Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Produkcja ogniw na dużą skalę w oparciu o rozpuszczalne porowate mikronośniki klasy GMP

5.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65469

⸱

7 lipca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, 2Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd.

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający produkcję na dużą skalę komórek przylegających za pomocą całkowicie zamkniętego systemu opartego na rozpuszczalnych mikronośnikach klasy GMP. Hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, komórek HEK293T i komórek Vero została zwalidowana i spełniła zarówno wymagania ilościowe, jak i kryteria jakościowe dla branży terapii komórkowej i genowej.

Streszczenie

Badacze z branży terapii komórkowej i genowej (CGT) od dawna stoją przed ogromnym wyzwaniem w zakresie efektywnej i zakrojonej na szeroką skalę ekspansji komórek. Aby wyeliminować podstawowe niedociągnięcia dwuwymiarowego (2D) systemu hodowli płaskiej, w innowacyjny sposób opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę produkcji komórek na skalę przemysłową (ACISCP) opartą na rozpuszczalnym i porowatym mikronośniku klasy GMP do hodowli 3D przylegających komórek, w tym ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (hMSC), komórek HEK293T i komórek Vero. Aby osiągnąć ekspansję na dużą skalę, przeprowadzono dwuetapową ekspansję za pomocą bioreaktorów ze zbiornikiem mieszadłem o pojemności 5 l i 15 l, aby uzyskać 1,1 x 1010 hMSC o łącznej 128-krotnej ekspansji w ciągu 9 dni. Komórki zebrano poprzez całkowite rozpuszczenie mikronośników, zagęszczono, przemyto i sformułowano za pomocą systemu przetwarzania komórek opartego na wirówce o ciągłym przepływie, a następnie podano za pomocą systemu napełniania komórek. W porównaniu z hodowlą planarną 2D nie ma istotnych różnic w jakości hMSC pobranych z hodowli 3D. Zastosowaliśmy również te rozpuszczalne porowate mikronośniki do innych popularnych typów komórek w sektorze CGT; w szczególności komórki HEK293T i komórki Vero hodowano do szczytowej gęstości komórek wynoszącej odpowiednio 1,68 x 107 komórek/ml i 1,08 x 107 komórek/ml. Badanie to dostarcza protokołu korzystania z platformy inżynierii bioprocesowej wykorzystującej cechy rozpuszczalnych mikronośników klasy GMP i zaawansowanego zamkniętego sprzętu w celu osiągnięcia produkcji komórek adherentnych na skalę przemysłową.

Wprowadzenie

Branża CGT doświadczyła wykładniczego rozwoju w ciągu ostatnich dwóch dekad. Przewiduje się, że ewolucja leków nowej generacji pozwoli leczyć i leczyć wiele chorób opornych na leczenie1. Od czasu pierwszego zatwierdzenia przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) produktu CGT, Kymriah, w 2017 r., badania i rozwój związany z CGT na świecie nadal rozwijają się w szybkim tempie, a FDA odnotowała wzrost liczby aktywnych wniosków o nowe leki eksperymentalne dla CGT do 500 w 2018 r. 2. Przewidywano, że do 2030 r. liczba zatwierdzeń produktów CGT w Stanach Zjednoczonych wyniesie prawdopodobnie 54-74 2.

Chociaż szybki wzrost badań i innowacji CGT jest ekscytujący, nadal istnieje duża luka technologiczna między badaniami laboratoryjnymi a produkcją na skalę przemysłową, która mogłaby dostarczyć te obiecujące leki, aby dotrzeć do tylu pacjentów, ilu potrzeba, po przystępnych kosztach. Obecne procesy przyjęte w tych badaniach klinicznych zostały ustanowione w laboratoriach do eksperymentów na małą skalę i potrzebne są znaczne wysiłki w celu ulepszenia i wprowadzenia innowacji w CGT manufacturing3. Istnieje wiele rodzajów produktów CGT, z których większość opiera się na żywych komórkach, które mogą być allogeniczne, autologiczne, inżynieryjne lub naturalne. Te żywe leki są znacznie bardziej złożone niż małe jednostki molekularne lub biologiczne, co sprawia, że produkcja na dużą skalę jest poważnym wyzwaniem4,5,6. W tej pracy demonstrujemy protokół produkcji komórek na dużą skalę dla trzech komórek zależnych od zakotwiczenia, które są szeroko stosowane w CGT. Należą do nich ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste/zrębowe (hMSC), które są wykorzystywane w terapii komórkowej, oraz komórki HEK293T i komórki Vero, które są wykorzystywane do produkcji wirusów do inżynierii genetycznej końcowego produktu komórkowego terapeutycznego. Komórki zależne od zakotwiczenia są zwykle hodowane w systemach płaskich, które wymagają ręcznego przetwarzania. Jednak ręczne metody hodowli wymagają znacznego nakładu pracy i są podatne na zanieczyszczenia, co może zagrozić jakości produktu końcowego. Ponadto nie ma kontroli procesu na linii produkcyjnej, co prowadzi do znacznych różnic w jakości między partiami7. Biorąc za przykład terapię komórkami macierzystymi, z obiecującą linią ponad 200 kandydatów na terapię komórkami macierzystymi, szacuje się, że potrzeba 300 bilionów hMSC rocznie, aby sprostać wymaganiom zastosowań klinicznych8. W związku z tym produkcja komórek terapeutycznych na dużą skalę stała się warunkiem wstępnym do przeprowadzenia tych interwencji terapeutycznych przy tak dużym zapotrzebowaniu na komórki9.

Aby zapobiec niepowodzeniom systemów planarnych, podjęto wysiłki w rozwijaniu procesów produkcyjnych na dużą skalę w bioreaktorach z mieszadłem z konwencjonalnymi nierozpuszczalnymi mikronośnikami10,11,12,13, ale cierpią one z powodu skomplikowanych procedur przygotowawczych i niskiej wydajności pozyskiwania komórek14. Niedawno opracowaliśmy innowacyjny mikronośnik rozpuszczalny do ekspansji komórek macierzystych, mając na celu obejście wyzwań związanych z pozyskiwaniem komórek z konwencjonalnych, nierozpuszczalnych komercyjnych mikronośników15. Ten nowatorski, dostępny na rynku rozpuszczalny porowaty mikronośnik 3D klasy GMP, 3D TableTrix, wykazał ogromny potencjał w produkcji komórek na dużą skalę. Rzeczywiście, hodowla 3D oparta na tych porowatych mikronośnikach może potencjalnie odtworzyć korzystne mikrośrodowiska biomimetyczne, aby promować adhezję, proliferację, migrację i aktywację komórek16. Porowate struktury i połączone ze sobą sieci porów mikronośników mogą tworzyć większy obszar adhezji komórek i promować wymianę tlenu, składników odżywczych i metabolitów, tworząc w ten sposób optymalny substrat do ekspansji komórek in vitro17. Wysoka porowatość tych rozpuszczalnych porowatych mikronośników 3D klasy GMP umożliwia ekspansję hMSC na dużą skalę, a zdolność do całkowitego rozpuszczenia komórek pozwala na efektywne zbieranie tych rozszerzonych komórek18. Jest to również produkt klasy GMP i został zarejestrowany jako farmaceutyczna substancja pomocnicza w Chińskim Centrum Oceny Leków (numery zgłoszeń: F20210000003 i F20200000496)19 oraz FDA Stanów Zjednoczonych (FDA, USA; Numer głównego pliku leku: 35481)20.

Tutaj ilustrujemy zautomatyzowany system produkcji komórek na skalę przemysłową (ACISCP)18 używając tych dyspergowalnych i rozpuszczalnych porowatych mikronośników do hMSC, HEK293T komórek i ekspansji komórek Vero. Udało nam się przeprowadzić dwupoziomową ekspansję hMSC (128 skumulowanych krotnych rozszerzeń w ciągu 9 dni) z bioreaktora o pojemności 5 litrów do bioreaktora o pojemności 15 litrów i ostatecznie uzyskaliśmy do 1,1 x 1010 hMSCs z jednej partii produkcji. Komórki zebrano poprzez całkowite rozpuszczenie mikronośników, zagęszczono, przemyto i sformowano za pomocą systemu przetwarzania komórek opartego na wirówce z ciągłym przepływem, a następnie podano za pomocą systemu napełniania komórek. Ponadto oceniliśmy jakość produktów hMSC, aby potwierdzić zgodność. Wykazaliśmy również zastosowanie tych rozpuszczalnych mikronośników do zwiększenia skali produkcji dwóch innych typów komórek kotwiczących, komórek HEK293T i komórek Vero, które są szeroko stosowane w przemyśle CGT. Szczytowa gęstość komórek HEK293T komórek osiągnęła 1,68 x 107 komórek/ml, podczas gdy gęstość szczytowa komórek Vero osiągnęła 1,08 x 107 komórek/ml. System ACISCP może zostać przystosowany do hodowli różnych przylegających komórek i potencjalnie może stać się potężną platformą przyczyniającą się do przyspieszenia uprzemysłowienia CGT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ludzka pępowina została pobrana ze szpitala Beijing Tsinghua Changgeng. Wszystkie procedury i protokoły dotyczące pozyskiwania, izolacji i hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych ludzkiej pępowiny (UCMSC) zostały przeprowadzone za świadomą zgodą i za zgodą Komitetu Etyki Szpitala Beijing Tsinghua Changgeng (numer zgłoszenia 22035-4-02), a procedury i protokoły były zgodne z Deklaracją Helsińską z 1964 r. i jej późniejszymi poprawkami lub porównywalnymi standardami etycznymi.

1. Monowarstwowa hodowla komórek hMSC, komórek HEK293T i komórek Vero

  1. Wyizoluj pierwotne ludzkie UCMSC od galaretki Whartona zgodnie z opisaną metodą21. Użyj pożywki hodowlanej hMSC bez surowicy (SF) do izolacji i wzrostu pierwotnych UCMSC, zbierz komórki podczas pasażu 2 i krioprzechowuj jako główny bank komórek (MCB).
  2. Zaszczepić 6 x 105 ludzkich UCMSC (najlepiej komórki pasażu 2 lub pasażu 3) w jednej kolbie T75 (tj. gęstość wysiewu na płaskich naczyniach 2D wynosi 8 000 komórek / cm2) do hodowli jednowarstwowej za pomocą 15 ml kompletnej pożywki hodowlanej SF hMSC. Zapewnić równomierny wysiew poprzez ruch kolby w kształcie ósemki. Hodowla w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych o stężeniu 5% CO2 do zręby 80%-90%.
  3. Aby zebrać, zdekantuj pożywkę do hodowli komórkowych i dwukrotnie przepłucz komórki 3-5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Następnie dodać 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1-2 minuty, aż większość komórek stanie się okrągła i odłączy się od kolby, jak zaobserwowano pod mikroskopem odwróconym w jasnym polu z obiektywem 4x. Dodać 3 ml pożywki hodowlanej SF hMSC, aby zakończyć trawienie.
  4. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przy 179 x g przez 5 minut. Zdekantować supernatant, dwukrotnie przepłukać osad komórkowy PBS i ponownie zawiesić w około 3-5 ml pożywki hodowlanej SF hMSC do wysiewu do mikronośników w bioreaktorach.
    UWAGA: Sprawdź żywotność komórek i upewnij się, że są one >90% żywotne. Komórki należy przygotować dopiero po zakończeniu wszystkich prac przygotowawczych dla bioreaktorów (kroki 2.1-3.6).
  5. W przypadku jednowarstwowej hodowli komórek HEK293T i komórek Vero, należy zaszczepić w temperaturze 2 x 106-3 x 106 komórek do każdej kolby T75 i wyhodować DMEM zawierającym odpowiednio 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 10% surowicy nowonarodzonych cieląt (NBS).
  6. Wykonaj kroki 1.3-1.4, aby zebrać komórki. Zawiesić w 3-5 ml DMEM zawierającym 10% FBS.

2. Przygotowanie bioreaktora z mieszadłem przed wysiewem komórek

  1. W dniu -1 dokładnie wypłucz szklane naczynie bieżącą wodą dejonizowaną (DI).
  2. Zdemontuj wszystkie rurki i wirniki ze stali nierdzewnej z płyty głównej, zanurz je w wodzie DI i poddaj sonikacji za pomocą myjki ultradźwiękowej o częstotliwości 40 kHz i 60 °C przez 1 godzinę, aby dokładnie wyczyścić.
    UWAGA: Przygotowania i procedury będą takie same dla rozbudowy pierwszego poziomu w bioreaktorze o pojemności 5 litrów i rozbudowy drugiego poziomu w bioreaktorze o pojemności 15 litrów. Parametry bioreaktora o pojemności 15 l są podane w nawiasach w całym tekście. Jeżeli w nawiasach nie podano żadnych parametrów, oznacza to, że parametry te są takie same dla bioreaktorów o pojemności 5 l i 15 l.
  3. Dokładnie sprawdź, czy wszystkie O-ringi są nienaruszone i na swoim miejscu, a następnie zamontuj zdemontowane części z powrotem na płycie głównej zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: W razie potrzeby wymień zużyte lub podarte O-ringi przed montażem. Zużyte oringi pogorszą szczelność, a co za tym idzie, sterylność naczynia.
  4. Dodać 7 l (18 l dla bioreaktora 15 l) 0,5 M roztworu NaOH do naczynia o pojemności 5 l i umieścić płytkę główną z rurkami zamontowanymi na krawędzi naczynia, aby zanurzyć probówki w roztworze NaOH. Odstawić na 12 godzin lub na noc, aby usunąć endotoksyny z probówek i szklanego naczynia.
    UWAGA: Nie przekraczaj 7 l (18 l), ponieważ jest to maksymalna objętość szklanego naczynia o pojemności 5 l (15 l). Podczas obchodzenia się z roztworem NaOH należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, ponieważ jest on.
  5. Zdejmij płytkę główną i zdekantuj roztwór NaOH do odpowiedniej butelki na odpady. Wyrzuć zgodnie z przepisami bezpieczeństwa w laboratorium. Dokładnie wypłukać naczynie, płytę główną i jej części wodą demineralizowaną bez endotoksyn lub wodą do wstrzykiwań w celu usunięcia pozostałości alkalicznych.
  6. Dodaj 2 l (5 l) PBS do naczynia, ponownie zmontuj wszystkie części i przykręć głowicę do metalowej ramy naczynia zgodnie z instrukcjami producenta.
  7. Zamontuj pakiet materiałów eksploatacyjnych systemu zamkniętego do odpowiednich części/rur/portów ze stali nierdzewnej (SS) na płycie głównej zgodnie z instrukcjami producenta. Zacisnąć wszystkie zaciski Roberta na rurach i zaleca się wzmocnienie przez zaciśnięcie hemostatykami. Pozostaw jedną z rurek z filtrem odpowietrzającym 0,22 μm na końcu, która jest podłączona do skraplacza, niezaciśniętą.
    UWAGA: Wsuń silikonowe rurki na końcówki na hemostatyki, aby zapobiec przebiciu silikonowych rurek. Clamp tylko na silikonowych rurkach i unikaj zaciskania rurek C-flex zawartych w tym zestawie. Pozostawienie jednej rurki na skraplaczu niezaciśniętej pozwoli na obniżenie ciśnienia podczas autoklawowania.
  8. Przygotuj 250 ml 0,1 M roztworu NaOH w autoklawowalnej szklanej butelce GL 45 o pojemności 500 ml i dopasuj do niej nakrętkę na złącze wieloportowe GL 45 z dwoma portami. Podłącz silikonową rurkę o długości 180 mm i wymiarach 0,13 cala x 0,25 cala (średnica wewnętrzna x średnica zewnętrzna) do jednego z portów w dolnej części nasadki; Długość powinna być wystarczająco długa, aby dotykać tylko dna butelki.
  9. Podłącz kolejny kawałek silikonowej rurki o długości o 500 mm dłuższej niż poprzednia do tego samego portu w górnej części nasadki, a drugi koniec podłącz do portu kroplowego na płycie głowicy naczynia o pojemności 5 litrów. Podłącz filtr odpowietrzający 0.22 μm do drugiego portu na nakrętce.
  10. Wykonaj dwupunktową kalibrację sondy pH zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie włóż sondy pH, tlenu rozpuszczonego (DO) i liczby żywych komórek do naczynia w odpowiednich portach PG13,5 i mocno przykręć do płyty głowicy.
  11. Przeprowadzić kontrolę szczelności w pełni zmontowanego naczynia zgodnie z instrukcjami producenta. Utrzymuj ciśnienie 0,4 bara ± 0,01 bara przez co najmniej 30 minut. Powoli zmniejszaj ciśnienie po tym, jak system przejdzie test. Jeśli próba szczelności nie powiedzie się, należy dokładnie poszukać punktów nieszczelności i wzmocnić zespół zbiornika.
  12. Autoklawuj w pełni zmontowane naczynie z zestawem materiałów eksploatacyjnych przy ciśnieniu 15 psi i temperaturze 121 °C przez 60 minut. Po autoklawowaniu sprawdź wszystkie filtry odpowietrzania, aby upewnić się, że są nienaruszone i suche. Usuń wszystkie hemostats.
    UWAGA: Filtr odpowietrzający mokre powietrze nie będzie skutecznie filtrować gazu i może zagrozić sterylności naczynia podczas hodowli komórkowej. Wymień filtry odpowietrzające, jeśli są mokre, i ponownie autoklaw całego naczynia.
  13. Przenieś autoklawowane naczynie do pomieszczenia czystego i poczekaj, aż całkowicie ostygnie do temperatury pokojowej. Włóż sondę temperatury do rurki osłony termometrycznej i podłącz silnika, sondy pH i sondy DO ze sterownika do odpowiednich części naczynia. Owiń szczelnie matę grzewczą wokół naczynia.
  14. Odkręć zaciski Roberta na elastycznych rurkach skraplacza spalin, iskrznika pierścieniowego, portu zasilania kroplowego dla NaOH i portu nakładki powietrznej. Włącz sterownik, zaloguj się i wprowadź parametry wymienione w tabeli 1 do systemu zgodnie z instrukcją producenta. Probówki te nie powinny być zaciskane w żadnym momencie procesu hodowli.
  15. Kliknij Start i nazwij eksperyment, aby uruchomić bioreaktor. Pozwól bioreaktorowi pracować z tymi ustawieniami przez co najmniej 12 godzin lub przez noc, aby nasycić PBS tlenem, aby później przeprowadzić jednopunktową kalibrację sondy DO.
  16. Skalibruj prędkość objętościową przepływu cieczy pompy 1 i pompy 2 w sterowniku bioreaktora. Zainstaluj silikonową rurkę o wymiarach 0.13 cala x 0.25 cala na każdej pompie osobno, z jednym końcem zanurzonym w butelce z wodą, a drugim końcem rurki włożonym do cylindra miarowego.
  17. Ustaw prędkość obrotową pompy na 300 obr./min i czas na 1 min. Zwróć uwagę na ilość wody dozowanej do cylindra miarowego dla obu pomp. Numery te będą potrzebne do kolejnych kroków.
  18. Przygotuj 500 ml pożywki hodowlanej SF hMSC zgodnie z instrukcjami producenta i zastąp nakrętkę butelki z pożywką do hodowli komórkowych jednorazowym zamknięciem pojemnika C-Flex EZ Top i kompatybilną nakrętką. Wymianę nasadki należy przeprowadzić w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC).
  19. Przyspawać rurkę wylotową na butelce z medium do rurki wlotowej C-flex na butelce z 10 g wstępnie wysterylizowanych mikronośników W01 do MSC. Zamontuj fragment rurki na pompie 1 sterownika bioreaktora, ustaw obroty pompy na 300 obr./min i wpompuj całą pożywkę hodowlaną z butelki do butelki mikronośników. Mikronośniki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia w 0,
    dniu UWAGA: Mikronośniki należy przygotować w dniu −1. W przypadku hodowli w bioreaktorze o pojemności 15 litrów należy przygotować łącznie cztery butelki (tj. 40 g z 4 x 500 ml pożywki SF).

3. Wysiew, hodowla i zbiór komórek w 5-litrowym bioreaktorze z mieszadłem

  1. W dniu 0 wykonaj jednopunktową kalibrację, a konkretnie 100%, dla sondy DO na sterowniku bioreaktora zgodnie z instrukcjami producenta. Bioreaktor z mieszadłem jest teraz gotowy do hodowli komórek.
  2. Przygotuj szklaną butelkę o pojemności 2 l (5 l) do zbiórki odpadów, wyposaż ją w zakrętkę złącza wieloportowego GL 45 z dwoma portami, z probówkami C-Flex 30 mm x 0,44 cala podłączonymi do obu portów i autoklawem do sterylizacji. Przyspawać rurkę C-flex od jednego z portów butelki na odpady do rurki zbiorczej na płycie czołowej zbiornika bioreaktora za pomocą spawarki do rur.
  3. Zatrzymaj tymczasowo kontrolę temperatury, pH i tlenu rozpuszczonego na sterowniku bioreaktora, zainstaluj silikonową rurkę przymocowaną do rurki do zbioru na pompie perystaltycznej 2 we właściwym kierunku przepływu cieczy i całkowicie dozuj cały PBS z naczynia do butelki na odpady. Wyjmij rurkę z pompy, a następnie uszczelnij i odłącz butelkę na odpady.
    UWAGA: Zawsze odłączaj wszelkie zaciski Roberta na elastycznych rurkach biorących udział w przepływie cieczy na każdym etapie. Zacisnąć z powrotem po zakończeniu przenoszenia cieczy przed uszczelnieniem i odłączeniem. Clamp bliżej w kierunku strony płyty czołowej. Odblokowywanie i zaciskanie należy wykonywać dla wszystkich kolejnych kroków, chyba że zaznaczono inaczej.
  4. Przygotuj 7 l (30 l) kompletnego podłoża SF hMSC i zastąp każdą oryginalną nakrętkę butelki jednorazowym zamknięciem pojemnika C-Flex EZ Top i kompatybilną nakrętką. Przyspawaj jednorazowy moduł filtracyjny do jednego z portów w jednorazowej torbie do przechowywania o pojemności 10 l (50 l). Wykonaj operację wymiany zaślepek wewnątrz BSC.
  5. Przefiltrować i przenieść pożywkę hodowlaną do worka do przechowywania, po jednej butelce na raz, przyspawan butelki z pożywką do hodowli komórkowych z drugim końcem filtra kapsułkowego i używając pompy na sterowniku bioreaktora. Oznacz jako worek na karmę.
  6. Przyspawaj jeden port wylotowy z worka zasilającego do rurki C-flex na rurze zasilającej płyty czołowej i zainstaluj rurkę do pompy 1 na sterowniku bioreaktora. Przyspawaj drugi port wylotowy z worka zasilającego do rurki upustowej i zainstaluj rurkę do pompy 2 na sterowniku bioreaktora we właściwym kierunku przepływu cieczy.
    UWAGA: Zamontuj sekcję na przewodzie przepływu płynu, która jest wykonana z rurki silikonowej, na pompie, aby uzyskać lepszą odporność na zużycie w porównaniu z rurkami C-Flex. Upewnij się, że rurki są zainstalowane we właściwym kierunku.
  7. Ustaw prędkość pompy 1 na 300 obr./min i zatrzymaj pompę po dozowaniu 1 l (5 l) medium z worka na paszę do naczynia, w oparciu o prędkość dozowania objętości zanotowaną w kroku 2.17. Ponownie rozpocznij kontrolę temperatury, pH i tlenu rozpuszczonego z tymi samymi ustawieniami, jak opisano w kroku 2.14.
  8. Uszczelnij i odłącz rurkę łączącą worek zasilający z rurką zasilającą na płycie głównej. Przyspawać rurkę C-Flex z butelki z rozproszonymi mikronośnikami przygotowanymi w kroku 2.18 do rurki zasilającej i przepompować całą zawartość z butelki do naczynia. Uszczelnić i odłączyć pustą butelkę z zawiesiną mikronośnika. Zdezynfekuj całą powierzchnię butelki 75% etanolem i umieść w BSC, aby użyć go jako butelki do przenoszenia zawiesiny komórek.
    UWAGA: Podczas uszczelniania i odłączania akcesoriów jednorazowych pozostaw dłuższy kawałek rurki C-Flex po stronie płyty czołowej, ponieważ w kolejnych krokach na tej samej rurze zostanie wykonanych wiele kroków.
  9. Upewnij się, że temperatura pokazana na sterowniku osiąga stan ustalony 37 °C, co zwykle trwa około 30 minut, przed przystąpieniem do przygotowania komórek nasiennych, jak w krokach 1.3-1.4. Zawiesić 2,5 x 108 hMSC w 500 ml pożywki SF i przenieść do pustej butelki uprzednio zawierającej zawiesinę mikronośnika.
    UWAGA: Komórki nasienne do rozbudowy bioreaktora o pojemności 15 litrów powinny być przygotowane zgodnie z krokiem 3.21, w celu zaszczepienia 1,0 x 109 komórek w 500 ml.
  10. Przyspawaj rurkę C-Flex z butelki zawierającej teraz zawiesinę komórek do portu zasilającego na płycie głównej i przepompuj całą zawartość butelki do naczynia, aby zainicjować inokulację komórek do mikronośników. Zamknij i odłącz pustą butelkę. Ponownie przyspawać port zasilający z worka zasilającego do rurki zasilającej na płycie głównej.
  11. Dostosuj ustawienia mieszania w sterowniku, aby umożliwić przerywane mieszanie w celu zwiększenia skuteczności inokulacji hMSC, ustawiając następujące parametry: V1 = 35 (30) obr./min/5 min; V2 = 0 obr./min/25 min; liczba cykli = 12 (24); końcowa prędkość mieszania = 35 (30) obr./min.
    UWAGA: Prędkość mieszania można ustawić na 40 (35) obr./min lub 45 (40) obr./min, jeżeli podczas procesu hodowli obserwuje się nierównomierne rozprowadzenie lub sedymentację mikronośników.
  12. Skonfiguruj zautomatyzowany system uzupełniania i wymiany pożywki w sterowniku bioreaktora w interfejsie wymiany pożywki. Ustawić parametry uprawy hMSC zgodnie z tabelą 2.
    UWAGA: Na tym etapie odkręć wszelkie zaciski Roberta na elastycznych rurkach biorących udział w przepływie cieczy, szczególnie w przypadku rurki zasilającej i upustowej. Utrzymuj je niezaciśnięte przez cały proces hodowli.
  13. Próbki należy przepuścić przez probówkę do pobierania próbek, łącząc jednorazowe worki do pobierania próbek za pomocą złączy Luer w żądanych punktach czasowych, zwykle raz dziennie, i za każdym razem dozując 10 ml do worka do pobierania próbek. Porcjować 2-3 ml próbki do pierwszego worka do pobierania próbek, wyrzucić, a następnie za każdym razem porcjować rzeczywiste 10 ml próbki do nowego worka do pobierania próbek.
    UWAGA: Początkowa próbka o objętości 2-3 ml może być płynem pozostawionym w probówce z poprzedniego punktu czasowego pobierania próbek i może nie odzwierciedlać dokładnie stanu w naczyniu. Zawsze wykonuj te czynności z dodatkowymi środkami aseptycznymi, odkażając złącza Luer przed i po wykonaniu lub zerwaniu połączeń 75% etanolem.
  14. Przenieść pobrane próbki do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wykonaj następujące testy na próbkach.
    1. Weź 200 μl zawiesiny mikronośnika obciążonej komórkami i zabarwij ją podwójnym barwieniem komórek Calcein-AM/PI zgodnie z instrukcjami producenta. Obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym.
    2. Osadzaj mikronośniki grawitacyjnie, co zwykle trwa 5-10 minut. Odessać supernatant i sprawdzić stężenie glukozy za pomocą glukometru zgodnie z instrukcjami producenta. Narysuj wykres poziomu glukozy.
    3. Inkubować osadzone mikronośniki obciążone komórkami w świeżo przygotowanych 3-5 ml roztworu trawiącego o stężeniu 1 mg/ml w temperaturze 37 °C przez 20-30 minut, aby całkowicie rozpuścić mikronośniki. Policz komórki po barwieniu AO/PI za pomocą automatycznego analizatora komórek fluorescencyjnych. Wykreśl krzywą wzrostu komórki. Skoreluj z krzywą wzrostu komórek na żywo w czasie rzeczywistym wygenerowaną na kontrolerze.
  15. W 4. lub 5. dniu hodowli należy przygotować 50 ml (200 ml) roztworu trawiącego o stężeniu 30 mg/ml. Stosunek masy roboczej między roztworem trawiącym a rozpuszczalnymi mikronośnikami waha się od 3:20 do 5:20. Sterylny filtr z filtrem kapsułkowym 0,22 μm, a następnie rozcieńczyć w 500 ml (2 l) zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) z wapniem i magnezem. Przenieść do jednorazowej torby do przechowywania o pojemności 3 l.
    UWAGA: Roztwór trawiący należy przygotowywać tylko tuż przed pobraniem komórek. Staraj się celować w co najmniej 1,0 x 10 9-1,2 x 109 komórek w przypadku rozszerzenia pierwszego poziomu i 1,0 x 1010 komórek w rozszerzeniu drugiego poziomu. Jeśli komórki rosną szybciej, zbierz je w 4 dniu; Jeśli nie, zbierz plony w 5 dniu. Nie zaleca się wychodzenia poza 5 dzień.
  16. Ustaw prędkość mieszania na 0 w sterowniku, aby mikronośniki się osiadały, co zwykle następuje w ciągu 20 minut. Wyłącz protokół automatycznej wymiany pożywki i zatrzymaj kontrolę temperatury, pH i DO w sterowniku bioreaktora. Ręcznie uruchomić pompę 2 przy 300 obr./min na sterowniku i dozować supernatant do reżimu karmienia, aby pozostawić około 1 l (2 l) zawiesiny hodowli w naczyniu (używając prędkości dozowania objętości zanotowanej w kroku 2.17 lub mierząc na podstawie podziałek na korpusie naczynia). Zamknij i całkowicie odłącz worek na paszę.
  17. Zespawać worek ze świeżo przygotowanym roztworem trawiącym z kroku 3.15 do rurki zasilającej i wpompować całą zawartość do naczynia. Rozpocznij prędkość mieszania przy 45 (40) obr./min. Upewnij się, że regulator temperatury nadal utrzymuje temperaturę na poziomie 37 °C. Mikronośniki rozpuszczą się w ciągu 40-60 minut. Pobrać 1 ml próbki za pomocą sterylnej strzykawki typu Luer lock po 30 minutach, a następnie co 5-10 minut obserwować pod mikroskopem w jasnym polu w celu sprawdzenia rozpuszczenia mikronośników.
  18. Po rozpuszczeniu mikronośników przyspawać jeden 3-litrowy worek do przechowywania (dwa 3-litrowe worki do przechowywania dla bioreaktora o pojemności 15 l) do probówki zbiorczej i całkowicie wypompować zawiesinę komórek za pomocą pompy 2 przy 300 obr./min. Przygotować 1 l (3,5 l) soli fizjologicznej zawierającej 1% albuminy surowicy ludzkiej (HSA) jako bufor do przemywania i 500 ml kompletnej pożywki SF (500 ml buforu do krioprezerwacji komórek, jako przykład przyjmuje się preparat 10% siarczanu dimetylu (DMSO) i 90% pożywki SF) w oddzielnych jednorazowych torbach do przechowywania, stosując metody i akcesoria wymienione w poprzednich krokach dla innych płynów.
  19. Włącz system przetwarzania komórek, zainstaluj jednorazowy zestaw do przetwarzania komórek do urządzenia zgodnie z instrukcjami producenta, przyspawaj worki z zawiesiną komórek, buforem płuczącym i pożywką SF (buforem do krioprezerwacji) z jednorazowym zestawem do przetwarzania komórek i dokładnie postępuj zgodnie ze wszystkimi instrukcjami wyświetlanymi w interfejsie użytkownika, aby zainicjować i sprawdzić integralność i prawidłową instalację zestawu.
  20. Po zakończeniu instalacji wprowadź do oprogramowania parametry wymienione w tabeli 3 dotyczące mycia komórek buforem płuczącym i ponownym zawieszeniem w pożywce SF (bufor krioprezerwacyjny), aby rozpocząć proces płukania i ponownego zawieszania. Cała procedura zostanie wykonana automatycznie z kilkoma ręcznymi punktami kontrolnymi.
  21. Pobrać próbkę komórek z komory wirówkowej, zgodnie ze wskazaniami systemu przetwarzania komórek, i obliczyć gęstość komórek za pomocą automatycznego analizatora komórek zgodnie z instrukcjami producenta. Dostosuj objętość do refuzji dla gęstości 2 x 106 komórek/ml lub maksymalnej całkowitej objętości 250 ml.
  22. Zamknij i odłącz worek do przenoszenia komórek od jednorazowego zestawu do przetwarzania komórek po tym, jak system zaessie komórek z komory. W razie potrzeby dostosuj gęstość komórek do 2 x 106 komórek/ml z kompletną pożywką SF w większej torbie do przenoszenia komórek/średniej torbie do przechowywania. Będą to komórki nasienne do rozbudowy drugiego poziomu bioreaktora o pojemności 15 litrów.

4. Formułowanie, wypełnianie i kończenie komórek

  1. Przygotowanie bioreaktora o pojemności 15 l należy rozpocząć na 1 dzień przed pobraniem komórek z bioreaktora o pojemności 5 litrów. Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 2 i 3 protokołu, z wyjątkiem parametrów dla 15 L podanych w nawiasach.
  2. Ponownie zawiesić komórki w 250 ml buforu do kriokonserwacji, a następnie zamknąć i odłączyć worek do przenoszenia komórek od jednorazowego zestawu do przetwarzania komórek po tym, jak system zaaspiruje komórki z komory.
  3. Przenieś 2 000 ml buforu do kriokonserwacji wraz z 250 ml zawieszonych komórek z etapu 4.2 do 3-litrowego worka do przenoszenia komórek. Przyspawaj ten worek transferowy do jednorazowego zestawu materiałów eksploatacyjnych Fill&Finish.
    UWAGA: Dodatkowa objętość bufora do krioprezerwacji zastosowana w tym miejscu powinna być określona przez specyfikację preparatu i obliczenie całkowitej liczby komórek zgodnie z wynikami zliczania uzyskanymi w kroku 3.21
  4. Zamontuj jednorazowy zestaw materiałów eksploatacyjnych Fill&Finish do systemu napełniania ogniw i włącz system chłodzenia wstępnego zgodnie z instrukcjami producenta. Postępuj zgodnie z instrukcjami w systemie i ustaw na napełnianie 20 ml / worek, co daje łącznie 20 worków na partię. Zamknij i odłącz te worki od zestawu i postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami kriokonserwacji. Używaj worków do krioprzechowywania.
  5. Przyspawaj nowy zestaw 20 worków do krioprezerwacji do jednorazowego zestawu materiałów eksploatacyjnych Fill&Finish i powtarzaj procedurę napełniania i wykańczania, aż wszystkie komórki zostaną podzielone. Postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami, aby kriokonserwować te komórki.

5. Charakterystyka jakości ogniw

  1. Pobrać próbki pobranych hMSC z rozpuszczalnych mikronośników i użyć systemu przetwarzania komórek do scharakteryzowania za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia tożsamości komórki zgodnie z metodami opisanymi w literaturze18.
  2. Rozmrozić komórki kriokonserwowane i ponownie platerować je na konwencjonalnych kolbach 2D lub mikropłytkach w celu dalszej charakterystyki cech komórek, w tym morfologii komórki i zdolności różnicowania tri-linii, zgodnie z metodami opisanymi w literaturze18.

6. HEK293T ekspansja na mikronośnikach G02 w bioreaktorze z mieszadłem

  1. Przygotuj bioreaktor o pojemności 5 l, jak wspomniano w kroku 2. W przypadku komórek HEK293T należy hodować komórki za pomocą sterylnych mikronośników G02 zamiast W01. Proces hodowli jest podobny do opisanego w sekcji 3 protokołu, chociaż niektóre parametry są inne, co zostanie szczegółowo opisane w poniższych krokach. Zainstaluj specjalną rurkę perfuzyjną w bioreaktorze w miejsce rurki odpowietrzającej, ponieważ perfuzja jest potrzebna do hodowli komórek HEK293T.
  2. W odróżnieniu od protokołu opisanego w sekcji 3 protokołu, należy przygotować 20 g mikronośników G02 (tj. dwie butelki) w DMEM z 10% FBS dla bioreaktora o pojemności 5 l, z objętością kultury w dniu 0 ustaloną na 3,5 l (tj. stężenie końcowe około 5,71 g/l). Dozować 2 litry pożywki do naczynia przed dwiema butelkami mikronośników G02 i zaszczepić 500 ml komórek 1,75 x 109 HEK293T komórek (tj. przy końcowej gęstości 5 x 105 komórek/ml).
  3. Przeprowadzić reżim mieszania i reżim wymiany pożywki (w oparciu o ilość pożywki wymaganą do wymiany dziennie, wyrażoną jako objętość kultury na dzień, CVD), który różni się od sekcji 3 protokołu i jest szczegółowo opisany w tabeli 4.
    UWAGA: Aktywuj pompę 1 i pompę 2 ręcznie, aby obie mogły pompować w sposób ciągły, aby nastąpiła perfuzja. Codziennie dostosowuj prędkość pompy, aby osiągnąć szybkość perfuzji w oparciu o kalibrację prędkości dozowania objętości pomp. Zazwyczaj będzie to zakres jednocyfrowy. W przypadku komórek HEK293T należy użyć świeżej pożywki jako paszy i całkowicie wyrzucić zużytą pożywkę do butelki na odpady, w przeciwieństwie do hMSC, dla których pożywka jest w obiegu.
  4. W przypadku rozbudowy drugiego poziomu do bioreaktora o pojemności 15 litrów należy zastosować przenoszenie komórek HEK293T między kulkami zamiast całkowitego rozpuszczenia mikronośników, jak to ma miejsce w przypadku hMSC. W szczególności należy zatrzymać mieszanie w celu osadzenia mikronośników po osiągnięciu pożądanej gęstości komórek, a następnie odessać jak najwięcej supernatantu z rurki perfuzyjnej, wprowadzić PBS 3-krotność objętości pozostałej zawiesiny, aby przemyć mikronośniki i powtórzyć trzy razy. Odessać i wyrzucić jak najwięcej PBS w końcowym praniu.
  5. Podawaj 3,5 l 1x rekombinowanej trypsyny, aby odłączyć komórki od mikronośników, podczas gdy mikronośniki G02 pozostają nienaruszone. Ustaw temperaturę na 37 °C, a prędkość mieszania na 60 obr./min. Zakończyć odklejanie w ciągu 45 minut, gdy odłączyło się więcej niż 80% komórek, z równą ilością kompletnego podłoża.
  6. Przenieś się bezpośrednio z portu zbiorów na przygotowany 15-litrowy statek w celu rozbudowy drugiego poziomu.

7. Ekspansja komórek Vero na mikronośnikach V01 w bioreaktorze z mieszadłem

  1. Przygotować mikronośniki V01, przenosząc liofilizowane mikronośniki do naczynia bioreaktora razem z PBS do stężenia 20 mg/ml. Zmontować i wysterylizować naczynie, jak wspomniano w sekcji 2 protokołu, ale zamiast tego należy sterylizować w autoklawie przez 30 minut.
  2. Po sterylizacji mikronośniki V01 w naturalny sposób osiadają. Zamień supernatant z podstawowym DMEM dwa razy za pomocą probówek odpowietrzających i zasilających, a następnie dodaj kompletny DMEM zawierający 10% NBS do 50% -75% objętości naczynia przed przejściem do sekcji protokołu 3 dotyczącej inokulacji komórek i hodowli.
  3. W odróżnieniu od protokołu opisanego w sekcji 3 protokołu, należy użyć 24 g mikronośników V01 do hodowli 4 l komórek Vero (tj. końcowe stężenie 6 g / l) i zaszczepić 500 ml 4 x 109 komórek Vero (tj. przy końcowej gęstości 1 x 106 komórek / ml).
  4. Postępuj zgodnie z krokami 6.3-6.6, aby zapoznać się z parametrami procesu hodowli i przejściem do ekspansji drugiego poziomu w bioreaktorze z mieszadłem o pojemności 15 l.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Platforma ACISCP to całkowicie zamknięty system, który wykorzystuje szereg bioreaktorów z mieszadłem do ekspansji w celu zwiększenia skali, system przetwarzania komórek do zautomatyzowanego zbierania i formułowania komórek oraz system napełniania komórek (Rysunek 1). Komórki adherentne przywierają do porowatych mikronośników, które mogą zostać rozproszone w bioreaktorze, co umożliwia hodowlę zawiesinową komórek adherentnych.

Zgodnie z opisanym protokołem, 2,5 x 10...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zarówno immunoterapia, jak i terapia komórkami macierzystymi wykorzystują żywe komórki jako leki; Jednak ich produkty końcowe nie powinny być oczyszczane ani sterylizowane w taki sam sposób, jak małe cząsteczki lub wirusy. W związku z tym należy zawsze pamiętać o zasadzie jakości w fazie projektowania (QbD) i praktycznie stosować ją w procesie produkcji i kontroli chemikaliów (CMC) podczas produkcji ogniw23. W celu spełnienia wymagań preferencyjnie uważa się, że w pełni zamknięty system hodowli ko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Y.D. jest doradcą naukowym, a H.X., Y.Z., L.G., M.L., Y.Y., W.L. i X.Y. są pracownikami Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd. Pozostali autorzy nie mają żadnego komercyjnego, zastrzeżonego ani finansowego interesu w produktach lub firmach opisanych w tym artykule. Wszyscy pozostali autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana finansowo przez National Science Foundation for Distinguished Young Scholars (82125018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% trypsyna EDTABasalMediaS310JVSłuży do zbierania komórek 2D.
3D FloTrix DigestCytoNiche BiotechR001-500Jest to odczynnik, który specyficznie rozpuszcza mikronośniki 3D TableTrix.
3D FloTrix MSC Serum Free MediumCytoNiche BiotechRMZ112Jest to bezsurowicowy, wolne od zwierząt podłoże do ekspansji i utrzymania mezenchymalnych komórek macierzystych w hodowli planarnej 2D, a także hodowli 3D na mikronośnikach 3D TableTrix.
Jednorazowy moduł filtracji 3D FloTrixCytoNiche BiotechR020-00-10Ten moduł zawiera 0,22 μ m Filtry kapsułkowe stosowane do filtracji pożywki hodowlanej i roztworu trawiącego.
Jednorazowa torba do przechowywania 3D FloTrix (10 l)CytoNiche BiotechR020-00-03Używana jako torba na paszę do bioreaktora 5 l.
Jednorazowa torba do przechowywania 3D FloTrix (3 L)CytoNiche BiotechR020-00-01Używana jako worki do wysiewu komórek lub przenoszenia.
Jednorazowa torba do przechowywania 3D FloTrix (50 L)CytoNiche BiotechR020-00-04Używana jako torba na paszę do bioreaktora 15 L.
3D FloTrix vivaPACK Jednorazowe wypełnienie i Zestaw materiałów eksploatacyjnych do wykończeniaCytoNiche BiotechPACK-01-01Jest to standardowy zestaw przystosowany do systemu napełniania i wykańczania 3D vivaPACK.
System napełniania i wykańczania 3D FloTrix vivaPACK do komórekCytoNiche BiotechvivaPACKTen system jest zamkniętym urządzeniem do obsługi cieczy, z automatycznymi funkcjami mieszania i odprowadzania gazu. Komórki zawieszone w buforze do kriokonserwacji można szybko i równomiernie podzielić na 20 worków na partię.
System przetwarzania komórek 3D FloTrix vivaPREP PLUSCytoNiche BiotechvivaPREP PLUSTen system jest urządzeniem opartym na wirówce przepływowej. Komórki mogą być zagęszczane, myte i ponownie zawieszane w całkowicie zamkniętych procedurach.
3D FloTrix vivaPREP PLUS Jednorazowy zestaw do przetwarzania komórekCytoNiche BiotechPREP-PLUS-00Jest to standardowy zestaw przystosowany do przetwarzania komórek 3D vivaPREP PLUS.
Bioreaktor 3D FloTrix vivaSPIN  15 LCytoNiche BiotechFTVS15Ten produkt bioreaktora wykorzystuje kontroler, szklany zbiornik z mieszadłem o pojemności 15 litrów i analizatory. Dostępna jest specjalna rurka perfuzyjna.
Bioreaktor 3D FloTrix vivaSPIN  5 LCytoNiche BiotechFTVS05Ten produkt bioreaktora wykorzystuje kontroler, szklany zbiornik z mieszadłem o pojemności 5 litrów i analizatory. Dostępna jest specjalna rurka perfuzyjna.
Zestaw materiałów eksploatacyjnych 3D FloTrix vivaSPIN do systemu zamkniętego (10/15 L)CytoNiche BiotechR020-10-10Jest to standardowy zestaw przewodów dostosowany do bioreaktora 3D vivaSPIN 15 L, zawierający worki do pobierania próbek.
Zestaw materiałów eksploatacyjnych 3D FloTrix vivaSPIN do systemu zamkniętego (2/5 L)CytoNiche BiotechR020-05-10Jest to standardowy zestaw przewodów dostosowany do bioreaktora 3D vivaSPIN 5 L, zawierający worki do pobierania próbek.
3D TableTrix mikronośniki G02CytoNiche BiotechG02-10-10gTe porowate i degradowalne mikronośniki nadają się do hodowli komórek HEK293T. Są one wstępnie wysterylizowane w 10 g / butelkę z rurkami C-Flex do spawania z rurami w bioreaktorach.
Mikronośniki 3D TableTrix V01CytoNiche BiotechV01-100-10gTe porowate i degradowalne mikronośniki nadają się do przylegających hodowli komórkowych, występują w postaci niesterylizowanych mikronośników, które przed użyciem należy autoklawować w PBS. Nadają się one szczególnie do produkcji szczepionek.
Mikronośniki 3D TableTrix W01CytoNiche BiotechW01-10-10g (opakowanie jednorazowe);
W01-200 (tabletki)		Te porowate i degradowalne mikronośniki nadają się do przylegających hodowli komórkowych, szczególnie do komórek, które muszą być zbierane jako produkty końcowe. Są one wstępnie wysterylizowane w 10 g / butelkę z rurkami C-Flex do spawania z rurami w bioreaktorach. Produkt uzyskał 2 kwalifikacje dla farmaceutycznych substancji pomocniczych od CDE, o numerach rejestracyjnych [F20200000496; F20210000003]. Otrzymał również kwalifikację DMF dla farmaceutycznych substancji pomocniczych od FDA, z numerem rejestracyjnym [DMF:35481]
APC anty-ludzkie przeciwciało CD45BioLegend368512Stosowany w cytometrii przepływowej do oceny tożsamości MSC
Zestaw do podwójnego barwienia Calcein-AM/PIDojindoC542Calcein-AM/PI Double Staining Kit służy do jednoczesnego barwienia fluorescencyjnego żywych i martwych komórek. Ten zestaw zawiera roztwory Calcein-AM i jodku propidyny (PI), które barwią odpowiednio żywe i martwe komórki.
Zakrętka do EZ Top Container Zamknięcia do pojemników NALGENE (500mL)Saint-GobainCAP-38Marki i numery katalogowe to tylko na przykład, podobne produkty są dostępne u różnych dostawców i o ile mają taką samą funkcjonalność, przedmioty można zastąpić innymi markami.
Rurka C-Flex, Formulacja 374 (0,25 cala x 0,44 cala)Saint-Gobain374-250-3Służy do spawania i rozłączania rur.
Worek do zamrażania CryoMACS 50Miltenyi Biotec 200-074-400Służy do rozbudowy jednorazowego wypełniacza 3D FloTrix vivaPACK& Wykończ zestaw materiałów eksploatacyjnych.
Siarczan dimetylu (DMSO) SigmaD2650-100mLSłuży do przygotowania roztworu do krioprezerwacji.
Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM)BasalMediaL120KJSłuży do hodowli komórek HEK293T i Vero.
DURAN Original GL 45 Butelka laboratoryjna (2 L)DWK nauki przyrodnicze218016357Służy do zbierania odpadów z bioreaktora o pojemności 5 l.
DURAN Original GL 45 Butelka laboratoryjna (5 L)DWK nauki przyrodnicze218017353Służy do zbierania odpadów z bioreaktora o pojemności 15 l.
DURAN Original GL 45 Butelka laboratoryjna (500 mL)DWK nauki przyrodnicze218014459Służy do dodatkowej butelki 0,1 M NaOH.
EZ Górne zamknięcia pojemników do pojemników NALGENE (500 ml)Saint-GobainEZ500 ML-38-2Marki i numery katalogowe to tylko na przykład, podobne produkty są dostępne u różnych dostawców i o ile mają taką samą funkcjonalność, przedmioty można zastąpić innymi markami.
Surowica bydlęca płodu (FBS) najwyższej jakościŻubr086-150Stosowany do hodowli komórek HEK293T.
Przeciwciało anty-ludzkie CD14 FITCBioLegend301804Stosowany w cytometrii przepływowej do oceny tożsamości MSC.
Przeciwciało anty-ludzkie CD34 FITCBioLegend343504Stosowany w cytometrii przepływowej do oceny tożsamości MSC.
Przeciwciało anty-ludzkie FITC CD90 (Thy1)BioLegend328108Stosowane w cytometrii przepływowej do oceny tożsamości MSC.
Cytometria przepływowaBeckman CoulterCytoFLEXSłuży do oceny tożsamości komórki.
Fluorescencyjny analizator komórekAlit life scienceCountstar Rigel S2Służy do zliczania komórek. Żywotność komórek można obliczyć, barwiąc barwnikami AO/PI.
Złącze wieloportowe GL 45 z 2 portami DWK nauki przyrodnicze292632806Marki i numery katalogowe to tylko przykład, podobne produkty są dostępne u różnych dostawców i tak długo, jak mają tę samą funkcjonalność, artykuły mogą być zastępowane innymi markami.
GlukometrSinocare6243578Służy do wykrywania stężenia glukozy w pożywce do hodowli komórkowych i supernatancie.
Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS), z wapniem i magnezemGibco14025092Służy do przygotowania roztworu trawiącego.
Albumina ludzka 20% Behring (HSA)CSL BehringN/ASłuży do przygotowania buforu do płukania.
Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyOLYMBUSCKX53SFSłuży do obserwacji i obrazowania w polu brifgt oraz fluorescencji.
Cylinder miarowy Nalgene (500 mL)Thermo Scientific3662-0500PKSłuży do kalibracji prędkości objętościowej przepływu cieczy pomp perystaltycznych.
Surowica dla noworodków cielęcych (NBS) bardzo drobnaMINHAI BIOSC101.02Służy do hodowli komórek Vero.
Zestaw do różnicowania i charakterystyki adipogennej ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych OriCellCyagenHUXUC-90031Służy do trójliniowego różnicowania hUCMSC.
Zestaw do różnicowania i charakterystyki chondrogennej ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych OriCellCyagenHUXUC-90041Służy do trójliniowego różnicowania hUCMSC.
Zestaw do różnicowania i charakterystyki osteogennej ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych OriCellCyagenHUXUC-90021Służy do trójliniowego różnicowania hUCMSC.
Przeciwciało anty-ludzkie CD105 BioLegend800504Stosowane w cytometrii przepływowej do oceny tożsamości MSC.
PE anty-ludzkie przeciwciało CD19BioLegend302208Stosowany w cytometrii przepływowej do oceny tożsamości MSC.
Przeciwciało anty-ludzkie przeciwko ludzkiej CD73 (ekto-5'-nukleotydazie) BioLegend344004Stosowany w cytometrii przepływowej do oceny tożsamości MSC.
Przeciwciało PE anty-ludzkie HLA-DRBioLegend307605Stosowany w cytometrii przepływowej do oceny tożsamości MSC.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Żubr311-010-CLStosowany w autoklawowaniu naczyń szklanych i mikronośników V01 oraz wymianie pożywki hodowlanej.
Sani-Tech Platinum Utwardzane silikonowe rurki sanitarne (0,13 cala x 0,25 cala)Saint-GobainULTRA-C-125-2FSłuży do przenoszenia roztworu napędzanego pompami perystaltycznymi.
Sterylna sól fizjologicznaHopebiolHBPP008-500Służy do przygotowania buforu do mycia.
Trypzyme Rekombinowana trypsynaBasalMediaS342JVTen odczynnik służy do przenoszenia kulek do koralików komórek HEK293T i Vero.
Uszczelniacz do rurYingqi BiotechTube Sealer ITen uszczelniacz jest kompatybilny zarówno z rurkami C-Flex, jak i rurkami PVC.
Spawarka do rur PVCChu BiotechTube Welder Micro ISłuży do spawania rur PVC.
Spawarka do rur TPEYingqi BiotechSpawarka do rur I-V2Służy do spawania rur TPE.
ViaStain AO / PI Viability StainsNexcelomCS2-0106-25mLDual-Fluorescence Viability, wykorzystujące oranż akrydynowy (AO) i jodek propydyny (PI), jest zalecaną metodą dokładnej analizy żywotności komórek pierwotnych, takich jak PBMC, i komórek macierzystych w próbkach zawierających szczątki.

Bibliografia

  1. Golchin, A., Farahany, T. Z. Biological products: Cellular therapy and FDA approved products. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (2), 166-175 (2019).
  2. Young, C. M., Quinn, C., Trusheim, M. R. Durable cell and gene therapy potential patient and financial impact: US projections of product approvals, patients treated, and product revenues. Drug Discovery Today. 27 (1), 17-30 (2022).
  3. Elverum, K., Whitman, M. Delivering cellular and gene therapies to patients: solutions for realizing the potential of the next generation of medicine. Gene Therapy. 27 (12), 537-544 (2020).
  4. Blache, U., Popp, G., Dünkel, A., Koehl, U., Fricke, S. Potential solutions for manufacture of CAR T cells in cancer immunotherapy. Nature Communications. 13 (1), 5225(2022).
  5. Lee, B., et al. Cell culture process scale-up challenges for commercial-scale manufacturing of allogeneic pluripotent stem cell products. Bioengineering. 9 (3), 92(2022).
  6. Emerson, J., Glassey, J. Bioprocess monitoring and control: Challenges in cell and gene therapy. Current Opinion in Chemical Engineering. 34, 100722(2021).
  7. Robb, K. P., Fitzgerald, J. C., Barry, F., Viswanathan, S. Mesenchymal stromal cell therapy: progress in manufacturing and assessments of potency. Cytotherapy. 21 (3), 289-306 (2019).
  8. Olsen, T. R., Ng, K. S., Lock, L. T., Ahsan, T., Rowley, J. A. Peak MSC-Are we there yet. Frontiers in Medicine. 5, 178(2018).
  9. Roots Analysis. Stem Cell Therapy Contract Manufacturing (CMO) Market, 2019 - 2030. , Available from: https://www.rootsanalysis.com/reports/view_document/stem-cell-therapy-contract-manufacturing-market-2019-2030/271.html (2019).
  10. Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. The International Journal of Artificial Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
  11. de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Silva, da, L, C., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. Journal of Biotechnology. 236, 88-109 (2016).
  12. Rafiq, Q. A., Coopman, K., Nienow, A. W., Hewitt, C. J. Systematic microcarrier screening and agitated culture conditions improves human mesenchymal stem cell yield in bioreactors. Biotechnology Journal. 11 (4), 473-486 (2016).
  13. Tavassoli, H., et al. Large-scale production of stem cells utilizing microcarriers: A biomaterials engineering perspective from academic research to commercialized products. Biomaterials. 181, 333-346 (2018).
  14. Mizukami, A., et al. Technologies for large-scale umbilical cord-derived MSC expansion: Experimental performance and cost of goods analysis. Biochemical Engineering Journal. 135, 36-48 (2018).
  15. Yan, X., et al. Dispersible and dissolvable porous microcarrier tablets enable efficient large-scale human mesenchymal stem cell expansion. Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (5), 263-275 (2020).
  16. Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. Haycock, J. W. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-39 (2011).
  17. Loh, Q. L., Choong, C. Three-dimensional scaffolds for tissue engineering applications: Role of porosity and pore size. Tissue Engineering. Part B Reviews. 19 (6), 485-502 (2013).
  18. Zhang, Y., et al. GMP-grade microcarrier and automated closed industrial scale cell production platform for culture of MSCs. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 16 (10), 934-944 (2022).
  19. NMPA. Pharmaceutical Excipient Registration Database: Microcarrier tablets for cells. Center for Drug Evaluation. , Available from: https://www.cde.org.cn/main/xxgk/listpage/ba7aed094c29ae314670a3563a716e (2023).
  20. List of Drug Master Files (DMFs). US Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/drug-mater-files-dmfs/list-drug-master-files-dmfs (2023).
  21. Beeravolu, N., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from human umbilical cord and fetal placenta. Journal of Visualized Experiments. (122), e55224(2017).
  22. Xie, Y., et al. The quality evaluation system establishment of mesenchymal stromal cells for cell-based therapy products. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 176(2020).
  23. Maillot, C., Sion, C., De Isla, N., Toye, D., Olmos, E. Quality by design to define critical process parameters for mesenchymal stem cell expansion. Biotechnology Advances. 50, 107765(2021).
  24. Silva Couto, P., et al. Expansion of human mesenchymal stem/stromal cells (hMSCs) in bioreactors using microcarriers: Lessons learnt and what the future holds. Biotechnology Advances. 45, 107636(2020).
  25. Chen, S., et al. Facile bead-to-bead cell-transfer method for serial subculture and large-scale expansion of human mesenchymal stem cells in bioreactors. Stem Cells Translational Medicine. 10 (9), 1329-1342 (2021).
  26. Tsai, A. C., Pacak, C. A. Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors. Bioengineering. 8 (7), 96(2021).
  27. Hewitt, C. J., et al. Expansion of human mesenchymal stem cells on microcarriers. Biotechnology Letters. 33 (11), 2325-2335 (2011).
  28. Mawji, I., Roberts, E. L., Dang, T., Abraham, B., Kallos, M. S. Challenges and opportunities in downstream separation processes for mesenchymal stromal cells cultured in microcarrier-based stirred suspension bioreactors. Biotechnology and Bioengineering. 119 (11), 3062-3078 (2022).
  29. Schirmaier, C., et al. Scale-up of adipose tissue-derived mesenchymal stem cell production in stirred single-use bioreactors under low-serum conditions. Engineering in Life Sciences. 14 (3), 292-303 (2014).
  30. Lawson, T., et al. Process development for expansion of human mesenchymal stromal cells in a 50L single-use stirred tank bioreactor. Biochemical Engineering Journal. 120, 49-62 (2017).
  31. Yang, J., et al. Large-scale microcarrier culture of HEK293T cells and Vero cells in single-use bioreactors. AMB Express. 9 (1), 70(2019).
  32. Fang, Z., et al. Development of scalable vaccinia virus-based vector production process using dissolvable porous microcarriers. 25th Annual Meeting of the American Society of Gene & Cell Therapy. Molecular Therapy. 30, 195-196 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

mikrono niki klasy GMPtr jwymiarowa hodowla kom rkowabioreaktor z mieszad emludzkie mezenchymalne kom rki macierzystezautomatyzowany system zamkni tyzbieranie kom reksystem przetwarzania kom rekekspansja kom rekwytwarzanie kom rek adherentnych
Produkcja ogniw na dużą skalę w oparciu o rozpuszczalne porowate mikronośniki klasy GMP
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.