Metody elektroporacji i potwierdzania przemian u Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Summary

Tutaj prezentujemy protokoły pracy z DSM20016 Limosilactobacillus reuteri, szczegółowo opisując wzrost, transformację plazmidu, PCR kolonii, pomiar fluorescencyjnego białka reporterowego i ograniczone mini-przygotowanie plazmidu, a także typowe problemy i rozwiązywanie problemów. Protokoły te umożliwiają pomiar białek reporterowych w DSM20016 lub potwierdzenie za pomocą PCR kolonii, jeśli nie jest zaangażowany reporter.

Abstract

Lactobacillus były niewiarygodnie dużym, różnorodnym rodzajem bakterii obejmującym 261 gatunków, z których kilka było szczepami komensalnymi z potencjałem do wykorzystania jako podwozie dla syntetycznych przedsięwzięć biologicznych w przewodzie pokarmowym. Duża zmienność fenotypowa i genotypowa zaobserwowana w obrębie rodzaju doprowadziła do niedawnej reklasyfikacji i wprowadzenia 23 nowych rodzajów.

Ze względu na szeroki zakres różnic w obrębie starych rodzajów, protokoły zademonstrowane u jednego członka mogą nie działać tak, jak reklamowano u innych członków. Brak scentralizowanych informacji na temat tego, jak dokładnie manipulować określonymi szczepami, doprowadził do szeregu podejść ad hoc, często zaadaptowanych z innych rodzin bakterii. Może to skomplikować sprawy dla badaczy rozpoczynających pracę w tej dziedzinie, którzy mogą nie wiedzieć, które informacje mają lub nie odnoszą się do wybranego przez nich szczepu.

W tym artykule staramy się scentralizować zestaw protokołów, które okazały się skuteczne, szczególnie w przypadku szczepu Limosilactobacillus reuteri o oznaczeniu F275 (inne numery kolekcji: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), wraz z poradami dotyczącymi rozwiązywania problemów i typowymi problemami, które można napotkać. Protokoły te powinny umożliwić badaczowi z niewielkim lub zerowym doświadczeniem w pracy z L. reuteri DSM20016 transformację plazmidu, potwierdzenie transformacji i pomiar sprzężenia zwrotnego systemu w czytniku płytkowym za pośrednictwem białka reporterowego.

Introduction

Rodzaj Lactobacillus był historycznie klasyfikowany jako Gram-dodatnie, pręcikowate, nietworzące przetrwalników, albo fakultatywne beztlenowce, albo mikroaerofile, które rozkładają cukry głównie do produkcji kwasu mlekowego¹. Te luźne kryteria doprowadziły do tego, że Lactobacillus jest, fenotypowo i genotypowo, niezwykle zróżnicowanym rodzajem. Ta szeroka kategoryzacja spowodowała przeklasyfikowanie rodzaju, wprowadzając 23 nowe rodzaje w 2020 roku².

Stary, szerszy rodzaj obejmował główne gatunki komensalne i probiotyczne, ogólnie uważane za bezpieczne (GRAS) do spożycia³. Rodzina Lactobacillaceae utrzymuje publiczne postrzeganie jako "dobre bakterie" ze względu na wiele zgłaszanych korzyści zdrowotnych wynikających z konsumpcji różnych szczepów^4,5,6,7. Łatwość, z jaką mogą poruszać się po przewodzie pokarmowym⁸ i ich publiczna akceptacja sprawiają, że szczepy Lactobacillaceae są silnymi kandydatami jako organizmy chassowe do spożycia, zastosowań leczniczych, terapeutycznych lub diagnostycznych.

Szeroki zakres cech występujących w rodzinie Lactobacillaceae doprowadził do sytuacji, w której de facto nie ma szczepu organizmu modelowego; grupy badawcze miały tendencję do wybierania gatunków o właściwościach najbardziej istotnych dla ich szczególnych celów. (Na przykład, laboratoria fermentacji mlecznej mogą wybrać L. lactis; badania nad fermentacją warzyw mogą wybrać L. plantarum; badania nad probiotykami mogą koncentrować się na L. acidophilus; i tak dalej.)

Ten sam szeroki zakres cech charakterystycznych dla różnych gatunków doprowadził do nagromadzenia protokołów i procedur, które mogą działać dobrze dla jednego podzbioru rodziny Lactobacillaceae, ale wymagają optymalizacji, aby działały efektywnie (a może w ogóle działały) w innych⁹. Ta potrzeba optymalizacji między członkami rodziny, a nawet w obrębie członków tego samego gatunku, może udaremnić wysiłki niezaznajomionych z nią badaczy. Protokoły publikowane w sekcjach metod artykułów mogą również zawierać własne modyfikacje¹⁰, co prowadzi do fragmentarycznych, zdecentralizowanych zbiorów protokołów.

L. reuteri jest uważany za powszechnie występujący komensal kręgowców, spotykany konsekwentnie u ssaków, ptaków¹¹ i ryb¹² przewodu pokarmowego (GI). Podszczepy L. reuteri są często genetycznie wyspecjalizowane, poprzez adaptację białka adhezyjnego śluzu, w celu bardziej trwałej kolonizacji określonych rodzimych gospodarzy^8,11,13. Przewód pokarmowy Gatunki Limosilactobacillus mogą być izolowane w żywicielach poza ich rodzimym żywicielem, ale mają tendencję bardziej do przejściowej natury⁸.

Ze względu na specjalizację człowiek-gospodarz, L. reuteri DSM20016 bardzo dobrze pozycjonuje się jako podłoże do zastosowań diagnostycznych lub terapeutycznych w dowolnym momencie ludzkiego przewodu pokarmowego, a szczep DSM20016 może zapewnić długotrwałe okno efektu dla interwencji w porównaniu do bardziej przejściowych szczepów.

W tym artykule przedstawiamy serię protokołów o udowodnionej skuteczności w Limosilactobacillus reuteri (oznaczenie szczepu: F275; inne numery kolekcji: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), wraz ze scentralizowanymi informacjami o szczepie z innych źródeł, aby pomóc w zastosowaniach biologii molekularnej i systemowej. Procedury określone w niniejszym dokumencie powinny umożliwić badaczowi bez wcześniejszego doświadczenia hodowlę L. reuteri, tworzenie elektrokompetentnych stad, selekcję przekształconych kolonii, potwierdzanie transformacji za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy kolonii (PCR) i mierzenie zaprojektowanej odpowiedzi systemu za pomocą fluorescencyjnych białek reporterowych.

Zauważamy, że powiązane protokoły obejmowały rekombinację genomu ssDNA wspomaganą CRISPR-Cas9 u L. reuteri (szczep: ATCC-PTA-6475)¹⁴, oraz edycji genomu wspomaganej nickazą CRSIPR-Cas9 w wielu innych niż L. reuteri, Lactobacillaceae family stains^15,16; nie dotyczą one jednak szczepu L. reuteri DSM20016, na którym się tutaj skupiamy.

Protocol

1. Przygotowanie L. reuteri DSM20016 elektrokompetentnych komórek

UWAGA: To jest oparte na protokole Berthier et al.¹⁷, z prędkościami wirowania podanymi przez Rattanachaikunsopon et al.¹⁸.

1. W probówce wirówkowej o pojemności 50 ml zaszczepić L. reuteri z wywaru glicerolu w 6 ml bulionu deMan Rogosa Sharpe (MRS). Inkubować tlenowo przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze statycznym.
2. Następnego ranka zaszczepić 4 ml nocnej kultury w 200 ml bulionu MRS (rozcieńczenie 1:50).
3. Pozostawić do wzrostu tlenowego w statycznym inkubatorze o temperaturze 37 °C, aż wartość gęstości optycznej 600 nm (OD600) osiągnie 0,5-0,85; powinno to zająć około 2-3 godzin.
4. Gdy tylko zostanie osiągnięta odpowiednia wartość OD600, zdekantuj pożywkę do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i umieść na lodzie, jednocześnie równoważąc probówki.
5. Wirować przez 5 minut przy 5 000 x g w wstępnie schłodzonej wirówce o temperaturze 4 °C.
6. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić każdy osad w 50 ml wstępnie schłodzonego (0 °C do 4 °C) ddH₂O i ponownie odwirować z tymi samymi ustawieniami, co w poprzednim kroku. Utrzymuj komórki na lodzie tak bardzo, jak to możliwe.
7. Powtórz krok 1.6.
8. Zawiesić każdą granulkę w 25 ml ddH₂O: 0,5 M sacharozy, 10% glicerolu. Wirować przy 5 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min. Odrzucić supernatant i umieścić komórki z powrotem na lodzie.
9. Ponownie zawiesić wszystkie granulki w tych samych 2 ml ddH₂O: 0,5 M sacharozy, 10% glicerolu.
10. Podwielokrotność podzielić na porcje o pojemności od 50 μl do 100 μl we wstępnie schłodzonych probówkach do mikrowirówek; przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.

2. Elektroporacja L. reuteri

UWAGA: Unikaj pipetowania tak bardzo, jak to możliwe, w następujących krokach. Zaleca się włączenie kontrolnej elektroporacji, bez dodatku plazmidu, aby upewnić się, że dobór antybiotyków jest odpowiedni.

1. Weź całą elektrokompetentną podwielokrotność L. reuteri i rozmroź ją na lodzie.
2. Delikatnie wymieszać 5 μl z 10 μl plazmidu (końcowe stężenie plazmidu >6 nM) z rozmrożoną podwielokrotnością, unikając w miarę możliwości pipetowania.
3. Przenieść do chłodzonej lodem kuwety elektroporacyjnej o szczelinie 1 mm.
4. Elektroporacja przy napięciu 1,25 kV, 400 Ω i 25 μF.
5. Dodaj 1 ml bulionu MRS o temperaturze pokojowej (RT) i wymieszaj, odwracając kuwetę raz lub dwa razy.
6. Umieścić kuwety w inkubatorze statycznym w temperaturze 37 °C na 2,5-3 godziny, aby umożliwić ich odzyskanie.
7. Umieść całą ilość na wielu płytkach agarowych MRS z odpowiednim doborem.
8. Umieść płytki w całkowicie hermetycznym pojemniku z małą zapaloną świecą ("tealight") i saszetką wytwarzającą atmosferę beztlenową.
9. Rosnąć w temperaturze 37 °C przez 2-3 dni lub do momentu, gdy pojawią się widoczne kolonie.

3. Pomiar kwasoodpornego fluorescencyjnego białka reporterowego mCherry2

1. Wybierz wszystkie kolonie wymagane do pomiaru i zaszczepij w 96-dołkowej mikropłytce do przechowywania z 1,5 ml sterylizowanego filtrem (nieautoklawizowanego) bulionu MRS na studzienkę i odpowiednio dobranym antybiotykiem.
2. Inkubować tlenowo przez 24 godziny przez noc w temperaturze 37 °C bez wstrząsania.
   UWAGA: Tę mikropłytkę do przechowywania należy przechowywać do wykorzystania w sekcji 4 (PCR kolonii).
3. L. reuteri wytrąca się z pożywki w fazie stacjonarnej; posiew na noc należy zawiesić za pomocą pipetowania.
4. Przenieść 200 μl na płaską, przezroczystą płytkę 96-dołkową, przenieść płytkę do czytnika płytek i zmierzyć OD i fluorescencję mCherry2 (wzbudzenie [Ex]: 589 nm; emisja [Em]: 610 nm) lub innych odpowiednich reporterów.

4. Potwierdzenie wychwytu plazmidu za pomocą PCR kolonii

1. Z 96-dołkowej mikropłytki do przechowywania z sekcji 3 przenieść 5 μl do probówki PCR.
   UWAGA: Jeśli minęło >5 minut, może być konieczne ponowne zawieszenie L. reuteri po raz drugi.
2. W przenośnej mikrowirówce stołowej odwirować w dół, aż będzie widać osad (około 2 minuty przy 2,000 x g), wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 20 μl 20 mM NaOH.
3. Gotować w temperaturze 95 °C przez 5 minut, odwirować i powtórzyć gotowanie po raz drugi.
4. Natychmiast schłodzić próbki; w kolejnych krokach należy starać się trzymać próbki w jak największym stopniu na lodzie, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo degradacji matrycy i zahamowania PCR.
5. Wirować w przenośnej mikrowirówce stołowej o masie 2 000 x g przez 2 minuty, aż resztki komórek zostaną granulowane, następnie pobrać 1 μl supernatantu i rozcieńczyć w 99 μl lodowatego ddH₂O wolnego od DNaz i RNaz (100-krotne rozcieńczenie).
6. Użyj 100-krotnego rozcieńczenia jako matrycy DNA w standardowej reakcji PCR przy użyciu starterów specyficznych dla plazmidu. Dołączyć kontrolę pozytywną z plazmidem pochodzącym z minipreparatu E. coli.
7. Próbki należy umieścić z powrotem na lodzie i dodać odpowiedni barwnik ładujący o stężeniu 1x.
8. Uruchomić w 1% żelu agarozowym w buforze TAE (kwas tris-octan-etylenodiaminotetraoctowy [EDTA]) pod napięciem 110 V przez 30 minut. Obraz, jeśli to konieczne.

5. Protokół mini-przygotowania dla L. reuteri , a następnie PCR w celu potwierdzenia obecności plazmidu

UWAGA: Protokół przeznaczony do użycia z zestawem mini-przygotowawczym wymienionym w Tabeli Materiałów.

1. Inokulować L. reuteri w 10 ml bulionu MRS zawierającego odpowiedni antybiotyk i inkubować przez noc w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C w inkubatorze statycznym.
2. Wirować przy 5 000 x g przez 10 minut w wstępnie schłodzonej wirówce o temperaturze 4 °C.
3. Przemyć osad w 2 ml standardowego buforu P1 (dołączonego do zestawu) w celu zniwelowania kwasowości, która może zakłócać późniejsze etapy, odwirować z tym samym ustawieniem, jak opisano poprzednio, i wyrzucić supernatant.
4. Zawiesić osad w 250 μl zmodyfikowanego buforu P1 zawierającego 10 mg/ml lizozymu i 100 U/ml mutanolizyny w celu lizy komórek bakteryjnych. Inkubować przez 1-2 godziny w temperaturze 37 °C.
5. Dodać 250 μl buforu P2, wymieszać przez odwrócenie cztery do sześciu razy i inkubować w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 5 minut.
6. Dodaj 350 μl buforu N3 (dołączonego do zestawu) i natychmiast delikatnie odwróć cztery do sześciu razy, aby wymieszać.
7. Wirować przy 10 000 x g przez 10 min.
8. Przenieść jak najwięcej supernatantu do kolumny wirowej i odwirować przy 10 000 x g przez 60 s. Odrzucić przepływ.
9. Przemyć kolumnę wirową 500 μl buforu PB (dołączonego do zestawu) i odwirować przy 10 000 x g przez 60 s. Odrzucić przepływ.
10. Przemyć kolumnę wirową 750 μl buforu PE (dołączonego do zestawu) i odwirować przy 10 000 x g przez 60 s. Odrzucić przepływ i wirować przez 60 sekund, aby usunąć resztki buforu.
11. Umieść kolumnę wirową w probówce do mikrowirówek o pojemności 1.5 ml. Nanieść 20-30 μl ddH₂O wolnego od DNA i RNAzy do filtra kolumny wirującej i pozostawić na 1-2 minuty, a następnie odwirować przy 10 000 x g przez 60 s.
12. Przeprowadzić standardową reakcję PCR przy użyciu starterów specyficznych dla plazmidu (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA), z eluatem dostarczającym matrycę DNA. Dołączyć kontrolę pozytywną z plazmidem pochodzącym z E. coli mini-prep.
    UWAGA: Ustawienia PCR używane w tym badaniu to: 98 °C przez 5 minut, (98 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s, 72 °C przez 45 s) 30 cykli, 72 °C przez 2 min, 4 °C trzymanie. Parametry są w dużym stopniu zależne od użytej polimerazy, długości fragmentu i dokładnych starterów używanych przez każdą osobę korzystającą z tego protokołu.

Results

Efektywność transformacji
L. reuteri nie wymaga niemetylowanego plazmidu dcm^-/dam^-, jak zaobserwowano dla innych Lactobacillaceae^19,20 (patrz Rysunek 1). Elektroporacja L. reuteri DSM20016 10 μl plazmidu o pTRKH3_mCherry2 8,5 kb (pochodzenie replikacji pAMβ1 theta) powinna dać wydajność transformacji na poziomie około 80 jednostek tworzących kolonie (CFU)/μg (od pi...

Discussion

Najbardziej krytycznym etapem transformacji L. reuteri DSM20016 jest wytworzenie beztlenowych warunków wzrostu po poszczepieniu przemian; Kolonie zdobyte w warunkach tlenowych są bardzo rzadkie i na ogół nie rosną po zaszczepieniu w bulionie MRS. Należy również ćwiczyć posiewanie całej objętości odzysku, aby zmaksymalizować prawdopodobieństwo wzrostu kolonii. Nawet przy tych dwóch krytycznych krokach, wydajność transformacji jest nadal ograniczeniem dla eksperymentów, ponieważ oczekiwana liczba kolonii może wyno...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA Ladder	NEB	N3200L
1mL Kuwety spektrofotometru	Thomas Scientific	1145J12
Agaroza	BioShop	AGR001
Allegra X-15R (wirówka z chłodzeniem)	Beckman Allegra	Nie	dotyczy już nie dotyczy
Saszetka AnaeroGen 2,5 l Thermo	Scientific
BTX, ECM 399 System elektroporacji	VWR	58017-984
Probówki wirówkowe (50 ml)	FroggaBio	TB50-500
Żel DNA x6 barwnik ładujący	NEB	B7024S
Kuweta do elektroporacji	Fisherbrand	FB101
Erytromycyna	Millipore Sigma	E5389-5G
Żelowa kąpiel elektroporacyjna VWR		76314-748
Glicerol	BioShop	GLY001
Limosilactobacillus reuteri	Instytut Leibniza DSMZ	DSM20016	Oznaczenie szczepu F275
Lizozym	BioShop	LYS702.5
Probówki do mikrowirówek (1,7 ml)	FroggaBio	LMCT1.7B
Zestaw do miniprzygotowania (Qiagen)	Qiagen	27106	slpGFP zastąpiony konstytutywnym, zoptymalizowanym pod kątem kodonu, reporterem mCherry2 białko
Bulion MRS (odwodniony)	Thermo Scientific	CM0359B
Mutanolysin	Millipore Sigma	M9901-5KU
NaOH	Pipeta Millipore Sigma	1064691000
P100	Eppendorf	3123000047
P1000 Pipeta	Eppendorf	3123000063
P2.5 Pipeta	Eppendorf	3123000012
P20 Pipeta	Eppendorf	3123000039
P200 Pipeta	Eppendorf	3123000055
probówki PCR	FroggaBio	STF-A120S
Osobista mikrowirówka	stołowa Genlantis	E200100
szalki Petriego	VWR	25384-088
PTC-150 Termocykler	MJ Research	Nie dotyczy	Produkt nie jest już produkowany
pTRKH3_slpGFP (zmodyfikowany)	Addgene	27168
SPECTRONIC 200 Spektrofotometr	Thermo Scientific	840-281700
Mikropłytka do przechowywania	Fisher Scientific	14-222-225
Sacharoza	BioShop	SUC507
TAE Bufor 50x	Thermo Scientific	B49
Vortex	VWR	58816-121	Nie jest już produkowany
Inkubator VWR 1500E		VWR N/A	Nie jest już produkowany