Artykuł metodologiczny

Magnetyczna analiza przepływu podwójnego reportera oparta na kulkach magnetycznych blokady przeciwciał wywołanych szczepionką peptydu PDL1-Vaxx w interakcji PD-1/PD-L1

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65467

⸱

7 lipca 2023

 ,  , 
1Department of Obstetrics & Gynecology, The Ohio State University Wexner Medical Center, 2The James Comprehensive Cancer Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Inhibitory punktów kontrolnych są ważnymi celami w opracowywaniu terapii do walki z rakiem. Raport ten przedstawia nową szczepionkę przeciwnowotworową opartą na peptydzie PDL1, PDL1-Vaxx, która indukuje neutralizującą produkcję przeciwciał poliklonalnych, które blokują tworzenie kompleksu PD-1 / PDL1. Praca ta szczegółowo opisuje również rozwój i testowanie testu opartego na koralikach fluorescencyjnych do analizy tej aktywności.

Streszczenie

Hamowanie receptorów punktów kontrolnych (PD-1, PD-L1 i CTLA-4) za pomocą przeciwciał monoklonalnych wykazało ogromne korzyści w badaniach klinicznych w leczeniu pacjentów z rakiem i stało się podstawowym podejściem w nowoczesnej immunoterapii nowotworów. Jednak tylko podgrupa pacjentów reaguje na immunoterapię przeciwciałami monoklonalnymi w punkcie kontrolnym. Dlatego pilne jest opracowanie nowych strategii terapeutycznych przeciwko nowotworom. Opracowano nową szczepionkę przeciwnowotworową PDL1 (ligand programowanej śmierci 1) z peptydów peptydowych komórek B, zawierającą aminokwasy 130-147 połączone z peptydem MVF ("rozwiązłym" białkiem fuzyjnym wirusa odry z komórek T) za pomocą łącznika GPSL. Badania przedkliniczne wykazały, że ta szczepionka PDL1 (PDL1-Vaxx) skutecznie stymuluje wysoce immunogenne przeciwciała u zwierząt. Zwierzęta zaszczepione PDL1-Vaxx wykazują zmniejszone obciążenie guzem i wydłużone wskaźniki przeżycia w różnych modelach raka zwierzęcego. Mechanizmy działania wskazują, że przeciwciała wywołane szczepionką hamują proliferację komórek nowotworowych, indukują apoptozę i blokują interakcję PD-1/PD-L1. W tym manuskrypcie przedstawiono test oparty na kulkach magnetycznych, który wykorzystuje system analizy przepływu z podwójnym reporterem do oceny interakcji PD-1 / PD-L1 i jej blokady przez przeciwciała anty-PDL1 podniesione przeciwko PDL1-Vaxx.

Wprowadzenie

W komórkach T, B i wewnątrzkomórkowych punktach kontrolnych układu odpornościowego, szlaki sygnałowe regulują aktywność immunologiczną. Niektóre komórki nowotworowe chronią się przed atakiem immunologicznym poprzez stymulację punktów kontrolnych, które hamują funkcje immunologiczne i sprzyjają przeżyciu i proliferacji nowotworu. Immunoterapia onkologiczna poprzez hamowanie punktów kontrolnych wykorzystuje przeciwciała do namierzania i blokowania punktów kontrolnych sygnalizacji, a tym samym przywracania funkcji przeciwnowotworowych układu odpornościowego1,2,3. Wysoce skuteczne terapie przeciwnowotworowe obejmują obecnie przeciwciała monoklonalne niwolumab, który jest ukierunkowany na białko programowanej śmierci 1 (PD-1)4, oraz atezolizumab, który jest ukierunkowany na ligand programowanej śmierci 1 (PD-L1)5. Podejście to wykazało duży sukces kliniczny w leczeniu pacjentów z rakiem. Jednak kliniczna użyteczność obecnych strategii hamowania punktów kontrolnych jest łagodzona przez zdarzenia niepożądane i oporność na leczenie, szczególnie w terapii jednolekowej6. Połączenie immunoterapii i skuteczniejszych strategii terapeutycznych o niższej toksyczności jest pilnie potrzebne w leczeniu raka1,3,6.

W ciągu ostatnich 30 lat, laboratorium dr Kaumaya opracowało peptydowe szczepionki przeciwnowotworowe i środki naśladujące peptydy do terapii raka, z których niektóre są w trakcie trwających badań klinicznych1,2,7,8,9,10,11,12,13,14. Na przykład B-Vaxx z immunoterapią skojarzoną HER-2 wykazał korzyści dla pacjentów w walce z przerzutowymi i/lub nawracającymi guzami litymi w badaniach klinicznych12. Najnowsze szczepionki przeciwnowotworowe laboratorium to PD1-Vaxx2,13 i PDL1-Vaxx14, które wykazały ogromne zalety w badaniach przedklinicznych, zwłaszcza w leczeniu skojarzonym. PD1-Vaxx zakończył badania kliniczne z eskalacją dawki w USA i Australii. PD1-Vaxx zostanie połączony z atezolizumabem w badaniu fazy 1b, które rozpocznie się w maju 2023 r. Niniejszy raport koncentruje się na ocenie zdolności przeciwciał indukowanych przez PDL1-Vaxx do blokowania interakcji PD-1/PD-L1.

Szczepionka przeciwnowotworowa PDL1-Vaxx to nowa szczepionka epitopowa peptydów z komórek B z aminokwasami PD-L1 130-147 połączoną z peptydem fuzji wirusa odry (MVF) za pomocą łącznika peptydów GPSL. Badania przedkliniczne wykazały, że PDL1-Vaxx jest wysoce immunogenny w stymulowaniu produkcji przeciwciał przeciwnowotworowych w różnych modelach zwierzęcych, przedłuża przeżycie i zmniejsza obciążenie nowotworem14. Te przeciwciała wytworzone przeciwko peptydowi PD-L1 mogą skutecznie blokować interakcję PD1/PD-L1, powodując w ten sposób aktywność przeciwnowotworową. W niniejszym raporcie przedstawiono test, który analizuje blokadę tworzenia kompleksu PD1 / PD-L1 przez przeciwciała indukowane PDL1-Vaxx przy użyciu formatu opartego na kulkach magnetycznych z podwójnym odczytem reporterowym na przyrządzie do cytometrii przepływowej.

Protokół

1. Przygotowanie eksperymentalne

UWAGA: Szczegóły dotyczące wszystkich odczynników i sprzętu wymienionych w tym kroku znajdują się w Tabeli Materiałów.

  1. Nabyć rekombinowany ludzki PD-1 (rhPD-1; z tagiem polihistydynowym). Przed użyciem zrekonstytuować liofilizowany rhPD-1 w sterylnie filtrowanym roztworze soli fosforanowo-buforowej (PBS), pH 7,4.
  2. Nabyć biotynilowany rekombinowany ludzki PD-L1 (rhPD-L1). Przed użyciem zrekonstytuować liofilizowany rhPD-L1 w sterylnej wodzie dejonizowanej.
  3. Nabyć odczynnik detekcyjny w postaci R-fizykoerytryny sprzężonej ze streptawidyną (SAPE). Wszystkie roztwory SAPE należy przechowywać w temperaturze chłodziarki (tj. 2-8 °C), chroniąc przed światłem.
  4. Nabyć fluorescencyjnie znakowane mikrosfery magnetyczne (średnica 6,5 µm, polistyren z zatopionym magnetytem) oraz zestaw do sprzęgania kulek (Bead Coupling Kit15 – w przypadku użycia patrz Tabela materiałów). Sprzęganie kowalencyjne z mikrosferami wymaga użycia sulfo-NHS (sulfo-N-hydroksysuccynimidu) i EDC (chlorowodorku N-[3-dimetyloaminopropylo]-N′-etylo-karbodiimidu).
    UWAGA: Zestawy kulek magnetycznych są dostępne z dowolnym z 500 unikalnych znaczników fluorescencyjnych, co pozwala na ich identyfikację i odróżnienie poszczególnych zestawów16. Kulki są oferowane w stężeniach zapasowych 2,5 × 106 beads/mL oraz 12,5 × 106 beads/mL. Kulki należy przechowywać w temperaturze chłodziarki (tj. 2-8 °C), chroniąc przed światłem. Nie zamrażać zawiesin kulek.
  5. Nabyć przeciwciała kontrolne dodatnie i ujemne oraz wtórne przeciwciała detekcyjne znakowane Brilliant Violet 421 (BV421). Wszystkie cząsteczki sprzężone z fluorochromami należy przechowywać w ciemności.
  6. Wszystkie reakcje sprzęgania przeprowadzać w probówkach o niskim wiązaniu białek, a wszystkie reakcje analityczne w 96-dołkowych płytkach mikrotytrujących o dnie okrągłym i niskim wiązaniu białek. Podczas etapów inkubacji testu płytki należy szczelnie zamykać jednorazową folią samoprzylepną lub plastikowymi pokrywkami do płytek 96-dołkowych. Do unieruchamiania kulek podczas etapów przemywania testu należy używać magnetycznego separatora płytek.
    ​UWAGA: System analizy przepływowej z podwójnym reporterem posiada trzy lasery: (1) jeden, który identyfikuje i kwantyfikuje fluorescencję specyficzną dla zestawu kulek (kanał klasyfikacji); (2) jeden, który wykrywa i kwantyfikuje fluorescencję fizykoerytryny (PE) specyficzną dla celu (kanał reporterowy 1; wzbudzenie 532 nm, emisja „pomarańczowa” 565-585 nm); oraz (3) jeden, który wykrywa i kwantyfikuje fluorescencję BV421 specyficzną dla drugiego analizowanego celu (kanał reporterowy 2; wzbudzenie 405 nm, emisja „niebieska” 421-441 nm).

2. Sprzęganie rhPD-1 z kuleczkami magnetycznymi

UWAGA: Białko przeznaczone do sprzęgania nie może zawierać albuminy surowicy bydlęcej (BSA), azotku sodu, glicyny, glicerolu, tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris) ani dodatków zawierających grupy aminowe i powinno być zawieszone w PBS o pH 7,4. Dostępny jest komercyjny zestaw do sprzęgania, który zawiera wszystkie niezbędne odczynniki i bufory opisane w niniejszym dokumencie (patrz Tabela materiałów).

  1. Wyjmij wszystkie odczynniki sprzęgające z lodówki i pozwól im wyrównać temperaturę do temperatury pokojowej (RT, 18-22 °C) przez 20–30 min.
  2. Resuspender mikrosfery macierzyste poprzez krótkie mieszanie w wstrząsarku vortex, sonikację lub rotację (15 min przy 15–30 obr./min), zgodnie z kartą informacyjną produktu.
  3. Przenieś 1 × 106 kuleczki magnetyczne do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml z niskim wiązaniem białek (patrz na Tabela materiałów).
  4. Przemyć kuleczki za pomocą 100 µL buforu aktywacyjnego150,1 M NaH2PO4 (jednobazowy), pH 6,2.
    UWAGA: Sprzęganie można również przeprowadzić przy użyciu gotowego zestawu do sprzęgania (Coupling Kit), który zawiera 0,1 M kwas 2-morfolinoetanosulfonowy (MES), pH 6,0, jako alternatywny bufor aktywacyjny i sprzęgający (patrz) Tabela materiałów).
    1. Umieść probówkę z kuleczkami w separatorze magnetycznym na 1–2 min.
      UWAGA: Alternatywnie kulki można oddzielić poprzez mikrowirowanie przy prędkości ≥8 000 × g przez 1–2 min.
    2. Odssać nadsącz za pomocą pipety z kulek unieruchomionych magnetycznie lub sformowanych w pelet, gdy probówka wciąż znajduje się w separatorze magnetycznym.
    3. Wyjmij probówkę do mikrocentryfugi z magnesu i dodaj 80 µL buforu do sprzęgania (patrz w sekcji) Tabela materiałów).
    4. Delikatnie wymieszaj probówkę z reakcją na wortexie, a następnie poddaj ją sonikacji przez 20 s w celu rozproszenia kulek.
  5. Aktywuj kulki za pomocą sulfo-NHS i EDC.
    UWAGA: Roztwór zapasowy sulfo-NHS ma stężenie 50 mg/mL i jest rozpuszczony w buforze aktywacyjnym. Roztwór zapasowy EDC ma również stężenie 50 mg/mL i jest rozpuszczony w buforze aktywacyjnym. Zarówno bufor aktywacyjny, jak i wilgoć w atmosferze powodują degradację EDC. Nie zaleca się stosowania przechowywanego roztworu EDC. Przed wykonaniem tego kroku należy przygotować świeży roztwór EDC w ilości wystarczającej do przeprowadzenia procedury i użyć go natychmiast po przygotowaniu. Nadmiar roztworu EDC należy zutylizować.
    OSTRZEŻENIE: EDC powoduje silne podrażnienie oczu oraz podrażnia drogi oddechowe i skórę.
    1. Dodaj 10 µL sulfo-NHS do probówki do mikrocentryfugi zawierającej wypłukane i aktywowane kuleczki.
    2. Dodaj 10 µL roztworu stokowego EDC do probówki do wirówki zawierającej kuleczki i sulfo-NHS.
    3. Chronić światłoczułe mikrosfery przed światłem i inkubować na rotatorze przez 20 min przy prędkości 15-30 obr./min w temperaturze pokojowej (18-22 °CAlternatywnie probówka może pozostać w spoczynku podczas etapu aktywacji, pod warunkiem łagodnego mieszania na wortexie w odstępach 10-minutowych w celu redystrybucji kulek.
  6. Wypłucz nadmiar odczynników sprzęgających z kulek.
    1. Umieść probówkę zawierającą aktywowane kuleczki w separatorze magnetycznym na 1-2 min.
    2. Odssać supernatant pipetą z kulek unieruchomionych magnetycznie lub sfałdowanych w granulacie, podczas gdy probówka wciąż znajduje się w separatorze magnetycznym.
    3. Zdejmij probówkę do mikrowirówki z magnesu i dodaj 100 µL buforu aktywacyjnego.
    4. Delikatnie wymieszaj zawartość probówki z reakcją za pomocą wstrząsarki vortex, aby rozproszyć kuleczki.
    5. Powtórz kroki 2.6.1–2.6.4 jeszcze dwa razy, aby w sumie uzyskać trzy przemycia. Po zakończeniu przemywania kuleczki będą zawieszone w 100 µL buforu aktywacyjnego o przybliżonym stężeniu 10 × 106 kulek/ml
  7. Sprzęgnij peptyd rhPD-1 z aktywowanymi kuleczkami.
    1. Dodaj 390 µL buforu aktywacyjnego do probówki zawierającej aktywowane kuleczki, tak aby całkowita objętość zawiesiny kuleczek wyniosła 490 µL.
    2. Dodaj 1 µg peptydu PD-1 do zawiesiny aktywowanych kulek poprzez dodanie 10 µL roztworu peptydu PD-1 (1 mg/ml rozpuszczonego w PBS) do probówki zawierającej aktywowane kulki.
    3. Krótko wymieszaj probówkę do mikrocentryfugi w wirówce typu vortex, aby równomiernie rozprzestrzenić PD-1 i aktywowane kuleczki.
    4. Inkubować kuleczki z PD-1 przez 2 h w ciemności w temperaturze pokojowej (18-22 °C) z rotacją (15–30 obr./min).
  8. Przemyć kuleczki dwukrotnie (2x), używając Buforu do Prób/Przemywania (PBS-TBN: 1x PBS, pH 7,4 + 0,1% BSA + 0,05% Tween-20 + 0,05% NaN3)315).
    1. Umieść probówkę zawierającą aktywowane kuleczki w separatorze magnetycznym na 1–2 min.
    2. Odssać supernatant pipetą z kulek unieruchomionych magnetycznie lub osadzonych w formie pelletu, nie wyjmując probówki z separatora magnetycznego.
    3. Wyjmij probówkę do mikrocentryfugi z magnesu i dodaj 100 µL buforu aktywacyjnego.
    4. Delikatnie wymieszaj zawartość probówki reakcyjnej w wstrząsarce typu vortex, aby rozproszyć kuleczki.
    5. Powtórzyć kroki 2.8.1-2.8.4 jeszcze raz, aby w sumie przeprowadzić dwa przemycia. Po zakończeniu płukania kuleczki będą zawieszone w 100 µL buforu aktywacyjnego w stężeniu 10 × 106 kulek/ml
      UWAGA: Bufor do analizy/płukania może zostać przygotowany bez dodatku azotku sodu (konserwantu), jeżeli bufor nie jest jednocześnie wykorzystywany jako medium do przechowywania.
    6. Przechowywać kulki sprzężone z rhPD-1 w ciemności w lodówce w temperaturze 2-8 °C jeśli nie zostaną użyte natychmiast. Kulki sprzężone z białkiem są stabilne do 18 miesięcy.

3. Ocena skuteczności sprzęgania rhPD-1 z kuleczkami

UWAGA: Mikrosfery sprzężone z rhPD-1 poddaje się reakcji z biotynilowanym rhPD-L1, który jest wykrywany poprzez inkubację z SAPE, a następnie analizowany za pomocą cytometru przepływowego. Pozwala to zweryfikować zarówno pomyślne sprzężenie PD-1 z kuleczkami magnetycznymi, jak i funkcjonalną interakcję pomiędzy białkami rhPD-1 i rhPD-L1.

  1. Przygotuj dwukrotne rozcieńczenia seryjne biotynilowanego rhPD-L1 w buforze PBS-TBN (roztwór zapasowy rhPD-L1 ma stężenie 1 mg/mL). Zakres końcowych stężeń rhPD-L1 do przetestowania wynosi od 8 µg/mL do 313 pg/mL. Przygotuj objętości 150 µL dla każdego rozcieńczenia rhPD-L1: 50 µL na każdą reakcję i dwie reakcje na każdą warunek, plus odpowiedni nadmiar w celu zrekompensowania strat podczas pipetowania.
    1. Oznacz probówki do mikrowirówki z rozcieńczeniami rhPD-L1 jako: 8 µg/mL, 4 µg/mL, 2 µg/mL, 1 µg/mL, 0,5 µg/mL, 0,25 µg/mL, 0,125 µg/mL, 0,063 µg/mL oraz 0,031 µg/mL. Probówka 0 µg/mL (sam PBS-TBN) służy jako kontrola bez PD-L1.
    2. Wlej 150 µL PBS-TBN do wszystkich oznakowanych probówek z rozcieńczeniami rhPD-L1.
      UWAGA: Najwyższe końcowe stężenie rhPD-L1 do przetestowania wynosi 8 µg/mL, a rhPD-L1 zostanie rozcieńczony 1:1 po dodaniu do mieszaniny reakcyjnej, zatem probówka oznakowana jako „8 µg/mL” odnosi się do stężenia końcowego i w rzeczywistości zawiera 16 µg/mL rhPD-L1. Etykiety na wszystkich probówkach z rozcieńczeniami wskazują końcowe stężenie rhPD-L1 po dodaniu do reakcji.
    3. Przygotuj rozcieńczenie rhPD-L1 o najwyższym stężeniu (rzeczywiście 16 µg/mL). Jest to dwuetapowe, 62,5-krotne rozcieńczenie roztworu zapasowego rhPD-L1 o stężeniu 1 mg/mL (1 000 µg/16 µg = 62,5).
      1. W probówce do mikrowirówki połącz 84 µL PBS-TBN z 16 µL roztworu zapasowego rhPD-L1 (1 mg/mL, tj. 1 000 µg). Jest to rozcieńczenie 6,25-krotne, a otrzymane stężenie wynosi 160 µg/mL rhPD-L1.
      2. W probówce oznakowanej jako „8 µg/mL” połącz 270 µL PBS-TBN z 30 µL rozcieńczenia rhPD-L1 przygotowanego w poprzednim kroku (160 µg/mL). Jest to rozcieńczenie 10-krotne, a otrzymane stężenie wynosi w rzeczywistości 16 µg/mL. Etykieta probówki „8 µg/mL” odnosi się do stężenia końcowego po dodaniu do reakcji.
    4. Przenieś 150 µL rozcieńczenia rhPD-L1 przygotowanego w kroku 3.1.3 („8 µg/mL”) do probówki „4 µg/mL”, zamknij zakrętkę probówki do mikrowirówki i krótko wymieszaj na wirówce typu vortex.
    5. Powtarzaj krok 3.1.4 sekwencyjnie, aż do przygotowania całej serii rozcieńczeń rhPD-L1. Po przygotowaniu wszystkie probówki od „8 µg/mL” do „0,063 µg/mL” oraz kontrola 0 µg/mL powinny zawierać 150 µL roztworu, a ostatnia probówka „0,031 µg/mL” powinna zawierać 300 µL roztworu. Pozwala to na uzyskanie wystarczającej objętości każdego rozcieńczenia, aby przetestować 50 µL każdego rozcieńczenia biotynilowanego rhPD-L1 w reakcjach powtórzonych, z zachowaniem odpowiedniego nadmiaru na straty podczas pipetowania.
  2. Policz kuleczki sprzężone z rhPD-1 za pomocą hemocytometru17.
  3. Rozcieńcz zapas kuleczek sprzężonych z rhPD-1 do stężenia 5 × 104 kuleczek/mL, w objętości wystarczającej do uzyskania 2 500 kuleczek/50 µL na reakcję.
  4. Wymieszaj na wirówce typu vortex zawiesinę kuleczek sprzężonych z rhPD-1 o stężeniu 5 × 104 kuleczek/mL i pipetuj 50 µL zawiesiny do każdej oznakowanej/wyznaczonej studni płyty mikrotytrującej z dołkami okrągłymi, tak aby dla każdego testowanego rozcieńczenia rhPD-L1 utworzono studnie dubletowe.
  5. Dodaj 50 µL z każdej probówki z rozcieńczeniem biotynilowanego rhPD-L1 przygotowanej w kroku 3.1 do odpowiednich studni na płycie mikrotytrującej.
  6. Przykryj płytę mikrotytrującą jednorazową folią lub plastikowym przylepnym uszczelnieniem do płyt i inkubuj płytę przez 1 h w ciemności w temperaturze pokojowej (RT 18-22 °C) na wstrząsarce orbitalnej (600 rpm).
  7. Wypłucz nadmiar biotynilowanego rhPD-L1 z kuleczek.
    1. Przenieś uszczelnioną płytę z wstrząsarki orbitalnej na magnetyczny separator płyt na 2 min w celu unieruchomienia kuleczek.
    2. Ostrożnie zdejmij przylepne uszczelnienie płyty, upewnij się, że magnes i płyta mikrotytrująca są stabilnie połączone, a następnie odwróć płytę i wylej nadsącz do zlewu lub odpowiedniego pojemnika na ciekłe odpady biologiczne. Delikatnie, ale energicznie uderz odwróconą płytą o warstwę chłonnego papierowego ręcznika, aby usunąć pozostały nadsącz.
    3. Zdejmij płytę mikrotytrującą z magnetycznego separatora płyt i pipetuj 150 µL PBS-TBN do każdej studni.
    4. Umieść nieuszczelnioną płytę na separatorze magnetycznym na 2 min, aby unieruchomić kuleczki.
    5. Upewnij się, że magnes i płyta mikrotytrująca są stabilnie połączone, a następnie odwróć płytę i wylej nadsącz do zlewu lub odpowiedniego pojemnika na ciekłe odpady biologiczne. Delikatnie, ale energicznie uderz odwróconą płytą o warstwę chłonnego papierowego ręcznika, aby usunąć pozostały nadsącz.
  8. Powtórz etapy płukania płyty 3.7.3-3.7.5 dwa razy, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania, za każdym razem używając 150 µL PBS-TBN. Upewnij się, że po ostatnim etapie płukania w studniach nie pozostał nadsącz. Pracuj sprawnie, aby zapobiec wysychaniu unieruchomionych kuleczek na dnie studni.
  9. Dodaj reagent detekcyjny SAPE.
    1. Rozcieńcz roztwór zapasowy SAPE w PBS-TBN do stężenia roboczego 6 µg/mL. Przygotuj wystarczającą objętość roboczego roztworu SAPE, aby każda studnia reakcyjna mogła otrzymać 100 µL/studnię, z odpowiednim nadmiarem na straty podczas pipetowania.
    2. Zdejmij płytę mikrotytrującą z magnetycznego separatora płyt.
    3. Dodaj 100 µL roboczego roztworu SAPE do każdej studni reakcyjnej i resuspenduj wypłukane kuleczki poprzez pipetowanie.
    4. Uszczelnij 96-dołkową płytę mikrotytrującą folią lub plastikowym przylepnym uszczelnieniem i inkubuj przez 1 h w ciemności w temperaturze pokojowej (RT 18-22 °C) na wstrząsarce orbitalnej przy 600 rpm.
    5. Wyjmij płytę mikrotytrującą z inkubatora, przenieś ją na magnetyczny separator płyt, aby unieruchomić kuleczki, zdejmij przylepne uszczelnienie i wypłucz kuleczki trzy razy za pomocą 150 µL PBS-TBN, zgodnie z opisem w krokach 3.7.3-3.7.5.
    6. Po usunięciu ostatniego płukania zdejmij płytę z magnetycznego separatora płyt i resuspenduj kuleczki w 100 µL PBS-TBN na studnię.
  10. Przeanalizuj wyniki.
    1. Odczytaj płytę za pomocą analizatora przepływowego (patrz Tabela materiałów), aby wyznaczyć medianę intensywności fluorescencji (MFI) dla każdej reakcji, stosując następujące ustawienia instrumentu: objętość aspiracji = 50 µL; minimalna liczba kuleczek = 100 kuleczek; czas oczekiwania (timeout) = 40 s; bramkowanie (gating) = 7 000-17 000; tryb pracy = Single Reporter. Dla każdego warunku przeprowadzane są pomiary w studniach dubletowych, a dwie otrzymane wartości MFI dla każdego warunku są uśredniane przed dalszymi obliczeniami danych i sporządzeniem wykresów.
      ​UWAGA: Wartość MFI dla każdego rozcieńczenia powinna wykazywać wiązanie zależne od stężenia, co wskazuje na dopuszczalną wydajność sprzęgania rhPD-1 z kuleczkami i potwierdza prawidłową interakcję rekombinowanych białek PD-1/PD-L1.

4. Test blokowania PD-1/PD-L1 z wykorzystaniem kulek magnetycznych PD-L1

UWAGA: Ten test ocenia aktywność blokującą rozpuszczalnych mediatorów (np. przeciwciał przeciwko peptydowi PDL1) w interakcjach rekombinowanych białek PD1/PD-L1. W skrócie, biotynilowany rhPD-L1 jest inkubowany z przeciwciałami wytworzonymi u królików po różnych inokulacjach peptydami PDL1-Vaxx. Mieszanina rhPD-L1 i przeciwciał przeciwko PDL1 jest następnie wychwytywana przy użyciu kulek magnetycznych sprzężonych z rhPD-1, a wiązanie rhPD-L1 z kulek sprzężonych z rhPD-1 jest ilościowo określane poprzez dodanie streptawidyny-PE. Sygnał fluorescencji PE koreluje odwrotnie z aktywnością blokującą testowanych przeciwciał/inhibitorów przeciwko PDL1. Wiązanie przeciwciał przeciwko peptydowi PDL1 jest jednocześnie oceniane poprzez wiązanie wtórnego przeciwciała sprzężonego z BV421 – przeciwciała przeciwko królikom (dla przeciwciał przeciwko peptydowi PDL1) lub przeciwciała przeciwko ludziom (dla przeciwciał kontrolnych) – oraz poprzez ocenę fluorescencji BV421 w drugim kanale urządzenia. Etapy testu zostały szczegółowo przedstawione graficznie na Rysunku 1.

  1. Przygotuj dwukrotny szereg rozcieńczeń testowych przeciwciał, obejmujący kandydatów na poliklonalne przeciwciała indukowane przez PDL1-Vaxx, przeciwciało kontrolne negatywne (trastuzumab, Herceptin, humanizowane monoklonalne przeciwciało anty-HER2) oraz przeciwciało kontrolne pozytywne (atezolizumab; humanizowane monoklonalne przeciwciało IgG1 anty-PDL1). W każdej reakcji zostanie wykorzystane 25 µL przypisanego rozcieńczenia przeciwciał, zatem podane objętości są wystarczające do przeprowadzenia każdej reakcji w dwóch powtórzonych studzienkach na warunek (tzn. 50 µL na warunek), z pewnym nadmiarem w celu zrekompensowania strat podczas pipetowania.
    1. Dla każdego przeciwciała anty-peptyd PDL1 indukowanego szczepionką oraz przeciwciała kontrolnego upewnij się, że zakres końcowych stężeń testowanych przeciwciał wynosi od 1 000 µg/mL do 8 µg/mL. Przygotuj roztwory zapasowe wszystkich przeciwciał o stężeniu 2 000 µg/mL.
    2. Dla każdego przeciwciała oznakuj probówki do rozcieńczeń jako 1 000 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL, 63 µg/mL, 31 µg/mL, 16 µg/mL oraz 8 µg/mL i dopisz nazwę przeciwciała. Dla każdego przeciwciała dodaj również probówkę „0 µg/mL”, która będzie służyć jako kontrola zawierająca sam nośnik (PBS-TBN).
      UWAGA: Po dodaniu do mieszaniny reakcyjnej stężenie przeciwciał zostanie rozcieńczone 1:1. Probówki do rozcieńczeń przeciwciał są oznakowane jako końcowe stężenie przeciwciał po dodaniu do reakcji i w rzeczywistości zawierają dwukrotnie większą ilość przeciwciał niż wskazano w oznaczeniu.
    3. Dodaj 75 µL PBS-TBN do wszystkich probówek do rozcieńczeń przeciwciał oznakowanych jako „500 µg/mL” i poniżej, w tym do probówek kontrolnych z samym nośnikiem „0 µg/mL”.
    4. Dla każdego przeciwciała pipetuj 150 µL roztworu zapasowego 2 000 µg/mL do odpowiedniej probówki oznakowanej jako „1 000 µg/mL”. Posłuży ona do przygotowania wszystkich kolejnych rozcieńczeń dla każdego przeciwciała.
    5. Dla każdego przeciwciała stwórz pełny szereg rozcieńczeń, przenosząc pipetą 75 µL z probówki „1 000 µg/mL” do probówki z kolejnym, niższym rozcieńczeniem w serii (tzn. „500 µg/mL”). Zamknij nowo przygotowaną probówkę z rozcieńczeniem, krótko wymieszaj ją w wortexie i kontynuuj tworzenie serii rozcieńczeń, przenosząc 75 µL z probówki „500 µg/mL” do probówki „250 µg/mL”. Powtarzaj ten schemat, aż zostanie przygotowane ostatnie rozcieńczenie „8 µg/mL” dla wszystkich przeciwciał.
      UWAGA: W ukończonej serii rozcieńczeń dla każdego przeciwciała we wszystkich probówkach powinna znajdować się objętość 75 µL, z wyjątkiem najniższego rozcieńczenia 8 µg/mL, które powinno zawierać objętość 150 µL. Każda reakcja wykorzystuje 25 µL rozcieńczenia przeciwciał, zatem objętości te są wystarczające do przeprowadzenia każdej reakcji w dwóch powtórzonych studzienkach na warunek (tzn. 50 µL na warunek), z zapasem na straty podczas pipetowania.
  2. Nanieś 25 µL rozcieńczonych przeciwciał do wyznaczonych studzienek płytki mikrotitracyjnej 96-dołkowej.
  3. Rozcieńcz biotynylizowany rhPD-L1 do stężenia roboczego 4 µg/mL w PBS-TBN w objętości wystarczającej do naniesienia 25 µL w dwóch powtórzonych studzienkach na warunek (tzn. 50 µL na warunek), z zapasem na straty podczas pipetowania.
    UWAGA: W tej pracy biotynylizowany rhPD-L1 w stężeniu 4 µg/mL dał sygnał MFI wynoszący około 50% maksymalnego sygnału zmierzonego we wcześniejszej ocenie sprzęgania i został wykorzystany do analizy blokowania PD-1/PD-L1.
  4. Dodaj 25 µL biotynylizowanego rhPD-L1 (4 µg/mL) do każdej studzienki reakcyjnej, przykryj płytkę mikrotitracyjną folią lub plastikową uszczelką samoprzylepną i inkubuj w RT (18-22 °C) przez 1 h przy wstrząsaniu na orbitalnym wstrząsarzu do płytek z prędkością 600 rpm.
  5. Rozcieńcz kulek sprzęganych z rhPD-1 do stężenia 50 000 kulek/mL, przygotowując objętość wystarczającą do naniesienia 50 µL/studzienka (2 500 kulek/studzienka) plus zapas na straty podczas pipetowania.
  6. Zdejmij 96-dołkową płytkę reakcyjną z wstrząsarki i usuń samoprzylepną uszczelkę płytki.
  7. Dodaj 50 µL mieszaniny kulek sprzęganych z rhPD-1 do każdej studzienki.
  8. Zamknij płytkę i inkubuj przez 1 h w ciemności w RT (18-22 °C) na wstrząsarce orbitalnej z prędkością 600 rpm.
  9. Przenieś zamkniętą płytkę z wstrząsarki orbitalnej do magnetycznego separatora płytek na 2 min w celu unieruchomienia kulek.
  10. Ostrożnie usuń samoprzylepną uszczelkę płytki, upewnij się, że magnes i płytka mikrotitracyjna są stabilnie połączone, odwróć płytkę i wylej nadymające ciecze. Delikatnie stuknij odwróconą płytkę o warstwę chłonnego papierowego ręcznika, aby usunąć nadmiar supernatantu.
  11. Wypłucz nadmiar reagentów reakcyjnych z kulek.
    1. Zdejmij płytkę mikrotitracyjną z magnetycznego separatora płytek i dodaj 150 µL PBS-TBN do każdej studzienki.
    2. Umieść płytkę mikrotitracyjną na magnetycznym separatorze płytek na 2 min w celu unieruchomienia kulek.
    3. Upewnij się, że magnes i płytka mikrotitracyjna są stabilnie połączone, odwróć płytkę i wylej supernatanty. Delikatnie stuknij odwróconą płytkę o warstwę chłonnego papierowego ręcznika, aby usunąć nadmiar supernatantu.
  12. Powtórz kroki płukania płytki 4.11.1-4.11.3 dwa razy, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania za pomocą PBS-TBN. Upewnij się, że reagent SAPE jest przygotowany (poniżej) przed usunięciem końcowego (trzeciego) roztworu płuczącego.
  13. Dodaj reagent detekcyjny SAPE.
    1. Rozcieńcz zapasowy roztwór SAPE do stężenia roboczego 6 µg/mL w PBS-TBN; przygotuj objętość wystarczającą do naniesienia 100 µL/studzienka, plus zapas na straty podczas pipetowania.
    2. Dodaj 100 µL/studzienka roztworu roboczego SAPE do każdej studzienki reakcyjnej i resuspenduj kulki za pomocą pipety.
    3. Zamknij płytkę i inkubuj przez 1 h w ciemności w RT (18-22 °C) na wstrząsarce orbitalnej z prędkością 600 rpm.
  14. Odlej nadmiar SAPE z reakcji.
    1. Przenieś zamkniętą płytkę z wstrząsarki orbitalnej do magnetycznego separatora płytek na 2 min w celu unieruchomienia kulek.
    2. Ostrożnie usuń samoprzylepną uszczelkę płytki, upewnij się, że magnes i płytka mikrotitracyjna są stabilnie połączone, odwróć płytkę i wylej supernatant. Delikatnie stuknij odwróconą płytkę o warstwę chłonnego papierowego ręcznika, aby usunąć supernatant zawierający nadmiar SAPE.
  15. Wypłucz nadmiar SAPE z kulek.
    1. Zdejmij płytkę mikrotitracyjną z magnetycznego uchwytu na płytki.
    2. Dodaj 150 µL PBS-TBN do każdej studzienki, aby zresuspendować kulki.
    3. Umieść płytkę mikrotitracyjną na magnetycznym separatorze płytek na 2 min w celu unieruchomienia kulek.
    4. Upewnij się, że magnes i płytka mikrotitracyjna są stabilnie połączone, odwróć płytkę i wylej supernatant. Delikatnie stuknij odwróconą płytkę o warstwę chłonnego papierowego ręcznika, aby usunąć nadmiar supernatantu.
  16. Przeprowadź dwa dodatkowe etapy płukania za pomocą PBS-TBN, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania, powtarzając kroki 4.15.1-4.15.4. Przygotuj sprzężone z BV421 wtórne przeciwciała detekcyjne (następny krok) przed usunięciem końcowego (trzeciego) roztworu płuczącego.
  17. Dodaj wtórne przeciwciała sprzężone z BV421.
    1. Rozcieńcz przeciwciała anty-ludzkie IgG sprzężone z BV421 (do wykrywania humanizowanych przeciwciał kontrolnych) oraz przeciwciała anty-królicze IgG sprzężone z BV421 (do wykrywania poliklonalnych przeciwciał indukowanych przez PDL1-Vaxx) (patrz Tabela Materiałów) w stosunku 1:400 w buforze do płukania/analizy (Wash/Assay Buffer) w objętościach wystarczających do użycia 100 µL/studzienka każdego z nich, z zapasem na straty podczas pipetowania.
    2. Dodaj 100 µL rozcieńczonych przeciwciał anty-ludzkich IgG sprzężonych z BV421 lub anty-króliczych IgG sprzężonych z BV421 do odpowiednich studzienek.
    3. Zamknij płytkę i inkubuj przez 1 h w ciemności w RT (18-22 °C) na wstrząsarce orbitalnej z prędkością 600 rpm.
  18. Odlej nadmiar wtórnych przeciwciał sprzężonych z BV421 z kulek.
    1. Przenieś zamkniętą płytkę z wstrząsarki orbitalnej do magnetycznego separatora płytek na 2 min w celu unieruchomienia kulek.
    2. Ostrożnie usuń samoprzylepną uszczelkę płytki, upewnij się, że magnes i płytka mikrotitracyjna są stabilnie połączone, odwróć płytkę i wylej supernatant. Delikatnie stuknij odwróconą płytkę o warstwę chłonnego papierowego ręcznika, aby usunąć supernatant zawierający nadmiar wtórnych przeciwciał sprzężonych z BV421.
  19. Wypłucz nadmiar wtórnych przeciwciał sprzężonych z BV421 z kulek.
    1. Dodaj 150 µL PBS-TBN do każdej studzienki, aby zresuspendować kulki.
    2. Umieść płytkę mikrotitracyjną na magnetycznym separatorze płytek na 2 min w celu unieruchomienia kulek.
    3. Upewnij się, że magnes i płytka mikrotitracyjna są stabilnie połączone, odwróć płytkę i wylej supernatant. Delikatnie stuknij odwróconą płytkę o warstwę chłonnego papierowego ręcznika, aby usunąć nadmiar supernatantu.
  20. Przeprowadź trzy dodatkowe etapy płukania za pomocą PBS-TBN, aby łącznie przeprowadzić cztery płukania, powtarzając kroki 4.19.1-4.19.3.
  21. Po usunięciu ostatniego (czwartego) buforu płuczącego zdejmij płytkę mikrotitracyjną z magnetycznego separatora płytek i zresuspenduj kulki w 100 µL PBS-TBN/studzienka za pomocą pipety.
  22. Przeanalizuj wyniki.
    1. Odczytaj płytkę w systemie analizy przepływowej z podwójnym raportorem, aby wyznaczyć MFI każdej reakcji, stosując następujące ustawienia instrumentu: objętość aspiracji = 50 µL; minimalna liczba kulek = 100 kulek; czas oczekiwania (timeout) = 40 s; bramkowanie (gating): 7 000-17 000; tryb pracy = Dual Reporter.
    2. W systemie z podwójnym raportorem upewnij się, że kanał raportujący 1 mierzy pomarańczową fluorescencję PE (ilość rhPD-L1 przyłączonego do kulek sprzęganych z rhPD-1), a kanał raportujący 2 mierzy niebieską fluorescencję BV421 (ilość przyłączonego przeciwciała blokującego związanego z rhPD-L1).
    3. Wykonaj pomiary w powtórzonych studzienkach dla każdego warunku i oblicz średnią z dwóch uzyskanych wartości MFI dla każdego warunku przed przeprowadzeniem dalszych obliczeń danych i tworzeniem wykresów.
    4. Znormalizuj wartość MFI każdej próbki względem kontroli negatywnej i oblicz procent inhibicji dla każdej próbki:
      Procent inhibicji = (100 × [MFI kontroli negatywnej − MFI próbki]) / MFI kontroli negatywnej
      UWAGA: Wartości MFI kontroli negatywnej (brak inhibicji) są wartościami najwyższymi; sygnał MFI związanego PD-L1 stanowi 100%, a inhibicję wiązania rhPD-L1 z rhPD-1 definiuje się jako 0%.

Schemat testu wiązania przeciwciał z etapami inkubacji z użyciem kulek PD-1, SAPE i cytometrii przepływowej.
Rysunek 1: Schemat podwójnego testu reporterowego blokady PD-1/PD-L1. Biotynilowany rekombinowany ludzki PD-L1 (rhPD-L1) jest wstępnie inkubowany z wybranymi przeciwciałami anty-PDL1 indukowanymi przez PDL1-Vaxx przed połączeniem z magnetycznymi kulkami sprzężonymi z rhPD-1, aby umożliwić tworzenie kompleksu punktu kontrolnego PD-1/PD-L1. Kompleksowy rhPD-L1 jest następnie wykrywany i znakowany poprzez dodanie fykoerytryny sprzężonej ze streptawidyną (SAPE, fluorofor pomarańczowy). Przeciwciała przeciwko epitopom PDL1-Vaxx celują w rhPD-L1, który utworzył kompleks z rhPD-1 uprzednio sprzężonym z kulkami magnetycznymi, i są one obrazowane przy użyciu przeciwciała wtórnego sprzężonego z Brilliant Violet 421 (BV421, fluorofor niebieski). Zarówno biotynilowany rhPD-L1 tworzący kompleks z PD-1 (sygnał PE), jak i przeciwciała anty-PDL1 rozpoznające i wiążące rhPD-L1 (sygnał BV421) są analizowane jednocześnie przy użyciu podwójnego instrumentu cytometrycznego, który bada próbki pod kątem obu fluoroforów w dwóch oddzielnych kanałach reporterowych. Wartości wyjściowe dla każdej próbki stanowią medianę intensywności fluorescencji każdego fluoroforu. Hamowanie tworzenia kompleksu PD1/PD-L1 przez różne przeciwciała indukowane przez PDL1-Vaxx jest następnie ekstrapolowane poprzez porównanie sygnałów eksperymentalnych z sygnałami generowanymi przy użyciu negatywnego przeciwciała monoklonalnego, które nie wiąże rhPD-L1 (0% hamowania). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki

Test ten pozwolił na precyzyjne określenie stopnia hamowania oddziaływania PD-1/PD-L1 przez cztery unikalne przeciwciała poliklonalne, wygenerowane przeciwko peptydom szczepionkowym rhPD-L1, które są badane jako potencjalne środki terapeutyczne w leczeniu nowotworów. Schemat tego testu przedstawiono na Rysunku 1. Ilość biotynylidowanego rhPD-L1, który związał się z kuleczkami sprzężonymi z rhPD-1, oraz hamowanie tego wiązania przez cztery kandydackie przeciwciała indukowane przez PLD1-Vaxx, zmierzono w Kanale Reporterowym 1 przy użyciu odczynnika detekcyjnego streptawidyna-PE, który bezpośrednio wiązał rhPD-L1 (Rysunek 2).

Wszystkie cztery poliklonalne przeciwciała anty-PDL1-peptydowe zablokowały interakcję rhPD-L1 z PD-1 unieruchomionym na mikrokulkach w różnym stopniu. Procent hamowania przez poszczególne przeciwciała anty-PDL1 peptydowe wynosił od 48% do 74% przy maksymalnym przebadanym stężeniu 1 000 µg/mL. Pozytywne kontrolne przeciwciało monoklonalne atezolizumab osiągnęło 92% blokady interakcji PD-1/PD-L1 przy maksymalnym przebadanym stężeniu14 4 µg/mL (Rysunek 2). Wszystkie eksperymentalne przeciwciała PDL1-Vaxx wykazały zależne od stężenia hamowanie wiązania rhPD-L1 z kulkami sprzężonymi z rhPD-1 w porównaniu z trastuzumabem, przeciwciałem kontrolnym negatywnym, którego nie oczekiwano, że będzie wchodzić w interakcje z systemem PD-1/PD-L1.

Wykres hamowania PD-1/PD-L1, stężenie przeciwciał względem hamowania, analiza danych dotyczących skuteczności przeciwciał.
Rysunek 2: Blokowanie interakcji rhPD-L1 z rhPD-1 sprzężonym z kulkami magnetycznymi przez przeciwciała przeciwko peptydowi PDL1, wykazane za pomocą nowego immunoanalizy opartej na fluorescencyjnych kulkach. Rekombinowane ludzkie PD-1 sprzężono z mikrosferami magnetycznymi, a następnie kulki inkubowano z biotinylowanym rhPD-L1, który został wcześniej inkubowany z różnymi przeciwciałami przeciwko peptydowi PDL1. Do związania biotyny i tym samym oceny względnej ilości rhPD-L1 dostępnego do związania z PD-1 użyto odczynnika detekcyjnego streptawidyna-fikoerytryna. Przeciwciała poliklonalne otrzymane u królików przeciwko peptydowym szczepionkom PDL1 (anti-PDL1[36], anti-PDL1[50], anti-PDL1[95] i anti-PDL1[130]) przebadano pod kątem aktywności hamującej, co wykazało blokowanie interakcji rekombinowanych PD-1/PD-L1 na poziomie 48%-74% przy najwyższym badanym stężeniu. Atezolizumab (inny monoklonalny przeciwciało anty-PDL1) posłużył jako kontrola pozytywna. Niezwiązane komercyjne przeciwciało monoklonalne trastuzumab (anty-HER2) posłużyło jako kontrola negatywna. Rysunek został zaadaptowany z pracy Guo i wsp.14. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres wiązania przeciwciała anty-PDL1 w funkcji stężenia, przedstawiający odpowiedź MFI w porównaniu z kontrolą.
Rysunek 3: Porównanie wiązania różnych przeciwciał indukowanych przez PDL1-Vaxx do kompleksu rhPD-L1 z kuleczkami magnetycznymi powlekanymi rhPD1. Do porównania wiązania różnych króliczych poliklonalnych przeciwciał anty-peptyd PDL1 do rhPD-L1 poprzez kuleczki powlekane rhPD-1 użyto wtórnego przeciwciała detekcyjnego sprzężonego z Brilliant Violet 421. Sygnał niebieskiej fluorescencji BV421 zarejestrowano w kanale raportującym 2 urządzenia z podwójnym raportowaniem; sygnał ten koreluje z względną wydajnością wiązania eksperymentalnych przeciwciał anty-peptyd PDL1. Jako kontrolę negatywną zastosowano trastuzumab (anty-HER2), przeciwciało monoklonalne celujące w inny punkt kontrolny niż PD-1/PD-L1. MFI oznacza średnią medianową intensywność fluorescencji kuleczek, którą mierzono w dwóch powtórzeniach w studzienkach reakcyjnych dla każdego wariantu. Rysunek został zaadaptowany z pracy Guo i wsp.14. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Względne zdolności czterech eksperymentalnych kandydatów na przeciwciała indukowane przez PDL1-Vaxx do wiązania rhPD-L1 porównano przy użyciu oddzielnego systemu detekcji (anty-IgG królicze sprzężone z BV421), który oceniano na drugim kanale reporterowym instrumentu. Wyniki te wykazały, że wszystkie cztery poliklonalne przeciwciała anty-peptyd PDL1 wiązały rhPD-L1 w sposób zależny od stężenia14 (Rysunek 3). Przeciwciało anty-PDL1(130) wykazało najwyższy sygnał wiązania rhPDL1 spośród czterech kandydatów na przeciwciała indukowane przez PDL1-Vaxx.

Dyskusja

Celem immunoterapii nowotworów związanych z punktami kontrolnymi jest zakłócenie interakcji między białkami punktów kontrolnych a ich ważnymi ligandami w przeżywalności i progresji guza2. Ta grupa badawcza aktywnie opracowuje nowe szczepionki PD-1 i PD-L1, które wywołują odpowiedź przeciwciał, która jest ukierunkowana i przerywa punkt kontrolny PD-1/PD-L1 3,8,13,14. Wcześniej przeprowadzono dwie wersje testów immunoenzymatycznych (ELISA) w celu oceny wpływu przeciwciał przeciwko peptydowi PDL1 na hamowanie rekombinowanej interakcji PD1 / PD-L114. (1) W pierwszym wariancie rhPD-L1 pokryto płytką do mikromiareczkowania, a następnie płytkę inkubowano z rozcieńczonymi przeciwciałami indukowanymi przez kandydata na szczepionkę anty-PDL1. Hamowanie rekombinowanej interakcji PD-1 / PD-L1 przez przeciwciała oceniono następnie poprzez dodanie biotynylowanego rhPD-1 i ilościowe określenie wiązania z unieruchomionym rhPD-L1 za pomocą koniugatu streptawidyny i peroksydazy chrzanowej i substratu kolorymetrycznego. Zdefiniowaliśmy to jako test blokady bezpośredniej. (2) W drugim wariancie PD-1 pokryto płytką do mikromiareczkowania. Biotynylowany rhPD-L1 był wstępnie inkubowany z każdym z przeciwciał poliklonalnych indukowanych przez kandydata anty-PLD1 w oddzielnych probówkach reakcyjnych. Mieszaniny rhPDL1/anty-PDL1 dodano następnie do studzienek płytkowych zawierających unieruchomiony rhPD-1 i pozostawiono do reakcji. Każdy rhPDL1, który reagował z unieruchomionym rhPD-1 w obecności potencjalnie blokujących przeciwciał indukowanych PDL1-Vaxx, został wykryty z późniejszą inkubacją streptawidyny-HRP i substratu kolorymetrycznego. Zdefiniowaliśmy to jako test blokady odwrotnej.

Odwrotna blokada rekombinowanej interakcji PD-1 / PD-L1 przez przeciwciała anty-peptydowe PDL1 wykazała hamowanie sygnału (tj. blokadę PD-1 / PD-L1) w sposób zależny od stężenia przeciwciał14, podczas gdy podejście do bezpośredniej blokady nie dostarczyło spójnych wyników (nie pokazano). Test podwójnej blokady reporterowej oparty na kulkach został opracowany w celu weryfikacji wyników testu ELISA i zbadania blokady interakcji PD-1 / PD-L1 w fazie płynnej, co eliminuje potencjalne problemy z dostępnością epitopów sterycznych/wiążących związane z unieruchomieniem rekombinowanych białek na dnie studzienek. Analiza mikrosfery była bezpośrednio skorelowana z wynikami blokowania ELISA przy użyciu testu odwrotnej blokady (ryc. 2). Ponadto testy immunologiczne oparte na fluorescencji mogą zapewnić lepszą czułość testu i poszerzony zakres dynamiczny w porównaniu z kolorymetrycznymi testami ELISA18, a ponadto multipleksowany test oparty na kulkach umożliwia jednoczesne wykonywanie dwóch niezależnych testów immunologicznych w ramach jednej reakcji. Sulfo-NHS i EDC stosowane do kowalencyjnego sprzężenia mikrosfer z rhPD-1 mogły prowadzić do różnic w wydajności obserwowanych między testami bezpośredniej blokady i odwróconej blokady oraz obserwowanych różnic w czułości między testami interakcji rekombinowanych PD-1 / PD-L1 na bazie kulek ELISA i Luminex. Uzasadnione są dalsze badania na poziomie chemicznym i molekularnym w celu zbadania możliwych mechanizmów odpowiedzialnych za te różnice.

Zarówno test ELISA14, jak i testy oparte na kulkach wykazują, że przeciwciała anty-PDL1 indukowane przez PDL1-Vaxx mogą hamować tworzenie kompleksu punktów kontrolnych PD1 / PD-L1. PDL1-Vaxx na bazie peptydów skutecznie indukuje przeciwciała anty-PDL1, które mogą blokować interakcję PD-1 / PD-L1. Podejście to może służyć jako nowatorska strategia terapeutyczna w leczeniu raka, co potwierdzają przedkliniczne badania na zwierzętach 3,13,14. Planowane badania kliniczne określą skuteczność PDL1-Vaxx w immunoterapii punktów kontrolnych i kontroli choroby u pacjentów z rakiem.

Oświadczenia

Pravin T.P. Kaumaya jest konsultantem Imugene, Ltd.

Podziękowania

Autorzy dziękują Sherry Dunbar PhD, MBA z Luminex Corporation (Austin, TX) za wsparcie badań oraz Matthew Silvermanowi PhD z Biomedical Publishing Solutions (Panama City, FL; mattsilver@yahoo.com) za pomoc naukową i pisarską. Praca ta została wsparta nagrodami dla Pravina T. P. Kaumaya z National Institutes of Health (R21 CA13508 i R01 CA84356) oraz Imugene Ltd z Sydney w Australii (OSU 900600, GR110567 i GR124326).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bufor aktywacyjny buffers
: 0,1 M NaH2PO4, pH 6,2milipore/SigmaS3139
testowy/bufor myjący: PBS-TBN (1x PBS, pH 7,4 + 0,1% BSA + 0,05% (v/v) Tween-20; 0,05% NaN3)Millipore/SigmaP3563 (PBS+Tween20), A7888 (albumina surowicy bydlęcej), S8032 (azydek sodu)
Bufor sprzęgający: 50 mM kwas 2-morfolinoetanosulfonowy (MES), pH 5,0MiliporeSigma M2933
Coupling Reagents
1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo]karbodimidowy chlorowodorek (EDC)ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)77149
xMAP Zestaw sprzęgający przeciwciała (w razie potrzeby), zawiera:Luminex Corp.  (Austin, Teksas)40-50016
EDC, 10 mg 
rozwiązanie sNHS, 250 i mikro; L
Bufor aktywacyjny/sprzęgający: 0,1 M Kwas 2-morfolinoetanosulfonowy (MES), pH 6,0
Bufor do płukania: 1x PBS, pH 7,4 + 0,1% BSA + 0,05% (v/v) Tween-20; 0,05% NaN3 (PBS-TBN)
Sulfo-NHS (N-hydroksysulfosukcynimid)ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)24510
Instrumentation and Ancillary Lab Supplies
xMAP INTELLIFLEX (instrument z podwójnym reporterem)Luminex Corp.  (Austin, Teksas)INTELLIFLEX-DRSE-RUO
Okrągłodenna 96-dołkowa płytka o niskim poziomie wiązania białekThermoFisher Scientific (Waltham, MA)07-200-761
Magnetyczny separator płytkowy Luminex (lub porównywalny) Luminex Corp.  (Austin, Teksas)CN-0269-01
Magnetyczny separator rurowy Luminex (lub porównywalny)Luminex Corp.  (Austin, Teksas)CN-0288-01
Mikrosfery MagPlex (magnetyczne, fluorescencyjne, 6,5- i mikro; Koraliki o średnicy m)Luminex Corp.  (Austin, Teksas)MC-1**** (różni się w zależności od etykiety kulki)
Probówki do mikrowirówek białkowych LoBindThermoFisher Scientific (Waltham, MA)022431081
peptydy, przeciwciała i Odczynniki do wykrywania
Atezolizumab (humanizowane przeciwciało monoklonalne anty-PDL1 IgG1), kontrola pozytywnaGenentech/Roche (San Francisco, CA)n/a (leki na receptę)
Biotynylowany rekombinowany ludzki PDL1 Sino Biological (Wayne, PA)10084-H49H-B
Brilliant Violet 421-kongugowany osioł anty-ludzki IgGJackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA)709-675-149
Brilliant Violet 421-kongugowany osioł anty-królik IgGJackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA)711-675-152
Rekombinowany ludzki PD-1 (oznaczony polihistydyną)Acro Biosystems (Newark, Niemcy)PD1-H5256 
R-fikoerytryna sprzężona ze streptawidyną (SAPE)Agilent (Santa Clara, CA)PJRS34-1
Trastuzumab (Herceptin, humanizowane przeciwciało monoklonalne anty-HER2), kontrola negatywnaGenentech/Roche (San Francisco, CA)n/a (leki na receptę)
Test

Bibliografia

  1. Kaumaya, P. T. B-cell epitope peptide cancer vaccines: a new paradigm for combination immunotherapies with novel checkpoint peptide vaccine. Future Oncology. 16 (23), 1767-1791 (2020).
  2. Pandey, P., et al. Revolutionization in cancer therapeutics via targeting major immune checkpoints PD-1, PD-L1 and CTLA-4. Pharmaceuticals. 15 (3), 335(2022).
  3. Guo, L., Overholser, J., Good, A. J., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. Preclinical studies of a novel human PD-1 B-cell peptide cancer vaccine PD1-Vaxx from BALB/c mice to beagle dogs and to non-human primates (cynomolgus monkeys). Frontiers in Oncology. 12, 826566(2022).
  4. Brahmer, J. R., Hammers, H., Lipson, E. J. Nivolumab: Targeting PD-1 to bolster antitumor immunity. Future Oncology. 11 (9), 1307-1326 (2015).
  5. Shah, N. J., Kelly, W. J., Liu, S. V., Choquette, K., Spira, A. Product review on the Anti-PD-L1 antibody atezolizumab. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (2), 269-276 (2018).
  6. Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. Immune-related adverse events associated with immune checkpoint blockade. The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).
  7. Kaumaya, P. T. A paradigm shift: Cancer therapy with peptide-based B-cell epitopes and peptide immunotherapeutics targeting multiple solid tumor types: Emerging concepts and validation of combination immunotherapy. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 11 (6), 1368-1386 (2015).
  8. Guo, L., Kaumaya, P. T. P. First prototype checkpoint inhibitor B-cell epitope vaccine (PD1-Vaxx) en route to human Phase 1 clinical trial in Australia and USA: Exploiting future novel synergistic vaccine combinations. British Journal of Cancer. 125 (2), 152-154 (2021).
  9. Dakappagari, N. K., Douglas, D. B., Triozzi, P. L., Stevens, V. C., Kaumaya, P. T. Prevention of mammary tumors with a chimeric HER-2 B-cell epitope peptide vaccine. Cancer Research. 60 (14), 3782-3789 (2000).
  10. Dakappagari, N. K., et al. Conformational HER-2/neu B-cell epitope peptide vaccine designed to incorporate two native disulfide bonds enhances tumor cell binding and antitumor activities. The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 54-63 (2005).
  11. Kaumaya, P. T., et al. Phase I active immunotherapy with combination of two chimeric, human epidermal growth factor receptor 2, B-cell epitopes fused to a promiscuous Tcell epitope in patients with metastatic and/or recurrent solid tumors. Journal of Clinical Oncology. 27 (31), 5270-5277 (2009).
  12. Bekaii-Saab, T., et al. Phase I immunotherapy trial with two chimeric HER-2 B-cell peptide vaccines emulsified in montanide ISA 720VG and Nor-MDP adjuvant in patients with advanced solid tumors. Clinical Cancer Research. 25 (12), 3495-3507 (2019).
  13. Kaumaya, P. T. P., Guo, L., Overholser, J., Penichet, M. L., Bekaii-Saab, T. Immunogenicity and antitumor efficacy of a novel human PD-1 B-cell vaccine (PD1-Vaxx) and combination immunotherapy with dual trastuzumab/pertuzumab-like HER-2 B-cell epitope vaccines (B-Vaxx) in a syngeneic mouse model. Oncoimmunology. 9 (1), 1818437(2020).
  14. Guo, L., Overholser, J., Darby, H., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. A newly discovered PD-L1 B_cell epitope peptide vaccine (PDL1-Vaxx) exhibits potent immune responses and effective anti-tumor immunity in multiple syngeneic mice models and (synergizes) in combination with a dual HER-2 B-cell vaccine (B-Vaxx). Oncoimmunology. 11 (1), 2127691(2022).
  15. Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. Luminex Corporation. The xMAP® Cookbook, 5th edition. , Available from: https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F (2022).
  16. MagPlex® Microspheres Documentation. Product information sheet. Luminex Corporation. , Available from: https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview (2014).
  17. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. 2019 (11), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).
  18. Gibbs, J., Vessels, M., Rothenberg, M. Selecting the Detection System - Colorimetric, Fluorescent, Luminescent Methods for ELISA Assays. Corning Inc. , Available from: https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf (2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Szczepionka PDL1 Vaxxblokada PD 1 PD L1test z u yciem kulek magnetycznychpeptydowa szczepionka przeciwnowotworowapunkt kontrolny odporno ciimmunoterapia nowotwor wprzeciwcia a poliklonalnecytometria przep ywowa
Magnetyczna analiza przepływu podwójnego reportera oparta na kulkach magnetycznych blokady przeciwciał wywołanych szczepionką peptydu PDL1-Vaxx w interakcji PD-1/PD-L1
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.