Tutaj opisujemy szczegółowy protokół użycia testu reporterowego opartego na lucyferazie w półautomatycznym, wysokoprzepustowym formacie przesiewowym.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badania przesiewowe leków komórkowych w kierunku inhibitorów peptydazy cysteinowej 4B związanej z autofagią
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Coraz więcej dowodów pokazuje, że wysoki strumień autofagiczny jest związany z progresją nowotworu i opornością na terapię przeciwnowotworową. Oznaczanie poszczególnych białek autofagii jest warunkiem wstępnym dla strategii terapeutycznych ukierunkowanych na ten szlak. Wykazano, że hamowanie autofagii proteazy ATG4B zwiększa całkowite przeżycie, co sugeruje, że ATG4B może być potencjalnym celem leczenia raka. Nasze laboratorium opracowało selektywny test na bazie lucyferazy do monitorowania aktywności ATG4B w komórkach. W tym teście substrat ATG4B, LC3B, jest oznaczany na C-końcu za pomocą wydzielalnej lucyferazy z morskiego widłonoga Gaussia princeps (GLUC). Ten reporter jest połączony z cytoszkieletem aktyny, utrzymując go w ten sposób w cytoplazmie komórek po nierozszczepieniu. Rozszczepienie, w którym pośredniczy ATG4B, powoduje uwalnianie GLUC przez niekonwencjonalne wydzielanie, które następnie można monitorować poprzez zbieranie supernatantów z hodowli komórkowej jako korelatu komórkowej aktywności ATG4B. W artykule przedstawiono adaptację tego testu opartego na lucyferazie do zautomatyzowanych wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Opisujemy przebieg pracy i optymalizację dla przykładowej wysokoprzepustowej analizy aktywności komórkowej ATG4B.
Wprowadzenie
Autofagia to konserwatywny proces metaboliczny, który pozwala komórkom utrzymać homeostazę wewnątrzkomórkową i reagować na stres poprzez degradację starej, wadliwej lub niepotrzebnej zawartości komórkowej za pomocą lizosomów1,2,3. W pewnych warunkach patofizjologicznych proces ten działa jako kluczowa odpowiedź komórkowa na niedobór składników odżywczych i tlenu, co skutkuje recyklingiem składników odżywczych i lipidów, umożliwiając komórkom dostosowanie się do ich potrzeb metabolicznych2,3
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Proces testowania jest opisany w Rysunek 1. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników i sprzętu użytego w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.
1. Produkcja retrowirusów
UWAGA: Plazmid kodujący ActinLC3dNGLUC to pMOWS-ActinLC3dNGLUC20. Do produkcji wirusa o wysokim mianie należy użyć komórek o niskiej liczbie pasażów (najlepiej mniejszej niż P20).
- Hodowla komórek HEK293T w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle (DMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% pen....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W poprzedniej publikacji8 z powodzeniem wykorzystaliśmy ten test do przesiewania bibliotek małych cząsteczek i siRNA, identyfikując nowe regulatory ATG4B. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół oraz reprezentatywne wyniki wykorzystania tego reportera lucyferazowego w półautomatycznym formacie wysokoprzepustowego przesiewania. Rysunek 8 przedstawia przykład analizy surowych danych dla jąder komórkowych oraz luminescencji. Typowy wynik pomiaru luminescencji ukazano.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten opisuje komórkowy test genu reporterowego do identyfikacji inhibitorów ATG4B. Identyfikacja pierwotnych trafień opiera się na aktywności lucyferazy po leczeniu komórek wyrażających pełnowymiarową otwartą ramkę odczytu LC3B między β-aktyną a dNGLUC. Niektóre zalety tego testu polegają na tym, że jest on czuły, wysoce ilościowy i nieinwazyjny, ponieważ może wykryć dNGLUC bez lizy komórek. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół generowania stabilnej linii komórkowej i pierwotnego badania przesiewowego. W.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez główne fundusze brytyjskiej Rady ds. Badań Medycznych dla MRC-UCL University Unit Grant Ref MC_U12266B, MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK (numer referencyjny grantu 2018RIF_15), oraz UCL Therapeutic Acceleration Support scheme, wspierany przez finansowanie z MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. Plazmid kodujący ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) uzyskano od dr Robina Kethelera (Wydział Medycyny Człowieka, Szkoła Medyczna w Berlinie).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 50 &mikro; L Jednorazowe końcówki - niefiltrowane, czyste, zagnieżdżone 8 stosów (stos pasywny) | Tecan | 30038609 | Jednorazowy stojak na 96 końcówek |
| Dozownik zbiorczy | BioTek MultiFlo | BioTek | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | podłoże |
| Columbus Oprogramowanie do analizy obrazu | Perkin Elmer | Wersja 2.9.1 | oprogramowanie do analizy obrazu |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-dołkowa mikropłytka polipropylenowa, przezroczysta, niesterylna | Beckman Coulter | 001-14555 | Płytka 384PP |
| EnVision II | Perkin Elmer | płytek luminescencyjnych | |
| Biblioteka ekspresowego wyboru (96-dołkowa)-L3600-Z369949-100µ L | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384-dołkowe płytki | Greiner Bio-One | 781076 | 384-dołkowe płytki w kolorze czarnym |
| Oprogramowanie do obrazowania Harmony | obrazowania | Perkin Elmer | Wersja 5.1 |
| Hoechst 33342, Trichlorowodorek, Trójwodzian - 10 mg/ml Roztwór w wodzie | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Seria Labcyte Echo 550 z oprogramowaniem Echo Cherry Pick | Nanoskalowy akustyczny dozownik cieczy | Labcyte/Beckman Coulter | |
| Milli-Q | Woda dejonizowana | ||
| Opera Phenix High-Content System badań przesiewowych | Perkin Elmer | Automatyczny mikroskop | |
| Paraformaldehyd 4% w PBS | Santa Cruz Biotechnologia | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well,, optycznie przezroczysty płaskie dno, poddany hodowli tkankowej, pokrywki | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Uzyskany od dr Robina Kethelera (Wydział Medycyny Człowieka, Szkoła Medyczna w Berlinie) | ||
| Odczynnik do infekcji / transfekcji polibrenem | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Dichlorowodorek puromycyny, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | platforma robotyczna do obsługi cieczy | |
| X-tremeGENE HP DNA Odczynnik do transfekcji | Merck | 6366244001 | DNA |
Bibliografia
- Kocaturk, N. M., et al. Autophagy as a molecular target for cancer treatment. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).
- Fu, Y., et al. Targeting ATG4 in cancer therapy. Cancers. 11 (5), 649(2019).
- Towers, C. G., Thorburn, A. <....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
