Wysokoprzepustowe testy behawioralnego starzenia się i długości życia przy użyciu maszyny Lifespan Machine

Podsumowanie

Platforma obrazowania "The Lifespan Machine" automatyzuje obserwację dużych populacji przez całe życie. Pokazujemy kroki wymagane do wykonania testów długości życia, odporności na stres, patogenezy i behawioralnego starzenia się. Jakość i zakres danych pozwalają naukowcom badać interwencje w procesie starzenia się pomimo obecności zmienności biologicznej i środowiskowej.

Streszczenie

Genetycznie identyczne zwierzęta trzymane w stałym środowisku wykazują szeroki rozkład długości życia, odzwierciedlający duży niegenetyczny, stochastyczny aspekt starzenia się zachowany we wszystkich badanych organizmach. Ten komponent stochastyczny oznacza, że aby zrozumieć starzenie się i zidentyfikować skuteczne interwencje, które przedłużają życie lub poprawiają zdrowie, naukowcy muszą jednocześnie monitorować duże populacje zwierząt doświadczalnych. Tradycyjna ręczna ocena zgonu ogranicza przepustowość i skalę wymaganą do testowania hipotez na dużą skalę, co prowadzi do opracowania zautomatyzowanych metod wysokoprzepustowych testów długości życia. Lifespan Machine (LSM) to wysokowydajna platforma obrazowania, która łączy zmodyfikowane skanery płaskie z niestandardowym oprogramowaniem do przetwarzania obrazów i walidacji danych w celu śledzenia nicieni przez całe życie. Platforma stanowi duży postęp techniczny, generując dane o długości życia dużych populacji zwierząt o wysokiej rozdzielczości czasowej na niespotykaną dotąd skalę oraz z precyzją statystyczną i dokładnością równą testom ręcznym wykonywanym przez doświadczonych badaczy. Ostatnio LSM został dalej rozwinięty w celu ilościowego określenia zmian behawioralnych i morfologicznych obserwowanych podczas starzenia się oraz powiązania ich z długością życia. W tym miejscu opisujemy, jak zaplanować, uruchomić i przeanalizować zautomatyzowany eksperyment dotyczący długości życia przy użyciu LSM. Ponadto podkreślamy kluczowe kroki wymagane do pomyślnego zebrania danych behawioralnych i wysokiej jakości krzywych przeżycia.

Wprowadzenie

Starzenie się to złożony, wieloaspektowy proces charakteryzujący się spadkiem fizjologicznych funkcji organizmu, co prowadzi do wzrostu ryzyka chorób i śmierci w miarę upływu czasu¹. Długość życia, mierzona jako czas od urodzenia lub początku dorosłości do śmierci, zapewnia jednoznaczny wynik starzenia się² oraz pośredni, ale rygorystycznie ilościowy wskaźnik zastępczy do pomiaru względnego tempa starzenia się między populacjami³. Badania nad starzeniem się często opierają się na dokładnych pomiarach długości życia, podobnie jak w badaniach klinicznych, w celu porównania wyników między jedną populacją narażoną na interwencję a nienarażoną grupą kontrolną. Niestety, problemy z odtwarzalnością przenikają badania nad starzeniem się, czasami z powodu statystycznie słabych eksperymentów⁴, a często z powodu wrodzonej wrażliwości testów długości życia na subtelne zmiany w środowisku⁵. Solidne eksperymenty wymagają wielu powtórzeń dużych populacji, a proces ten szczególnie korzysta z eksperymentalnej skalowalności oferowanej przez automation⁶.

Rygorystyczne wymagania testów długości życia wynikają z nieprzewidywalności samego procesu starzenia. Osobniki izogeniczne żyjące w identycznych środowiskach wykazują różne czasy śmierci i tempo spadku fizjologicznego⁷, co sugeruje, że długość życia wiąże się z wysokim stopniem stochastyczności^7,8. W związku z tym duże populacje są potrzebne do pomiaru ilościowych zmian w procesie starzenia, takich jak zmiany średniej lub maksymalnej długości życia, oraz do przezwyciężania uprzedzeń wynikających ze zmienności indywidualnej. Ponadto zdolność do wysokoprzepustowych testów żywotności ma kluczowe znaczenie dla wspierania badań kształtów krzywych przeżycia i modeli dynamiki starzenia się⁹.

Nicień Caenorhabditis elegans jest nieocenionym modelem do badań nad starzeniem się ze względu na jego krótką żywotność, podatność genetyczną i szybki czas generacji, co podkreśla jego przydatność do wysokoprzepustowych testów starzenia i długości życia. Tradycyjnie, długość życia w C. Elegans został zmierzony poprzez śledzenie zsynchronizowanej, małej populacji około 50-100 zwierząt w czasie na pożywkach stałych i zapisywanie czasu poszczególnych zgonów. W miarę starzenia się zwierząt i utraty mobilności, ręczne określanie czasu śmierci wymaga indywidualnego szturchania zwierząt i sprawdzania, czy nie ma małych ruchów głowy lub ogona. Jest to zwykle żmudny i pracochłonny proces, chociaż podjęto wysiłki, aby go przyspieszyć^10,11,12. Co ważne, powolne procesy eksperymentalne utrudniają postęp w naszym zrozumieniu starzenia się i skuteczności badanych interwencji.

Aby sprostać wymaganiom starzejących się badań nad danymi ilościowymi, opracowano wiele technologii automatyzujących zbieranie danych, w tym niezwykły zakres podejść od komór mikroprzepływowych po skanery płaskie^{13,14,15,16,17,18}. LSM różni się od innych metod obszerną optymalizacją pod kątem gromadzenia wysoce precyzyjnych i dokładnych danych o żywotności, co osiąga się dzięki opracowaniu starannych protokołów kalibracji sprzętu w połączeniu z obszernym pakietem oprogramowania, który pozwala użytkownikom walidować, poprawiać i udoskonalać automatyczne analizy¹³. Chociaż oprogramowanie może być w zasadzie stosowane do różnych metod obrazowania, w praktyce większość użytkowników korzysta ze skanerów płaskich zmodyfikowanych tak, aby umożliwić precyzyjną kontrolę nad temperaturą i wilgotnością otoczenia - czynnikami o krytycznym znaczeniu ze względu na ich duży wpływ na długość życia¹⁹. LSM wykonuje zdjęcia nicieni co 20 minut w odstępach od dni do miesięcy, w zależności od warunków środowiskowych i genotypu. Uzyskane dane mają znacznie wyższą rozdzielczość czasową w porównaniu z danymi z testów ręcznych, a zebrane obrazy zapewniają trwały wizualny zapis pozycji nicieni przez całe życie. Korzystając z metod uczenia maszynowego, czasy śmierci są automatycznie przypisywane do każdej osoby. Wyniki te można szybko, ręcznie zweryfikować za pomocą oprogramowania klienckiego o nazwie "Worm Browser". Dzięki swojemu sprzętowi i oprogramowaniu, LSM może generować krzywe przeżycia, które są statystycznie nie do odróżnienia od ręcznej oceny zgonów z rąk doświadczonych badaczy, z dodatkową zaletą w postaci zmniejszonego obciążenia pracą i wyższej skalowalności¹³.

Najnowsza wersja LSM pozwala również na badanie behawioralnego starzenia się poprzez zbieranie danych morfologicznych i behawioralnych przez całe życie nicieni i raportowanie ich wraz z długością życia każdego osobnika. W szczególności LSM rejestruje czas zaprzestania energicznego ruchu (VMC) każdego zwierzęcia, co jest punktem orientacyjnym często używanym do ilościowego określania "długości zdrowia" osobnika w odróżnieniu od jego długości życia. Poprzez jednoczesne gromadzenie danych dotyczących długości życia i behawioralnego starzenia się, LSM wspiera badanie interwencji, które mogą mieć zróżnicowany wpływ na różne fenotypowe wyniki starzenia się²⁰. Do badania behawioralnego starzenia się można wykorzystać różne makroskopowo obserwowalne fenotypy, takie jak ruchy ciała lub pompowanie gardła²¹, tissue integrity²² oraz prędkość ruchu lub obracanie wywołane bodźcem¹⁷. Porównania między różnymi fenotypami starzenia się mogą pomóc w analizie struktury przyczynowej procesów starzenia. Na przykład porównanie VMC i długości życia zostało niedawno wykorzystane do scharakteryzowania dwóch odrębnych procesów starzenia się u C. elegans²³.

Chociaż początkowo opracowany do pomiaru długości życia C. elegans, LSM wspiera zbieranie danych o przeżywalności i zachowaniu wielu gatunków nicieni, w tym C. brygsae, C. tropicalis, C. japonica, C. brenneri i P. pacificus²³. Technologia ta ułatwia badanie wpływu interwencji biologicznych i środowiskowych na długość życia, odporność na stres i oporność na patogeny i może być połączona z narzędziami eksperymentalnymi, takimi jak celowane testy interferencji RNA lub systemy degradacji białek indukowanych auksyną. Do tej pory był używany w literaturze naukowej w szerokim zakresie zastosowań^{6,24,25,26,27,28,29,30}.

Tutaj przedstawiamy krok po kroku protokół przeprowadzania eksperymentu z użyciem Maszyny do Długości Życia przy użyciu płytek agarowych, od początkowych etapów konfiguracji eksperymentalnej do wyniku wynikowych krzywych przeżycia. Charakterystyczną cechą LSM jest to, że wysiłek jest wysoce skoncentrowany na początku, co oznacza, że większość czasu badacza spędza podczas konfiguracji eksperymentalnej i, w niewielkim stopniu, podczas akwizycji po uzyskaniu obrazu. Zbieranie danych jest całkowicie zautomatyzowane przez cały czas trwania eksperymentu i pozwala badaczowi na "wolne ręce". Opisane tutaj kroki są wspólne dla wielu różnych typów testów przeżycia - ta sama konfiguracja eksperymentalna jest wykonywana dla testów długości życia, termotolerancji, stresu oksydacyjnego i patogenezy. W sekcji dotyczącej reprezentatywnych wyników omawiamy podzbiór danych z niedawno opublikowanego manuskryptu, aby zilustrować skuteczność potoku analizy i podkreślić najważniejsze kroki podczas analizy obrazu²³.

Protokół

1. Wymagania programowe i sprzętowe

1. Skanery płaskie: Zasadniczo LSM można wdrożyć przy użyciu różnych urządzeń do obrazowania. Szczegółowe instrukcje dotyczące modyfikacji skanera i ustawiania ostrości są dostępne gdzie indziej¹³. Sprzęt LSM pokazano na rysunku uzupełniającym 1.
2. Narzędzia do analizy danych: Oprogramowanie LSM składa się z trzech współdziałających komponentów: pakietu oprogramowania do sterowania skanerem opartego na systemie Linux, pakietu zarządzania metadanymi opartego na przeglądarce internetowej oraz pakietu oprogramowania do analizy obrazów klienta systemu Windows i Linux. Zapoznaj się z instrukcjami dotyczącymi instalowania narzędzi programowych opublikowanymi w repozytorium GitHub (https://github.com/nstroustrup/lifespan).
3. Oprogramowanie do wizualizacji i walidacji danych: Użyj przeglądarki robaków, programu klienckiego, aby zaplanować eksperymenty, zweryfikować analizę obrazu, wykonać ręczną adnotację ruchu nicieni i uzyskać dane dotyczące przeżycia. Binarne pliki wykonywalne są dostępne dla przeglądarki robaków w systemach Windows 7, Windows 8 i Windows 10, a przeglądarka robaków jest kompilowana z kodu źródłowego w systemie Linux lub Apple iOS. Instrukcja instalacji jest dostępna we wspomnianym wyżej repozytorium GitHub.

Rysunek uzupełniający 1: Żywotność sprzętu maszynowego. Jeden skaner płaski z otwartą pokrywą, aby pokazać załadowane płyty, które są umieszczone skierowaną w dół do 16 otworów wyciętych na gumowej macie. Gumowa mata jest umieszczana na powierzchni szklanego skanera. Etykiety dotyczące warunków są napisane po bokach płyt, aby uniknąć problemów podczas analizy obrazu. Taśma znakująca z numerem ("1") i/lub nazwą urządzenia ("Jabba") ułatwia późniejszą weryfikację lokalizacji próbki podczas pracy z wieloma urządzeniami skanerującymi. Więcej szczegółów na temat komponentów sprzętowych LSM można znaleźć gdzie indziej¹³. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

2. Konfiguracja przed dniem eksperymentu

1. Kalibracja temperatury inkubatora: Temperatura otoczenia jest głównym wyznacznikiem C. Długość życia Elegans19. Aby uzyskać dokładne wyniki, należy przeprowadzić akwizycję obrazu w starannie skalibrowanej temperaturze, utrzymywanej na stałym poziomie przez cały czas trwania eksperymentu. Aby to osiągnąć, na kilka dni przed rozpoczęciem eksperymentu zmierz i skalibruj temperaturę powierzchni każdego skanera podczas pracy. Używaj termopar o wysokiej precyzji, jak opisano w innym miejscu³¹ (patrz Tabela materiałów).
2. Układ płytek skanera: Przed rozpoczęciem eksperymentu zaplanuj optymalny układ płytek hodowlanych dla każdego skanera.
   UWAGA: Ma to na celu uniknięcie wprowadzania czynników zakłócających wynikających ze zmian temperatury między skanerami i na powierzchni każdego skanera. Skanery różnią się nieznacznie średnią temperaturą powierzchni, a ponadto wykazują subtelne odchylenia temperatury na swojej powierzchni³¹.
   1. Położenie płytki skanera: Aby kontrolować te efekty termiczne w późniejszej analizie danych, należy losowo zrandomizować wszelkie współzmienne biologiczne dotyczące pozycji skanera i ustandaryzować położenie płytki we wszystkich skanerach.
   2. Liczba próbek na skanerach: W przypadku korzystania z układu 16 mat gumowych (patrz Tabela materiałów), w każdym skanerze należy umieścić cztery płytki na stan, w sumie co najmniej cztery skanery. Gwarantuje to, że każdy warunek jest rozłożony na wiele skanerów, dzięki czemu zakłócające skutki temperatury skanera mogą zostać zidentyfikowane i usunięte podczas analizy danych¹³. Aby uprościć tę analizę, dołącz wspólny warunek referencyjny (np. próbki typu dzikiego) do każdego skanera.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, ze względu na rozmieszczenie wentylatorów skanera, płytki w prawym górnym rogu gumowej maty są bardziej podatne na wysuszenie. W razie potrzeby pozostaw tę lokalizację pustą.
3. Płytki i przygotowanie próbek
   1. Nalewanie płytek hodowlanych: W celu optymalnego wysuszenia płytek hodowlanych skanera (patrz Tabela materiałów), należy wlać pożywkę agarową na 4 dni przed załadowaniem nicieni. Chociaż ostrość skanera jest regulowana, aby umożliwić dodawanie różnych objętości agaru do płytek, standardowa objętość płytki wynosi 8 ml.
      UWAGA: Pomocne może być zalanie płytek pompą perystaltyczną, szczególnie w przypadku dużych eksperymentów.
   2. Wysiew talerzy: Wysiewaj płytki pożądaną kulturą bakteryjną co najmniej 2 dni przed rozpoczęciem eksperymentu, aby umożliwić prawidłowe wysuszenie i wzrost bakteryjnego trawnika. Zazwyczaj 200 μl kultury bakteryjnej wystarcza do stworzenia trawnika, który będzie karmił 40 nicieni przez kilka tygodni.
      UWAGA: Płytki zwykle używane do obrazowania są szczelniej zamknięte niż standardowe szalki Petriego z kulturami; Dlatego zaleca się wysiewanie i suszenie płytek wewnątrz okapu laboratoryjnego, zwykle przez około 1 godzinę lub do momentu odpowiedniego wysuszenia.
4. Postępowanie z nicieniami
   1. Wielkość populacji: Liczba nicieni, które można wiarygodnie zobrazować na jednej płytce, zależy od genotypu, wieku, w którym nicienie są platerowane, oraz ilości pokarmu dodanego do każdej płytki. W przypadku eksperymentów z długością życia, które rozpoczynają się we wczesnej dorosłości, załaduj około 40 zwierząt na talerz. Ta liczba zapewnia wystarczającą ilość jedzenia i pozwala uniknąć tłoku.
   2. Wzrost dużych populacji: Aby przygotować się do ekspansji i synchronizacji populacji, zacznij od populacji nicieni odpowiedniej dla wybranej metody synchronizacji (patrz poniżej). Staraj się przeprowadzić synchronizację na zwierzętach w ich wieku maksymalnej produkcji jaj, co dla zwierząt N2 typu dzikiego to 2 dzień dorosłości³².
      UWAGA: Innym powodem, dla którego warto synchronizować populacje przy użyciu zwierząt w drugim dniu ich dorosłości, jest usunięcie wieku matki jako czynnika przyczyniającego się do niejednorodności populacji. Wiek matki w C. Wykazano, że elegans wpływa na wiele cech sprawności u potomstwa, przy czym zwierzęta dnia 2 typu dzikiego produkują potomstwo "najwyższej jakości"³³.
   3. Przeprowadzanie synchronizacji wieku: Aby uzyskać dokładne wyniki, zsynchronizuj wiek zwierząt tak precyzyjnie, jak to możliwe. W tym protokole synchronizacja wieku jest wykonywana przy użyciu zmodyfikowanego leczenia podchlorynem³⁴. Inne metody mogą obejmować synchronizację przez składanie jaj, zatrzymanie larw L1 lub ręczne pobieranie larw L4.
      UWAGA: W celu synchronizacji wieku przez leczenie podchlorynem spodziewaj się uzyskania od trzech do czterech jaj od każdego dorosłego hermafrodyty.
   4. Utrzymanie populacji wolnych od potomstwa: Utrzymanie populacji wolnych od potomstwa poprzez wystawienie nicieni w późnym stadium L4 na działanie 5-fluoro-2'-deoksyurydyny (FUdR)³⁵.
      UWAGA: W małych dawkach FuDR jest śmiertelny dla rozwijających się zarodków, nie powodując makroskopowo widocznych zmian w linii zarodkowej ani nie zmieniając tempa produkcji oocytów. Inne metody obejmują użycie sterylnych termicznie mutantów, użycie sterylizujących konstruktów RNAi lub po prostu czekanie do starzenia się po rozrodczości, aby przenieść nicienie na płytki w celu obrazowania.
   5. Przenoszenie populacji: Podczas przenoszenia tysięcy zwierząt między płytami, standardowy protokół obejmujący drut platynowo-irydowy staje się pracochłonny. Metody polegające na płynnej zawiesinie nicieni ułatwiają przenoszenie i zwiększają ich wydajność. Zbierz nicienie za pomocą buforu M9 + Mg (Na₂HPO₄ 42,27 mM, KH₂PO₄ 22,05 mM, NaCl 85,56 mM, MgSO₄ 1 mM), zmniejsz całkowitą objętość, gdy nicienie osiądą grawitacyjnie, a następnie szybko przenieś nicienie na płytki używane do obrazowania.
      UWAGA: Przenoszenie nicieni za pomocą płynnej zawiesiny może prowadzić do różnic w liczbie zwierząt przenoszonych na każdą płytkę. Staraj się być konsekwentny w liczbie nicieni na każdej płytce, aby uniknąć zmienności eksperymentalnej.
   6. Stosowanie interwencji: Zatrzymywanie i wznawianie akwizycji obrazu podczas eksperymentu komplikuje analizę obrazu (patrz dyskusja). Dlatego eksperymenty LSM należy rozpocząć dopiero po zakończeniu wszystkich niezbędnych czynności związanych z nicieniami.
5. Sterylizacja mat gumowych: Autoklaw dużą liczbę mat jednocześnie, pojedynczo owijając je folią aluminiową.
   UWAGA: Maty gumowe należy sterylizować między użyciami, aby uniknąć gromadzenia się zanieczyszczeń grzybiczych lub bakteryjnych. Większość zwykle stosowanych rodzajów gumy ulega degradacji w wyniku agresywnej obróbki etanolem.

3. Konfiguracja w dniu eksperymentu

1. Wspornik płytki i przygotowanie szkła skanera: Aby uprościć obsługę płytek, nie należy ładować szalek Petriego bezpośrednio na powierzchnię skanera, ale zamiast tego należy je przytrzymać za pomocą gumowych mat wspartych na taflach szkła (patrz Tabela materiałów). Populacje są obrazowane przez to szkło, więc utrzymuj szkło w czystości i pokryj je powłoką przeciwmgielną, hydrofobową i sterylizującą (patrz Tabela materiałów).
   1. Przed załadowaniem płytek do inkubatora należy oczyścić powierzchnię szkła nośnego z płyt z obu stron środkiem do czyszczenia szyb przeciwmgielnym.
   2. Przed załadowaniem płytek na szkło nośne należy zastosować ochronną hydrofobową powłokę szklaną (patrz Tabela Materiałów), aby zminimalizować zaparowanie po stronie szkła, która będzie miała kontakt z matą gumową. Dobrze rozprowadź ten zabieg i pozostaw go na szkle na 5-10 minut przed przejściem do następnego kroku. Po aplikacji należy energicznie oczyścić, aby usunąć wszelkie pozostałości.
   3. Zastosuj 70% etanol do dezynfekcji powierzchni szkła, która będzie miała kontakt z matą gumową. Pozostaw na 1 minutę lub 2 minuty, a następnie usuń szmatką lub ręcznikiem papierowym.
2. Ładowanie płyt na skanery
   1. Najpierw umieść autoklawowane maty gumowe na obrabianym szkle nośnym płyty.
   2. Zdejmij pokrywkę z płytek używanych do obrazowania z załadowanymi nicieniami i umieść je na gumowych matach skierowanych w stronę powierzchni szkła. Upewnij się, że gumowa mata jest szczelnie uszczelniona wokół wszystkich płyt, na przykład dodając kolejną taflę szkła na wierzchu i upewniając się, że leży płasko lub stukając w górną część każdej płyty (luźne płytki będą się lekko poruszać i uderzać w szkło, wydając dźwięk, podczas gdy mocno zabezpieczone płytki nie będą się poruszać po stuknięciu).
      UWAGA: Przydatne jest indywidualne oznaczenie każdego arkusza szkła nośnego płytą taśmą oznaczeniową z informacjami o zawartości płytki i przeznaczonym skanerze. Dane te mogą być wykorzystane po zakończeniu eksperymentu w celu wyjaśnienia wszelkich potencjalnych niejasności dotyczących lokalizacji płyt.
   3. Przed załadowaniem płytek do skanerów należy odłączyć wentylatory skanera, aby chronić palce eksperymentatora podczas ładowania płytki.
   4. Delikatnie wsuń płytki i podtrzymującą je taflę szkła na powierzchnię skanera.
      UWAGA: Unikaj wywierania nacisku bezpośrednio na gumową matę, ponieważ powoduje to przesuwanie się maty po szkle nośnym płyty. Kiedy maty się ślizgają, płyty są często wybijane z maty.
   5. Ponownie aktywuj wentylatory skanera i wizualnie potwierdź, że wentylatory przednie i boczne są zasilane. Jeśli skanery są wyłączone, włącz je w tym momencie.

4. Akwizycja obrazu przed

UWAGA: Obszerny schemat blokowy podsumowujący wszystkie kroki oparte na oprogramowaniu podczas pozyskiwania obrazu jest przedstawiony w Rysunek 1.

Rysunek 1: Graficzny przegląd potoku analizy obrazów Lifespan Machine. Etapy przed, w trakcie i po akwizycji obrazu są w dużej mierze wykonywane w interfejsie internetowym (WI, kolor czerwony) oraz w przeglądarce robaków (WB, kolor zielony). Niektóre kroki są wykonywane na innych platformach (O, w kolorze niebieskim), takich jak dokumenty TXT w kroku 3a, Photoshop lub jego odpowiednik w kroku 4b oraz JMP lub jego odpowiednik w kroku 13. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Ustawienia akwizycji obrazu: Wygeneruj plik określający harmonogram eksperymentu i lokalizację płyt na każdym skanerze, aby skonfigurować akwizycję obrazu.
   UWAGA: Ten plik zawiera ważne metadane, takie jak tytuł eksperymentu, częstotliwość przechwytywania obrazów i całkowity czas trwania eksperymentu. Zazwyczaj ten plik nie jest generowany de novo dla każdego eksperymentu, ale zamiast tego pliki eksperymentu z poprzednich eksperymentów są ponownie używane jako szablony. W przypadku pierwszego eksperymentu użytkownika dostarczany jest plik szablonu (Plik uzupełniający 1).
   1. Poproś o podgląd zrzutów: Podaj lokalizację wszystkich płyt na każdym skanerze. Dostępnych jest kilka narzędzi przyspieszających ten proces. Najpierw użyj skanera, aby uzyskać obraz całej powierzchni skanera, zwany "przechwytywaniem podglądu". Upewnij się, że obrazy podglądu wyraźnie pokazują całą powierzchnię każdej płyty, która ma być zobrazowana (Rysunek 2A) bez smug lub przycinania krawędzi płyty.
      1. Korzystając z interfejsu internetowego, znajdź sekcję Pobieranie obrazów na stronie głównej i skorzystaj z łącza o nazwie Urządzenia przechwytujące i serwery obrazów. Na tej stronie kliknij przycisk oznaczony Wyszukaj nowe urządzenia (tj. skanery) w polu Serwery przechwytywania i przetwarzania obrazów. Monitoruj postęp serwera w wykrywaniu skanerów, klikając łącze [log] obok server.
         UWAGA: Przed wykonaniem tego kroku upewnij się, że żądane skanery są "włączone" i podłączone do serwera.
      2. Na tej samej stronie interfejsu internetowego upewnij się, że każdy skaner podłączony do serwera znajduje się w polu Image Capture Devices (Urządzenia do przechwytywania obrazów). Etykieta "Brak" w obszarze "Bieżący stan" nie jest już wyświetlana, jeśli urządzenie zostanie pomyślnie wykryte. Zaznacz pole wyboru odpowiadające każdemu skanerowi zawierającemu nowo załadowane płyty.
      3. U dołu sekcji Urządzenia do przechwytywania obrazu kliknij przycisk Poproś o przechwycenie podglądu. W ciągu 1 minuty lub 2 minut skanery powinny się zaświecić i rozpocząć skanowanie.
         UWAGA: Początkowe położenie szklanych arkuszy nośnych musi być często dostosowywane, aby wszystkie płyty znalazły się w widocznym zakresie. Pozycje można korygować, sprawdzając obrazy podglądu i dokonując korekt położenia płyty oraz ponownie wykonując nowe obrazy podglądu. Jeśli skanowanie przebiega bardzo wolno (kilka minut na jeden skan) lub jeśli podgląd przechwyconych obrazów zawiera długie białe smugi, jest to znak, że płytka, gumowa mata lub inny przedmiot blokuje światło w obszarze kalibracji skanera (oznaczonym białymi strzałkami na powierzchni skanera). Wszystkie obiekty należy przestawić w taki sposób, aby tylko szkło nośne zajmowało ten obszar.
   2. Zdefiniuj obszary skanowania: Postępuj zgodnie z kolejnymi krokami w przeglądarce robaka, aby przeanalizować obrazy podglądu i zebrać je w jeden obraz kompozytowy, który służy do określania położenia każdej płyty do analizy danych. Upewnij się, że wynikowy obraz wygląda podobnie do Rysunek 2B.
      1. Najpierw, korzystając z przeglądarki robaków, otwórz każdy podgląd przechwyconego obrazu, wybierając opcję menu Plik > Otwórz obraz, a następnie wybierz żądany obraz.
      2. Na każdym obrazie kliknij, aby wybrać kolumny dla regionów z płytami (jeśli mata gumowa ma 16 lokalizacji płyt, wybierz 4 kolumny).
         UWAGA: Obszary skanowania powinny być określone jako wysokie kolumny (a nie szerokie wiersze), ponieważ przechwytywanie skanera jest wolniejsze w przypadku szerszych obszarów, co powoduje rozmycie obrazów z powodu ruchu nicieni.
      3. Po zdefiniowaniu wszystkich obrazów wyeksportuj specyfikacje regionów na dysk, wybierając z menu pozycję Akwizycja obrazu > Zdefiniuj obszary skanowania > Zapisz wybrane obszary skanowania na dysku i wybierając żądaną lokalizację.
   3. Wygeneruj harmonogram eksperymentu:
      1. Postępując zgodnie z formatem pliku uzupełniającego 1, złóż plik zawierający nazwę eksperymentu, fizyczne lokalizacje każdej kolumny na skanerach (skopiowane z pliku obszarów skanowania wygenerowanego w kroku 4.1.2.3), całkowity czas trwania eksperymentu oraz częstotliwość przechwytywania obrazu, a następnie zapisz go zarówno jako plik TXT, jak i jako plik XML.
      2. Następnie w przeglądarce robaków kliknij Pobieranie obrazu > Prześlij harmonogram eksperymentów i wybierz wygenerowany plik XML. Przeglądarka robaka zapyta, czy wyświetlić podsumowanie harmonogramu, czy uruchomić eksperyment. Kliknij Wygeneruj plik podsumowania.
   4. Sprawdź poprawność pliku podsumowania: Po przesłaniu harmonogramu eksperymentu przeglądarka robaka wyświetli podsumowanie harmonogramu. To podsumowanie jest wyświetlane na ekranie i zapisywane na dysku. Zapoznaj się z nim i zweryfikuj daty zaplanowanych przechwyceń, a także lokalizację, nazwę i liczbę skanerów.
   5. Prześlij harmonogram eksperymentu: Jeśli plik podsumowania jest zadowalający, załaduj ponownie plik XML dla harmonogramu eksperymentu do przeglądarki robaków, wybierając opcję menu Pobieranie obrazu > Prześlij harmonogram eksperymentu. Przeglądarka robaka zapyta po raz drugi, czy wyświetlić podsumowanie harmonogramu, czy uruchomić eksperyment. Tym razem kliknij Uruchom! .
      UWAGA: Kilka minut po przesłaniu eksperymentu rozsądnie jest skorzystać z interfejsu internetowego, aby potwierdzić, że eksperyment został pomyślnie przesłany, a skany są zbierane przez wszystkie skanery. Zwykle zdarza się, że kilka pierwszych skanów zostaje pominiętych, zwłaszcza w dużych eksperymentach.
   6. Organizowanie eksperymentów w interfejsie internetowym: Klaster skanera o dużym obciążeniu może generować setki eksperymentalnych zestawów danych zebranych przez wielu różnych użytkowników. Aby uporządkować tę listę, przypisz eksperymenty do oddzielnych grup, na przykład odpowiadających nazwie użytkownika odpowiedzialnego za eksperyment.
      1. Utwórz nową grupę lub zmodyfikuj istniejącą: Utwórz nowe grupy w interfejsie internetowym, klikając pozycję Zarządzaj grupami eksperymentalnymi w polu o nazwie Pozyskiwanie obrazów. Na nowej stronie, która się pojawi, dodaj żądaną nazwę w Utwórz nową grupę i kliknij Utwórz. Aby zmodyfikować nazwę istniejącej grupy, w tym samym polu wybierz żądaną grupę obok pozycji Modyfikuj istniejącą grupę, a następnie wybierz pozycję Modyfikuj.
      2. Przypisywanie eksperymentów do grupy: aby przypisać nowe eksperymenty do określonej grupy, przejdź do interfejsu internetowego i znajdź żądany eksperyment, który domyślnie zostanie przypisany do grupy Bez grupy u dołu listy eksperymentów. Kliknij link po prawej stronie sekcji eksperymentu, w której znajduje się napis Edytuj, a następnie użyj listy rozwijanej, aby wybrać nazwę grupy, której chcesz użyć. Następnie wybierz pozycję Zapisz.
   7. Anuluj eksperyment:
      UWAGA: LSM będzie nadal działać autonomicznie, dopóki końcowe skany nie zostaną określone w harmonogramie eksperymentu. Po zakończeniu harmonogramu eksperymentalnego LSM będzie domyślnie kontynuował zbieranie skanów, ale natychmiast odrzuci dane obrazu w procesie zwanym automatycznym skanowaniem. Te automatyczne skanowania są wykonywane, aby zapobiec wyłączaniu się i chłodzeniu skanerów oraz utrzymaniu standardowego profilu temperatury, tak aby wyłączenie innych skanerów nie miało wpływu na żadne inne eksperymenty uruchomione w tej samej przestrzeni (ale z innego eksperymentu).
      1. Zatrzymaj automatyczne skanowanie: Aby zatrzymać automatyczne skanowanie w trwającym eksperymencie w interfejsie internetowym, kliknij Edytuj obok żądanego eksperymentu, a następnie Anuluj oczekujące skanowanie i wybierz Anuluj zaplanowane przechwytywania.

Rysunek 2: Podgląd obrazu przechwytywania i wybór obszaru skanowania. (A) Dla każdego skanera w eksperymencie generowany jest podgląd obrazu. (B) Wybór jednego rzędu płyt na raz (czerwone pola), co zwiększa szybkość skanowania i zapobiega rozmyciu ruchu robaka w wyniku skanowania obszarów, które są zbyt szerokie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Akwizycja obrazu

UWAGA: Następujące kroki można wykonać zarówno w trakcie trwania eksperymentu, jak i po jego zakończeniu.

1. Wyprowadzanie pliku maski eksperymentu: Nieprzetworzone dane obrazu ze skanerów zawierają wiele obszarów, które nie muszą być przetwarzane (obszary poza płytami). Aby skupić analizę na każdej płycie z osobna, tworzona jest "maska", która określa obszar zajmowany przez każdą płytę na każdym skanerze. Wygeneruj tę maskę, rysując położenie każdej płyty jako nakładkę na obrazy zebrane przez skanery.
   1. Korzystając z przeglądarki robaków, wybierz żądany eksperyment, wybierając pozycję Plik, > wybierz bieżący eksperyment, a następnie kliknij nazwę eksperymentu.
   2. Ponownie w przeglądarce robaków wybierz opcję Pobieranie obrazu > Zdefiniuj maski próbki > Generuj kompozyt maski eksperymentu, a następnie zapisz maskę w żądanym miejscu. Upewnij się, że wynikowy plik wygląda podobnie do Rysunek 3A.

Rysunek 3: Specyfikacja lokalizacji płyt dla każdego skanera za pomocą masek próbek. Aby zapewnić niezależną analizę płyt w wybranych kolumnach pokazanych na rysunku Rysunek 1, poszczególne płyty muszą być identyfikowane poprzez wygenerowanie kompozytu maski obrazu. (A) Przechwytywanie skanów skanerów jest otwierane za pomocą oprogramowania do manipulacji obrazem (proszę zwrócić uwagę na nazwę skanera "han" nad zeskanowanym wyborem oraz "a-d" odnoszące się do każdej z kolumn). (B) Poszczególne etapy generowania maski w celu zaznaczenia położenia każdej płyty w kompozycji maski wymagają ustawienia tła na, (C) usunięcie postrzępionych krawędzi i krawędzi niewybranych płyt poprzez rozszerzanie, a następnie zmniejszanie tła, oraz (D) zaznaczenie płyt pierwszego planu i wypełnienie obszarów w całości białymi pikselami. (E) Aby LSM rozpoznał poszczególne płytki w zeskanowanych rzędach, każdy biały obszar w rzędzie jest wypełniany innym odcieniem szarości, zwykle o rosnącej jasności. (F) Na tym etapie maska jest zapisywana (kompresja LZW bez określonych warstw, jeśli została wygenerowana w Photoshopie). Maska jest następnie skanowana przez przeglądarkę robaków, a oprogramowanie generuje wizualizację maski. Poprawna wizualizacja maski powinna wyświetlać jeden zdefiniowany kwadrat na płytkę z małym krzyżykiem w środku i innym kolorem dla każdego wiersza. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Dodaj adnotację do maski eksperymentu: Otwórz plik wygenerowany w poprzednim kroku za pomocą programu do obróbki obrazów (takiego jak Photoshop lub GIMP), aby zaznaczyć położenie każdej płyty na obrazie. Poniżej znajduje się przegląd wszystkich etapów edycji maski przy użyciu programu Photoshop.
   1. W programie Photoshop wybierz narzędzie Wypełnienie z tolerancją ustawioną na zero, zaznaczoną opcją ciągłe i odznaczoną opcją wygładzania. Kliknij szare tło, aby ustawić je całkowicie na czarne. Upewnij się, że wynikowy obraz wygląda podobnie do Rysunek 3B.
   2. Użyj narzędzia magiczna różdżka, aby wybrać czarne tło, z aliasem ustawionym na wyłączone, tolerancją ustawioną na zero i wybraną opcją ciągłą. Aby wygładzić krawędzie, rozszerz wybrane tło o 30 pikseli, klikając Wybierz > Modyfikuj > Rozwiń. Następnie zmniejsz zaznaczenie o 20 pikseli w opcji Wybierz > modyfikuj > kontrakt. Upewnij się, że wynikowy obraz wygląda podobnie do Rysunek 3C.
   3. Wygładzone tło można całkowicie wypełnić czarnymi pikselami, na przykład ustawiając tolerancję narzędzia Wypełnienie na 255 i wypełniając zaznaczony obszar. Następnie kliknij Wybierz > odwrotność, aby odwrócić zaznaczenie i wybrać pierwszy plan. Wypełnij nowy obszar całkowicie białymi pikselami, na przykład ustawiając tolerancję narzędzia do wypełniania na 255 i wypełniając obszar kolorem białym. Upewnij się, że wynikowy obraz wygląda podobnie do Rysunek 3D.
   4. Aby oddzielić każdą płytkę w jednym regionie, wypełnij każdy wiersz innym gradientem szarości w celu zwiększenia jasności. Można to zrobić za pomocą narzędzia Wypełnienie, a następnie wybierając żądany kolor, z tolerancją ustawioną na 0. Upewnij się, że wynikowy obraz wygląda podobnie do Rysunek 3E. Zapisz go w kompresji LZW bez określonych "warstw".
      UWAGA: Kolejność płyt jest ustalana na podstawie koloru określonych obszarów. Aby nadać tabliczkom nazwy od 1 do 4 w kolejności od góry do dołu, określ kolory zwiększające jasność dla każdego wiersza.
   5. W przeglądarce robaków wybierz opcje Akwizycja obrazu > Zdefiniuj maski próbki > Analizuj lokalizacje płyt narysowanych na kompozycji maski eksperymentalnej, a następnie wybierz plik wygenerowany w poprzednim kroku. Oprogramowanie zajmie teraz kilka chwil na przeanalizowanie przesłanej maski.
   6. Przeglądarka robaków wyświetli wizualizację maski. Sprawdź maskę pod kątem potencjalnych błędów w pliku. Upewnij się, że każdy rząd talerzy jest wypełniony innym kolorem i obrysowany kolorowym prostokątem. Upewnij się, że wynikowy obraz wygląda podobnie do Rysunek 3F.
      UWAGA: Jeśli na jednej z płytek widoczne są co najmniej dwa okręgi lub dwa okręgi mają ten sam kolor, wróć do kroku 5.2, aby poprawić plik maski i załaduj go ponownie do przeglądarki robaków.
   7. Po sprawdzeniu, czy wizualizacja maski jest poprawna, w przeglądarce robaków wybierz opcję Pobieranie obrazu > Zdefiniuj maski próbki > Prześlij kompozyt przeanalizowanej maski eksperymentu do klastra. Serwer analizy obrazu będzie teraz analizował położenie wszystkich płyt w eksperymencie.
3. Zastosuj maskę: LSM używa masek do dzielenia surowych danych obrazu na poszczególne płyty. Aby rozpocząć ten proces, zaplanuj zadanie aplikacji maski za pomocą interfejsu internetowego.
   1. Przed wysłaniem zadania sprawdź, czy wszystkie skanery zidentyfikowały obszary w masce. Przejdź do strony głównej interfejsu internetowego, znajdź nazwę eksperymentu i kolumnę o nazwie Analiza obrazu, a następnie kliknij pozycję Uruchom analizę. Sprawdź, czy wszystkie urządzenia w próbkach eksperymentów mają zidentyfikowane regiony.
   2. Aby zastosować maskę, w tym samym interfejsie kliknij Nowe zadanie dla wszystkich próbek. W polu o nazwie Zaplanuj zadanie dla poszczególnych obrazów zaznacz pole Zastosuj maskę, a następnie Zapisz zadanie.
      UWAGA: Maska zostanie zastosowana do wszystkich już przechwyconych obrazów, a także do wszystkich obrazów zarejestrowanych w przyszłości.
4. Wykonaj kontrolę jakości płyty:
   UWAGA: Płyty zanieczyszczone, wysuszone lub zamglenie są cenzurowane na tym etapie analizy obrazu. Przykład zanieczyszczonych, wysuszonych, zaparowanych i optymalnych płytek pokazano na Rysunek 4. Inne powody cenzurowania to głód, puste talerze lub larwy w bezpłodnych populacjach. Nieprawidłowe tabliczki często zawierają złożone kształty, które maszyna stara się zinterpretować jako nicienie. Ważne jest, aby na tym etapie wykluczyć nieprawidłowe płyty, aby zapobiec długim czasom przetwarzania w późniejszych etapach analizy obrazu.
   1. Korzystając z interfejsu internetowego, wyklucz płyty, które mają zostać ocenzurowane, znajdując żądany eksperyment i kolumnę o nazwie Opisz informacje o płycie, a następnie wybierając opcję Według obrazu.
   2. Aby sprawdzić tablice, kliknij Wyświetl obrazy.
      UWAGA: Jeśli krok wyświetlania obrazów nie działa poprawnie, może to oznaczać, że serwer Linux nie jest poprawnie skonfigurowany. Instrukcje, jak to zrobić, dostępne są w poradniku instalacji oprogramowania we wspomnianym repozytorium GitHub.
   3. Aby wykluczyć tablice, zaznacz pole Cenzura, wybierz opcję z listy rozwijanej o nazwie Powód cenzury, a następnie kliknij Zapisz dla każdej strony.
5. Dodaj informacje o metadanych: Metadane opisują zawartość każdej płytki w eksperymencie. Informacje te są następnie włączane do wszystkich plików danych statystycznych, które są następnie generowane.
   1. Aby dodać informacje o metadanych związanych ze szczepem, genotypem, temperaturą, żywnością itp., przejdź do strony głównej interfejsu internetowego, znajdź żądany eksperyment i kolumnę o nazwie Annotate Plate Information, a następnie wybierz Według pozycji.
   2. Wprowadź etykiety i wybierz skanery, dla których chcesz zapisać metadane, klikając Zapisz na urządzeniach w lewym dolnym rogu.
   3. Aby ponownie wykorzystać metadane między różnymi skanerami bez konieczności ponownego wprowadzania wszystkich etykiet, przejdź do opcji Załaduj z urządzenia w prawym górnym rogu, wybierz skaner, z którego chcesz ponownie użyć metadanych, i kliknij Załaduj z urządzenia.
6. Określ czas "zerowego wieku": Domyślnie LSM mierzy czas w odniesieniu do początku epoki UNIX. Rzadko jest to wygodne, dlatego wymagane jest określenie czasu referencyjnego (na przykład daty, w której wszystkie osobniki wykluły się lub osiągnęły dorosłość).
   1. Aby określić informacje o czasie zerowym, przejdź do strony głównej interfejsu internetowego, znajdź żądany eksperyment i kolumnę o nazwie Analiza obrazu, a następnie wybierz pozycję Uruchom analizę.
   2. Na nowej stronie, która zostanie wyświetlona, wybierz pozycję Nowe zadanie dla wszystkich regionów. W polu o nazwie Aktualizuj informacje o regionie wybierz Czas, w którym zwierzęta miały wiek 0, dodaj informacje, a następnie kliknij Aktualizuj wybrane pola.
      UWAGA: Jeśli wszystkie zwierzęta nie mają tego samego czasu zerowego wieku, wybierz zamiast tego Nowe zadanie dla określonych typów zwierząt i powtórz powyższe kroki dla każdej grupy.
7. Zaplanuj wykrywanie robaka: LSM może zautomatyzować wykrywanie każdego nicienia na podstawie jego położenia na płytce.
   1. Aby rozpocząć automatyczne wykrywanie nicieni dla każdego obrazu, przejdź do strony głównej interfejsu internetowego, znajdź żądany eksperyment i kolumnę o nazwie Analiza obrazu, a następnie wybierz pozycję Uruchom analizę.
   2. Na nowej stronie, która się pojawi, kliknij Nowe zadanie dla wszystkich regionów, a następnie pole o nazwie Zaplanuj zadanie dla poszczególnych obrazów i zaznacz pola Filtr mediany > Próg > Wykrywanie robaków > Zapisz zadanie. Te zadania zostaną zastosowane do wszystkich przeszłych i przyszłych przechwyconych obrazów.
      UWAGA: Aby zaplanować zadanie tylko dla określonego szczepu lub schorzenia, kliknij zamiast tego Zadania dla określonych typów zwierząt. Klasyfikacja obiektów jest wykonywana przy użyciu modeli SVM, które są określone jako pliki przechowywane w podfolderze Models w katalogu długoterminowego przechowywania LSM. Zestawy parametrów wykrywania nicieni w wersji 2.0 dla LSM można pobrać z repozytorium GitHub.

Rysunek 4: Kontrola jakości płyt za pomocą interfejsu internetowego. Cenzurowanie nieoptymalnych nagrań na interfejsie internetowym przed analizą ruchu robaka ma kluczowe znaczenie dla przyspieszenia procesu przetwarzania obrazu. Przykładami płytek podlegających usunięciu są warunki (A) wysuszenia, (B) zanieczyszczenia lub (C) zaparowania, w zależności od przypadku. (D) Optymalne płytki, które należy uwzględnić w dalszej analizie. Podziałka liniowa o średnicy 10 mm jest nakładana na obraz podglądowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Akwizycja po obrazie

UWAGA: Po zakończeniu wykrywania robaków, wszystkie dane zebrane z eksperymentu muszą być agregowane w czasie, aby śledzić każdą osobę przez cały okres jej życia i zidentyfikować czas śmierci wszystkich osób. Poczekaj, aż wszystkie zwierzęta w eksperymencie umrą i aż wszystkie zadania wykrywania robaków zostaną zakończone, a następnie wykonaj następujące kroki:

1. Zaplanuj analizę ruchu:
   1. Analiza ruchu integruje wszystkie dane eksperymentalne w czasie, aby oszacować czas śmierci. Aby rozpocząć to zadanie, przejdź do strony głównej interfejsu internetowego i znajdź żądany eksperyment w kolumnie o nazwie Analiza obrazu. Wybierz łącze Uruchom analizę.
   2. Na nowej stronie, która się pojawi, kliknij link Nowe zadanie dla wszystkich regionów, a następnie z menu rozwijanego Zaplanuj zadanie dla całego regionu, wybierz opcję Analizuj ruch robaka i kliknij przycisk Zapisz zadanie.
   3. Serwer akwizycji obrazów LSM automatycznie rozpocznie analizę ruchu na wszystkich płytach.
      UWAGA: Analiza ruchu jest największym pojedynczym zadaniem. Na nowoczesnym procesorze wielordzeniowym analiza każdej płytki z eksperymentu o żywotności 1 miesiąca może zająć 20 minut lub więcej.
2. Wygeneruj scenorys: Po zakończeniu analizy ruchu scenorys LSM umożliwia użytkownikom ręczną walidację automatycznych wyników i upewnienie się, że oprogramowanie przyjmuje prawidłowe założenia dotyczące morfologii i zachowania nicieni.
   1. Na stronie głównej interfejsu internetowego znajdź żądany eksperyment i kolumnę o nazwie Analiza obrazu, a następnie wybierz pozycję Uruchom analizę. Na nowej stronie, która się pojawi, kliknij pozycję Nowe zadanie eksperymentu. Następnie w sekcji Zaplanuj zadanie dla całego regionu wybierz opcję Generuj scenorys zwierząt i kliknij przycisk Zapisz zadanie.
   2. Po zakończeniu generowania scenorysu przez LSM przejdź do przeglądarki robaków i wybierz żądany eksperyment. Wróć do menu głównego i wybierz opcję Walidacja > Przeglądaj cały eksperyment > natychmiast po śmierci każdego robaka.
3. Dodawanie adnotacji do scenorysów w przeglądarce robaków: Typowy scenorys w przeglądarce robaków powinien wyglądać następująco: Rysunek 5.
   1. Dodawanie adnotacji do obiektów "niebędących robakami"
      UWAGA: Każdy obiekt wykryty podczas ruchu jest wyświetlany w scenorysie, uporządkowany według szacowanego czasu śmierci. O ile użytkownik nie określi inaczej, każdy obiekt zostanie uwzględniony w wynikowych krzywych przeżycia. Klasyfikacja obiektów LSM jest celowo kalibrowana tak, aby miała wysoki odsetek wyników fałszywie dodatnich, jako kompromis w celu zminimalizowania liczby niewykrytych nicieni. Wykluczenie obiektów niebędących robakami jest ważne dla uzyskania wysokiej jakości krzywych przeżycia (patrz reprezentatywne wyniki). Na pierwszej i ostatniej stronie scenorysu zwykle znajduje się duża liczba obiektów niebędących robakami, które można szybko ręcznie wykluczyć zbiorczo.
      1. Aby wykluczyć obiekty inne niż robaki z serii ujęć, kliknij raz prawym przyciskiem myszy obraz obiektu. Wykluczony obiekt zostanie teraz obrysowany białym polem. Aby wykluczyć wiele obiektów jednocześnie, przytrzymaj Control i kliknij prawym przyciskiem myszy dowolny obiekt, a wszystkie obiekty na stronie serii ujęć zostaną wykluczone.
      2. Po wykluczeniu obiektu z analizy można go ponownie uwzględnić, klikając ponownie dwukrotnie prawym przyciskiem myszy.
      3. Aby zapisać adnotacje wykonane podczas adnotacji scenorysu, kliknij przycisk Zapisz. Zaleca się częste zapisywanie postępu podczas dodawania adnotacji.
   2. Dodawanie adnotacji do czasów śmierci:
      UWAGA: Bez interwencji użytkownika LSM dokładnie szacuje czas śmierci dla większości populacji. Zaleca się jednak rutynowe potwierdzanie dokładności wyników automatycznych poprzez ręczną walidację losowego podzbioru osób z każdego eksperymentu. Szczególną uwagę należy zwrócić na osoby żyjące najkrócej i najdłużej, ponieważ wszelkie błędy w automatycznej analizie mają tendencję do grupowania się w tych grupach.
      1. Kliknij lewym przyciskiem myszy dowolny obiekt serii ujęć, aby otworzyć nowe okno, w którym są wyświetlane szczegółowe informacje o tym obiekcie w szeregach czasowych. To okno umożliwia inspekcję wszystkich obrazów obiektu zebranych w trakcie eksperymentu, a także ilościowe określenie dynamiki ruchu i morfologii obiektu. Korzystając z tego samego interfejsu, ręcznie dodawaj adnotacje do czasów śmierci. Interfejs do adnotacji czasu śmierci jest pokazany w Rysunek 6.
      2. Aby ręcznie dodać adnotacje do czasów śmierci, kliknij lewym przyciskiem myszy na dolnym pasku w punkcie odpowiadającym czasowi śmierci. Użyj spacji i strzałek w prawo lub w lewo na klawiaturze, aby poruszać się po przedziałach czasowych, lub kliknij bezpośrednio na pasku w żądanym przedziale czasu.
         UWAGA: Wizualizacja przedstawia stan ruchu zwierząt w czasie, podobnie jak poziomy wykres słupkowy z osią x oznaczającą czas. Różowa/fioletowa sekcja wskazuje przedział czasu, w którym obiekt porusza się energicznie, żółty oznacza słaby ruch, czerwony oznacza nieporuszające się zwierzęta, a zielony oznacza okres ekspansji związanej ze śmiercią. Nicienie wykazują charakterystyczne zdarzenia morfologiczne związane ze śmiercią: stopniowe kurczenie się ciała zwykle występuje przed śmiercią, po którym następuje gwałtowna ekspansja ciała w trakcie lub bezpośrednio po śmierci (Ryc. 6B). Obiekty niebędące robakami, takie jak kurz lub cienie, nie wykazują tej dynamiki w wielkości ciała, a zamiast tego zazwyczaj podążają za liniową, stopniową zmianą rozmiaru i intensywności w czasie. Ta różna dynamika wielkości ciała zapewnia szybką i prostą metodę szybkiej klasyfikacji i ręcznego wykluczania.
      3. W zależności od podejścia analitycznego, czas śmierci może być traktowany albo jako czas ustania ruchu (początek czerwonego paska w wizualizacji ruchu), albo jako czas ekspansji związanej ze śmiercią (zielony pasek w wizualizacji ruchu). Aby ręcznie dodać adnotacje do zdarzeń skurczu i rozszerzenia, kliknij prawym przyciskiem myszy dolny pasek w żądanym przedziale czasu.
   3. Niektóre podstawowe wizualizacje danych dotyczących śmiertelności są dostarczane natywnie w kliencie Worm Browser. Krzywe przeżycia i diagnostyka czasu zgonu są pokazane dla każdej populacji obecnej w scenorysie (Rysunek 7). Zobacz krzywe przeżycia po lewej stronie i wykres punktowy porównujący czas zaprzestania energicznych ruchów (VMC) z czasem śmierci dla każdej osoby po prawej stronie scenorysu.
      UWAGA: Możliwe jest pogrupowanie tych wyników według różnych parametrów eksperymentalnych poprzez podustawienie na dolnym pasku dla warunków, takich jak określone odkształcenia, skanery lub płytki. Poszczególne robaki można wybrać na podstawie ich czasu śmierci, klikając lewym przyciskiem myszy na poszczególne punkty na wykresie VMC w funkcji czasu śmierci.
4. Zapisywanie danych o śmiertelności na dysku: LSM generuje dane o śmiertelności w postaci plików CSV. Wykreśl wynikowe krzywe przeżycia i przeanalizuj je w dowolnym oprogramowaniu statystycznym, takim jak R, SAS, STATA lub JMP.
   1. Aby wygenerować te pliki, wybierz eksperyment w przeglądarce robaków, a następnie w menu wybierz Pliki danych, czasy śmierci, a następnie kliknij pozycję Generuj czasy śmierci dla bieżącego eksperymentu. LSM wygeneruje plik wyjściowy z danymi dotyczącymi przeżycia eksperymentu, który zostanie zapisany w katalogu wyników.
   2. Jeśli adnotacje odręczne zostały wykonane w serii ujęć, w przeglądarce robaka pojawi się monit z pytaniem, jak postępować z adnotacjami odręcznymi. Kliknij "Natychmiast", aby dołączyć adnotacje odręczne do wyprowadzonego pliku czasów śmierci.
      UWAGA: Pliki z danymi o śmiertelności są zapisywane w katalogu wyników określonym w pliku imageserver.ini. Zapisywane są różne pliki, ale najczęściej używaną wersją jest "survival_simple/survival=machine_hand", która zawiera wszystkie ręczne adnotacje wykonane za pomocą scenorysu.
   3. Analizuj dane dotyczące śmiertelności w wybranym oprogramowaniu statystycznym.

Rysunek 5: Scenorys zwierząt w przeglądarce robaków. (A) Wszystkie stacjonarne robaki są pokazane w porządku chronologicznym według czasu śmierci z adnotacjami maszynowymi. Aby poruszać się po serii ujęć, naciśnij przyciski w prawym dolnym rogu (B) i (C) często zapisuj adnotacje. (D) Obrazy z nieszarym tłem przedstawiają dwa przypadki śmierci robaka (wczesna śmierć jako kolor zielony, późniejsza śmierć jako kolor czerwony), które mogą wystąpić, gdy dwa robaki umierają blisko siebie, lub gdy martwe robaki są przenoszone przez przechodzącego robaka i w związku z tym są wykrywane jako martwe dwukrotnie. (E) Czerwony znacznik w dolnym rogu obrazu identyfikuje robaki z wykrytym czasem śmierci; (F) Zielona tabliczka wskazuje miejsce, w którym obiekt nie pozostawał w bezruchu na tyle długo, aby zarejestrować czas śmierci. (G) Wiele robaków w tej samej ramce może zostać oznaczonych poprzez naciśnięcie shift i kliknięcie lewym przyciskiem myszy. (H) Obiekty niebędące robakami są wykluczane z analizy przez kliknięcie prawym przyciskiem myszy. (I) Eksplodowane robaki są cenzurowane z analizy poprzez kliknięcie na odpowiadający mu obrazek (otworzy się okno adnotacji) oraz naciskanie shift i kliknięcie prawym przyciskiem myszy aż pojawi się komunikat "zwierzę eksplodowało". Podziałka liniowa o grubości 0,5 mm i etykiety są nakładane na zrzut ekranu okna przeglądarki robaka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Sprawdzanie obiektów i adnotacje o czasach śmierci w przeglądarce robaków. Kliknięcie lewym przyciskiem myszy dowolnego obiektu w scenorysie przeglądarki robaków otwiera nowy interfejs i pozwala użytkownikowi sprawdzić dynamikę ruchu obiektu. Po prawej stronie wyświetlany jest wynik ruchu (A), który określa ilościowo ruch obiektu; Szacuje się to na podstawie zmiany intensywności pikseli między kolejnymi obserwacjami. Dodatkowo po prawej stronie wyświetlana jest zmiana całkowitej intensywności obiektu, która określa ilościowo zmiany rozmiaru obiektu. Po lewej stronie, górny pasek pokazuje (C) maszynowe oszacowanie czasu śmierci, podczas gdy dolny pasek to (D) adnotacja odręczna człowieka. Kliknięcie w dowolny punkt pasków i naciśnięcie spacji pozwala użytkownikowi przejść przez ramy czasowe, w których robak został zobrazowany. Na tych paskach różowy reprezentuje czas spędzony w energicznym ruchu, czerwony reprezentuje czas spędzony w śmierci, a żółty to wszystko pomiędzy. Czas spędzony na rozszerzaniu i kurczeniu się po czasie śmierci jest pokazany na zielono. Etykiety są nakładane na zrzut ekranu okna przeglądarki robaka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Statystyki podsumowujące populację w przeglądarce robaków. Statystyki populacji dla urządzenia skanującego "obiwan", z wykresem przeżycia (lewy panel) i wykresem punktowym czasu zaprzestania energicznych ruchów (VMC) w funkcji czasu śmierci (prawy panel). Wykreślone są szczegóły (A) jednego warunku, uzyskanego z (B) jednego skanera uzyskanego przez uprzednie wybranie (C) grupy przeżycia według szczepu. (D) Kwadratowe kształty na wykresie punktowym przedstawiają zdarzenia z adnotacjami odręcznymi, podczas gdy (E) okrągłe kształty przedstawiają zdarzenia oznaczone maszynowo. (F) Adnotacja odręczna jest często wymagana w przypadku zdarzeń śmierci, które nastąpiły wcześnie lub (G) tych, w których czas zaprzestania energicznych ruchów zbiega się z czasem śmierci. Etykiety są nakładane na zrzut ekranu okna przeglądarki robaka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

Eksperymentalna powtarzalność w testach długości życia jest wyzwaniem i wymaga zarówno ściśle kontrolowanych warunków eksperymentalnych, jak i dużych populacji, aby osiągnąć wystarczającą rozdzielczość statystyczną^4,36. LSM doskonale nadaje się do badania dużych populacji zwierząt w stałym środowisku z wysoką rozdzielczością czasową. Aby zademonstrować możliwości LSM, podkreślić kluczowe etapy analizy i pomóc badaczom w ustaleniu priorytetów ich wysiłków związanych z pracą, przedstawiamy podzbiór danych z optymalnego, wcześniej opublikowanego eksperymentu²³. Ze względu na charakter tego eksperymentu jako testu dawka-odpowiedź, do wiarygodnego wykrywania zmian w długości życia potrzebna była znaczna liczba zwierząt. Z drugiej strony, eksperyment ten wymagałby intensywnego zaangażowania czasowego ze strony wielu badaczy lub, gdyby został zmniejszony, doprowadziłby do słabych wyników. Zestaw danych mierzył ilościowe zmiany w długości życia po usunięciu genu podjednostki polimerazy II (b) RNA (RPB-2), wymaganego do transkrypcji informacyjnego RNA. Korzystanie z systemu indukowanego auksyną³⁷ w C. elegans, endogenne locus RPB-2 zostało oznaczone sekwencją degronową w celu warunkowego ubikwitylacji i degradacji RPB-2 przy użyciu różnych stężeń auksyny (kwasu α-naftaleneoctowego). Eksperyment przeprowadzono na AMP100 [rpb-2 (cer135); eft-3p::TIR-1] z cer135 odpowiadającym znacznikowi AID wstawionemu przez CRISPR rpb-2::GFPΔpiRNA::AID::3xFLAG²³. Warunki eksperymentalne były w temperaturze 20 °C i przy użyciu NEC937 inaktywowanego promieniami UV (OP50 ΔuvrA; KanR)³⁸ E. Coli. Hermafrodyty sterylizowano poprzez przeniesienie nicieni w późnym stadium L4 na płytki zawierające 5-fluoro-2-deoksyurydynę (FUdR). Nicienie przeniesiono w 2. dniu dorosłego życia na płytki zawierające różne stężenia auksyny. W pierwotnym badaniu autorzy wykazali, że w obecności auksyny degradacja RPB-2 skracała długość życia w sposób zależny od dawki²³.

Tutaj pokazujemy wkład, jaki walidacja danych po eksperymencie i adnotacja wnoszą do końcowego wyniku krzywej przeżycia (Rysunek 8). W ostatnich krokach analizy obrazu w storyboardzie Worm Browser porównaliśmy surowe krzywe przeżycia utworzone przed adnotacją scenorysu z krzywymi przeżycia utworzonymi po ręcznym wykluczeniu obiektów niebędących robakami, a także z krzywymi przeżycia utworzonymi po adnotacji zarówno obiektów niebędących robakami, jak i indywidualnych czasów śmierci (Rysunek 8A-C). Odkryliśmy, że początkowe krzywe przeżycia utworzone przed adnotacją scenorysu (Rysunek 8A) były zniekształcone przez niewłaściwe włączenie obiektów niebędących robakami, co było najbardziej widoczne w ogonach krzywych przeżycia. Przed ręczną adnotacją krzywe przeżycia obejmowały wszystkie obiekty wykryte przez maszynę jako potencjalne obiekty robaków, z których około połowa, ze względu na celowo wysoki odsetek wyników fałszywie dodatnich, była obiektami niebędącymi robakami i musiała zostać ręcznie wykluczona (Rysunek 8D). Jest to zgodne z projektem, ponieważ algorytmy są skalibrowane tak, aby miały stosunkowo wysoki odsetek wyników fałszywie ujemnych, ponieważ znacznie łatwiej jest wykluczyć nieprawidłowo uwzględnione obiekty niż wyszukać i odzyskać nieprawidłowo wykluczone obiekty. Po wykluczeniu obiektów niebędących robakami podczas ręcznej adnotacji scenorysu, wynikowe krzywe przeżycia miały znacznie wyższą rozdzielczość (Rysunek 8B,E), a dalsze ręczne adnotacje czasów śmierci na scenorysie spowodowały zmiany nie większe niż ~4% w szacowanej średniej długości życia. W związku z tym wykazaliśmy, że usunięcie obiektów niebędących robakami podczas procesu analizy obrazu LSM jest kluczowym krokiem do uzyskania dobrze rozdzielonych krzywych przeżycia.

Rysunek 8: Wpływ ręcznej walidacji danych na krzywe przeżycia. Degradacja RPB-2 skraca C. długość życia eleganów w obecności auksyny (K-NAA: kwas α-natalenooctowy) w sposób zależny od dawki. (A) Krzywe przeżycia wykreślone z surowych danych wyjściowych LSM po kontroli jakości płyt i bez ręcznych adnotacji obiektów robaków w scenorysie Worm Browser. (B) Krzywe przeżycia wykreślone po ręcznym opisaniu obiektów robaków w scenorysie. (C) Krzywe przeżycia wykreślone po ręcznym opisie obiektów robaków i czasów śmierci w scenorysie. (D) Podsumowanie wszystkich obiektów wykrytych przez LSM. Ocenzurowane obiekty robaków obejmowały obiekty wykluczone automatycznie (na przykład z powodu robaków przemieszczających się poza skanowany obszar) lub ręcznie przez eksperymentatora (na przykład z powodu pękania robaków). (E) Tabelaryczna reprezentacja szacowanej średniej długości życia po adnotacji o obiekcie robaka (po lewej) i dodatkowej adnotacji o czasie śmierci przez rękę (po prawej). Procentowa różnica w średniej długości życia między sąsiednimi grupami o różnych stężeniach auksyny i statystycznej mocy wykrywania. Wszystkie wykresy zostały wykreślone w programie statystycznym JMP. Dane dla tego rysunku zostały zaadaptowane za zgodą Oswal et al.²³. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wychodząc poza długość życia jako pojedynczy punkt końcowy do badania starzenia się, rozważyliśmy starzenie behawioralne i zbadaliśmy, które etapy poeksperymentalnej analizy obrazu były najbardziej kluczowe dla jego pomiaru. Koncentrując się na związku między zaprzestaniem energicznego ruchu (VMC) a długością życia, porównaliśmy wyniki LSM na różnych etapach analizy i walidacji obrazu (Rysunek 9A-D). Odkryliśmy, że obiekty niebędące robakami wykazywały unikalną zależność między pozornym VMC a długością życia, przy czym oba te elementy są oznaczone jako występujące prawie jednocześnie w każdym obiekcie (Rysunek 9A). Natomiast prawdziwe nicienie zwykle przestawały się energicznie poruszać na kilka dni przed śmiercią (Ryc. 9A). Ta różnica w zależności między VMC a długością życia zapewnia dodatkowy sposób szybkiej identyfikacji i wykluczania obiektów innych niż robaki.

Rysunek 9: Wpływ ręcznej walidacji danych na analizę intensywnego zaprzestania ruchu (VMC). (A) Dane dotyczące starzenia się behawioralnego bez ręcznych adnotacji obiektów robaków w storyboardzie przeglądarki robaków, wyświetlające związek między czasami śmierci a czasami VMC w obiektach niebędących robakami (na czarno) w porównaniu z obiektami robaków (na czerwono). (B) Dane dotyczące starzenia się behawioralnego wykreślone po ręcznym adnotacji obiektów robaków w scenorysie. (C) Dane dotyczące starzenia się behawioralnego wykreślone po ręcznym naniesieniu adnotacji na temat obiektów robaków i czasów śmierci w serii ujęć. (D) Tabelaryczna reprezentacja średniej pozostałej długości życia (ARL; uzyskana z przecięcia między wiekiem zgonu a wiekiem VMC) na różnych etapach procesu analizy obrazu oraz procentową różnicą w ARL między adnotacją obiektu robaka a dalszą adnotacją czasu śmierci. (E) Graficzne przedstawienie szacowanych ARL na różnych etapach analizy po uzyskaniu obrazu oraz ich związek z długością życia robaków (która zależy od stężenia auksyny: kwas α-natalenooctowy). Dopasowanie splajnu zostało wykonane metodą splajnu sześciennego. Wszystkie wykresy zostały wykreślone w programie statystycznym JMP. Dane dla tego rysunku zostały zaadaptowane za zgodą Oswal et al.²³. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Stwierdziliśmy, że adnotacja i wykluczenie obiektów niebędących robakami za pomocą przeglądarki robaków było wystarczające, aby w przybliżeniu oszacować związek między VMC a czasem śmierci (Rysunek 9A-C), podsumowując oczekiwaną dynamikę fizjologicznego spadku liczby nicieni²³. Aby dokładniej to zbadać, rozważyliśmy ten sam zestaw danych polimerazy II RNA i oszacowaliśmy średnią pozostałą długość życia (ARL) po VMC dla każdej subpopulacji jako przecięcie modelu regresji liniowej wiążącego długość życia z VMC. Aby zrozumieć wpływ adnotacji danych na ARL, ponownie obliczyliśmy ARL po każdym kroku adnotacji danych (Rysunek 9E). Odkryliśmy, że ręczna adnotacja czasów śmierci w behawioralnej analizie starzenia się była szczególnie ważna u dłużej żyjących robaków, w tym przypadku tych narażonych na najniższe stężenia auksyny (Rysunek 9D, E). W przeciwieństwie do minimalnego wpływu na krzywe przeżycia, ręczna adnotacja czasu zgonu miała istotny wpływ na ilościową zależność między VMC a długością życia, zwiększając szacowaną ARL, na przykład przy 0 μM auksyny, z 8,09 dnia do 10,42 dnia po śmierci; Stanowi to różnicę ARL wynoszącą 29%. W związku z tym stwierdziliśmy, że związek między VMC a czasem zgonu wyjaśniony przez ARL był znacznie bardziej wrażliwy na ręczne adnotacje czasów śmierci w porównaniu z pomiarami czasu zgonu dla samej długości życia. Wrażliwość tę można wytłumaczyć względnym czasem trwania ARL i długością życia; te same korekty czasu śmierci będą zwykle małe w stosunku do długości życia, ale duże w stosunku do ARL. W związku z tym zmiany w czasach śmierci będą miały większy względny wpływ na ARL w porównaniu z długością życia.

Plik uzupełniający 1: Struktura pliku harmonogramu eksperymentów Maszyny Żywotności. Harmonogram eksperymentu składa się z trzech części. Po pierwsze, dołączane są podstawowe informacje o eksperymencie, takie jak nazwa i specyfikacja przechwytywania. Z tej części wynika, że dla każdego nowego eksperymentu należy zmieniać tylko nazwę eksperymentu. Druga część dokumentu jest generowana przez wyeksportowanie obszarów skanowania z przeglądarki robaków i określa fizyczną lokalizację obszarów skanowania dla każdego skanera ("asuna", "bulma", "moskwa", "rio", "yuno" i "yuki" w tym przykładzie). Są one zastępowane przy każdym nowym eksperymencie i kopiowane z plików TXT wygenerowanych dla każdego skanera indywidualnie w kroku 4.1.2.3. Trzecia część dokumentu zawiera informacje o czasie trwania eksperymentu, który również powinien być modyfikowany dla każdego nowego eksperymentu, oraz o częstotliwości przechwytywania. Urządzenie będzie skanować każdy zdefiniowany obszar pojedynczo w określonych odstępach czasu przez cały czas trwania eksperymentu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W tym miejscu udostępniamy szczegółowy, dostępny protokół do przeprowadzania eksperymentu przy użyciu najnowszej wersji Lifespan Machine. Wykazaliśmy, że kluczowym krokiem dla osiągnięcia dobrze rozdzielonych krzywych przeżycia jest ręczne wykluczanie obiektów niebędących robakami podczas akwizycji po pobraniu obrazu. Ręczna adnotacja czasu zgonu ma niewielki wpływ na ogólny kształt krzywych przeżycia, co pokazuje, że w pełni zautomatyzowane szacowanie czasu zgonu jest skuteczne nawet bez ręcznej adnotacji (Rysunek 8). Wręcz przeciwnie, uzyskanie wysokiej jakości danych dotyczących starzenia się wymaga dokładniejszego opisywania czasu śmierci, zwłaszcza u osób długowiecznych (ryc. 9). W związku z tym ilość czasu potrzebna na ręczne adnotacje do scenorysu będzie ostatecznie zależeć od konkretnego mierzonego wyniku. Ogólnie rzecz biorąc, stwierdzamy, że podczas pracy z LSM wysiłki badacza są najbardziej kluczowe podczas konfiguracji eksperymentalnej i, w mniejszym stopniu, podczas analizy po akwizycji obrazu. Na koniec podkreślamy wartość wysokowydajnych, zautomatyzowanych testów w tworzeniu wysoce rozdzielczych danych dotyczących przeżycia i behawioralnego starzenia się, przy jednoczesnym zwiększeniu produktywności badaczy i wspieraniu odtwarzalności eksperymentalnej.

LSM umieszcza nicienie na płytkach agarowych, odtwarzając klasyczny test długości życia w zautomatyzowanym kontekście. Inne narzędzia zostały opracowane w celu zautomatyzowania pomiaru długości życia C. elegans przy użyciu różnych metod ograniczania nicieni. Należą do nich podejścia, w których pojedyncze nicienie są trzymane w pożywkach stałych (WorMotel¹⁵) lub w urządzeniu mikroprzepływowym (Lifespan-on-a-chip¹¹) lub te, które śledzą większą populację zwierząt za pomocą mikroprzepływów (WormFarm¹⁴). Do zalet platform mikroprzepływowych należy możliwość precyzyjnej kontroli środowiska w czasie rzeczywistym oraz automatyczne usuwanie potomstwa poprzez wykluczenie wielkości. Jednak wspomniane urządzenia do tej pory nie okazały się łatwe do skalowania, ponieważ wymagają rozległej obsługi ręcznej i często polegają na codziennym przechwytywaniu obrazu lub wideo uruchamianym przez eksperymentatora. Inne platformy, takie jak Stress-Chip³⁹, wykorzystują zmodyfikowane skanery płaskie zaprojektowane dla LSM do obrazowania niestandardowych urządzeń mikroprzepływowych.

W przeciwieństwie do innych metod, LSM posiada rozbudowane możliwości adnotacji i walidacji danych, umożliwiając w ten sposób użytkownikom systematyczne przeprowadzanie kontroli jakości wymaganej do zbierania precyzyjnych i dokładnych danych o wysokiej rozdzielczości w kontekście wysokiej przepustowości¹³. Technika ta jest wszechstronna ze względu na wykorzystanie obecnych protokołów laboratoryjnych opartych na płytkach agarowych i oferuje wyjątkową przewagę w zakresie skalowalności eksperymentalnej ze względu na względną łatwość ustawiania dużych grup skanerów płaskich. Chociaż LSM wymaga początkowej inwestycji czasowej w zbudowanie i obsługę oraz przeszkolenie użytkowników w zakresie specjalistycznego oprogramowania, koszty te są równoważone przez solidną, wysokowydajną produkcję danych o żywotności. Klaster maszyn składający się z 50 lub więcej skanerów został wdrożony w kilku laboratoriach, działających nieprzerwanie przez ponad dekadę⁴⁰.

LSM ma ograniczenia. Zwierzęta są umieszczane w skanerach podczas automatycznego zbierania danych dotyczących przeżycia, co ogranicza zdolność badaczy do wykonywania interwencji eksperymentalnych równolegle z obserwacją i wymaga sterylizacji zwierząt lub rozpoczęcia eksperymentów po fazie rozrodczej nicieni. Zmiany temperatury są rzadkim wyjątkiem od ograniczenia interwencji, ponieważ temperaturę otoczenia można modulować bez konieczności otwierania skanerów i uzyskiwania dostępu do zwierząt. W przypadkach, w których konieczne jest zastosowanie interwencji praktycznych w odniesieniu do nicieni w średnim wieku, powszechnym rozwiązaniem jest opóźnienie rozpoczęcia automatycznej obserwacji do czasu przeprowadzenia niezbędnego postępowania ze zwierzętami. Ponadto istnieje nieodłączna różnica w rozmieszczeniu płyt wewnątrz skanerów i w ich poprzek. Mogą one podlegać niewielkim, lokalnym różnicom w warunkach środowiskowych (takich jak temperatura, światło, wentylacja itp.), które mogą wpływać na C. Długość życia eleganów ¹⁹. Ten wpływ środowiska można dodatkowo określić ilościowo i zbadać za pomocą modeli przyspieszonej regresji czasu awarii⁴¹. Sposobem na złagodzenie tego efektu jest po prostu skalowanie liczby płyt i skanerów w celu uzyskania rygorystycznego pomiaru niezależnego od wahań środowiska. Zazwyczaj płytki z tym samym schorzeniem są losowo rozmieszczone w każdym skanerze, a populacje wielkości większe niż 500 osób na stan i między skanerami wykazały statystycznie solidne szacunki przeżycia³¹.

Ogólnie rzecz biorąc, LSM pozwala na bardzo dokładne i duże gromadzenie danych dotyczących przeżycia i starzenia się behawioralnego, a także może umożliwić przeprowadzanie wcześniej niewykonalnych badań przesiewowych w sposób ilościowy. W ten sposób LSM przyczynia się do znacznego postępu technicznego w ustandaryzowanym zbiorze krzywych przeżycia i zapewnia nowatorskie ramy dla sprzężonych badań nad długością życia i starzeniem się behawioralnym nicieni.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas 1-naftaleneoctowy (auksyna)	Sigma	N0640	Rozpuścić auksynę w 1M wodorotlenku potasu i dodać do stopionego agaru
5-fluoro-2-deoksyurydynę (FUDR)	Sigma	F0503	27,5 μ g/ml FUDR zastosowano do eliminacji potomstwa z populacji na bakteriach inaktywowanych promieniowaniem UV
Płyn do mycia szkła	Kristal-M	QB-KRISTAL-M125ml
Hydrofobowa powłoka przeciwmgielna do szkła	Rain-X Scheibenreiniger	C. 059140
Guma matowa	Lokalny crafstman		Wycięte na arkuszu gumy EPDM o wysokiej wytrzymałości
Szkło skanera	Lokalny dostawca		9 "x 11,5" cala arkusz szkła
Płytki skanera Nauki	biologiczne	351006	50 mm x 9 mm, polistyrenowa szalka Petriego
Termometr referencyjny USB	Brando	ULIFE055500	Do kalibracji temperatury skanerów