Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający produkcję na dużą skalę komórek przylegających za pomocą całkowicie zamkniętego systemu opartego na rozpuszczalnych mikronośnikach klasy GMP. Hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, komórek HEK293T i komórek Vero została zwalidowana i spełniła zarówno wymagania ilościowe, jak i kryteria jakościowe dla branży terapii komórkowej i genowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Produkcja ogniw na dużą skalę w oparciu o rozpuszczalne porowate mikronośniki klasy GMP
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badacze z branży terapii komórkowej i genowej (CGT) od dawna stoją przed ogromnym wyzwaniem w zakresie efektywnej i zakrojonej na szeroką skalę ekspansji komórek. Aby wyeliminować podstawowe niedociągnięcia dwuwymiarowego (2D) systemu hodowli płaskiej, w innowacyjny sposób opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę produkcji komórek na skalę przemysłową (ACISCP) opartą na rozpuszczalnym i porowatym mikronośniku klasy GMP do hodowli 3D przylegających komórek, w tym ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (hMSC), komórek HEK293T i komórek Vero. Aby osiągnąć ekspansję na dużą skalę, przeprowadzono dwuetapową ekspansję za pomocą bioreaktorów ze zbiornikiem mieszadłem o pojemności 5 l i 15 l, aby uzyskać 1,1 x 1010 hMSC o łącznej 128-krotnej ekspansji w ciągu 9 dni. Komórki zebrano poprzez całkowite rozpuszczenie mikronośników, zagęszczono, przemyto i sformułowano za pomocą systemu przetwarzania komórek opartego na wirówce o ciągłym przepływie, a następnie podano za pomocą systemu napełniania komórek. W porównaniu z hodowlą planarną 2D nie ma istotnych różnic w jakości hMSC pobranych z hodowli 3D. Zastosowaliśmy również te rozpuszczalne porowate mikronośniki do innych popularnych typów komórek w sektorze CGT; w szczególności komórki HEK293T i komórki Vero hodowano do szczytowej gęstości komórek wynoszącej odpowiednio 1,68 x 107 komórek/ml i 1,08 x 107 komórek/ml. Badanie to dostarcza protokołu korzystania z platformy inżynierii bioprocesowej wykorzystującej cechy rozpuszczalnych mikronośników klasy GMP i zaawansowanego zamkniętego sprzętu w celu osiągnięcia produkcji komórek adherentnych na skalę przemysłową.
Wprowadzenie
Branża CGT doświadczyła wykładniczego rozwoju w ciągu ostatnich dwóch dekad. Przewiduje się, że ewolucja leków nowej generacji pozwoli leczyć i leczyć wiele chorób opornych na leczenie1. Od czasu pierwszego zatwierdzenia przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) produktu CGT, Kymriah, w 2017 r., badania i rozwój związany z CGT na świecie nadal rozwijają się w szybkim tempie, a FDA odnotowała wzrost liczby aktywnych wniosków o nowe leki eksperymentalne dla CGT do 500 w 2018 r. 2. Przewidywano, że do 2030 r. liczba zatwierdzeń produktów CGT w Stanach Zjednoczonych wyniesie prawdopodobnie 54-74 2.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ludzka pępowina została pobrana ze szpitala Beijing Tsinghua Changgeng. Wszystkie procedury i protokoły dotyczące pozyskiwania, izolacji i hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych ludzkiej pępowiny (UCMSC) zostały przeprowadzone za świadomą zgodą i za zgodą Komitetu Etyki Szpitala Beijing Tsinghua Changgeng (numer zgłoszenia 22035-4-02), a procedury i protokoły były zgodne z Deklaracją Helsińską z 1964 r. i jej późniejszymi poprawkami lub porównywalnymi standardami etycznymi.
1. Monowarstwowa hodowla komórek hMSC, komórek HEK293T i komórek Vero
- Wyizoluj pierwotne ludzkie UCMSC od galaretki Whartona zgodnie ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Platforma ACISCP to całkowicie zamknięty system, który wykorzystuje szereg bioreaktorów z mieszadłem do ekspansji w celu zwiększenia skali, system przetwarzania komórek do zautomatyzowanego zbierania i formułowania komórek oraz system napełniania komórek (Rysunek 1). Komórki adherentne przywierają do porowatych mikronośników, które mogą zostać rozproszone w bioreaktorze, co umożliwia hodowlę zawiesinową komórek adherentnych.
Zgodnie z opisanym protokołem, 2,5 x 10.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zarówno immunoterapia, jak i terapia komórkami macierzystymi wykorzystują żywe komórki jako leki; Jednak ich produkty końcowe nie powinny być oczyszczane ani sterylizowane w taki sam sposób, jak małe cząsteczki lub wirusy. W związku z tym należy zawsze pamiętać o zasadzie jakości w fazie projektowania (QbD) i praktycznie stosować ją w procesie produkcji i kontroli chemikaliów (CMC) podczas produkcji ogniw23. W celu spełnienia wymagań preferencyjnie uważa się, że w pełni zamknięty system hodowli ko.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Y.D. jest doradcą naukowym, a H.X., Y.Z., L.G., M.L., Y.Y., W.L. i X.Y. są pracownikami Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd. Pozostali autorzy nie mają żadnego komercyjnego, zastrzeżonego ani finansowego interesu w produktach lub firmach opisanych w tym artykule. Wszyscy pozostali autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana finansowo przez National Science Foundation for Distinguished Young Scholars (82125018).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,25% trypsyna EDTA | BasalMedia | S310JV | Służy do zbierania komórek 2D. |
| 3D FloTrix Digest | CytoNiche Biotech | R001-500 | Jest to odczynnik, który specyficznie rozpuszcza mikronośniki 3D TableTrix. |
| 3D FloTrix MSC Serum Free Medium | CytoNiche Biotech | RMZ112 | Jest to bezsurowicowy, wolne od zwierząt podłoże do ekspansji i utrzymania mezenchymalnych komórek macierzystych w hodowli planarnej 2D, a także hodowli 3D na mikronośnikach 3D TableTrix. |
| Jednorazowy moduł filtracji 3D FloTrix | CytoNiche Biotech | R020-00-10 | Ten moduł zawiera 0,22 μ m Filtry kapsułkowe stosowane do filtracji pożywki hodowlanej i roztworu trawiącego. |
| Jednorazowa torba do przechowywania 3D FloTrix (10 l) | CytoNiche Biotech | R020-00-03 | Używana jako torba na paszę do bioreaktora 5 l. |
| Jednorazowa torba do przechowywania 3D FloTrix (3 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-01 | Używana jako worki do wysiewu komórek lub przenoszenia. |
| Jednorazowa torba do przechowywania 3D FloTrix (50 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-04 | Używana jako torba na paszę do bioreaktora 15 L. |
| 3D FloTrix vivaPACK Jednorazowe wypełnienie i Zestaw materiałów eksploatacyjnych do wykończenia | CytoNiche Biotech | PACK-01-01 | Jest to standardowy zestaw przystosowany do systemu napełniania i wykańczania 3D vivaPACK. |
| System napełniania i wykańczania 3D FloTrix vivaPACK do komórek | CytoNiche Biotech | vivaPACK | Ten system jest zamkniętym urządzeniem do obsługi cieczy, z automatycznymi funkcjami mieszania i odprowadzania gazu. Komórki zawieszone w buforze do kriokonserwacji można szybko i równomiernie podzielić na 20 worków na partię. |
| System przetwarzania komórek 3D FloTrix vivaPREP PLUS | CytoNiche Biotech | vivaPREP PLUS | Ten system jest urządzeniem opartym na wirówce przepływowej. Komórki mogą być zagęszczane, myte i ponownie zawieszane w całkowicie zamkniętych procedurach. |
| 3D FloTrix vivaPREP PLUS Jednorazowy zestaw do przetwarzania komórek | CytoNiche Biotech | PREP-PLUS-00 | Jest to standardowy zestaw przystosowany do przetwarzania komórek 3D vivaPREP PLUS. |
| Bioreaktor 3D FloTrix vivaSPIN 15 L | CytoNiche Biotech | FTVS15 | Ten produkt bioreaktora wykorzystuje kontroler, szklany zbiornik z mieszadłem o pojemności 15 litrów i analizatory. Dostępna jest specjalna rurka perfuzyjna. |
| Bioreaktor 3D FloTrix vivaSPIN 5 L | CytoNiche Biotech | FTVS05 | Ten produkt bioreaktora wykorzystuje kontroler, szklany zbiornik z mieszadłem o pojemności 5 litrów i analizatory. Dostępna jest specjalna rurka perfuzyjna. |
| Zestaw materiałów eksploatacyjnych 3D FloTrix vivaSPIN do systemu zamkniętego (10/15 L) | CytoNiche Biotech | R020-10-10 | Jest to standardowy zestaw przewodów dostosowany do bioreaktora 3D vivaSPIN 15 L, zawierający worki do pobierania próbek. |
| Zestaw materiałów eksploatacyjnych 3D FloTrix vivaSPIN do systemu zamkniętego (2/5 L) | CytoNiche Biotech | R020-05-10 | Jest to standardowy zestaw przewodów dostosowany do bioreaktora 3D vivaSPIN 5 L, zawierający worki do pobierania próbek. |
| 3D TableTrix mikronośniki G02 | CytoNiche Biotech | G02-10-10g | Te porowate i degradowalne mikronośniki nadają się do hodowli komórek HEK293T. Są one wstępnie wysterylizowane w 10 g / butelkę z rurkami C-Flex do spawania z rurami w bioreaktorach. |
| Mikronośniki 3D TableTrix V01 | CytoNiche Biotech | V01-100-10g | Te porowate i degradowalne mikronośniki nadają się do przylegających hodowli komórkowych, występują w postaci niesterylizowanych mikronośników, które przed użyciem należy autoklawować w PBS. Nadają się one szczególnie do produkcji szczepionek. |
| Mikronośniki 3D TableTrix W01 | CytoNiche Biotech | W01-10-10g (opakowanie jednorazowe); W01-200 (tabletki) | Te porowate i degradowalne mikronośniki nadają się do przylegających hodowli komórkowych, szczególnie do komórek, które muszą być zbierane jako produkty końcowe. Są one wstępnie wysterylizowane w 10 g / butelkę z rurkami C-Flex do spawania z rurami w bioreaktorach. Produkt uzyskał 2 kwalifikacje dla farmaceutycznych substancji pomocniczych od CDE, o numerach rejestracyjnych [F20200000496; F20210000003]. Otrzymał również kwalifikację DMF dla farmaceutycznych substancji pomocniczych od FDA, z numerem rejestracyjnym [DMF:35481] |
| APC anty-ludzkie przeciwciało CD45 | BioLegend | 368512 | Stosowany w cytometrii przepływowej do oceny tożsamości MSC |
| Zestaw do podwójnego barwienia Calcein-AM/PI | Dojindo | C542 | Calcein-AM/PI Double Staining Kit służy do jednoczesnego barwienia fluorescencyjnego żywych i martwych komórek. Ten zestaw zawiera roztwory Calcein-AM i jodku propidyny (PI), które barwią odpowiednio żywe i martwe komórki. |
| Zakrętka do EZ Top Container Zamknięcia do pojemników NALGENE (500mL) | Saint-Gobain | CAP-38 | Marki i numery katalogowe to tylko na przykład, podobne produkty są dostępne u różnych dostawców i o ile mają taką samą funkcjonalność, przedmioty można zastąpić innymi markami. |
| Rurka C-Flex, Formulacja 374 (0,25 cala x 0,44 cala) | Saint-Gobain | 374-250-3 | Służy do spawania i rozłączania rur. |
| Worek do zamrażania CryoMACS 50 | Miltenyi Biotec | 200-074-400 | Służy do rozbudowy jednorazowego wypełniacza 3D FloTrix vivaPACK& Wykończ zestaw materiałów eksploatacyjnych. |
| Siarczan dimetylu (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | Służy do przygotowania roztworu do krioprezerwacji. |
| Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM) | BasalMedia | L120KJ | Służy do hodowli komórek HEK293T i Vero. |
| DURAN Original GL 45 Butelka laboratoryjna (2 L) | DWK nauki przyrodnicze | 218016357 | Służy do zbierania odpadów z bioreaktora o pojemności 5 l. |
| DURAN Original GL 45 Butelka laboratoryjna (5 L) | DWK nauki przyrodnicze | 218017353 | Służy do zbierania odpadów z bioreaktora o pojemności 15 l. |
| DURAN Original GL 45 Butelka laboratoryjna (500 mL) | DWK nauki przyrodnicze | 218014459 | Służy do dodatkowej butelki 0,1 M NaOH. |
| EZ Górne zamknięcia pojemników do pojemników NALGENE (500 ml) | Saint-Gobain | EZ500 ML-38-2 | Marki i numery katalogowe to tylko na przykład, podobne produkty są dostępne u różnych dostawców i o ile mają taką samą funkcjonalność, przedmioty można zastąpić innymi markami. |
| Surowica bydlęca płodu (FBS) najwyższej jakości | Żubr | 086-150 | Stosowany do hodowli komórek HEK293T. |
| Przeciwciało anty-ludzkie CD14 FITC | BioLegend | 301804 | Stosowany w cytometrii przepływowej do oceny tożsamości MSC. |
| Przeciwciało anty-ludzkie CD34 FITC | BioLegend | 343504 | Stosowany w cytometrii przepływowej do oceny tożsamości MSC. |
| Przeciwciało anty-ludzkie FITC CD90 (Thy1) | BioLegend | 328108 | Stosowane w cytometrii przepływowej do oceny tożsamości MSC. |
| Cytometria przepływowa | Beckman Coulter | CytoFLEX | Służy do oceny tożsamości komórki. |
| Fluorescencyjny analizator komórek | Alit life science | Countstar Rigel S2 | Służy do zliczania komórek. Żywotność komórek można obliczyć, barwiąc barwnikami AO/PI. |
| Złącze wieloportowe GL 45 z 2 portami | DWK nauki przyrodnicze | 292632806 | Marki i numery katalogowe to tylko przykład, podobne produkty są dostępne u różnych dostawców i tak długo, jak mają tę samą funkcjonalność, artykuły mogą być zastępowane innymi markami. |
| Glukometr | Sinocare | 6243578 | Służy do wykrywania stężenia glukozy w pożywce do hodowli komórkowych i supernatancie. |
| Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS), z wapniem i magnezem | Gibco | 14025092 | Służy do przygotowania roztworu trawiącego. |
| Albumina ludzka 20% Behring (HSA) | CSL Behring | N/A | Służy do przygotowania buforu do płukania. |
| Odwrócony mikroskop fluorescencyjny | OLYMBUS | CKX53SF | Służy do obserwacji i obrazowania w polu brifgt oraz fluorescencji. |
| Cylinder miarowy Nalgene (500 mL) | Thermo Scientific | 3662-0500PK | Służy do kalibracji prędkości objętościowej przepływu cieczy pomp perystaltycznych. |
| Surowica dla noworodków cielęcych (NBS) bardzo drobna | MINHAI BIO | SC101.02 | Służy do hodowli komórek Vero. |
| Zestaw do różnicowania i charakterystyki adipogennej ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych OriCell | Cyagen | HUXUC-90031 | Służy do trójliniowego różnicowania hUCMSC. |
| Zestaw do różnicowania i charakterystyki chondrogennej ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych OriCell | Cyagen | HUXUC-90041 | Służy do trójliniowego różnicowania hUCMSC. |
| Zestaw do różnicowania i charakterystyki osteogennej ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych OriCell | Cyagen | HUXUC-90021 | Służy do trójliniowego różnicowania hUCMSC. |
| Przeciwciało anty-ludzkie CD105 BioLegend | 800504 | Stosowane w cytometrii przepływowej do oceny tożsamości MSC. | |
| PE anty-ludzkie przeciwciało CD19 | BioLegend | 302208 | Stosowany w cytometrii przepływowej do oceny tożsamości MSC. |
| Przeciwciało anty-ludzkie przeciwko ludzkiej CD73 (ekto-5'-nukleotydazie) BioLegend | 344004 | Stosowany w cytometrii przepływowej do oceny tożsamości MSC. | |
| Przeciwciało PE anty-ludzkie HLA-DR | BioLegend | 307605 | Stosowany w cytometrii przepływowej do oceny tożsamości MSC. |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Żubr | 311-010-CL | Stosowany w autoklawowaniu naczyń szklanych i mikronośników V01 oraz wymianie pożywki hodowlanej. |
| Sani-Tech Platinum Utwardzane silikonowe rurki sanitarne (0,13 cala x 0,25 cala) | Saint-Gobain | ULTRA-C-125-2F | Służy do przenoszenia roztworu napędzanego pompami perystaltycznymi. |
| Sterylna sól fizjologiczna | Hopebiol | HBPP008-500 | Służy do przygotowania buforu do mycia. |
| Trypzyme Rekombinowana trypsyna | BasalMedia | S342JV | Ten odczynnik służy do przenoszenia kulek do koralików komórek HEK293T i Vero. |
| Uszczelniacz do rur | Yingqi Biotech | Tube Sealer I | Ten uszczelniacz jest kompatybilny zarówno z rurkami C-Flex, jak i rurkami PVC. |
| Spawarka do rur PVC | Chu Biotech | Tube Welder Micro I | Służy do spawania rur PVC. |
| Spawarka do rur TPE | Yingqi Biotech | Spawarka do rur I-V2 | Służy do spawania rur TPE. |
| ViaStain AO / PI Viability Stains | Nexcelom | CS2-0106-25mL | Dual-Fluorescence Viability, wykorzystujące oranż akrydynowy (AO) i jodek propydyny (PI), jest zalecaną metodą dokładnej analizy żywotności komórek pierwotnych, takich jak PBMC, i komórek macierzystych w próbkach zawierających szczątki. |
Bibliografia
- Golchin, A., Farahany, T. Z. Biological products: Cellular therapy and FDA approved products. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (2), 166-175 (2019).
- Young, C. M., Quinn, C., Trusheim, M. R.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
