Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badania przesiewowe leków komórkowych w kierunku inhibitorów peptydazy cysteinowej 4B związanej z autofagią

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65464

⸱

30 czerwca 2023

 ,  , 
1Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London, 2Department of Human Medicine, Medical School Berlin

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół użycia testu reporterowego opartego na lucyferazie w półautomatycznym, wysokoprzepustowym formacie przesiewowym.

Streszczenie

Coraz więcej dowodów pokazuje, że wysoki strumień autofagiczny jest związany z progresją nowotworu i opornością na terapię przeciwnowotworową. Oznaczanie poszczególnych białek autofagii jest warunkiem wstępnym dla strategii terapeutycznych ukierunkowanych na ten szlak. Wykazano, że hamowanie autofagii proteazy ATG4B zwiększa całkowite przeżycie, co sugeruje, że ATG4B może być potencjalnym celem leczenia raka. Nasze laboratorium opracowało selektywny test na bazie lucyferazy do monitorowania aktywności ATG4B w komórkach. W tym teście substrat ATG4B, LC3B, jest oznaczany na C-końcu za pomocą wydzielalnej lucyferazy z morskiego widłonoga Gaussia princeps (GLUC). Ten reporter jest połączony z cytoszkieletem aktyny, utrzymując go w ten sposób w cytoplazmie komórek po nierozszczepieniu. Rozszczepienie, w którym pośredniczy ATG4B, powoduje uwalnianie GLUC przez niekonwencjonalne wydzielanie, które następnie można monitorować poprzez zbieranie supernatantów z hodowli komórkowej jako korelatu komórkowej aktywności ATG4B. W artykule przedstawiono adaptację tego testu opartego na lucyferazie do zautomatyzowanych wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Opisujemy przebieg pracy i optymalizację dla przykładowej wysokoprzepustowej analizy aktywności komórkowej ATG4B.

Wprowadzenie

Autofagia to konserwatywny proces metaboliczny, który pozwala komórkom utrzymać homeostazę wewnątrzkomórkową i reagować na stres poprzez degradację starej, wadliwej lub niepotrzebnej zawartości komórkowej za pomocą lizosomów1,2,3. W pewnych warunkach patofizjologicznych proces ten działa jako kluczowa odpowiedź komórkowa na niedobór składników odżywczych i tlenu, co skutkuje recyklingiem składników odżywczych i lipidów, umożliwiając komórkom dostosowanie się do ich potrzeb metabolicznych2,3,4. Autofagia została również zidentyfikowana jako komórkowa reakcja na stres związana z kilkoma chorobami, takimi jak zaburzenia neurodegeneracyjne, infekcje patogenami i różne rodzaje raka. Funkcja autofagii w raku jest złożona i zależy od rodzaju, stadium i statusu guza. Może hamować nowotworzenie poprzez autofagiczną degradację uszkodzonych komórek, ale może również promować przeżycie zaawansowanych nowotworów poprzez poprawę przeżywalności komórek w stresujących warunkach, takich jak niedotlenienie, niedobór składników odżywczych i uszkodzenia cytotoksyczne2,4,5,6.

Kilka badań wykazało, że hamowanie autofagii przynosi korzyści jako strategia przeciwnowotworowa. Tak więc hamowanie krytycznych etapów, takich jak tworzenie autofagosomu lub jego fuzja z lizosomem, może być skuteczną metodą kontroli raka2,4,5,6. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że ATG4B bierze udział w pewnych stanach patologicznych i zyskał uwagę jako potencjalny cel przeciwnowotworowy2,3,4. Na przykład zaobserwowano, że komórki raka jelita grubego i komórki ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu receptora 2 (HER2) z dodatnim receptorem 2 piersi miały znacznie wyższe poziomy ekspresji ATG4B niż sąsiednie normalne komórki2,4. W komórkach raka prostaty hamowanie ATG4B skutkowało specyficzną dla linii komórkowej podatnością na chemioterapię i radioterapię7. Ostatnio pojawiły się mocne dowody na to, że gruczolakorak przewodowy trzustki (PDAC) jest szczególnie podatny na hamowanie ATG4B. Na przykład w genetycznie zmodyfikowanym modelu mysim wykazano, że okresowa utrata funkcji ATG4B zmniejsza wzrost guza PDAC i zwiększa przeżywalność3,4. Ogólnie rzecz biorąc, ATG4B ulega silnej nadekspresji w niektórych typach raka, jest związany z progresją guza i jest związany z opornością na terapię przeciwnowotworową2,4,8.

Proteazy cysteinowe ATG4 u ssaków mają czterech członków rodziny, ATG4A-ATG4D. Białka te wykazują pewną selektywność docelową w stosunku do rodziny białek LC3/GABARAP (ATG8)9,10,11 i mogą mieć dodatkowe funkcje niezwiązane z ich aktywnością proteazy12,13. Co więcej, ATG4 funkcjonuje w regulacji nowego rodzaju modyfikacji potranslacyjnej, ylacji białek ATG811,12. Podczas gdy ATG4B i jego główny substrat LC3B są najszerzej badane, wyłania się obraz, który sugeruje złożoną rolę każdego członka podrodziny w regulacji procesów autofagicznych i nieautofagicznych. Jest to dodatkowo potwierdzone przez złożoną sieć modyfikacji potranslacyjnych, które regulują aktywność ATG4B poprzez fosforylację, acetylację, glikozylację i nitrozylację9,10,11,12,13.

Opublikowano kilka znanych inhibitorów ATG4B2,4,14,15. Chociaż są one odpowiednie jako narzędzia badawcze, ich profil farmakodynamiczny, selektywność lub siła działania uniemożliwiły jeszcze ich opracowanie jako kandydatów przedklinicznych4,16. Ogólnie rzecz biorąc, istnieje pilna potrzeba zidentyfikowania silniejszych i bardziej selektywnych związków. Często związki te są dobrymi biochemicznymi inhibitorami funkcji białek, jednak ich skuteczność w testach komórkowych jest słaba. Istnieje wiele testów do monitorowania aktywności ATG4B, w tym metody biochemiczne i testy komórkowe4. Wcześniej opracowaliśmy prosty, oparty na luminescencji, wysokoprzepustowy test do monitorowania aktywności ATG4B w komórkach8,17. Ten test wykorzystuje białko lucyferazy z Gaussia princeps (GLUC), które jest stabilne i aktywne w środowisku zewnątrzkomórkowym i może być indukcyjnie uwalniane z komórek w odpowiedzi na aktywność proteolityczną ATG4B18,19.

W tym konstrukcie reporterowym, dNGLUC jest połączony z cytoszkieletem aktynowym komórek. Łącznik specyficzny dla proteazy może zostać wprowadzony między kotwicę β-aktyny a dNGLUC, zmieniając wydzielanie w zależności od rozszczepienia łącznika. Użyliśmy pełnowymiarowej otwartej ramki odczytu LC3B między β-aktyną a dNGLUC, aby móc monitorować rozszczepienie LC3B17,18,19. Chociaż mechanizm wydzielania dNGLUC jest słabo poznany, jest on specyficzny dla monitorowania aktywności ATG4B, nie zależy od ogólnej autofagii, ponieważ występuje w komórkach nokautujących ATG5 i jest pośredniczony przez niekonwencjonalne mechanizmy, które nie wymagają klasycznego peptydu sygnałowego4,18,19. Z powodzeniem wykorzystaliśmy ten reporter do badań przesiewowych małych cząsteczek i bibliotek siRNA oraz zidentyfikowaliśmy nowe regulatory aktywności ATG4B, takie jak kinazy białkowe Akt8. W tym artykule opisano szczegółowy protokół użycia tego reportera lucyferazy w półautomatycznym, wysokoprzepustowym formacie przesiewowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Proces testowania jest opisany w Rysunek 1. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników i sprzętu użytego w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Produkcja retrowirusów

UWAGA: Plazmid kodujący ActinLC3dNGLUC to pMOWS-ActinLC3dNGLUC20. Do produkcji wirusa o wysokim mianie należy użyć komórek o niskiej liczbie pasażów (najlepiej mniejszej niż P20).

  1. Hodowla komórek HEK293T w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle (DMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny (P/S) w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze, w atmosferze 5%CO2 do momentu, gdy osiągną 80%-90% zlewania przed wysiewem do transfekcji.
  2. Dzień przed transfekcją wysiewać komórki na 6-dołkową płytkę o gęstości 1 × 106 komórek/basenik w 2 ml/dołku kompletnej pożywki. Inkubować płytkę przez noc w nawilżanym inkubatorze w atmosferze 5% CO2,
    UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, jeśli używasz odczynnika do transfekcji na bazie liposomalnej. Protokół ten opisuje użycie odczynnika nieopartego na liposomalach. Przed rozpoczęciem transfekcji pozwól, aby odczynnik do transfekcji DNA, DNA i pożywka osiągnęły równowagę do temperatury pokojowej (~15 min).
  3. Do każdej transfekcji dodać 200 μl pożywki bez surowicy do 1,5 ml probówek wirówek. W każdej probówce dodaj następujące ilości plazmidów: 1,000 ng pMOWS-ActinLC3dNGLUC; 900 ng GagPolu; 100 ng VSV-G.
    UWAGA: Podana tutaj ilość plazmidów i objętość pożywki dotyczą płytki 12-dołkowej. Jeśli używasz innego typu płytki, dostosuj objętość pożywki i ilości plazmidu, aby osiągnąć końcowe stężenie 5 ng / μL plazmidu transferowego, 4,5 ng / μl plazmidu pakującego i 0,5 ng / μL plazmidu otoczkowego. Użyj dowolnego plazmidu pakującego, który zawiera geny eksprymujące gag i pol, oraz dowolnego plazmidu otoczkowego, który zawiera gen eksprymujący VSV-G.
  4. Wirować fiolkę z odczynnikiem do transfekcji DNA przez 30 s. Odpipetować 4 μl odczynnika do transfekcji bezpośrednio do pożywki zawierającej rozcieńczone DNA. Delikatnie wymieszaj, delikatnie przechylając tubkę.
    UWAGA: Nie dotykaj końcówkami ścianek plastikowych rurek. Nie pipetować w górę i w dół ani nie wirować.
  5. Inkubować reakcję przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Podczas inkubacji reakcji usuń starą pożywkę z płytki 6-dołkowej i zastąp ją 2 ml / dołek świeżej pożywki bez surowicy.
  7. Dodaj każdy kompleks transfekcji do każdej studzienki w sposób kroplowy.
  8. Delikatnie potrząśnij lub zakręć płytką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie na całej powierzchni dołka.
  9. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze w atmosferze 5% CO2 .
  10. Po 24 godzinach zastąp starą pożywkę świeżą, kompletną pożywką (2 ml/dołek) i włóż komórki z powrotem do nawilżonego inkubatora w atmosferze 5% CO2 przez 72 godziny.
  11. Po 72 godzinach zebrać supernatant do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przez 10 minut w temperaturze 4 000 × g w temperaturze 4 °C w celu usunięcia martwych komórek i zanieczyszczeń. W celu dalszego oczyszczenia użyj dużej strzykawki o pojemności 60 ml, aby przepuścić supernatant przez filtr 0,20 μm. Natychmiast przygotować jednorazowe porcje o pojemności 300 μl i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Unikaj cyklu zamrażania i rozmrażania, aby utrzymać maksymalną aktywność produktu.

2. Transdukcja retrowirusowa

  1. Dzień przed transdukcją komórek wysiewać komórki docelowe o średniej gęstości (PANC1 w ilości 1 ×10 5 komórek/dołek) na 12-dołkowej płytce w 1 ml/dołku pożywki uzupełnionej 10% FBS i 1% P / S. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z atmosferą 5% CO2,
    UWAGA: Najlepszą gęstość komórek należy ustalić z wyprzedzeniem, ponieważ różne typy komórek mają różne zdolności przyłączania. Najlepiej użyć gęstości komórek, aby uzyskać zbieżność 40%-50%.
  2. Przed każdym użyciem wyjąć zamrożone porcje retrowirusa z zamrażarki o temperaturze -80 °C i rozmrozić na lodzie.
    UWAGA: Nie zamrażaj ponownie nieużywanych podwielokrotności.
  3. W stożkowej probówce o pojemności 50 ml przygotować mieszaninę supernatantu wirusowego i polibrenu o końcowym stężeniu 8 μg/ml.
    UWAGA: Kolejne objętości odnoszą się do transdukcji płytki 12-dołkowej zawierającej końcową objętość 500 μl/basenik. Końcową objętość supernatantu wirusa można oszacować, testując szereg rozcieńczeń wirusa w obecności polibrenu. Można stosować wyższe lub niższe rozcieńczenia w zależności od pożądanych poziomów ekspresji transgenu i wielkości użytego naczynia.
  4. Usuń stare podłoże z płytki 12-dołkowej i dodaj 500 μl mieszaniny do każdego dołka. Inkubować komórki z supernatantem wirusa przez noc w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze w atmosferze 5% CO2,
    UWAGA: Przechowywać dwie studzienki z kompletną pożywką (bez supernatantu wirusowego) do użycia jako kontrola selekcji.
  5. Zastąp pożywkę zawierającą wirusa świeżą, kompletną pożywką wzrostową (1 ml/basenik). Umieść komórki z powrotem w nawilżonym inkubatorze w atmosferze 5% CO2 przez 48 godzin.

3. Selekcja i utrzymanie populacji zbiorczej

  1. Zastąp pożywkę wzrostową pożywką selekcyjną (kompletną pożywką wzrostową o końcowym stężeniu 1 μg/ml puromycyny). Monitoruj wzrost komórek i zmieniaj pożywkę selekcyjną co 2-3 dni. Przy zbieganiu rozwiń się do naczynia 6-dołkowego, a następnie do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 10 cm.
  2. Utrzymuj komórki w pożywce selekcyjnej co najmniej tak długo, jak jest to potrzebne do całkowitej śmierci komórek kontrolnych (nietransdukowanych).
    UWAGA: W celu uzyskania pomyślnych wyników zaleca się określenie optymalnych stężeń puromycyny przed rozpoczęciem projektu eksperymentalnego. W tym celu wygeneruj krzywą zabijania puromycyny, aby określić minimalne stężenie wymagane do zabicia nietransdukowanych komórek w okresie od 3 do 10 dni.
  3. Gdy komórki rosną w pożywce selekcyjnej, rozwiń komórki na kompletnym pożywce wzrostowej i zamroź porcje zapasowe do projektu eksperymentalnego.
    UWAGA: Zapisz numer przejścia i unikaj pracy z populacjami zbiorczymi z zamrożonego stada o numerach przejścia większych niż pięć. Przed wykonaniem testu należy regularnie sprawdzać, czy nie ma zanieczyszczenia mykoplazmą. Najlepiej użyć nowej partii komórek przed każdym testem, aby uzyskać maksymalny sygnał lucyferazy.
  4. Utrzymuj komórki w pożywce selekcyjnej i zasiej wystarczającą liczbę komórek, aby osiągnąć pożądaną gęstość na dzień przed testem.

4. Dodawanie złożone

UWAGA: Biblioteka małych cząsteczek Selleckchem składa się z około 4 000 związków ułożonych w ośmiu rzędach i 10 kolumnach na pięćdziesięciu 96-dołkowych płytkach przy podstawowym stężeniu 10 mM w dimetylosulfotlenku (DMSO).

  1. Porcję 30 μl związku należy umieścić w odpowiednim dołku na płytce źródłowej, która jest kompatybilna z dozownikiem cieczy akustycznej w skali nano. Użyj 384-dołkowej płytki polipropylenowej (płytka 384PP). Przechowywać te tabliczki szczelnie zamknięte i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Opisany tutaj protokół badań przesiewowych obejmuje łącznie 10 płytek testowych dziennie; jako końcowe stężenie testowe zastosowano stałe stężenie 10 μM wraz z 24-godzinnym okresem inkubacji.
  2. Rozmrozić płytki biblioteki złożonej w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Upewnij się, że płyta jest całkowicie rozmrożona i zrównoważona do temperatury pokojowej. Gradient temperatury na płycie może wpływać na obchodzenie się z cieczą.
  3. Dozować 50 nL/studzienkę do 384-dołkowej płytki testowej za pomocą nanoskalowego dozownika cieczy akustycznej.
    UWAGA: Upewnij się, że wybrane w programie tabliczki źródłowe i docelowe są zgodne z tymi użytymi w tym kroku.
  4. Utwórz program dozowania w arkuszu kalkulacyjnym.
  5. Otwórz oprogramowanie.
  6. Otwórz nowy protokół. Na karcie Protokół wybierz następujące opcje: Format płytki próbki, 384PP; Typ płytki do próbki, 384PP_DMSO2; oraz typ płytki docelowej, CellCarrier-384 Ultra PN (Rysunek 2A).
  7. W obszarze Lista wyboru wybierz opcję importu (Rysunek 2B), aby zaimportować arkusz kalkulacyjny zawierający program dozujący (Rysunek 2C).
  8. Wybierz opcję Uruchom protokół (Rysunek 2D), sprawdź, czy wyświetlane informacje są poprawne, a następnie kliknij przycisk Uruchom.
  9. W nowym oknie o nazwie Uruchom status (Rysunek 2E), kliknij Start i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi w oknach monitów (Rysunek 2F,G).

5. Rozsiewanie komórek

  1. Trypsynizować komórki z kolby do hodowli komórkowej lub szalki Petriego do hodowli komórkowych i zneutralizować trypsynę, dodając pożywkę zawierającą FBS.
  2. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy stężeniu 390 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie delikatnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml kompletnej pożywki wzrostowej.
  3. Wykonaj zliczanie komórek.
  4. Przygotować zawiesinę komórkową z 4,6 × 107 komórek w 230 ml kompletnej pożywki hodowlanej.
    UWAGA: Ta objętość i gęstość komórek dotyczy 10 384-dołkowych płytek testowych oraz martwej objętości dwóch 384-dołkowych płytek.
  5. Dozować 50 μl zawiesiny komórek do każdego dołka na 384-dołkowej płytce do oznaczania, przygotowanej w sekcji 4.
    UWAGA: Wysiewanie komórek można wykonać ręcznie lub za pomocą dozownika zbiorczego.
  6. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z atmosferą 5% CO2 przez 24 godziny.

6. Zbieranie komórkowego supernatantu

UWAGA: Używana tutaj platforma robotyczna do obsługi płynów obsługuje ciecze za pomocą wielokanałowego ramienia dla 96 końcówek. Jeśli nie jest dostępna automatyzacja obsługi cieczy, protokół można dostosować do formatu o niskiej przepustowości za pomocą pipet wielokanałowych.

  1. Skonfiguruj pokład stacji roboczej automatyzacji laboratorium, jak pokazano na Rysunek 3.
  2. Umieść jednorazowy stos 96 końcówek w pozycji P1 (Rysunek 3A).
    UWAGA: Każdy stos 96 końcówek składa się z ośmiu jednorazowych stojaków. W przypadku korzystania z ramienia wielokanałowego dla końcówek 96-dołkowych, płytka 384-dołkowa jest podzielona na cztery ćwiartki. W ten sposób każdy stos końcówek wystarcza do przeniesienia supernatantu z dwóch płytek testowych na dwie puste, stałe, czarne, 384-dołkowe płytki. Cały stos końcówek należy wymienić po każdym cyklu dwóch płyt.
  3. Umieść płytki testowe w pozycjach P2 i P4 (Rysunek 3A).
  4. Umieść puste, jedno, czarne, 384-dołkowe płytki w pozycjach P3 i P5 (Rysunek 3A).
    UWAGA: Ta elastyczna i wydajna platforma robotyczna została przystosowana do tego testu i został napisany specjalny program (Rysunek 3B).
  5. Zdobądź wskazówki z pozycji P1.
  6. Odessać 10 μl supernatantu z płytki w pozycji P2 i przenieść do pustej, stałej czarnej płytki w pozycji P3.
    UWAGA: Końcówki powinny być umieszczone na odpowiedniej głębokości wewnątrz studzienek, aby zasysać supernatant bez naruszania monowarstwy komórek na dnie studzienki.
  7. Upuść końcówki w odpadach na pozycji P6 (Rysunek 3A).
  8. Powtórzyć kroki 6.5-6.7 dla pozostałych studzienek płytki w pozycji P2, a następnie powtórzyć te same kroki, aby przenieść supernatant z pozycji P4 do pozycji P5.
    UWAGA: Pamiętaj, aby zebrać supernatant i dozować do odpowiednich studzienek do pustej, solidnej czarnej płytki (Rysunek 3C,D). Ponieważ wydzielany dNGLUC jest bardzo stabilny w pożywce do hodowli komórkowych, płytki można szczelnie zamykać i przechowywać do 7 dni w temperaturze 4 °C w ciemności.

7. Test lucyferazy

UWAGA: dNGLUC używany w reporterze wykazuje kinetykę błysku z szybkim zanikiem sygnału. Ze względu na szybki zanik luminescencji po dodaniu substratu (koelenterazyny) czytnik płytek powinien być ustawiony na pomiar sygnału luminescencji w supernatantach; Wstrzyknij substrat do studzienki i dobrze odczytaj to po kilku sekundach. Z tego powodu należy użyć czytnika płytek, który jest w stanie monitorować luminescencję i jest wyposażony w wtryskiwacz substratu, aby zapewnić, że czas między etapami iniekcji i odczytu będzie jednolity dla wszystkich próbek. Ustawienia używane w czytniku płytek można znaleźć w Rysunek 4.

  1. Przygotować natywną celendrazynę w postaci roztworu podstawowego o stężeniu 1 mg/ml w zakwaszonym metanolu (10 μl 3 M HCl na 1 ml metanolu).
    UWAGA: Postępuj zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi zdrowia i bezpieczeństwa dotyczącymi obchodzenia się z metanolem w laboratorium i unikaj kontaktu ze skórą. Przygotować świeży roztwór substratu roboczego przed rozpoczęciem oznaczania.
  2. Zainicjuj pompę wtryskową (Rysunek 5A).
  3. Przepłucz rurkę wodą dejonizowaną (Rysunek 5B-D).
  4. Przepłucz rurkę metanolem.
  5. Podczas płukania rurki należy przygotować roztwór substratu roboczego, rozcieńczając substrat w stosunku 1:100 (na jedną płytkę 384-dołkową dodać 220 μl z roztworu podstawowego substratu do 21,8 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami [PBS]).
  6. Przepłucz rurkę roztworem roboczym podłoża (Rysunek 5B-D).
  7. Załaduj płytkę do czytnika i rozpocznij pomiar zgodnie z ustawieniami opisanymi w Rysunek 4.
  8. Powtórzyć kroki 7.6-7.7 dla wszystkich płytek do oznaczania.
  9. Po zakończeniu wszystkich płytek testowych przepłucz rurki metanolem.
  10. Przepłucz rurkę wodą dejonizowaną.
    UWAGA: Pod koniec tego kroku uzyskuje się surowe wartości lucyferazy, które są skorelowane z komórkową aktywnością ATG4B. W celu normalizacji liczby komórek konieczne są kolejne kroki, polegające na zliczeniu liczby komórek w każdym dołku za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

8. Utrwalanie i barwienie komórek

UWAGA: Ten krok można wykonać ręcznie za pomocą pipety wielokanałowej lub za pomocą dozownika zbiorczego.

  1. Utrwalić komórki 4% paraformaldehydem (w 1x PBS) przez 15 min.
    UWAGA: Postępuj zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi zdrowia i bezpieczeństwa dotyczącymi obchodzenia się z paraformaldehydem w laboratorium i unikaj kontaktu ze skórą. Jeśli to możliwe, wykonaj ten krok w kapturze bezpieczeństwa.
  2. Umyj trzy razy 1x PBS.
  3. Wybarwić jądra Hoechst 33342 rozcieńczonym w stosunku 1:5 000 w 1x PBS przez 15 min.
  4. Umyj trzy razy 1x PBS.

9. Akwizycja obrazu

UWAGA: Wykonaj akwizycję obrazu za pomocą automatycznego mikroskopu. Jako alternatywę dla akwizycji obrazu w celu określenia liczby komórek, można również określić wewnątrzkomórkową aktywność lucyferazy. Istnieją zalety i wady w odniesieniu do tego, czy normalizuje się do liczby komórek, czy do wewnątrzkomórkowej aktywności lucyferazy, co omówiono poniżej. Odkryliśmy, że określanie liczby komórek jest mniej inwazyjne i powoduje mniejszą zmienność niż określanie wewnątrzkomórkowych wartości lucyferazy.

  1. Uruchom oprogramowanie operacyjne mikroskopu (Rysunek 6).
  2. Na karcie Ustawienia wybierz odpowiedni predefiniowany typ blachy. Jeśli typ blachy nie jest wstępnie ustawiony, wprowadź wymiary blachy ręcznie.
  3. Załaduj płytkę do mikroskopu, klikając opcję Wysuń i załaduj.
  4. Następnie wybierz obiektyw 20x Air (przysłona numeryczna [NA]: 0.4).
    UWAGA: Upewnij się, że kołnierz obiektywu jest ustawiony na prawidłową wartość, co umożliwia prawidłowe ustawienie ostrości przy różnych typach płytek.
  5. W obszarze Channel Selection (Wybór kanału) wybierz pozycję Hoechst 33342.
    UWAGA: Ustawienia kanału dla czasu, mocy i wysokości muszą być zoptymalizowane zgodnie z używanym typem płyty.
  6. W polu Definiuj układ wybierz wszystkie dołki z blachy i cztery pola ze studni.
  7. W obszarze Zadania online wybierz odpowiedni folder, aby przesłać dane do oprogramowania analitycznego.

10. Analiza obrazu

UWAGA: Dowolne oprogramowanie do analizy obrazów może być użyte do segmentacji i zliczania jąder komórkowych na podstawie uzyskanych obrazów. W tym miejscu opisujemy kroki, które należy wykonać, aby korzystać z określonego oprogramowania online, które jest kompatybilne z wieloma plikami zautomatyzowanych mikroskopów.

  1. Uruchom oprogramowanie do analizy obrazu.
  2. Przejdź do zakładki Analiza obrazu, aby rozpocząć segmentację obrazu (Rysunek 7A).
  3. W zakładce Input Image (Obraz wejściowy) kliknij znak +, aby dodać nowy blok konstrukcyjny (Rysunek 7A).
  4. Z listy wybierz opcję Znajdź jądra (Rysunek 7A) i wybierz Hoechst 33342 jako opcję kanału (Rysunek 7B).
  5. Sprawdź wzrokowo segmentowane obiekty na obrazie i wybierz najdokładniejszą metodę segmentacji.
    UWAGA: W tym eksperymencie użyliśmy metody C (Rysunek 7C). Każda opcja metody ma podkategorie, które można dostosować, aby uzyskać najlepszą możliwą segmentację.
  6. Następnie kliknij zakładkę Definiuj wyniki (Rysunek 7C) i wybierz opcję Standardowe wyjście jako opcję Metoda.
  7. Z podkategorii wybierz Liczba jąder obiektów i Liczba obiektów (Rysunek 7C).
  8. Zapisz potok analizy przy użyciu opcji Zapisz analizę na dysku lub Zapisz analizę w bazie danych.
  9. Na karcie Analiza wsadowa wybierz z drzewa dane do analizy.
  10. W obszarze Metoda wybierz potok analizy zapisany w kroku 10.8.
    UWAGA: Możliwe jest również wgranie pliku skryptu spoza oprogramowania referencyjnego lub wgranie istniejącej analizy zapisanej w bazie danych.
  11. Kliknij Uruchom analizę, aby rozpocząć analizę (Rysunek 7D). Pod koniec tego przepływu pracy generowane są dwa zestawy danych: surowe wartości lucyferazy z supernatantów i liczba komórek w każdym dołku. Użyj obu, aby znormalizować wartość lucyferazy na komórkę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W poprzedniej publikacji8 z powodzeniem wykorzystaliśmy ten test do przesiewania bibliotek małych cząsteczek i siRNA, identyfikując nowe regulatory ATG4B. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół oraz reprezentatywne wyniki wykorzystania tego reportera lucyferazowego w półautomatycznym formacie wysokoprzepustowego przesiewania. Rysunek 8 przedstawia przykład analizy surowych danych dla jąder komórkowych oraz luminescencji. Typowy wynik pomiaru luminescencji ukazano...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje komórkowy test genu reporterowego do identyfikacji inhibitorów ATG4B. Identyfikacja pierwotnych trafień opiera się na aktywności lucyferazy po leczeniu komórek wyrażających pełnowymiarową otwartą ramkę odczytu LC3B między β-aktyną a dNGLUC. Niektóre zalety tego testu polegają na tym, że jest on czuły, wysoce ilościowy i nieinwazyjny, ponieważ może wykryć dNGLUC bez lizy komórek. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół generowania stabilnej linii komórkowej i pierwotnego badania przesiewowego. W...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez główne fundusze brytyjskiej Rady ds. Badań Medycznych dla MRC-UCL University Unit Grant Ref MC_U12266B, MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK (numer referencyjny grantu 2018RIF_15), oraz UCL Therapeutic Acceleration Support scheme, wspierany przez finansowanie z MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. Plazmid kodujący ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) uzyskano od dr Robina Kethelera (Wydział Medycyny Człowieka, Szkoła Medyczna w Berlinie).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
50 &mikro; L Jednorazowe końcówki - niefiltrowane, czyste, zagnieżdżone 8 stosów (stos pasywny)Tecan30038609Jednorazowy stojak na 96 końcówek
Dozownik zbiorczyBioTek MultiFloBioTek
CoelenterazineSanta Cruz Biotechnologysc-205904podłoże
Columbus Oprogramowanie do analizy obrazuPerkin ElmerWersja 2.9.1oprogramowanie do analizy obrazu
DPBS (1x)Gibco14190-144
Echo Qualified 384-dołkowa mikropłytka polipropylenowa, przezroczysta, niesterylnaBeckman Coulter001-14555Płytka 384PP
EnVision IIPerkin Elmerpłytek luminescencyjnych
Biblioteka ekspresowego wyboru (96-dołkowa)-L3600-Z369949-100µ LSelleckchemL3600Selleckchem
FMK9AMedChemExpressHY-100522
Greiner FLUOTRAC 200 384-dołkowe płytkiGreiner Bio-One781076384-dołkowe płytki w kolorze czarnym
Oprogramowanie do obrazowania HarmonyobrazowaniaPerkin ElmerWersja 5.1
Hoechst 33342, Trichlorowodorek, Trójwodzian - 10 mg/ml Roztwór w wodzieThermoFisherH3570Hoechst 33342
Seria Labcyte Echo 550 z oprogramowaniem Echo Cherry PickNanoskalowy akustyczny dozownik cieczyLabcyte/Beckman Coulter
Milli-QWoda dejonizowana
Opera Phenix High-Content System badań przesiewowychPerkin ElmerAutomatyczny mikroskop
Paraformaldehyd 4% w PBSSanta Cruz Biotechnologiasc-281692
PhenoPlate 384-well,, optycznie przezroczysty płaskie dno, poddany hodowli tkankowej, pokrywkiPerkin Elmer6057300CellCarrier-384 Ultra PN
pMOWS-ActinLC3dNGLUCUzyskany od dr Robina Kethelera (Wydział Medycyny Człowieka, Szkoła Medyczna w Berlinie)
Odczynnik do infekcji / transfekcji polibrenemMerckTR-1003-Gpolybrene
Dichlorowodorek puromycyny, 98%, Thermo Scientific ChemicalsThermoFisherJ61278.MEPuromycin
Tecan Freedom EVO 200 robotTecanplatforma robotyczna do obsługi cieczy
X-tremeGENE HP DNA Odczynnik do transfekcjiMerck6366244001DNA
czytnik Oprogramowanie do Wodadejonizowana Roche

Bibliografia

  1. Kocaturk, N. M., et al. Autophagy as a molecular target for cancer treatment. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).
  2. Fu, Y., et al. Targeting ATG4 in cancer therapy. Cancers. 11 (5), 649(2019).
  3. Towers, C. G., Thorburn, A. Therapeutic targeting of autophagy. EBioMedicine. 14, 15-23 (2016).
  4. Agrotis, A., Ketteler, R. On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns. Cells. 9 (1), 53(2019).
  5. Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A. Targeting autophagy in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (9), 528-542 (2017).
  6. Kimmelman, A. C., White, E. Autophagy and tumor metabolism. Cell Metabolism. 25 (5), 1037-1043 (2017).
  7. Tran, E., et al. Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).
  8. Pengo, N., et al. Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148(2018).
  9. Kauffman, K. J., et al. Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases. Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).
  10. Tanida, I., Sou, Y. -S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3. The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).
  11. Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells. Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).
  12. Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).
  13. Ketteler, R., Tooze, S. A. ATG4: More than a protease. Trends in Cell Biology. 31 (7), 515-516 (2021).
  14. Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy. Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).
  15. Fernández, ÁF., López-Otín, C. The functional and pathologic relevance of autophagy proteases. The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).
  16. Maruyama, T., Noda, N. N. Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition. The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).
  17. Ketteler, R., Seed, B. Quantitation of autophagy by luciferase release assay. Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).
  18. Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -W., Seed, B. A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage. Genome Biology. 9 (4), 64(2008).
  19. Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15, 14(2014).
  20. Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors. Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Inhibicja ATG4Bbiałka autofagiiprzesiewanie komórkoweprzesiewanie wysokoprzepustowetest lucyferazymałocząsteczkowe inhibitoryoporność na terapię nowotworowąaktywność ATG4Bregulacja potranslacyjnalinie komórkowe z knockoutem
Badania przesiewowe leków komórkowych w kierunku inhibitorów peptydazy cysteinowej 4B związanej z autofagią
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.