Method Article

Mapowanie dystrybucji komórkowej białka optogenetycznego za pomocą siatki stymulacji świetlnej

DOI:

10.3791/65471

⸱

January 26th, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Addgene

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół obejmuje transfekcję czujników cAMP i bPAC-nLuc, białka optogenetycznego, w celu dokładnego śledzenia jego dystrybucji komórkowej i odpowiedzi na stymulację światłem. Innowacyjne podejście polegające na stworzeniu mapy odpowiedzi cAMP przy użyciu systemu skanowania punktowego ma potencjał do przyspieszenia badań nad białkami optogenetycznymi w różnych dziedzinach.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naszym celem było dokładne śledzenie dystrybucji komórkowej białka optogenetycznego i ocena jego funkcjonalności w określonym miejscu cytoplazmatycznym. Aby to osiągnąć, przeprowadziliśmy jednoczesną transfekcję komórek za pomocą czujników cAMP ukierunkowanych na jądro i naszego opracowanego laboratoryjnie białka optogenetycznego, bakteryjnej fotoaktywowanej cyklazy adenylowej-nanolucyferazy (bPAC-nLuc). bPAC-nLuc, po stymulacji światłem o długości 445 nm lub substratami lucyferazy, wytwarza adenozyno-3',5'-cykliczny monofosforan adenozyny (cAMP). Zastosowaliśmy półprzewodnikowy oświetlacz laserowy podłączony do systemu skanowania punktowego, który pozwolił nam stworzyć wzór siatki/matrycy małych oświetlonych plamek (~1 μm2) w całej cytoplazmie komórek HC-1. W ten sposób byliśmy w stanie skutecznie śledzić rozmieszczenie bPAC-nLuc ukierunkowanych na cele jądrowe i wygenerować kompleksową mapę odpowiedzi cAMP. Mapa ta dokładnie przedstawiała rozmieszczenie komórkowe bPAC-nLuc, a jego reakcja na stymulację światłem zmieniała się w zależności od ilości białka w oświetlonym miejscu. To innowacyjne podejście przyczynia się do poszerzania zestawu dostępnych technik do badania komórkowych białek optogenetycznych. Możliwość mapowania jego rozmieszczenia i reakcji z dużą precyzją ma daleko idący potencjał i może przyczynić się do rozwoju różnych dziedzin badań.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetyka, która zrewolucjonizowała neuronauki, jest teraz rozwijającą się dziedziną badań i rozwijającą się technologią rutynowo używaną przez wiele laboratoriów na całym świecie i w różnych obszarach badawczych w biologii. Opracowaliśmy bPAC-nLuc, wszechstronne białko optogenetyczne, łącząc światłoczułą cyklazę adenylową (AC) z Beggiatoa sp. (bakteryjna fotoaktywowana cyklaza adenylowa; bPAC) z nanolucyferazy (nLuc)1,2,3. Po stymulacji niebieskim światłem bPAC wytwarza drugi przekaźnik 3',5'-cykliczny monofosforan adenozyny (cAMP). nLuc to niedawno opracowana mała lucyferazy, która w obecności jednego ze swoich substratów może generować bioluminescencję i aktywować produkcję cAMP4. W ten sposób to białko optogenetyczne może być aktywowane przejściowo za pomocą krótkich impulsów świetlnych lub stale z furimazyną lub innymi substratami lucyferazy, co pozwala nam naśladować różne wzorce sygnalizacji cAMP i oceniać odpowiedzi komórkowe (aktywacja czynników transkrypcyjnych, ekspresja genów, proliferacja komórek, migracja itp.). Ostatnie postępy w sygnalizacji2-go przekaźnika podkreśliły znaczenie zdarzeń zachodzących w bardzo ograniczonych regionach cytozolowych (np. endosomalna produkcja cAMP dla fosforylacji białka wiążącego element odpowiedzi cAMP (CREB) lub mikrodomeny Ca2+ dla czynnika jądrowego translokacji aktywowanych limfocytów T (NFAT) do jądra)5,6. Dlatego ważne jest opracowanie spójnych i systematycznych strategii oceny, naśladowania i blokowania sygnalizacji z tych przedziałów w żywych komórkach. Aby pokazać zdolność bPAC-nLuc do specyficznej aktywacji w różnych przedziałach komórkowych, przeprowadziliśmy kotransfekcję linii komórkowej pochodzącej z wątrobiaka (HC-1) z ukierunkowanym na jądro bPAC-nLuc i H208, czujnikiem cAMP rezonansowego transferu energii Förstera (FRET) (NLS-bPAC-nLuc; NLS-H208). Komórki HC-1 wywodzące się z linii HTC są pozbawione możliwej do osądzenia aktywności AC, co skutkuje bardzo niskimi podstawowymi poziomami cAMP, co czyni je idealnymi do pomiaru przypuszczalnej produkcji cAMP przy jednoczesnym wykorzystaniu pełnego zakresu dynamiki czujników FRET7,8. Za pomocą lasera na ciele stałym (445 nm, LDI-7, 89 North) podłączonego do systemu skanowania punktowego (UGA-42 Geo, Rapp OptoElectronic), opisujemy protokół systematycznej stymulacji bardzo małych okrągłych obszarów lub plamek (~1μm2) w obrębie pojedynczych komórek. System skanowania punktowego został podłączony do jednego z backportów dwupoziomowego mikroskopu, co pozwoliło nam na stymulację komórek i jednoczesne wykonywanie pomiarów FRET za pośrednictwem niezależnej ścieżki światła. Przedstawiamy metodę w tym protokole, w której oprogramowanie SysCon Geo, dostarczone wraz z systemem stymulacji przez Rapp OptoElectronic, jest wykorzystywane do wykonania kompleksowego skanowania cytoplazmy komórek. Podejście to polega na wygenerowaniu mapy odpowiedzi cAMP poprzez ustawienie sekwencji iluminacji, które stymulują komórki we wzorze siatki (Rysunek 1).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórek HC-1 i przygotowanie do obrazowania

  1. Utrzymuj komórki HC-1 w DMEM uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), penicyliną (100 IU / L), streptomycyną (100 mg / L) i L-glutaminą w 10 cm szalkach i inkubowane w temperaturze 37 °C, 5% CO2, w 95% nawilżonym powietrzu.
  2. Przenikaj komórki co 2-4 dni, gdy komórki są w ~ 90% zlewane, używając rozcieńczeń 1:5 lub 1:10.
  3. Komórki nasienne do transfekcji na szklanych szkiełkach nakrywkowych 2 dni przed eksperymentem.
    1. Pracując w sterylnych warunkach w kapturze do hodowli tkankowej z wstępnie podgrzaną pożywką i PBS, odessać pożywkę z prawie zlewającego się naczynia z komórkami i delikatnie przemyć 5 ml PBS.
    2. Odessać PBS i dodać 1 ml trypsyny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut, aż komórki się oderwą.
    3. Zawiesić komórki w pożywce o objętości 4 ml i przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    4. Użyj hemocytometru, aby policzyć liczbę komórek i obliczyć gęstość komórek.
    5. Rozcieńczyć komórki do gęstości 1,5 x 104 komórek/ml.
    6. Odpipetować 2 ml zawiesiny komórek na szklane szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm z powłoką poli-D-lizynową w naczyniu 6-dołkowym.
    7. Inkubować komórki przez około 24 godziny w inkubatorze aż do 70% zbieżności.
  4. Transfekcję komórek należy przeprowadzić za pomocą zestawu do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta, stosując stosunek 0,25 μg DNA NLS-bPAC-nLuc/0,75 μg DNA NLS-H208 na 3 μl odczynnika do transfekcji i 2 μl odczynnika P3000 rozcieńczonego w pożywce Opti-MEM pozbawionej czerwieni fenolowej.
  5. Umieść komórki w inkubatorze na ~48 godzin, aby umożliwić wystarczającą ekspresję bPAC-nLuc, niezbędną do wytworzenia wykrywalnych poziomów cAMP.
    UWAGA: Minimalny wymagany poziom ekspresji bPAC-nLuc będzie się różnił w zależności od siły działania systemu stymulacji i parametrów stymulacji.
  6. Przygotuj komórki na szkiełkach nakrywkowych do obrazowania.
    1. Odessać pożywkę z jednej studzienki i przemyć dwukrotnie 2 ml PBS.
    2. Ostrożnie podnieś szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczy i umieść je w komorze obrazowania.
    3. Dodać 1 ml Opti-MEM bez czerwieni fenolowej do komory obrazowania. Komórki można również obrazować w HBSS lub innym fizjologicznym roztworze zgodnym z fluorescencją.

2. Symulacja światła i obrazowanie żywych komórek

  1. Wykonaj hodowlę komórkową i manipulację komórkami wykazującymi ekspresję NLS-bPAC-nLuc w ciemnym środowisku. Aby uniknąć ekspozycji na długości fal <500 nm, należy użyć czerwonej lampy safelight (tabela materiałów) z bursztynową kompaktową żarówką fluorescencyjną o mocy 13 W (tabela materiałów).
  2. Wykonuj eksperymenty w zmotoryzowanym mikroskopie dwupokładowym (Tabela materiałów) wyposażonym w 6-liniowy silnik świetlny z wieloma diodami LED (Tabela materiałów), koło filtrów emisyjnych (Tabela materiałów), stolik XY (Tabela materiałów), kamerę ORCA-Fusion Digital CMOS (Tabela materiałów) i obiektyw olejowy 100x/1,4 NA (∞/0,17/FN26,5). Rejestruj obrazy za pomocą oprogramowania do mikroskopii cyfrowej (tabela materiałów). Ta konfiguracja jest w stanie stymulować komórki i jednocześnie wykonywać pomiary FRET przy użyciu niezależnej ścieżki światła wyposażonej w filtr dichroiczny ZT458rdc (tabela materiałów).
    UWAGA: Można użyć dowolnej konfiguracji akwizycji, jeśli umożliwia jednoczesną stymulację optogenetyczną i obrazowanie FRET/intensiometryczne za pomocą kompatybilnego czujnika.
  3. Włącz geosystem UGA - 42. Włącz mikroskop i ustaw go z odpowiednimi parametrami do pomiaru za pomocą czujnika H208 FRET. Konfiguracja akwizycji będzie zależeć od poziomów ekspresji czujnika FRET. Typowe parametry to czas symulacji 40 ms dla YFP/mScarletI, 15% mocy diody LED i 0,5 Hz.
  4. Otwórz oprogramowanie SysCon i oprogramowanie do obrazowania, które steruje mikroskopem.
  5. W oknie Kamera wybierz zakładkę Kalibracja i wybierz długość fali lasera zgodną z białkiem optogenetycznym. Do stymulacji bPAC-nLuc należy użyć długości fali 445 nm.
  6. Skalibruj system przed każdym użyciem. Jest to ważne, ponieważ niewielkie różnice w konfiguracji, a nawet zmiany temperatury pokojowej (RT), mogą zmienić precyzję stymulacji.
  7. W oknie kamery wybierz kartę Kamera i kliknij aby rozpocząć akwizycję z poziomu oprogramowania do wyobrażania sobie.
  8. W oknie Przeglądarka obrazów wizualizuj na żywo lub wcześniejszą akwizycję fluorescencji komórek pobraną z oprogramowania do obrazowania, które pokieruje położeniem obiektów stymulujących.
  9. Użyj trybu "kliknij i odblokuj", aby szybko ocenić czas reakcji pojedynczej komórki przed rozpoczęciem eksperymentu.
  10. Korzystając z okna Sequence-Manager, wybierz aby utworzyć nową sekwencję.
    UWAGA: Aby sprawdzić, czy kalibracja systemu jest prawidłowa, narysuj różne kształty i rozmiary w oknie przeglądarki obrazów. Powinny one dokładnie odpowiadać wzorcom stymulacji rzutowanym na komórki, zapewniając dokładne dopasowanie do zamierzonego projektu.
  11. W oknie Przeglądarka obrazów wybierz ikonę Okrągły na pasku narzędzi po lewej stronie, aby narysować okrągłe obiekty stymulacyjne.
  12. Utwórz wiele małych identycznych okręgów i rozprowadź je równomiernie, aby zapewnić jednorodne pokrycie całej cytoplazmy komórek, które mają być stymulowane.
  13. Kliknij prawym przyciskiem myszy każdy z nich, aby sprawdzić jednorodność okrągłych obiektów stymulacyjnych. Pojawi się okno; Użyj go, aby zbadać ich promień, położenie itp.
  14. Ustaw promień od 1 do 5, w zależności od używanego obiektywu i rozmiaru komórki.
  15. Aby uzyskać równomierne odstępy i wyrównanie okręgów, użyj przycisku w oknie podrzędnym Widok. Dodatkowo ustaw właściwości siatki za pomocą przycisku
  16. Upewnij się, że siatka lub matryca równomiernie rozmieszczonych okrągłych obiektów stymulacyjnych całkowicie zakrywa komórkę, a jej rozmiar (np. 6 x 6 lub 10 x 10) zależy od wielkości komórki. Jako kontrolę dla zerowej stymulacji, która nie powinna wyzwalać żadnych zdarzeń komórkowych, dołącz kilka okręgów umieszczonych na zewnątrz komórki.
  17. Każdy obiekt utworzony w oknie przeglądarki obrazów pojawi się w oknie Oś czasu.
    1. W oknie podrzędnym Czas obiektu skonfiguruj właściwości czasowe każdego obiektu stymulacji (czas rozpoczęcia, czas trwania, opóźnienie).
    2. W oknie podrzędnym Źródło światła skonfiguruj długość fali i intensywność każdego obiektu. W przypadku tego protokołu upewnij się, że każdy obiekt używa tej samej długości fali i jest identyczny pod względem czasu trwania i intensywności. Czas rozpoczęcia będzie inny dla każdego obiektu, a opóźnienie między nimi może być zróżnicowane w zależności od oczekiwanego wyniku, aby uniknąć nakładania się efektu różnych stymulacji.
  18. W oknie Oś czasu zmień kolejność, w której każdy obiekt stymulacji będzie aktywowany, jeśli jest to wymagane. Konfiguruj stymulacje w regularny sposób (np. od lewej do prawej, od góry do dołu) lub w losowy wzór, w zależności od konkretnego eksperymentu.
  19. Prześlij sekwencję do systemu i skonfiguruj liczbę cykli sekwencji (przebiegów), które system wykona.
  20. Umieść obszary zainteresowania (ROI) w oprogramowaniu do obrazowania w żądanych pozycjach.
  21. Rozpocznij akwizycję obrazów fluorescencyjnych za pomocą mikroskopu i naciśnij w oknie UGA-42.

3. Analiza danych

  1. Chociaż oprogramowanie dostarczone przez system stymulacji pozwala na zapisywanie sekwencji do dalszego wykorzystania, nie rejestruje ono rzeczywistych informacji z eksperymentu. Dlatego skrupulatnie dokumentuj wszystkie szczegóły związane z miejscami i sekwencjami stymulacji zastosowanymi podczas eksperymentu, w tym parametry takie jak pozycja, intensywność, czas trwania, liczba przebiegów itp. Należy udokumentować wszelkie inne istotne warunki doświadczalne, takie jak środki farmakologiczne lub określone roztwory.
  2. Podczas eksperymentu umieść wyznaczone ROI w oprogramowaniu do obrazowania, aby uchwycić zmiany intensywności fluorescencji z całej komórki lub określonych miejsc w komórkach.
  3. Zwróć szczególną uwagę na umiejscowienie ROI względem miejsc stymulacji. Zmierz zmiany intensywności fluorescencji w obrębie lub daleko od stymulowanych obszarów. Dostosuj pozycje ROI po eksperymencie, dostarczając oprogramowanie do obrazowania, które umożliwia zapisywanie obrazów uzyskanych podczas eksperymentu, a nie tylko wartości intensywności ROI.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki przedstawione w Rysunek 1 pokazują, że tylko stymulacje skierowane do jądra komórkowego były w stanie wygenerować mierzalne wzrosty cAMP. Potwierdza to, że NLS-bPAC-nLuc ulega ekspresji wyłącznie w przedziale jądrowym komórek HC-1. Możliwe jest precyzyjne stymulowanie białka optogenetycznego za pomocą tego wzoru siatki/macierzy do mapowania jego dystrybucji wewnątrzkomórkowej. Dodatkowo, wyższe elewacje cAMP w kierunku centrum jądra odzwierciedlają większą masę bPAC-nLuc symulowaną przez centralne plamki w porównaniu do tych umieszczonych na peryferiach jądra (Rysunek 1).

figure-results-1
Rysunek 1: Protokół stymulacji siatki i mapa odpowiedzi cAMP. Sekwencyjne stymulacje światłem niebieskim (445 nm; 30 s odstęp między impulsami; ciąg impulsów: 50 ms, całkowity czas trwania 500 ms, 10 Hz, 7% mocy lasera) na komórkach HC-1 transfekowanych NLS-H208 (czujnik cAMP) i NLS-bPAC-nLuc. Lewy panel wyświetla żółtą fluorescencję białka fluorescencyjnego (YFP) z H208, która została nałożona na rzeczywiste impulsy świetlne uchwycone przez kamerę sCMOS reprezentowaną na pojedynczym obrazie. Ślady po prawej stronie pokazują przejściowy wzrost cAMP wywołany stymulacją NLS-bPAC-nLuc w każdym miejscu stymulacji. Odjętą w tle fluorescencję NLS-H208 zmierzono przy użyciu pojedynczego ROI obejmującego całe jądro i obliczono znormalizowane współczynniki (R/R0). Odpowiedzi w obszarach zewnętrznych (wiersze 1 i 7, kolumny A i G) były negatywne i nie są wyświetlane. Bar = 3 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego badania było precyzyjne monitorowanie wewnątrzkomórkowej dystrybucji białka optogenetycznego i ocena jego działania w określonym przedziale cytoplazmatycznym. Pokazaliśmy również precyzyjne możliwości stymulacyjne systemu skanowania punktowego na komórkach wykazujących ekspresję białka optogenetycznego. Aby to osiągnąć, zastosowaliśmy ukierunkowany na energię jądrową bPAC-nLuc o wysokich poziomach ekspresji, ale bardzo ograniczonej dystrybucji ograniczonej do jądra. Wyniki wykazały, że miejsca stymulacji oddalone tylko o ~1 μm mogą albo wywołać produkcję cAMP, albo nie, w zależności od dystrybucji komórkowej białka optogenetycznego; tylko stymulacje skierowane do jądra były w stanie podnieść poziom cAMP. W tym protokole celem nie było wygenerowanie zlokalizowanego wzrostu cAMP, ale raczej pokazanie, że krótkie stymulacje światłem mogą być wystarczająco dokładne, aby aktywować białka optogenetyczne w bardzo ograniczonych obszarach komórki bez stymulacji otaczających białek. Jednak takie podejście stanowi niezbędną kontrolę dla badania innych białek optogenetycznych o rozproszonym rozmieszczeniu i/lub generowaniu zlokalizowanych wzrostów cAMP. Można to osiągnąć poprzez zmianę poziomów ekspresji białka optogenetycznego, intensywności i częstotliwości stymulacji itp. Aby dokładnie zmierzyć te zlokalizowane sygnały, kluczowe znaczenie ma dokładne rozważenie parametrów akwizycji i charakterystyki czujnika. Obejmuje to wybór odpowiednich pozycji i rozmiarów ROI, określenie częstotliwości akwizycji oraz wybór czujników FRET/intensiometrycznych o optymalnym powinowactwie, intensywności, zakresie dynamiki i stałej dysocjacji.

W niedawno opublikowanym artykule zastosowaliśmy podobną strategię, aby funkcjonalnie zademonstrować dystrybucję ukierunkowanego na jądro bPAC-nLuc i zdolność zmodyfikowanej fosfodiesterazy (PDE; ΔRI-PDE8) do zniesienia podwyższenia cAMP w linii komórkowej9 pochodzącej z tarczycy. W tym artykule przeprowadziliśmy stymulację komórek wzdłuż linii prostej, a nie siatki, a punkty świetlne zostały umieszczone względem punktów orientacyjnych komórek (np. centrum jądra, krawędzi jądrowej itp.), a nie w systematycznym wzorze. Co ciekawe, nawet stymulacje skierowane na krawędź jądra były niewystarczające, aby wywołać wykrywalną odpowiedź cAMP. Doszliśmy do wniosku, że było to prawdopodobnie spowodowane stymulacją niewystarczającej masy NLS-bPAC-nLuc9. Jednak w obecnym protokole niektóre stymulacje skierowane w okolice krawędzi jądrowej wywołały wykrywalny wzrost cAMP. Ta rozbieżność może być przypisana różnym czynnikom, w tym poziomom ekspresji bPAC-nLuc, charakterystyce stymulacji, morfologii jądra, obecności endogennych PDE, białek buforowych itp.

Podczas gdy inne celowane lub nieukierunkowane białka optogenetyczne mogą wykazywać bardziej rozproszone rozmieszczenie, to systematyczne podejście wspiera wyciąganie znaczących wniosków poprzez staranne przygotowanie eksperymentów i analizę danych. Co więcej, podejście to umożliwia celowanie w wyspecjalizowane struktury komórkowe (np. lamellipodia, dendryty, rzęski pierwotne itp.), ułatwiając porównanie odpowiedzi w dystalnych i proksymalnych regionach tych struktur i/lub ciała komórki.

Strategia ta może być również wykorzystana do oceny aktywacji dalszych elementów w szlaku cAMP, takich jak kinaza białkowa A (PKA) lub białko wymienne bezpośrednio aktywowane przez cAMP (EPAC1). Ponadto, ponieważ na bPAC-nLuc nie mają wpływu te same modulatory, co endogenne AC, na które mogą wpływać lokalne interakcje z białkami lub innymi czynnikami, można założyć, że konsekwentnie generuje tę samą ilość cAMP przy tym samym poziomie ekspresji. Badając zmniejszenie uniesienia cAMP lub spadek poziomu cAMP po chwilowym wzroście, podejście to pozwala na ocenę degradacji, dyfuzji lub funkcjonalności i dystrybucji endogennych lub transfekowanych PDE. Strategia ta okazuje się szczególnie przydatna do oceny zachowania dowolnego białka optogenetycznego w różnych lokalizacjach komórkowych, pomagając uniknąć stronniczości wynikającej z arbitralnego umieszczania miejsc stymulacji w cytoplazmie.

Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że wielkość miejsca stymulacji i jego energia będą ostatecznie zależeć od szczególnych cech zastosowanej konfiguracji (ścieżki światła, obiektywy, system skanowania itp.). Aby zapewnić dokładne wyniki, względna ekspresja białka optogenetycznego, wrażliwość komórek na użytą długość fali oraz wszelkie inne parametry powinny być brane pod uwagę podczas przeprowadzania każdego eksperymentu w każdym poszczególnym systemie. Należy również zauważyć, że nie zbadaliśmy pełnego zakresu, w jakim system może być sterowany w wdrażaniu mniejszych punktów stymulacji i/lub gęstszych siatek (tj. mniej rozmieszczonych miejsc stymulacji) w celu systematycznej oceny mniejszych struktur komórkowych z większą precyzją. Dodatkowo przetestowaliśmy tę strategię przy użyciu wyłącznie systemu skanowania punktów UGA-42 Geo. Takie podejście może być możliwe przy użyciu różnych systemów, pod warunkiem, że mogą one w powtarzalny sposób generować równomiernie rozmieszczone zlokalizowane miejsca. Każdy system powinien być zoptymalizowany, aby dawać podobne wyniki.

Na koniec należy dokładnie ocenić potencjalną stymulację czujników FRET przez system stymulacji. Na przykład cyjanowe białko fluorescencyjne (CFP) z pewnością będzie stymulowane, a nawet wybielane przez laser o długości fali 445 nm stosowany w tym protokole. Zastosowanie wyższych mocy lasera (lub filtrów o neutralnej gęstości (ND) o wyższej przepuszczalności) zwiększy szanse na pobudzenie czujników fluorescencyjnych i wprowadzenie fałszywych informacji do eksperymentu i/lub wygenerowanie problemów z analizą danych. Należy również dokładnie ocenić normalne fotowybielanie czujników FRET/intensiometrycznych. Wreszcie, ponieważ bPAC może być wrażliwy na światło otoczenia i generować cAMP nawet w ciemnych warunkach (ciemna aktywność bPAC została zmierzona jako 33 ± 5 pmol/min/mg białka3), po transfekcji bPAC-nLUC należy ostrożnie manipulować komórkami, aby uniknąć zanieczyszczenia światłem (np. w inkubatorze, przed i/lub w trakcie eksperymentów itp.). Opcjonalnie komórki mogą być inkubowane z inhibitorem PDE (np. 3-izobutylo-1-metyloksantyna; IBMX10) w celu określenia podstawowej aktywności bPAC-nLuc i potwierdzenia, że stosowane warunki oświetleniowe są odpowiednio ciemne.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie zostało zapewnione przez National Institutes of Health (NIH) przyznaje R01 GM099775 i GM130612 dla D.L.A.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kompaktowa żarówka fluorescencyjna 13 W Bursztynowa - Low Blue LightsPhotonic Developments 
3-Izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX)SigmaI7018
6-liniowa multi-LED Lumencor Spectra XLumencor 6-liniowy silnik oświetleniowy multi-LED 
Corning - DMEM Thermo FischerMT10013CMEA
Corning - Regularna płodowa surowica bydlęcaThermo FischerMT35011CV
Okulary nakrywkowe: kółkaThermo Fischer12545102P
GBX-2 ciemnoczerwony filtr safelight 5,5" Kodak1416827Czerwona lampa ostrzegawcza   
Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS) 10xThermo Fischer14185052Rozcieńczony do 1x, dostosowane pH
LDI-789 North
L-GlutamineThermo FischerBW17605E
Lipofectamine 3000 Zestaw do transfekcjiThermo FischerL3000001
Olympus IX83 z napędem silnikowym  dwupokładowy  mikroskop OlympusZmotoryzowany mikroskop dwupokładowy 
Opti-MEM, bez czerwieni fenolowejThermo Fischer11058021
ORCA-fusion cyfrowa kamera CMOS HamamatsuC14440-20UP
Penicylina-streptomycyna (10 000 U/mL)Thermo Fischer15140122
Roztwór buforowany fosforanem (1x)Lonza17516F
i zestawy filtrów przed emisjąPrior Scientific, Inc.Koło filtra emisji 
Wcześniej  Proscan XY stagePrior Scientific, Inc.Stolik XY 
Slidebook 6Innowacje w zakresie inteligentnego obrazowania Oprogramowaniemikroskopii cyfrowej
Oprogramowanie SysConOprogramowaniedostarczane przez system stymulacji 
UGA-42  Położenie geograficzne Rapp OptoElectronic
UPlanSApo 100xOlympus100x/1.4 NA obiektyw olejowy (∞/0.17/FN26.5)
ZT458rdc dichroik Chroma Technology CorpBS, Długość fali (CWL):  498 nm
  Koło filtrów do SysCon

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naim, N., et al. Luminescence-activated nucleotide cyclase regulates spatial and temporal cAMP synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 294 (4), 1095-1103 (2019).
  2. Naim, N., Reece, J. M., Zhang, X., Altschuler, D. L. Dual activation of cAMP production through photostimulation or chemical stimulation. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2173, 201-216 (2020).
  3. Stierl, M., et al. Light modulation of cellular cAMP by a small bacterial photoactivated adenylyl cyclase, bPAC, of the soil bacterium Beggiatoa. The Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1181-1188 (2011).
  4. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
  5. Liccardo, F., Luini, A., Di Martino, R. Endomembrane-based signaling by GPCRs and G-proteins. Cells. 11 (3), 528(2022).
  6. Groschner, K., Graier, W. F., Romanin, C. Store-operated ca(2)+ entry (SOCE) pathways. , Springer, Vienna. (2017).
  7. Ross, E. M., Howlett, A. C., Ferguson, K. M., Gilman, A. G. Reconstitution of hormone-sensitive adenylate cyclase activity with resolved components of the enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6401-6412 (1978).
  8. Insel, P. A., Maguire, M. E., Gilman, A. G., Bourne, H. R., Coffino, P., Melmon, K. L. Beta adrenergic receptors and adenylate cyclase: products of separate genes. Molecular Pharmacology. 12, 1062-1069 (1976).
  9. Pizzoni, A., Zhang, X., Naim, N., Altschuler, D. L. Soluble cyclase-mediated nuclear cAMP synthesis is sufficient for cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (4), e2208749120(2023).
  10. Keravis, T., Lugnier, C. Cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE) isozymes as targets of the intracellular signalling network: benefits of PDE inhibitors in various diseases and perspectives for future therapeutic developments. British Journal of Pharmacology. 165 (5), 1288-1305 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optogenetic Protein MappingLight Stimulation GridCyclic AMP SignalingbPAC nanoluciferaseNuclear Targeted ProteinFRET MeasurementsFluorescence ImagingSubcellular ActivationMotorized MicroscopeCellular Distribution

Related Articles