Artykuł metodologiczny

Podwójna immunofluorescencja γH2AX i 53BP1 w ludzkich limfocytach obwodowych

DOI:

10.3791/65472

⸱

14 lipca 2023

 ,  ,  , 
1Unità di Genetica, Dipartimento di Biologia, University of Pisa, 2Department of Women-Child-Newborn Obstetrics and Gynaecology, Foundation IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia metodę oceny powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA poprzez jednoczesne wykrywanie ognisk γH2AX i 53BP1 w jądrach interfazowych ludzkich limfocytów obwodowych traktowanych bleomycyną.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęknięcia podwójnej nici (DSB) są jednym z najpoważniejszych uszkodzeń, jakie mogą wystąpić w jądrach komórkowych, a jeśli nie zostaną naprawione, mogą prowadzić do poważnych skutków, w tym raka. Komórka jest zatem wyposażona w złożone mechanizmy naprawy DSB, a szlaki te obejmują histon H2AX w swojej fosforylowanej formie w Ser-139 (a mianowicie γH2AX) i białko wiążące p53 1 (53BP1). Ponieważ oba białka mogą tworzyć ogniska w miejscach DSB, identyfikacja tych markerów jest uważana za odpowiednią metodę badania zarówno DSB, jak i ich kinetyki naprawy. Zgodnie z procesami molekularnymi, które prowadzą do powstawania ognisk γH2AX i 53BP1, bardziej przydatne może być zbadanie ich kolokalizacji w pobliżu DSB w celu opracowania alternatywnego podejścia, które umożliwia ilościowe określenie DSB poprzez jednoczesne wykrycie dwóch markerów uszkodzenia DNA. W związku z tym protokół ten ma na celu ocenę uszkodzeń genomowych indukowanych w ludzkich limfocytach przez czynnik radiomimetyczny bleomycynę poprzez obecność ognisk γH2AX i 53BP1 w podwójnej immunofluorescencji. Korzystając z tej metodologii, określiliśmy również zmienność liczby ognisk γH2AX i 53BP1 w czasie, jako wstępną próbę zbadania kinetyki naprawy DSB indukowanych bleomycyną.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uszkodzenia DNA są stale indukowane przez czynniki, które mogą być endogenne, takie jak ROS generowane przez komórkowy metabolizm oksydacyjny, lub egzogenne, zarówno chemiczne, jak i fizyczne1. Do najbardziej szkodliwych zmian chorobowych należą pęknięcia dwuniciowe (DSB), które odgrywają zasadniczą rolę w przyczynianiu się do niestabilności genomu, ponieważ powodują aberracje chromosomowe, które z kolei mogą zainicjować proces karcynogenezy. W ten sposób komórki są wyposażone w złożone i wydajne mechanizmy naprawy DSBs2.

Gdy dochodzi do DSB, komórka uruchamia odpowiedź na uszkodzenie DNA (DDR....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie zostało zatwierdzone przez komisję etyczną Uniwersytetu w, a od każdego dawcy uzyskano świadomą i podpisaną zgodę.

1. Powstawanie ognisk γH2AX i 53BP1

  1. Przygotowanie próbek i postępowanie mutagenne
    1. Pobrać próbki krwi pełnej przez nakłucie żyły od zdrowych dorosłych osób w probówkach do pobierania krwi (np. Vacutainer) zawierających heparynę litową jako antykoagulant.
    2. W celu zapewnienia właściwego zachowania próbki krwi należy rozpocząć procedurę w ciągu 24 godzin od pobrania
      3. próbki.
    3. Dodać 300 μl próbki do probówki zawierającej 4,7 ml kompletnej pożywki (0,5% peni....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dane uzyskane przez analizę limfocytów obwodowych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego pozwalają nam ocenić trzy główne aspekty: skuteczność leczenia bleomycyną w zwiększaniu liczby ognisk γH2AX i 53BP1 (a tym samym DSB) ze względu na jej działanie mutagenne, w jakim stopniu oba ogniska kolokalizowały się w miejscu DSB, oraz przebieg czasowy ognisk γH2AX i 53BP1 w celu określenia kinetyki naprawy DSB indukowanych bleomycyną. Zgodnie z oczekiwaniami, zaobserwowano bardzo wyższą częstość ognisk zarówno γH2AX, jak i 53BP1.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza immunofluorescencyjna ognisk γH2AX i 53BP1 jest odpowiednią metodą oceny uszkodzeń genomu w jądrach międzyfazowych układu komórkowego. Procedura ta ma kilka krytycznych punktów, które mogą mieć wpływ na wynik eksperymentów, głównie środki stosowane w utrwalaniu i przepuszczalności, rodzaj przeciwciał i ich czynniki rozcieńczające oraz stężenie mutagenu.

Utrzymanie integralności białka ma fundamentalne znaczenie, ponieważ metoda immunofluorescencyjna zakłada identyfikację antygenów, któ.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni dawcom krwi pełnej oraz całemu personelowi medycznemu, który pobrał próbki krwi.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AlexaFluor 568 kozia anty-mysia IgG (γ 1)InvitrogenA2112453BP1
BleoprimSanofiSiarczan bleomycyny (mutagen)
Roztwór penicyliny i streptomycyny 100XEurocloneECB3001Dantybiotyki do pożywki
hodowlanej PBS 10XTermofisher14200075Sól fizjologiczna buforowana fosforanami
FBS EurocloneEC20180LPłodowa surowica bydlęca do immunofluorescencji
Kozia anty-królicza IgG (H+L) DyLight 488 ConiugatedTermofisher#35552γ Przeciwciało drugorzędowe H2AX
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-53BP1MerckMAB 380253BP1 przeciwciało pierwszorzędowe
Labophot 2fluorescencyjnyNikon
Histon H2AX (Ser139) przeciwciało królikaSygnalizacja komórkowa# 2577i gamma; Przeciwciało pierwszorzędowe H2AX
FitohemoaglutyninaTermofisherR30852801składnik pożywki
hodowlanej Przedłuż złoty odczynnik zapobiegający blaknięciu z DAPICell Signaling#8961Roztwór zapobiegający blaknięciu z DAPI do barwienia przeciwdziałającego
barwieniu RPMI 1640EurocloneECB9006LPożywka
hodowlana Triton-X100SigmaT9284Niejonowy detergent do przepuszczalność
Przeciwciało drugorzędowe Mikroskop

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
  2. Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Gamma H2AXogniska 53BP1limfocyty ludzkiep kni cia dwuniciowemarkery uszkodze DNAtraktowanie bleomycynkwantyfikacja ogniskkinetyka naprawyanaliza ko lokalizacji

Powiązane artykuły