Ten protokół obejmuje transfekcję czujników cAMP i bPAC-nLuc, białka optogenetycznego, w celu dokładnego śledzenia jego dystrybucji komórkowej i odpowiedzi na stymulację światłem. Innowacyjne podejście polegające na stworzeniu mapy odpowiedzi cAMP przy użyciu systemu skanowania punktowego ma potencjał do przyspieszenia badań nad białkami optogenetycznymi w różnych dziedzinach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mapowanie dystrybucji komórkowej białka optogenetycznego za pomocą siatki stymulacji świetlnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Naszym celem było dokładne śledzenie dystrybucji komórkowej białka optogenetycznego i ocena jego funkcjonalności w określonym miejscu cytoplazmatycznym. Aby to osiągnąć, przeprowadziliśmy jednoczesną transfekcję komórek za pomocą czujników cAMP ukierunkowanych na jądro i naszego opracowanego laboratoryjnie białka optogenetycznego, bakteryjnej fotoaktywowanej cyklazy adenylowej-nanolucyferazy (bPAC-nLuc). bPAC-nLuc, po stymulacji światłem o długości 445 nm lub substratami lucyferazy, wytwarza adenozyno-3',5'-cykliczny monofosforan adenozyny (cAMP). Zastosowaliśmy półprzewodnikowy oświetlacz laserowy podłączony do systemu skanowania punktowego, który pozwolił nam stworzyć wzór siatki/matrycy małych oświetlonych plamek (~1 μm2) w całej cytoplazmie komórek HC-1. W ten sposób byliśmy w stanie skutecznie śledzić rozmieszczenie bPAC-nLuc ukierunkowanych na cele jądrowe i wygenerować kompleksową mapę odpowiedzi cAMP. Mapa ta dokładnie przedstawiała rozmieszczenie komórkowe bPAC-nLuc, a jego reakcja na stymulację światłem zmieniała się w zależności od ilości białka w oświetlonym miejscu. To innowacyjne podejście przyczynia się do poszerzania zestawu dostępnych technik do badania komórkowych białek optogenetycznych. Możliwość mapowania jego rozmieszczenia i reakcji z dużą precyzją ma daleko idący potencjał i może przyczynić się do rozwoju różnych dziedzin badań.
Wprowadzenie
Optogenetyka, która zrewolucjonizowała neuronauki, jest teraz rozwijającą się dziedziną badań i rozwijającą się technologią rutynowo używaną przez wiele laboratoriów na całym świecie i w różnych obszarach badawczych w biologii. Opracowaliśmy bPAC-nLuc, wszechstronne białko optogenetyczne, łącząc światłoczułą cyklazę adenylową (AC) z Beggiatoa sp. (bakteryjna fotoaktywowana cyklaza adenylowa; bPAC) z nanolucyferazy (nLuc)1,2,3. Po stymulacji niebieskim światłem bPAC wytwarza drugi przekaźnik 3',5'-cykliczny monofosforan adenozyny (cAMP). nLuc to niedawno opracowana mała lucyferazy, która w obecności jednego ze swoich substratów może generować bioluminescencję i aktywować produkcję cAMP4. W ten sposób to białko optogenetyczne może być aktywowane przejściowo za pomocą krótkich impulsów świetlnych lub stale z furimazyną lub innymi substratami lucyferazy, co pozwala nam naśladować różne wzorce sygnalizacji cAMP i oceniać odpowiedzi komórkowe (aktywacja czynników transkrypcyjnych, ekspresja genów, proliferacja komórek, migracja itp.). Ostatnie postępy w sygnalizacji2-go przekaźnika podkreśliły znaczenie zdarzeń zachodzących w bardzo ograniczonych regionach cytozolowych (np. endosomalna produkcja cAMP dla fosforylacji białka wiążącego element odpowiedzi cAMP (CREB) lub mikrodomeny Ca2+ dla czynnika jądrowego translokacji aktywowanych limfocytów T (NFAT) do jądra)5,6. Dlatego ważne jest opracowanie spójnych i systematycznych strategii oceny, naśladowania i blokowania sygnalizacji z tych przedziałów w żywych komórkach. Aby pokazać zdolność bPAC-nLuc do specyficznej aktywacji w różnych przedziałach komórkowych, przeprowadziliśmy kotransfekcję linii komórkowej pochodzącej z wątrobiaka (HC-1) z ukierunkowanym na jądro bPAC-nLuc i H208, czujnikiem cAMP rezonansowego transferu energii Förstera (FRET) (NLS-bPAC-nLuc; NLS-H208). Komórki HC-1 wywodzące się z linii HTC są pozbawione możliwej do osądzenia aktywności AC, co skutkuje bardzo niskimi podstawowymi poziomami cAMP, co czyni je idealnymi do pomiaru przypuszczalnej produkcji cAMP przy jednoczesnym wykorzystaniu pełnego zakresu dynamiki czujników FRET7,8. Za pomocą lasera na ciele stałym (445 nm, LDI-7, 89 North) podłączonego do systemu skanowania punktowego (UGA-42 Geo, Rapp OptoElectronic), opisujemy protokół systematycznej stymulacji bardzo małych okrągłych obszarów lub plamek (~1μm2) w obrębie pojedynczych komórek. System skanowania punktowego został podłączony do jednego z backportów dwupoziomowego mikroskopu, co pozwoliło nam na stymulację komórek i jednoczesne wykonywanie pomiarów FRET za pośrednictwem niezależnej ścieżki światła. Przedstawiamy metodę w tym protokole, w której oprogramowanie SysCon Geo, dostarczone wraz z systemem stymulacji przez Rapp OptoElectronic, jest wykorzystywane do wykonania kompleksowego skanowania cytoplazmy komórek. Podejście to polega na wygenerowaniu mapy odpowiedzi cAMP poprzez ustawienie sekwencji iluminacji, które stymulują komórki we wzorze siatki (Rysunek 1).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Hodowla komórek HC-1 i przygotowanie do obrazowania
- Utrzymuj komórki HC-1 w DMEM uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), penicyliną (100 IU / L), streptomycyną (100 mg / L) i L-glutaminą w 10 cm szalkach i inkubowane w temperaturze 37 °C, 5% CO2, w 95% nawilżonym powietrzu.
- Przenikaj komórki co 2-4 dni, gdy komórki są w ~ 90% zlewane, używając rozcieńczeń 1:5 lub 1:10.
- Komórki nasienne do transfekcji na szklanych szkiełkach nakrywkowych 2 dni przed eksperymentem.
- Pracując w sterylnych warunkach w kapturze do hodowli tkankowej z wstępnie podgrzaną pożywką i PBS, odessać pożywkę z prawie zlewającego się naczynia z komórkami i delikatnie przemyć 5 ml PBS.
- Odessać PBS i dodać 1 ml trypsyny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut, aż komórki się oderwą.
- Zawiesić komórki w pożywce o objętości 4 ml i przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
- Użyj hemocytometru, aby policzyć liczbę komórek i obliczyć gęstość komórek.
- Rozcieńczyć komórki do gęstości 1,5 x 104 komórek/ml.
- Odpipetować 2 ml zawiesiny komórek na szklane szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm z powłoką poli-D-lizynową w naczyniu 6-dołkowym.
- Inkubować komórki przez około 24 godziny w inkubatorze aż do 70% zbieżności.
- Transfekcję komórek należy przeprowadzić za pomocą zestawu do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta, stosując stosunek 0,25 μg DNA NLS-bPAC-nLuc/0,75 μg DNA NLS-H208 na 3 μl odczynnika do transfekcji i 2 μl odczynnika P3000 rozcieńczonego w pożywce Opti-MEM pozbawionej czerwieni fenolowej.
- Umieść komórki w inkubatorze na ~48 godzin, aby umożliwić wystarczającą ekspresję bPAC-nLuc, niezbędną do wytworzenia wykrywalnych poziomów cAMP.
UWAGA: Minimalny wymagany poziom ekspresji bPAC-nLuc będzie się różnił w zależności od siły działania systemu stymulacji i parametrów stymulacji. - Przygotuj komórki na szkiełkach nakrywkowych do obrazowania.
- Odessać pożywkę z jednej studzienki i przemyć dwukrotnie 2 ml PBS.
- Ostrożnie podnieś szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczy i umieść je w komorze obrazowania.
- Dodać 1 ml Opti-MEM bez czerwieni fenolowej do komory obrazowania. Komórki można również obrazować w HBSS lub innym fizjologicznym roztworze zgodnym z fluorescencją.
2. Symulacja światła i obrazowanie żywych komórek
- Wykonaj hodowlę komórkową i manipulację komórkami wykazującymi ekspresję NLS-bPAC-nLuc w ciemnym środowisku. Aby uniknąć ekspozycji na długości fal <500 nm, należy użyć czerwonej lampy safelight (tabela materiałów) z bursztynową kompaktową żarówką fluorescencyjną o mocy 13 W (tabela materiałów).
- Wykonuj eksperymenty w zmotoryzowanym mikroskopie dwupokładowym (Tabela materiałów) wyposażonym w 6-liniowy silnik świetlny z wieloma diodami LED (Tabela materiałów), koło filtrów emisyjnych (Tabela materiałów), stolik XY (Tabela materiałów), kamerę ORCA-Fusion Digital CMOS (Tabela materiałów) i obiektyw olejowy 100x/1,4 NA (∞/0,17/FN26,5). Rejestruj obrazy za pomocą oprogramowania do mikroskopii cyfrowej (tabela materiałów). Ta konfiguracja jest w stanie stymulować komórki i jednocześnie wykonywać pomiary FRET przy użyciu niezależnej ścieżki światła wyposażonej w filtr dichroiczny ZT458rdc (tabela materiałów).
UWAGA: Można użyć dowolnej konfiguracji akwizycji, jeśli umożliwia jednoczesną stymulację optogenetyczną i obrazowanie FRET/intensiometryczne za pomocą kompatybilnego czujnika. - Włącz geosystem UGA - 42. Włącz mikroskop i ustaw go z odpowiednimi parametrami do pomiaru za pomocą czujnika H208 FRET. Konfiguracja akwizycji będzie zależeć od poziomów ekspresji czujnika FRET. Typowe parametry to czas symulacji 40 ms dla YFP/mScarletI, 15% mocy diody LED i 0,5 Hz.
- Otwórz oprogramowanie SysCon i oprogramowanie do obrazowania, które steruje mikroskopem.
- W oknie Kamera wybierz zakładkę Kalibracja i wybierz długość fali lasera zgodną z białkiem optogenetycznym. Do stymulacji bPAC-nLuc należy użyć długości fali 445 nm.
- Skalibruj system przed każdym użyciem. Jest to ważne, ponieważ niewielkie różnice w konfiguracji, a nawet zmiany temperatury pokojowej (RT), mogą zmienić precyzję stymulacji.
- W oknie kamery wybierz kartę Kamera i kliknij aby rozpocząć akwizycję z poziomu oprogramowania do wyobrażania sobie.
- W oknie Przeglądarka obrazów wizualizuj na żywo lub wcześniejszą akwizycję fluorescencji komórek pobraną z oprogramowania do obrazowania, które pokieruje położeniem obiektów stymulujących.
- Użyj trybu "kliknij i odblokuj", aby szybko ocenić czas reakcji pojedynczej komórki przed rozpoczęciem eksperymentu.
- Korzystając z okna Sequence-Manager, wybierz aby utworzyć nową sekwencję.
UWAGA: Aby sprawdzić, czy kalibracja systemu jest prawidłowa, narysuj różne kształty i rozmiary w oknie przeglądarki obrazów. Powinny one dokładnie odpowiadać wzorcom stymulacji rzutowanym na komórki, zapewniając dokładne dopasowanie do zamierzonego projektu. - W oknie Przeglądarka obrazów wybierz ikonę Okrągły na pasku narzędzi po lewej stronie, aby narysować okrągłe obiekty stymulacyjne.
- Utwórz wiele małych identycznych okręgów i rozprowadź je równomiernie, aby zapewnić jednorodne pokrycie całej cytoplazmy komórek, które mają być stymulowane.
- Kliknij prawym przyciskiem myszy każdy z nich, aby sprawdzić jednorodność okrągłych obiektów stymulacyjnych. Pojawi się okno; Użyj go, aby zbadać ich promień, położenie itp.
- Ustaw promień od 1 do 5, w zależności od używanego obiektywu i rozmiaru komórki.
- Aby uzyskać równomierne odstępy i wyrównanie okręgów, użyj przycisku w oknie podrzędnym Widok. Dodatkowo ustaw właściwości siatki za pomocą przycisku
- Upewnij się, że siatka lub matryca równomiernie rozmieszczonych okrągłych obiektów stymulacyjnych całkowicie zakrywa komórkę, a jej rozmiar (np. 6 x 6 lub 10 x 10) zależy od wielkości komórki. Jako kontrolę dla zerowej stymulacji, która nie powinna wyzwalać żadnych zdarzeń komórkowych, dołącz kilka okręgów umieszczonych na zewnątrz komórki.
- Każdy obiekt utworzony w oknie przeglądarki obrazów pojawi się w oknie Oś czasu.
- W oknie podrzędnym Czas obiektu skonfiguruj właściwości czasowe każdego obiektu stymulacji (czas rozpoczęcia, czas trwania, opóźnienie).
- W oknie podrzędnym Źródło światła skonfiguruj długość fali i intensywność każdego obiektu. W przypadku tego protokołu upewnij się, że każdy obiekt używa tej samej długości fali i jest identyczny pod względem czasu trwania i intensywności. Czas rozpoczęcia będzie inny dla każdego obiektu, a opóźnienie między nimi może być zróżnicowane w zależności od oczekiwanego wyniku, aby uniknąć nakładania się efektu różnych stymulacji.
- W oknie Oś czasu zmień kolejność, w której każdy obiekt stymulacji będzie aktywowany, jeśli jest to wymagane. Konfiguruj stymulacje w regularny sposób (np. od lewej do prawej, od góry do dołu) lub w losowy wzór, w zależności od konkretnego eksperymentu.
- Prześlij sekwencję do systemu i skonfiguruj liczbę cykli sekwencji (przebiegów), które system wykona.
- Umieść obszary zainteresowania (ROI) w oprogramowaniu do obrazowania w żądanych pozycjach.
- Rozpocznij akwizycję obrazów fluorescencyjnych za pomocą mikroskopu i naciśnij w oknie UGA-42.
3. Analiza danych
- Chociaż oprogramowanie dostarczone przez system stymulacji pozwala na zapisywanie sekwencji do dalszego wykorzystania, nie rejestruje ono rzeczywistych informacji z eksperymentu. Dlatego skrupulatnie dokumentuj wszystkie szczegóły związane z miejscami i sekwencjami stymulacji zastosowanymi podczas eksperymentu, w tym parametry takie jak pozycja, intensywność, czas trwania, liczba przebiegów itp. Należy udokumentować wszelkie inne istotne warunki doświadczalne, takie jak środki farmakologiczne lub określone roztwory.
- Podczas eksperymentu umieść wyznaczone ROI w oprogramowaniu do obrazowania, aby uchwycić zmiany intensywności fluorescencji z całej komórki lub określonych miejsc w komórkach.
- Zwróć szczególną uwagę na umiejscowienie ROI względem miejsc stymulacji. Zmierz zmiany intensywności fluorescencji w obrębie lub daleko od stymulowanych obszarów. Dostosuj pozycje ROI po eksperymencie, dostarczając oprogramowanie do obrazowania, które umożliwia zapisywanie obrazów uzyskanych podczas eksperymentu, a nie tylko wartości intensywności ROI.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wyniki przedstawione na Rysunku 1 wykazują, że tylko stymulacje skierowane do jądra komórkowego były w stanie wywołać mierzalne wzrosty poziomu cAMP. Potwierdza to, że NLS-bPAC-nLuc jest ekspresowany wyłącznie w kompartmencie jądrowym komórek HC-1. Wykorzystując ten wzór siatki/macierzy, możliwe jest precyzyjne stymulowanie białka optogenetycznego w celu zmapowania jego rozmieszczenia wewnątrzkomórkowego. Ponadto wyższe wzrosty cAMP w obszarze centrum jądra o...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Celem tego badania było precyzyjne monitorowanie wewnątrzkomórkowej dystrybucji białka optogenetycznego i ocena jego działania w określonym przedziale cytoplazmatycznym. Pokazaliśmy również precyzyjne możliwości stymulacyjne systemu skanowania punktowego na komórkach wykazujących ekspresję białka optogenetycznego. Aby to osiągnąć, zastosowaliśmy ukierunkowany na energię jądrową bPAC-nLuc o wysokich poziomach ekspresji, ale bardzo ograniczonej dystrybucji ograniczonej do jądra. Wyniki wykazały, że miejsca stymulacji oddal...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.
Podziękowania
Finansowanie zostało zapewnione przez National Institutes of Health (NIH) przyznaje R01 GM099775 i GM130612 dla D.L.A.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kompaktowa żarówka fluorescencyjna 13 W Bursztynowa - Low Blue Lights | Photonic Developments | ||
| 3-Izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX) | Sigma | I7018 | |
| 6-liniowa multi-LED Lumencor Spectra X | Lumencor | 6-liniowy silnik oświetleniowy multi-LED | |
| Corning - DMEM | Thermo Fischer | MT10013CMEA | |
| Corning - Regularna płodowa surowica bydlęca | Thermo Fischer | MT35011CV | |
| Okulary nakrywkowe: kółka | Thermo Fischer | 12545102P | |
| GBX-2 ciemnoczerwony filtr safelight 5,5" | Kodak | 1416827 | Czerwona lampa ostrzegawcza |
| Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS) 10x | Thermo Fischer | 14185052 | Rozcieńczony do 1x, dostosowane pH |
| LDI-7 | 89 North | ||
| L-Glutamine | Thermo Fischer | BW17605E | |
| Lipofectamine 3000 | Zestaw do transfekcji | Thermo Fischer | L3000001 |
| Olympus IX83 z napędem silnikowym dwupokładowy mikroskop | Olympus | Zmotoryzowany mikroskop dwupokładowy | |
| Opti-MEM, bez czerwieni fenolowej | Thermo Fischer | 11058021 | |
| ORCA-fusion cyfrowa kamera CMOS | Hamamatsu | C14440-20UP | |
| Penicylina-streptomycyna (10 000 U/mL) | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Roztwór buforowany fosforanem (1x) | Lonza | 17516F | |
| i zestawy filtrów przed emisją | Prior Scientific, Inc. | Koło filtra emisji | |
| Wcześniej Proscan XY stage | Prior Scientific, Inc. | Stolik XY | |
| Slidebook 6 | Innowacje w zakresie inteligentnego obrazowania Oprogramowanie | mikroskopii cyfrowej | |
| Oprogramowanie SysCon | Oprogramowanie | dostarczane przez system stymulacji | |
| UGA-42 Położenie geograficzne | Rapp OptoElectronic | ||
| UPlanSApo 100x | Olympus | 100x/1.4 NA obiektyw olejowy (∞/0.17/FN26.5) | |
| ZT458rdc dichroik | Chroma Technology Corp | BS, Długość fali (CWL): 498 nm |
Bibliografia
- Naim, N., et al. Luminescence-activated nucleotide cyclase regulates spatial and temporal cAMP synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 294 (4), 1095-1103 (2019).
- Naim, N., Reece, J. M., Zhang, X., Altschuler, D. L. Dual activation of cAMP production through photostimulation or chemical stimulation. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2173, 201-216 (2020).
- Stierl, M., et al. Light modulation of cellular cAMP by a small bacterial photoactivated adenylyl cyclase, bPAC, of the soil bacterium Beggiatoa. The Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1181-1188 (2011).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- Liccardo, F., Luini, A., Di Martino, R. Endomembrane-based signaling by GPCRs and G-proteins. Cells. 11 (3), 528(2022).
- Groschner, K., Graier, W. F., Romanin, C. Store-operated ca(2)+ entry (SOCE) pathways. , Springer, Vienna. (2017).
- Ross, E. M., Howlett, A. C., Ferguson, K. M., Gilman, A. G. Reconstitution of hormone-sensitive adenylate cyclase activity with resolved components of the enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6401-6412 (1978).
- Insel, P. A., Maguire, M. E., Gilman, A. G., Bourne, H. R., Coffino, P., Melmon, K. L. Beta adrenergic receptors and adenylate cyclase: products of separate genes. Molecular Pharmacology. 12, 1062-1069 (1976).
- Pizzoni, A., Zhang, X., Naim, N., Altschuler, D. L. Soluble cyclase-mediated nuclear cAMP synthesis is sufficient for cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (4), e2208749120(2023).
- Keravis, T., Lugnier, C. Cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE) isozymes as targets of the intracellular signalling network: benefits of PDE inhibitors in various diseases and perspectives for future therapeutic developments. British Journal of Pharmacology. 165 (5), 1288-1305 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
