Method Article

Wyrównanie zsynchronizowanych danych szeregów czasowych przy użyciu modelu charakteryzowania utraty synchronizacji cyklu komórkowego do porównań między eksperymentami

DOI:

10.3791/65466

⸱

June 9th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Duke University, 2Department of Biology, University of Massachusetts, 3Orlando Data Science LLC, 4Department of Computer Science, Duke University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z wyzwań związanych z analizą eksperymentów z synchronizowanymi szeregami czasowymi jest to, że eksperymenty często różnią się długością powrotu do zdrowia po synchronizacji i okresem cyklu komórkowego. W związku z tym pomiary z różnych eksperymentów nie mogą być analizowane zbiorczo ani łatwo porównywane. W tym miejscu opisujemy metodę dopasowywania eksperymentów, aby umożliwić porównania specyficzne dla fazy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie cyklu komórkowego często polega na synchronizowaniu populacji komórek w celu pomiaru różnych parametrów w szeregu czasowym, gdy komórki przechodzą przez cykl komórkowy. Jednak nawet w podobnych warunkach powtórzone eksperymenty wykazują różnice w czasie wymaganym do wyjścia z synchronizacji i przejścia przez cykl komórkowy, uniemożliwiając w ten sposób bezpośrednie porównania w każdym punkcie czasowym. Problem porównywania pomiarów dynamicznych między eksperymentami nasila się w populacjach zmutowanych lub w alternatywnych warunkach wzrostu, które wpływają na czas odzyskiwania synchronicznego i/lub okres cyklu komórkowego.

Wcześniej opublikowaliśmy parametryczny model matematyczny o nazwie Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS), który monitoruje, jak synchroniczne populacje komórek uwalniają się z synchronizacji i przechodzą przez cykl komórkowy. Parametry wyuczone z modelu można następnie wykorzystać do konwersji eksperymentalnych punktów czasowych z zsynchronizowanych eksperymentów szeregów czasowych na znormalizowaną skalę czasu (punkty linii życia). Zamiast reprezentować czas, który upłynął w minutach od rozpoczęcia eksperymentu, skala linii życia reprezentuje postęp od synchronizacji do wejścia w cykl komórkowy, a następnie przez fazy cyklu komórkowego. Ponieważ punkty linii życia odpowiadają fazie przeciętnej komórki w zsynchronizowanej populacji, ta znormalizowana skala czasowa pozwala na bezpośrednie porównania między eksperymentami, w tym tymi z różnymi okresami i czasami rekonwalescencji. Co więcej, model został wykorzystany do dostosowania eksperymentów cyklu komórkowego między różnymi gatunkami (np. Saccharomyces cerevisiae i Schizosaccharomyces pombe), umożliwiając w ten sposób bezpośrednie porównanie pomiarów cyklu komórkowego, które mogą ujawnić ewolucyjne podobieństwa i różnice.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomiary szeregów czasowych wykonywane na zsynchronizowanych populacjach komórek w trakcie ich postępu w cyklu komórkowym to standardowa metoda badania mechanizmów kontrolujących postęp cyklu komórkowego1,2,3,4,5,6,7, 8. Możliwość dokonywania porównań między eksperymentami szeregów czasowych synchronizacji/wydania ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia tych dynamicznych procesów. Wykorzystanie powtórzonych eksperymentów w celu potwierdzenia wyników może zwiększyć pewność co do odtwarzalności wniosków. Co więcej, porównania między warunkami środowiskowymi, mutantami, a nawet między gatunkami mogą dostarczyć wielu nowych informacji na temat regulacji cyklu komórkowego. Jednak międzyeksperymentalna zmienność w odzyskiwaniu po synchroniczności i w szybkości progresji cyklu komórkowego upośledza zdolność do dokonywania porównań między punktami czasowymi między powtórzeniami lub między eksperymentami ze zmienionym czasem cyklu komórkowego. Ze względu na te wyzwania replikaty często nie są uwzględniane dla pełnych szeregów czasowych (np. Spellman et al.4). Gdy zbierane są repliki dla całego szeregu czasowego, dane nie mogą być analizowane w formie zagregowanej, ale raczej do analizy używana jest pojedyncza replika, a inne powtórzenia są często przenoszone do dodatkowych liczb (np. Orlando i in.8). Co więcej, porównania między eksperymentami o różnej charakterystyce regeneracji lub progresji cyklu komórkowego są trudne. Pomiary mniejszych odstępów czasu między zdarzeniem będącym przedmiotem zainteresowania a punktem orientacyjnym cyklu komórkowego (np. pojawienie się pąków, wejście w fazę S lub początek anafazy) mogą pomóc w zmniejszeniu błędów, jeśli te przełomowe zdarzenia są śledzone1,2,3,9,10,11,12. Jednak subtelne, ale ważne różnice mogą pozostać niewykryte lub przesłonięte przy użyciu tych metod ad hoc. Wreszcie, analizy pojedynczych komórek pozwalają analizować progresję cyklu komórkowego bez polegania na synchronizacji lub dopasowaniu13, chociaż pomiary na dużą skalę w badaniach pojedynczych komórek mogą być trudne i kosztowne.

Aby przezwyciężyć te trudności, opracowaliśmy model Charakteryzujący Utratę Synchronizacji Cyklu Komórkowego (CLOCCS), aby pomóc w analizie pomiarów szeregów czasowych wykonanych na zsynchronizowanych populacjach14,15. CLOCCS to elastyczny model matematyczny, który opisuje rozkład zsynchronizowanych komórek w różnych fazach cyklu komórkowego, gdy są one uwalniane z synchronizacji i przechodzą przez cykl komórkowy. Struktura procesu rozgałęziania umożliwia modelowi uwzględnienie asymetrycznych cech komórek macierzystych i potomnych po podziale, jak zaobserwowano u S. cerevisiae, a jednocześnie jest przydatny dla organizmów, które dzielą się przez rozszczepienie, takich jak S. pombe. Model może pobierać dane wejściowe z różnych typów pomiarów w celu określenia fazy cyklu komórkowego. Może pobierać dane dotyczące fazy cyklu pączkowania komórek, które obejmują pomiary procentu pączków komórek w czasie, co pozwala na oszacowanie liczby komórek poza niezabudzoną fazą G114,15. Model może również pozyskiwać dane cytometryczne przepływu, które mierzą zawartość DNA, umożliwiając w ten sposób ocenę przejść punktów orientacyjnych z G1 do S, S do G2 i z M do G115. Fluorescencyjne markery morfologiczne mogą być również wykorzystywane do identyfikacji fazy cyklu komórkowego. Fluorescencyjne znakowanie pierścieni, jąder i ciał wrzecionowatych (SPB) miozyny może być wykorzystane do określenia fazy cyklu komórkowego, a te zostały włączone do modelu CLOCCS11; Pomiary te nie zostaną jednak opisane w niniejszym protokole. Dodatkowo indeks septacji został wykorzystany jako dane wejściowe do modelowania danych z S. pombe14. Dzięki temu model może być wykorzystywany do analiz cyklu komórkowego w różnych organizmach i może być dalej rozbudowywany.

CLOCCS to model parametryczny, który pozwala na pełne bayesowskie wnioskowanie wielu parametrów z danych wejściowych (np. procent pączkowania, zawartość DNA). Parametry te obejmują czas regeneracji po synchronizacji, długość okresu cyklu komórkowego (oszacowaną oddzielnie dla komórek macierzystych i potomnych) oraz średnią pozycję komórek w cyklu komórkowym w każdym punkcie czasowym. Parametry te reprezentują zachowanie przeciętnej komórki w populacji, umożliwiając badaczowi mapowanie każdego punktu czasowego do pozycji cyklu komórkowego wyrażonej jako punkt linii życia. Konwersja na punkty linii życia zależy od parametrów CLOCCS lambda (λ) i mu0 (μ0)14,15. Parametr λ odpowiada średniemu okresowi cyklu komórkowego komórek macierzystych. Jednak ze względu na opóźnienie matka-córka14,15, nie jest to średni okres cyklu komórkowego całej populacji, która obejmuje zarówno komórki matki, jak i komórki potomne. CLOCCS dodatkowo wnioskuje o parametrze delta (δ), który odpowiada opóźnieniu matka-córka, a tym samym pozwala na obliczenie średniego okresu cyklu komórkowego całej populacji. Wreszcie, ponieważ każdy eksperyment rozpoczyna się po zwolnieniu z synchronizacji cyklu komórkowego, czas wymagany do odzyskania sprawności po metodzie synchronizacji jest reprezentowany przez parametr CLOCCS μ0. CLOCCS dopasowuje model do wejściowych danych fazowych cyklu komórkowego, a następnie wnioskuje o tych parametrach za pomocą algorytmu Monte Carlo losowego łańcucha Markowa14,15. Mapując wiele eksperymentów do wspólnej skali czasowej cyklu życia cyklu komórkowego, można dokonać bezpośrednich porównań specyficznych dla fazy między powtórzeniami lub eksperymentami, w których czas odzyskiwania lub okresy cyklu komórkowego nie są identyczne8,14,15.

Ponieważ zsynchronizowane populacje tracą synchronizację w pewnym tempie w trakcie szeregu czasowego14,15,16,17, zmienność szybkości utraty synchronizacji może również utrudniać porównania ilościowe między eksperymentami. Identyfikując lokalizację populacji i wariancję w ich rozmieszczeniu, CLOCCS uwzględnia różnice w tempie utraty synchronizacji. To potężne narzędzie pozwala na konkretne i szczegółowe porównania między eksperymentami, zapewniając w ten sposób możliwość bezpośredniego dokonywania odpowiednich porównań nie tylko między powtórzeniami, ale także między warunkami środowiskowymi, mutantami, a nawet gatunkami, które mają dramatycznie różny czas cyklu komórkowego14,15.

Ten artykuł opisuje metodę wykorzystującą CLOCCS do szacowania parametrów poprzez dopasowywanie danych z eksperymentów synchronicznych/uwalniających, mapowanie danych do wspólnej skali linii życia, a następnie dokonywanie odpowiednich porównań między powtórzeniami lub eksperymentami. Wyrównanie linii życia pozwala na bezpośrednie porównania specyficzne dla fazy w tych eksperymentach, co pozwala na agregację i porównanie kontrprób oraz na dokonywanie bardziej odpowiednich porównań między eksperymentami o różnych czasach regeneracji i okresach cyklu komórkowego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zbieranie danych z fazy cyklu komórkowego i danych eksperymentalnych

  1. Zsynchronizuj komórki w odniesieniu do cyklu komórkowego przy użyciu żądanej metody synchronizacji (np. elutriacja odśrodkowa opisana w Leman et al.18 lub zatrzymanie feromonów godowych zgodnie z opisem w Rosebrock19; zarówno Leman et al.18, jak i Rosebrock19 również zawierają metody uwalniania od synchronizacji). Rozpocznij pobieranie próbek w całym szeregu czasowym, upewniając się, że szereg czasowy ma długość co najmniej dwóch pełnych okresów cyklu komórkowego, a optymalnie zbierz co najmniej 10 próbek na cykl komórkowy. W każdym punkcie czasowym należy pobrać próbkę do danych dotyczących fazy cyklu komórkowego (cytometria pączkowania lub cytometria przepływowa) oraz próbkę do danych eksperymentalnych, jak opisano poniżej.
  2. Jeśli używasz danych o pączkowaniu jako danych o fazie cyklu komórkowego, zbierz dane dotyczące pączkowania dla wyrównania CLOCCS.
    1. Próbkowanie w całym szeregu czasowym. Dla każdego punktu czasowego zbierz komórki i utrwal je, mieszając 200 μl sonikowanej hodowli komórkowej z 200 μl roztworu utrwalającego, jak opisano w Leman et al.18.
    2. W przypadku standardowego pączkowania policz co najmniej 200 komórek na punkt czasowy za pomocą mikroskopu światła przechodzącego z obiektywem 40x i hemocytometrem. Dodać próbkę komórek z kroku 1.2.1 do hemocytometru i rozcieńczyć, jeśli gęstość uniemożliwia zliczenie. Zapisz liczbę pączkujących i niepączkujących komórek w każdym punkcie czasowym. Oblicz procent pączkujących komórek i wykreśl dla każdego punktu czasowego na krzywej pączkowania.
      UWAGA: Dostępne są inne metody określania informacji o fazie cyklu komórkowego, ale nie są one opisane w niniejszym protokole. Pozostałe metody są opisane w pliku readme CLOCCS oraz w poprzednim worku11.
  3. W przypadku korzystania z danych o zawartości DNA metodą cytometrii przepływowej jako danych dotyczących fazy cyklu komórkowego, należy zebrać dane dotyczące barwienia DNA metodą cytometrii przepływowej w celu wyrównania CLOCCS metodą cytometrii przepływowej.
    1. Próbkowanie w całym szeregu czasowym. Dla każdego punktu czasowego zbierz komórki i napraw je zgodnie z opisem w Haase i Reed20.
    2. Wybarwić DNA i przeanalizować za pomocą standardowej analizy cytometrii przepływowej. Zalecany protokół barwienia dla S. cerevisiae jest opisany w Haase and Reed20.
  4. Zbierz powiązane dane omiczne lub powiązane dane eksperymentalne. W przypadku standardowych danych transkryptomicznych należy je zebrać zgodnie z opisem w Leman et al.18 i Kelliher et al.21,22. Upewnij się, że dane są powiązane z punktami czasowymi zawierającymi dane dotyczące fazy cyklu komórkowego, aby umożliwić dalsze wyrównanie. Aby uzyskać optymalne wyrównanie, upewnij się, że każdy punkt czasowy zawierający dane eksperymentalne ma również powiązane dane fazowe.
    UWAGA: Dane eksperymentalne mogą przybierać różne formy. Tradycyjnie używamy metody dopasowania opisanej dla wyrównywania eksperymentów transkryptomicznych szeregów czasowych. Jednak każdy typ danych związanych z punktami czasowymi może być wyrównany (np. proteomics22).

2. Instalacja wymaganego oprogramowania

UWAGA: W tej sekcji zakładamy, że Conda, Java 19 i Git są już zainstalowane (Tabela materiałów).

  1. Pobierz repozytorium CLOCCS_alignment, wprowadzając następujące polecenie w terminalu:
    git clone git clone https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
  2. Utwórz środowisko Conda przy użyciu pliku conda_req.yml, wprowadzając następujące polecenie w terminalu w folderze, w którym sklonowano repozytorium CLOCCS_alignment:
    conda env create -f conda_req.yml

3. Używanie CLOCCS do parametryzacji eksperymentów

  1. Kliknij dwukrotnie plik cloccs_v2023.jar w folderze CLOCCS w repozytorium CLOCCS_alignment i poczekaj na otwarcie graficznego interfejsu użytkownika. Ten ekran umożliwia wprowadzanie opcji przebiegu CLOCCS i wyświetla wyniki po uruchomieniu.
  2. Wprowadź ustawienia ogólne.
    1. Ustaw Sim Anneal, Burn In i Iterations, wpisując w powiązanych polach wprowadzania tekstu. Sim Anneal (symulowane wyżarzanie) identyfikuje dobre początkowe wartości parametrów, Burn In wyszukuje mody a posteriori, a ostatni etap pozwala na wyciągnięcie wszystkich wniosków a posteriori. Wyższe wartości wydłużają czas pracy, ale także zwiększają dokładność.
    2. Wprowadź warunki eksperymentalne, określając temperaturę w stopniach Celsjusza i metodę synchronizacji, korzystając z pola tekstowego oznaczonego Temperatura i menu rozwijanego Synchro. Metoda, odpowiednio.
    3. Opcjonalnie skonfiguruj ustawienia zaawansowane w menu Ustawienia zaawansowane. Ustawienia zaawansowane pozwalają na ustawienie a priori dla każdego z parametrów ("mu0", "sigma0", "sigmav", "lambda", "bud.start", "bud.end").
      UWAGA: Więcej informacji na temat ustawień zaawansowanych można znaleźć w readme.txt w folderze CLOCCS repozytorium CLOCCS_alignment.
  3. Wprowadź ustawienia do użycia z danymi pączkowania.
    1. Wybierz odpowiedni wybór z menu rozwijanego Typ modelu. Domyślna opcja Pączek służy do standardowych informacji o pączkowaniu drożdży.
      UWAGA: W menu rozwijanym dostępne są również inne, bardziej zaawansowane opcje: Mutant dla informacji o pączkowaniu dla mutantów, które przechodzą wiele cykli pączkowania bez podziału, BudSSLSMR dla informacji o pączkowaniu i dodatkowych informacji o korpusie wrzeciona i pierścieniu miozyny oraz BudNucDivNeck dla informacji o pączkowaniu oraz dodatkowych informacji o podziale i jądrach szyjki pąka. Te zaawansowane opcje są opisane w pliku readme CLOCCS oraz w poprzednich pracach11,14,15.
    2. Zaimportuj dane za pomocą panelu Import danych, wpisując tekst w polach wprowadzania tekstu lub przesyłając plik, klikając przycisk Wybierz plik. Pierwsza kolumna określa punkty czasowe. Pozostałe dwie kolumny określają dane pączkowania i mogą przyjmować dowolną z następujących opcji: liczbę niezaszczepionych komórek (Brak pąków), liczbę pączkujących komórek (Pączek) lub całkowitą liczbę komórek (Łącznie).
  4. Wprowadź ustawienia do użycia z danymi cytometrii przepływowej. Dla każdego eksperymentu uruchom krok 3.3 lub krok 3.4.
    UWAGA: Dane cytometrii przepływowej i dane dotyczące pączkowania mogą być używane razem. Chociaż wcześniej opisaliśmy uruchamianie ich razem15, w przypadku tego narzędzia muszą być one uruchamiane niezależnie, a następnie porównywane.
    1. Przekonwertuj pliki .fcs na prawidłowy format wejściowy CLOCCS dla cytometrii przepływowej, postępując zgodnie z instrukcjami w pliku uzupełniającym 1 (znajdującym się również w repozytorium CLOCCS_alignment jako CLOCCS/flow_cytometry_conversion_instructions.txt).
    2. Wybierz opcję Przepływ z menu rozwijanego Typ modelu.
    3. Zaimportuj dane za pomocą panelu Import danych. Kliknij Wybierz plik i wybierz plik wygenerowany w kroku 3.4.1.
    4. Wybierz punkty czasowe, dla których ma zostać wykreślone dopasowanie cytometryczne CLOCCS przepływu, wybierając punkty czasowe w polu Czasy dopasowania.
  5. Po wybraniu wszystkich wejść do cytometrii pączkującej lub przepływowej, kliknij przycisk Zastosuj, a następnie kliknij przycisk Próbka u góry ekranu.
  6. Wyświetl wykresy rozwijającej się krzywej lub cytometrii przepływowej z przewidywanymi pasowaniami, wybierając kartę Przewidywane dopasowania. Ta karta otwiera się domyślnie natychmiast po poprzednim kroku.
  7. Wyświetl histogramy parametrów dla każdego parametru, wybierając kartę Histogramy parametrów, a następnie wybierając kartę podrzędną odpowiadającą interesującemu parametrowi spośród następujących opcji: mu0, delta, sigma0, sigmav, lambda, bud.start, bud.end itp.
  8. Wyświetl wykres punktacji a posteriori, wybierając kartę Posterior Score (Punktacja posterioryczna).
  9. Wyświetl ustawienia, a następnie zmień je, wybierając kartę Ustawienia; wyświetl dziennik poprzednich uruchomień, wybierając kartę Dziennik.
  10. Uzyskaj parametry CLOCCS z pasowania, wybierając zakładkę Parametry tylne. Wynikowa tabela będzie miała następującą postać: każdy wiersz składa się z parametru, a ostatni wiersz jest wierszem tylnym. Kolumny składają się z przewidywanego parametru średniej, dolnego przedziału ufności 2,5%, górnego przedziału ufności 97,5% i współczynnika akceptacji.
    1. Zapisać parametry użyte do dopasowania dla każdego doświadczenia: czas powrotu do zdrowia po synchroniczności (μ0) i średni okres cyklu komórkowego komórek macierzystych (λ).
    2. Oblicz okres cyklu komórkowego, obliczając średnią okresu komórki macierzystej (λ) i okresu komórki potomnej (λ + δ), gdzie δ jest opóźnieniem specyficznym dla córki.
      UWAGA: Powtórz sekcję 3 ze wszystkimi eksperymentami, które mają być uwzględnione w porównaniach.

4. Konwersja punktów czasowych na punkty linii życia za pomocą funkcji konwersji Pythona i parametrów CLOCCS

UWAGA: Konwersja między punktami czasowymi a punktami linii życia wymaga dwóch formuł konwersji21. Implementacja języka Python do konwersji i wizualizacji danych jest dostępna w repozytorium CLOCCS_alignment i opisana poniżej.

  1. Aktywuj środowisko Conda, wprowadzając następujące polecenie w terminalu: conda activate CLOCCS_alignment
  2. Otwórz interaktywny notes języka Python, wpisując następujące polecenie w terminalu: jupyter notebook
  3. Utwórz nowy notes języka Python w żądanym folderze.
    UWAGA: Przykładowy notes został dołączony w celu zademonstrowania standardowego użycia i można go znaleźć w Alignment/JOVE_example.ipynb w repozytorium wyrównania CLOCCS_.
  4. Zaimportuj plik Pythona zawierający funkcje wyrównania, uruchamiając następujące polecenie w pierwszej komórce:
    %run path_to_repo/cloccs_alignment/Wyrównanie/utilities.py
    1. Zastąp ścieżkę do repozytorium CLOCCS_alignment dla path_to_repo.
  5. Jeśli używasz danych pączkowania jako danych fazy cyklu komórkowego, zaimportuj ramkę danych zawierającą procent pączków w każdym punkcie czasowym, uruchamiając następujące polecenie w nowej komórce:
    budding_df = pd.read_csv("path_to_folder/budding_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
    1. Zastąp odpowiednią ścieżkę i nazwę pliku. Jeśli plik jest plikiem .csv, usuń sep ="\t"
  6. Jeśli używasz danych pączkowania jako danych fazy cyklu komórkowego, dopasuj dane pączkowania do skali czasu punktu linii życia, wprowadzając następującą funkcję do nowej komórki:
    aligned_budding_df = df_conversion_from_parameters(budding_df, punkty czasowe, param_mu0, param_lambda)
    1. W przypadku punktów czasowych należy zastąpić listę punktów czasowych indeksem ramki danych budding_df.
    2. W przypadku param_mu0 i param_lambda zastąp wyuczone parametry z pączkującego CLOCCS uruchomionego w sekcji 3 dla eksperymentu.
  7. Jeśli używasz danych cytometrii przepływowej, zaimportuj dane cytometrii przepływowej, uruchamiając następujące polecenie w nowej komórce:
    flow_samples = flow_cytometry_import(flow_input_folder)
    1. W przypadku flow_input_folder należy zastąpić odpowiednią ścieżkę do folderu zawierającego pliki .fcs cytometrii przepływowej.
  8. Jeśli używasz danych cytometrii przepływowej, wygeneruj tabelę konwersji między punktami czasowymi i punktami linii życia dla każdego eksperymentu, wpisując następujące polecenie w nowej komórce:
    flow_converter = convert_tp_to_ll(punkty czasowe, param_mu0, param_lambda)
    1. W przypadku punktów czasowych zastąp je listą punktów czasowych z danych cytometrii przepływowej.
    2. W przypadku param_mu0 i param_lambda należy zastąpić wyuczone parametry z cytometrii przepływowej CLOCCS przeprowadzonej w sekcji 3 dla eksperymentu.
  9. Zaimportuj ramkę danych zawierającą dane eksperymentalne do notesu, uruchamiając następujące polecenie w nowej komórce:
    data_df = pd.read_csv("path_to_folder/exp_data_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
    1. Zastąp odpowiednią ścieżkę i nazwę pliku. Jeśli plik jest plikiem .csv, usuń sep ="\t".
      UWAGA: Można to zrobić dla dowolnych danych tabelarycznych. Dane eksperymentalne muszą po prostu zawierać punkty czasowe jako kolumny lub indeks ramki danych. Przykładowe dane można znaleźć w repozytorium CLOCCS_alignment.
  10. Dopasuj dane eksperymentalne do skali czasu punktu linii życia, wprowadzając następującą funkcję do nowej komórki:
    lifeline_aligned_df = df_conversion_from_parameters(data_df, punkty czasowe, param_mu0, param_lambda, interpolacja, dolna, górna)
    1. W przypadku punktów czasowych zastąp listę punktów czasowych jako indeks lub kolumny data_df eksperymentalnego z poprzedniego kroku.
    2. W przypadku param_mu0 i param_lambda należy zastąpić wartości uzyskane w sekcji 3 z CLOCCS.
      UWAGA: Parametry mogą pochodzić z dowolnego przebiegu CLOCCS wykonanego na dowolnym z akceptowanych typów danych fazy cyklu komórkowego.
    3. Opcjonalnie zastąp interpolację wartością True lub False albo pozostaw puste (wartość domyślna to False).
      UWAGA: Po ustawieniu wartości False dane nie będą interpolowane. Po ustawieniu wartości Prawda punkty linii życia zostaną zaokrąglone i interpolowane w celu wypełnienia wartości między punktami linii życia, tak aby w zakresie punktów linii życia znajdował się punkt na liczbę całkowitą. Pozwala to na lepsze porównanie między zestawami danych.
    4. Opcjonalnie zastąp lowerll i upperll wartościami None lub liczbami całkowitymi.
      UWAGA: Po ustawieniu na Brak, wszystkie punkty linii życia po interpolacji są zachowywane. Gdy podawane są liczby całkowite, dane są obcinane tak, że punkty linii życia mieszczą się w zakresie od dolnego do górnego. Pozwala to na porównanie między zestawami danych z różnymi dolnymi lub górnymi kolumnami.
  11. Pobierz zestaw danych wyrównany do linii życia, wprowadzając następujące polecenie w nowej komórce: lifeline_aligned_df.to_csv("path_to_desired_location/name_of_file.tsv", sep = "\t")
  12. Powtórz kroki 4.5-4.11 ze wszystkimi eksperymentami, które mają być uwzględnione w porównaniach.

5. Porównywanie krzywych pączkowania i danych cytometrii przepływowej

  1. Wykreśl pączkujące krzywe przed wyrównaniem za pomocą funkcji narzędzi Pythona, wprowadzając następujące polecenie w nowej komórce:
    plot_budding_curves(list_of_budding_curves, list_for_legend = leg_list, point_type = str_type, tytuł = str_title)
    1. Zastąp listę zawierającą ramki danych wszystkich pożądanych krzywych pączkowania do wykreślenia dla list_of_budding_curves-[bud_df1, bud_df2, bud_df3].
    2. W razie potrzeby zastąp legendę listą etykiet - [Eksperyment 1, Eksperyment 2, Mutant] dla leg_list. Jeśli nie, wyklucz lub zastąp je Brak.
    3. Zastąp czas str_type.
    4. W razie potrzeby zastąp str_title tytułem ciągu, Porównanie, pączkujące krzywe. Jeśli nie, zastąp go Brak, lub wyklucz.
  2. Wykreśl krzywe pączkowania po wyrównaniu za pomocą funkcji narzędzi Pythona, postępując zgodnie z instrukcjami w kroku 5.1, ale z listą wyrównanych krzywych pączkowania podstawioną przez list_of_budding_curves i z linią życia za point_type zamiast czasu.
  3. Aby wykreślić dane cytometrii przepływowej, należy wykreślić powiązane dane z plików .fcs w odpowiednich punktach linii życia za pomocą konwertera wygenerowanego w kroku 4.8.
  4. Przelicz punkty linii życia na fazę cyklu komórkowego za pomocą tabeli konwertera (tabela 1).
    UWAGA: Można to również wykreślić, postępując zgodnie z instrukcjami w kroku 5.1, ale z fazą dla point_type zamiast czasu.

6. Porównywanie danych eksperymentalnych

  1. Określ listę genów, która ma zostać wykreślona na wykresach liniowych na podstawie informacji z literatury lub genów będących przedmiotem zainteresowania w badaniach.
  2. Użyj podanego plot_linegraph_comparison w pliku narzędzi języka Python, aby przeprowadzić porównania wykresów liniowych z oryginalną, wyrównaną lub wyrównaną i interpolowaną ramką danych, wpisując następujące polecenie w nowej komórce:
    plot_linegraph_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genetyk, point_type = str_type, tytuł = str_title)
    1. Zastąp listę ramek danych eksperymentów, które mają być porównane, list_of_dfs.
      UWAGA: Ramki danych mogą być niewyrównane lub wyrównane; Odpowiednie point_type należy jednak wprowadzić w kroku 6.2.4.
    2. Zastąp listę tytułów każdej ramki danych w tej samej kolejności, co lista ramek danych dla list_for_legend.
    3. Zastąp listę nazw genów (które muszą być zawarte w indeksie ramek danych), które mają być wykreślone dla listy genów.
    4. Zastąp typ punktu str_type. Użyj linii życia (domyślnie jest to skala punktów linii życia) lub fazy (skala linii życia fazy cyklu komórkowego) dla wyrównanych ramek danych w kroku 6.2.1 lub czasu dla niewyrównanych ramek danych w kroku 6.2.1.
    5. Zastąp str_title opcjonalnym tytułem ciągu.
  3. Określ listę genów, która ma zostać uwzględniona na mapie cieplnej, korzystając z literatury lub algorytmów, aby określić najważniejsze geny okresowe.
    UWAGA: Aby zapewnić prawidłowe porównania map cieplnych, dane powinny być wyrównane, interpolowane i dostosowane do skali czasu w kroku 6.2; Powinien mieć taką samą początkową i końcową wartość linii życia dla każdego eksperymentu.
    1. Uruchom algorytmy okresowości, aby określić najważniejsze geny okresowe23,24, lub użyj żądanych metod alternatywnych, aby określić listę genów (tj. wyniki literatury).
    2. Zaimportuj plik listy genów .csv lub tsv do notesu przy użyciu następującego polecenia w nowej komórce:
      sort_df = pd.read_csv("path_to_folder/sorting_filename.tsv", sep="\t", index_col=0)
    3. Zastąp odpowiednią ścieżkę i nazwę pliku. Jeśli plik jest plikiem .csv, usuń sep="\t".
  4. Użyj podanej funkcji plot_heatmap_comparison w pliku narzędzi języka Python, aby przeprowadzić porównanie mapy cieplnej w wyrównanej, interpolowanej i wyrównanej fazowo ramce danych, wpisując następujące polecenie w nowej komórce:
    plot_heatmap_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genetyk, tytuł = str_title)
    1. Zastąp list_of_dfs listą wyrównanych ramek danych eksperymentów, które mają zostać porównane.
    2. Zastąp listę tytułów każdej ramki danych w tej samej kolejności, co lista ramek danych dla list_for_legend.
    3. Zastąp listę nazw genów (które muszą być zawarte w indeksie ramek danych), które mają być wykreślone dla listy genów.
    4. Zastąp opcjonalny tytuł ciągu ciągiem znaków str_title.
      UWAGA: Pierwsza ramka danych na liście to ta, która będzie używana do porządkowania genów na mapie cieplnej. Geny zostaną uporządkowane według maksimum w pierwszym okresie dla tej ramki danych i ta sama kolejność zostanie użyta dla kolejnych ramek danych na liście.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kroki opisane w powyższym protokole i w przepływie pracy w Rysunek 1 został zastosowany do pięciu eksperymentów z szeregami czasowymi synchronizacji cyklu komórkowego, aby zademonstrować dwa reprezentatywne porównania: między powtórzeniami z różnymi metodami synchronizacji (feromon kojarzeniowy i elutriacja odśrodkowa18) i platformy sekwencjonowania (sekwencjonowanie RNA [sekwencjonowanie RNA] i mikromacierz), a także w różnych warunkach eksperymentalnych. Przeprowadz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono metodę dokładniejszej i ilościowej oceny danych z eksperymentów szeregów czasowych na zsynchronizowanych populacjach komórek. Metoda wykorzystuje wyuczone parametry z CLOCCS, bayesowskiego modelu wnioskowania, który wykorzystuje wejściowe dane fazowe cyklu komórkowego, takie jak dane o pączkowaniu i dane o zawartości DNA cytometrycznej przepływowej, do parametryzacji każdego eksperymentu14,15. CLOCCS wykorzystuje wejściowe dane fazowe cyk...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. Campione i S. Haase byli wspierani przez fundusze National Science Foundation (DMS-1839288) i National Institutes of Health (5R01GM126555). Dodatkowo autorzy chcieliby podziękować Huarui Zhou (Duke University) za komentarze do manuskryptu i za beta testy protokołu. Dziękujemy również Francisowi Motcie (Florida Atlantic University) i Joshui Robinsonowi za ich pomoc w tworzeniu kodu Java.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2x PBS do roztworuutrwalającego. Opisany w Leman 2014.
4% formaldehydudo roztworu utrwalającego.
100% etanoldo utrwalania cytometrii przepływowej. Opisane w Haase 2002.
Cytometr
https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
Githttps://git-scm.com/
Java 19https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
MikroskopDo liczenia komórek i pąków.
Minicondahttps://docs.conda.io/en/latest/
Roztwórproteazy Do protokołu cytometrii przepływowej. Opisane w Haase 2002.
RNAza RoztwórDo protokołu cytometrii przepływowej. Opisane w Haase 2002.
SYTOX Zielony barwnik kwasem nukleinowymInvitrogenS7020Do barwienia cytometrią przepływową. Opisane w Haase 2002.
TrispH 7,5
przepływowy CLOCCS Do protokołu cytometrii przepływowej.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tyers, M., Tokiwa, G., Futcher, B. Comparison of the Saccharomyces cerevisiae G1 cyclins: Cln3 may be an upstream activator of Cln1, Cln2 and other cyclins. EMBO Journal. 12 (5), 1955-1968 (1993).
  2. Schwob, E., Nasmyth, K. CLB5 and CLB6, a new pair of B cyclins involved in DNA replication in Saccharomyces cerevisiae. Genes and Development. 7, 1160-1175 (1993).
  3. Polymenis, M., Schmidt, E. V. Coupling of cell division to cell growth by translational control of the G1 cyclin CLN3 in yeast. Genes and Development. 11 (19), 2522-2531 (1997).
  4. Spellman, P. T., et al. Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization. Molecular Biology of the Cell. 9 (12), 3273-3297 (1998).
  5. Cho, R. J., et al. A genome-wide transcriptional analysis of the mitotic cell cycle. Molecular Cell. 2 (1), 65-73 (1998).
  6. Bar-Joseph, Z. Analyzing time series gene expression data. Bioinformatics. 20 (16), 2493-2503 (2004).
  7. Pramila, T., Wu, W., Miles, S., Noble, W. S., Breeden, L. L. The Forkhead transcription factor Hcm1 regulates chromosome segregation genes and fills the S-phase gap in the transcriptional circuitry of the cell cycle. Genes and Development. 20 (16), 2266-2278 (2006).
  8. Orlando, D. A., et al. Global control of cell-cycle transcription by coupled CDK and network oscillators. Nature. 453 (7197), 944-947 (2008).
  9. Nash, R., Tokiwa, G., Anand, S., Erickson, K., Futcher, A. B. The WHI1+ gene of Saccharomyces cerevisiae tethers cell division to cell size and is a cyclin homolog. EMBO Journal. 7 (13), 4335-4346 (1988).
  10. Basco, R. D., Segal, M. D., Reed, S. I. Negative regulation of G1 and G2 by S-phase cyclins of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (9), 5030-5042 (1995).
  11. Mayhew, M. B., Robinson, J. W., Jung, B., Haase, S. B., Hartemink, A. J. A generalized model for multi-marker analysis of cell cycle progression in synchrony experiments. Bioinformatics. 27 (13), 295-303 (2011).
  12. Qu, Y., et al. Cell cycle inhibitor Whi5 records environmental information to coordinate growth and division in yeast. Cell Reports. 29 (4), 987-994 (2019).
  13. Di Talia, S., Skotheim, J. M., Bean, J. M., Siggia, E. D., Cross, F. R. The effects of molecular noise and size control on variability in the budding yeast cell cycle. Nature. 448 (7156), 947-951 (2007).
  14. Orlando, D. A., et al. A probabilistic model for cell cycle distributions in synchrony experiments. Cell Cycle. 6 (4), 478-488 (2007).
  15. Orlando, D. A., Iversen, E. S., Hartemink, A. J., Haase, S. B. A branching process model for flow cytometry and budding index measurements in cell synchrony experiments. Annals of Applied Statistics. 3 (4), 1521-1541 (2009).
  16. Duan, F., Zhang, H. Correcting the loss of cell-cycle synchrony in clustering analysis of microarray data using weights. Bioinformatics. 20 (11), 1766-1771 (2004).
  17. Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H. Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: analysis by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).
  18. Leman, A. R., Bristow, S. L., Haase, S. B. Analyzing transcription dynamics during the budding yeast cell cycle. Methods in Molecular Biology. 1170, 295-312 (2014).
  19. Rosebrock, A. P. Synchronization and arrest of the budding yeast cell cycle using chemical and genetic methods. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (1), (2017).
  20. Haase, S. B., Reed, S. I. Improved flow cytometric analysis of the budding yeast cell cycle. Cell Cycle. 1 (2), 132-136 (2002).
  21. Kelliher, C. M., Leman, A. R., Sierra, C. S., Haase, S. B. Investigating conservation of the cell-cycle-regulated transcriptional program in the fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. PLoS Genetics. 12 (12), e1006453(2016).
  22. Kelliher, C. M., et al. Layers of regulation of cell-cycle gene expression in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2644-2655 (2018).
  23. Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: An efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. Journal of Biological Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
  24. Deckard, A., Anafi, R. C., Hogenesch, J. B., Haase, S. B., Harer, J. Design and analysis of large-scale biological rhythm studies: A comparison of algorithms for detecting periodic signals in biological data. Bioinformatics. 29 (24), 3174-3180 (2013).
  25. Smith, L. M., et al. An intrinsic oscillator drives the blood stage cycle of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Science. 368 (6492), 754-759 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Cycle SynchronyTime Series AlignmentLifeline NormalizationCross Experiment ComparisonSynchronized Cell PopulationsCell Cycle PhaseFlow CytometryBudding YeastTranscriptomic DataProteomic Data

Related Articles