próbki w 1% żelu agarozowym przy 10 V przez ok. 3 h.
      3. Przenieść żel do tacki i namoczyć w roztworze do depurynacji przy delikatnym wstrząsaniu przez 20 min.
      4. Opłukać żel dH2O i namoczyć w roztworze denaturującym przez 15 min z wstrząsaniem. Usunąć roztwór denaturujący.
      5. Namoczyć żel w roztworze denaturującym przez 15 min przy delikatnym wstrząsaniu.
      6. Opłukać żel dH2O, a następnie przemyć 2x przez 15 min buforem do transferu przy delikatnym wstrząsaniu.
      7. Napełnić tackę 1-1,5 L buforu do transferu i ustawić ją na stabilnej platformie.
      8. Odciąć długi kawałek papieru Whatmana i położyć go na platformie w taki sposób, aby oba końce papieru były zanurzone w buforze do transferu.
      9. Wyciąć jeden pasek pozytywnej membrany nylonowej i cztery paski papieru Whatmana o rozmiarze odpowiadającym żelowi.
      10. Położyć na platformie dwa kawałki papieru Whatmana nasączone buforem do transferu.
      11. Położyć żel stroną aktywną do dołu na kawałkach papieru Whatmana.
      12. Na żelu położyć pozytywną membranę nylonową, a następnie dwa pozostałe kawałki papieru Whatmana nasączone buforem do transferu. Należy upewnić się, że stos pozostaje mokry od buforu do transferu.
      13. Usunąć pęcherzyki powietrza, wygładzając je za pomocą pręta szklanego.
      14. Położyć stos ręczników papierowych na zmontowanym zestawie, a następnie obciążyć przedmiotem o masie 0,5 kg (np. szklaną butelką).
      15. Pozostawić zestaw do transferu przez noc w temperaturze pokojowej.
      16. Po transferze przeprowadzić sieciowanie UV membrany z całkowitą energią 1 20 J/cm2.
      17. W celu detekcji locus ARS316 przeprowadzić hybrydyzację southern blot przy użyciu sond radioaktywnych zsyntetyzowanych za pomocą opisanego systemu znakowania DNA.
        UWAGA: Wszystkie kolejne kroki wykonywać na lodzie, chyba że wskazano inaczej.
      18. W probówce o niskim stopniu wiązania rozcieńczyć 25-40 ng fragmentu PCR (sondy) w 19 µL dH2O i inkubować w 95 °C przez 5 min. Natychmiast schłodzić na lodzie.
      19. Dodać do probówki po 1 µL 50 µM dCTP, 50 µM dGTP i 50 µM dTTP.
      20. Dodać 20 µL buforu zawierającego losowe heksamery nukleotydowe dostarczone w zestawie.
      21. Dodać do probówki 5 µL radioaktywnie znakowanego nukleotydu [α-32P] dATP. Wszystkie kroki z materiałem radioaktywnie znakowanym przeprowadzać w zatwierdzonym środowisku ochronnym dla materiałów promieniotwórczych.
      22. Dodać 1 µL fragmentu Klenowa i inkubować w 37 °C na thermomixerze przez 15 min w celu syntezy jednoniciowego DNA.
      23. Dodać 5 µL buforu zatrzymującego w celu przerwania reakcji.
      24. Odwirować kolumnę do wykluczaniaCielularnego przez 2 min przy 1 50 × g, aby usunąć bufor do przechowywania. Usunąć przelew i umieścić kolumnę w nowej probówce.
      25. Przepuścić mieszaninę sondy przez kolumnę, aby usunąć niewbudowane nukleotydy radioaktywne. Odwirować przez 30 s przy 1 50 × g, aby zebrać sondę.
      26. Dodać 150 µL DNA z plemni łososia (1:10), aby zablokować niespecyficzne wiązanie sondy z membraną.
      27. Inkubować mieszaninę sondy w 95 °C przez 5 min w celu denaturacji dwuniciowego DNA.
      28. Szybko zamrozić na lodzie przez kilka sekund i odwirować przez kilka sekund przy 50 × g, aby usunąć kropelki wody skondensowane na zakrętce.
      29. Krótko przemyć membranę southern blot buforem do hybrydyzacji przez 5-10 min w rotacji.
      30. Przeprowadzić prehybrydyzację membrany z buforem do hybrydyzacji przez 1 h w 5 °C w rotacji. Usunąć bufor do hybrydyzacji.
      31. Dodać do membrany 15 mL świeżego buforu do hybrydyzacji (wstępnie podgrzanego do 5 °C) wraz z przygotowaną sondą. Inkubować membranę przez noc w 5 °C w rotacji.
      32. Przeprowadzić przemywania po hybrydyzacji 2x przez 15 min za każdym razem w 0,3x SSC, 0,1% SDS w 5 °C w rotacji.
      33. Przeprowadzić przemywania po hybrydyzacji 2x przez 15 min za każdym razem w 0,1x SSC, 0,1% SDS w 55 °C w rotacji.
      34. Przeprowadzić przemywania po hybrydyzacji 2x przez 15 min za każdym razem w 0,1x SSC, 1,5% SDS w 5 °C w rotacji.
      35. Wyjąć membranę z probówki do hybrydyzacji i naświetlać ją na ekranie fosforymagerze przez maksymalnie 3 dni, aby uzyskać radioaktywne odciski na filmie.
      36. Pozyskać obrazy z filmu za pomocą laserowego systemu skanującego do fosforymagerii.
  2. Analiza białek
    1. Przygotowanie próbek
      1. Dopasować objętości wszystkich próbek białek do ich objętości końcowych (odpowiednio 20 µL, 10 µL, 10 µL, 20 µL i 20 µL dla surowego ekstraktu komórkowego, inputu, przepływu, kulek i eluatu) poprzez dodanie 1 µL β-merkaptoetanolu, buforu do próbek PAGE LDS (1x) oraz dH2O.
      2. Zdenaturować próbki w 95 °C przez 5 min.
    2. Analiza western blot
      UWAGA: Elektroforezę SDS-PAGE i western blotting przeprowadzić zgodnie ze standardowymi protokołami15,16.
      1. Nanieść 15 µL każdej próbki do każdego dołka żelu SDS-PAGE o grubości 1,5 mm.
      2. Przeprowadzić immunostaining membrany przy użyciu przeciwciał PAP (1:2 0) i LexA (1:1 0) z inkubacją przez noc w 4 °C. Rozcieńczyć w 5% roztworze mleka w proszku/PBST.
        UWAGA: Po analizie PAP membranę można oczyścić (stripping) zgodnie z łagodnym protokołem strippingu17 przed immunostainingiem z drugim przeciwciałem LexA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Oczyszczanie domeny chromatyny ARS316 o wielkości ~1,4 kb odbywało się za pośrednictwem konstytutywnie ekspresowanego białka adapterowego LexA-TAP. W celu uzyskania kontroli negatywnej przeprowadzono oczyszczanie z użyciem szczepu izogennego, który wykazuje ekspresję LexA-TAP, ale nie posiada zintegrowanych sekwencji RS oraz miejsc wiązania LexA. Rysunek 3 przedstawia wynik analizy DNA z typowego eksperymentu oczyszczania przeprowadzonego zarówno na szczepie kontrolnym, jak i na szczepie zdo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Identyfikacja czynników i krajobrazu chromatyny w określonym docelowym regionie genomowym nadal stanowi poważne wyzwanie w badaniach nad chromatyną18. Protokół ten opisuje skuteczny system do specyficznego wycinania i oczyszczania odrębnych domen chromatyny z chromosomów drożdży. Zgodnie z naszą wiedzą, czystość i wydajność tego jednoetapowego oczyszczania przezwyciężają wiele ograniczeń metod oczyszczania chromatyny specyficznych dla locus, umożliwiając w ten sposób osiągnięcie bardzo wysokiego w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca w laboratorium S.H. była wspierana przez DFG za pośrednictwem SFB1064 (ID projektu 213249687), Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution) oraz Helmholtz Gesellschaft.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szczepy drożdży< / silny>
kontrolny szczep: < / silny> MATa; ura3 i Delta; 0; leu2Δ 0; jego3Δ 1; met15 i Delta; 0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecRSekcja 1, patrz referencje 13 i 14
Recombination Szczep: MATa; ura3Δ 0; leu2Δ 0; jego3Δ 1; met15 i Delta; 0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecRSekcja 1, patrz odniesienie 13 i 14
Plasmid
K238 plazmidsekcja 1, patrz numer referencyjny 13
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 ° C
K071 Kolce plazmidowego DNASekcja 7.1, patrz odniesienie 13
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C
Odczynniki
AcetonCarl Roth5025.1Sekcja 2
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Octan amonu (NH4Ac)Sigma AldrichA7262Sekcja 6 i 7.1
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Roztwór amonu (NH4OH) 25%Merck Millipore533003Sekcja 6
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Siarczan amonuSanta CruzSc-29085Sekcja 2
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Agar baktonowyBD (VWR)90000-760Sekcja 3
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Pepton baktonowyBD (VWR)211820Sekcja 3
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
β-MerkaptoetanolSigma Aldrich07604Sekcja 7.2
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C
Zestaw podłoża chemiluminescencyjnegoThermoFisher34580Sekcja 7.2
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C
Wodorofosforan di-sodowy dwunastowodnyMerck1.06579.1000Sekcja 2 i 7.1
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Ditiothreitol (DTT)ThermoFisher15508013Section 4
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze 4 & C
EtanolMerck100983Sekcja 7.1
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma AldrichEDSekcja 7.1
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Galaktoza (zapas 20% (w/v))Sigma AldrichG0625-1KG  /  5KGSekcja 3
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Żel Barwnik ładujący (6x)BioLabsB7024ASekcja 7.1
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
GlusoseSigma-AldrichG8270Sekcja
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
GlycineCarlRoth.0079.4Section 2
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Glikogen (5 mg/mL)InvitrogenAM9510Sekcja 7.1
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 ° C
Kwas solny (HCl)PanReac AppliChem182109.1211Sekcja 2, 4 i 7.1
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Octan magnezu (MgAc)Bernd Kraft15274.2600/C035Sekcja 4
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Chlorek magnezu (MgCl2)Sigma AldrichM8266Sekcja 6
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Bufor do próbek Nu PAGE LDS (4x)Invitrogen2399549 Sekcja 7.2
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (25:24:1 v/v)Invitrogen15593-031Sekcja 7.1
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C
Chlorek potasu (KCl)SigmaP9541Sekcja 4
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Znakowane radioaktywnie &alfa;-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL)Hartmann AnalyticSRP-203Sekcja 7.1
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze 4 ° C
System etykietowania RadPrimeThermoFisher18428-011Sekcja 7.1
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
Rafinoza (20% (w/v) zapasów)SERVA34140.03Sekcja 3
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Chlorek sodu (NaCl)MerckK53710504142sekcja 7.1
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Cytrynian sodu (Na3C6H5O7)Sigma-Aldrich71402Sekcja 7.1
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigma AldrichS5881Sekcja 7.1
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
N-dodecylosiarczan sodu (SDS) (5% zapasu (w/v) ) AlfaAesarA11183Sekcja 7.1
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Fosforan sodu jednozasadowySigma-Aldrich71496Sekcja 2 i 7.1
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Sód  azideSanta Cruz  Biotechnologiasc-208393Sekcja 2
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
  TriethylamineSigma Aldrich90340Section 2
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Tris baseChem CruzSC-3715BSection 2 and 4
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Triton X-100Sigma AldrichX100Section 2 i 4
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Tween-20Bernd Kraft18014332Sekcja 4
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Ekstrakt drożdżowyBD (VWR)212720Sekcja 3
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Czynnik kojarzenia drożdży alfa (1 &mikro; g/ml zapasu )  BiomolY2016.5Sekcja 3
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
Drożdżowe syntetyczne pożywki drop-out Suplementy bez LEUCINESigma AldrichY1376Sekcja 1, patrz odniesienie 14
Enzymes
Enzym restrykcyjny HpaI (5,000 U/ml)NEBR0105SSekcja 7.1
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy (100x)ThermoFisher Scientific78446Sekcja 4
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
Proteinaza K (10 mg / ml)SERVA33756Sekcja 7.1
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
RNaza A (10 mg/ml)  ThermoFisherEN0531Sekcja 7.1
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 stopni; Proteaza C
TEV (10000 U/&mikro; L)NEBP8112SSekcja 5
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
Materiały
BcMag Aktywowane epoksydem kulki magnetyczneBioclone Inc.FC-102Sekcja 2
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C
Suchy lódSekcja 4
Probówki wirówkowe o niskim poziomie wiązania 2,0 mlEppendorf22431102Sekcja 4
Microspin  Kolumny G-25Cytiva27-5325-01Sekcja 7.1
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
ParafilmMerckP7793Sekcja 4
Dodatnia membrana nylonowaBiozol11MEMP0001Sekcja 7.1
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Membrana transferowa PVDFImmobilon-Merck MilliporeIPVH00010Sekcja 7.2
Przechowywanie: Przechowywać w pokoju temperatura
SDS-PAGE żel 4-12% bis-tris (15 dołków, 1,5 mm)Invitrogen  NP0336BOXSekcja 7.2
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze 4 stopni;
Strzykawka C (25 ml) z mocowaniem typu luerHenke Sass Wolf4200-000V0Sekcja 3
Papier Whatman (arkusz bibuły Western Blotting Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting)Cytiva3030-917Sekcja 7.1
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej
Przeciwciała
Anti-LexA, poliklonalne IgG królika, przeciwciało regionu wiążącego DNAMerck Millipore06-719Sekcja 7.2
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
Kozia IgG Anty-Królicza IgG (H + L), koniugat peroksydazy chrzanowejInvitrogenG21234Sekcja 7.2
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 &; Przeciwciało
antyperoksydazy C (PAP) wytwarzane u królika w celu wykrywania białek znakowanych TAPSigma AldrichP1291-500ULSekcja 7.2
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 &; C
Przeciwciała IgG królikaSigmaI5006-100MGSekcja 2
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze 4 &;
CPrimery (10 &mikro; M)
ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCTSekcja 7.1
K071 Kolce w plazmidowym DNA: fwd: 5'-TTTTCCTGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACATSekcja 7.1
PCR fragment genomowego DNA drożdży jako matryca   dla wzmocnienia ARS316 (dla southern blot): fwd 5'- AAATTCTGCCCTTGATTCGT                                                                                                  rev 5'- TTTGTTTATCTCATCACTAATSekcja 7.1
PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGTSekcja 7.1
Equipment
Młynek do kawyGastroback42601Sekcja 4
Kolba DewaraNAL GENE4150-2000Sekcja 3
Stojak magnetyczny DynaMag TM-2Invitrogen12321DSekcja 4, 5 i 6
Piec do hybrydyzacjiHybaid Mini10Ri418Sekcja 2
MikrowirówkaEppendorf5424RSekcja 4 i 7.1
Sieciownik UVAnalytikjena95-0174-02Sekcja 7.1

Bibliografia

  1. Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell. 98 (3), 285-294 (1999).
  2. Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. Purification and enrichment of specific chromatin loci. Nature Methods. 17 (4), 380-389 (2020).
  3. Korthout, T., et al. Decoding the chromatin proteome of a single genomic locus by DNA sequencing. PLoS Biology. 16 (7), e2005542(2018).
  4. Antão, J. M., Mason, J. M., Déjardin, J., Kingston, R. E. Protein landscape at Drosophila melanogaster telomere-associated sequence repeats. Molecular and Cellular Biology. 32 (12), 2170-2182 (2012).
  5. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
  6. Ide, S., Dejardin, J. End-targeting proteomics of isolated chromatin segments of a mammalian ribosomal RNA gene promoter. Nature Communications. 6, 6674(2015).
  7. Unnikrishnan, A., Gafken, P. R., Tsukiyama, T. Dynamic changes in histone acetylation regulate origins of DNA replication. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 430(2010).
  8. Buxton, K. E., et al. Elucidating protein-DNA interactions in human alphoid chromatin via hybridization capture and mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3433-3442 (2017).
  9. Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of chromatin-associated proteins via sequence-specific capture and mass spectrometric protein identification in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Proteome Research. 13 (8), 3810-3825 (2014).
  10. Liu, S. J., et al. CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells. Science. 355, 7111(2017).
  11. Hamperl, S., et al. Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae. Functional Analysis of DNA and Chromatin. 1094, 329-341 (2014).
  12. Hamperl, S., et al. Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 42 (1), 2(2014).
  13. Weiβ, M. Single-copy locus proteomics of early- and late-firing DNA replication origins identifies a role of Ask1/DASH complex in replication timing control. Cell Reports. 42 (2), 112045(2023).
  14. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  15. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  16. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  17. Western blot membrane stripping for restaining protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol (2023).
  18. Vermeulen, M., Déjardin, J. Locus-specific chromatin isolation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (5), 249-250 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rdze nukleosomuoddzia ywania bia ko DNAoczyszczanie powinowactwemizolacja za pomoc kulek magnetycznychnatywna chromatynamodyfikacje histon wmiejsca inicjacji replikacji DNA
Oczyszczanie chromatyny locus genu z pojedynczą kopią u Saccharomyces cerevisiae
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.