Ten protokół przedstawia metodę oceny powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA poprzez jednoczesne wykrywanie ognisk γH2AX i 53BP1 w jądrach interfazowych ludzkich limfocytów obwodowych traktowanych bleomycyną.
Artykuł metodologiczny
Ten protokół przedstawia metodę oceny powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA poprzez jednoczesne wykrywanie ognisk γH2AX i 53BP1 w jądrach interfazowych ludzkich limfocytów obwodowych traktowanych bleomycyną.
Pęknięcia podwójnej nici (DSB) są jednym z najpoważniejszych uszkodzeń, jakie mogą wystąpić w jądrach komórkowych, a jeśli nie zostaną naprawione, mogą prowadzić do poważnych skutków, w tym raka. Komórka jest zatem wyposażona w złożone mechanizmy naprawy DSB, a szlaki te obejmują histon H2AX w swojej fosforylowanej formie w Ser-139 (a mianowicie γH2AX) i białko wiążące p53 1 (53BP1). Ponieważ oba białka mogą tworzyć ogniska w miejscach DSB, identyfikacja tych markerów jest uważana za odpowiednią metodę badania zarówno DSB, jak i ich kinetyki naprawy. Zgodnie z procesami molekularnymi, które prowadzą do powstawania ognisk γH2AX i 53BP1, bardziej przydatne może być zbadanie ich kolokalizacji w pobliżu DSB w celu opracowania alternatywnego podejścia, które umożliwia ilościowe określenie DSB poprzez jednoczesne wykrycie dwóch markerów uszkodzenia DNA. W związku z tym protokół ten ma na celu ocenę uszkodzeń genomowych indukowanych w ludzkich limfocytach przez czynnik radiomimetyczny bleomycynę poprzez obecność ognisk γH2AX i 53BP1 w podwójnej immunofluorescencji. Korzystając z tej metodologii, określiliśmy również zmienność liczby ognisk γH2AX i 53BP1 w czasie, jako wstępną próbę zbadania kinetyki naprawy DSB indukowanych bleomycyną.
Uszkodzenia DNA są stale indukowane przez czynniki, które mogą być endogenne, takie jak ROS generowane przez komórkowy metabolizm oksydacyjny, lub egzogenne, zarówno chemiczne, jak i fizyczne1. Do najbardziej szkodliwych zmian chorobowych należą pęknięcia dwuniciowe (DSB), które odgrywają zasadniczą rolę w przyczynianiu się do niestabilności genomu, ponieważ powodują aberracje chromosomowe, które z kolei mogą zainicjować proces karcynogenezy. W ten sposób komórki są wyposażone w złożone i wydajne mechanizmy naprawy DSBs2.
Gdy dochodzi do DSB, komórka uruchamia odpowiedź na uszkodzenie DNA (DDR), gdzie wraz z kompleksem MRE11/RAD50/NBS1 rekrutowane są kinazy ATM lub ATR do aktywacji innych białek, które spowalniają lub zatrzymują cykl komórkowy3. Istotnym celem tych kinaz jest histon H2AX, który jest fosforylowany na Ser-139 w ciągu kilku megazasad od DSB (a mianowicie γH2AX), umożliwiając w ten sposób rekrutację kilku czynników naprawczych, takich jak m.in. białko wiążące BRCA1 i p53 1 (53BP1)3. Później uruchamiana jest jedna ścieżka między rekombinacją homologiczną (HR), niehomologicznym łączeniem końców (NHEJ) lub wyżarzaniem jednoniciowym (SSA) w celu naprawy DSBs4,5. W związku z tym 53BP1 jest zaangażowany w dyktowanie wyboru między HR a NHEJ, głównie promując aktywację NHEJ, a nie HR6. Co więcej, zarówno ufosforylowana forma histonu H2AX, jak i 53BP1 mogą tworzyć ogniska w miejscach DSB. Ponieważ ogniska te utrzymują się do momentu przywrócenia integralności podwójnej nici, ocena pojawienia się/zaniku ognisk γH2AX lub 53BP1 w pewnym przedziale czasu jest uważana za użyteczną metodę oceny występowania i naprawy DSB w systemie komórkowym6,7. Jednakże, zgodnie z opisanymi powyżej procesami molekularnymi, ponieważ oczekuje się, że ogniska γH2AX i 53BP1 będą kolokalizować się w pobliżu DSB podczas DDR8,9, przydatne może być jednoczesne wykrycie obecności tych markerów w podwójnej immunofluorescencji.
Tak więc, celem tego manuskryptu było oszacowanie przydatności jednoczesnej kwantyfikacji ognisk γH2AX i 53BP1 do oceny uszkodzeń genomowych indukowanych w ludzkich limfocytach obwodowych przez radiomimetyczny czynnik bleomycynę. Korzystając z tej samej metodologii, podjęliśmy również próbę nakreślenia kinetyki naprawy DSB indukowanych bleomycyną zgodnie z wcześniej ustaloną procedurą eksperymentalną10.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Badanie zostało zatwierdzone przez komisję etyczną Uniwersytetu w, a od każdego dawcy uzyskano świadomą i podpisaną zgodę.
1. Powstawanie ognisk γH2AX i 53BP1
2. Analiza za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego
UWAGA: "Mikroskop fluorescencyjny" odnosi się do dowolnego mikroskopu, który wykorzystuje fluorescencję do generowania obrazu. Próbka jest oświetlana światłem o określonej długości fali (lub długościach fal), które jest pochłaniane przez fluorofory, powodując emitowanie światła o dłuższych długościach fal12. AlexaFluor568 i DyLight 488 pochłaniają światło o długości fali około 568 i 488 nm oraz emitują światło o długości fali odpowiednio 603 i 520 nm. W związku z tym są one widoczne jako czerwona lub zielona fluorescencja przy użyciu odpowiednio filtra TRITC lub FITC.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dane uzyskane przez analizę limfocytów obwodowych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego pozwalają nam ocenić trzy główne aspekty: skuteczność leczenia bleomycyną w zwiększaniu liczby ognisk γH2AX i 53BP1 (a tym samym DSB) ze względu na jej działanie mutagenne, w jakim stopniu oba ogniska kolokalizowały się w miejscu DSB, oraz przebieg czasowy ognisk γH2AX i 53BP1 w celu określenia kinetyki naprawy DSB indukowanych bleomycyną. Zgodnie z oczekiwaniami, zaobserwowano bardzo wyższą częstość ognisk zarówno γH2AX, jak i 53BP1...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Analiza immunofluorescencyjna ognisk γH2AX i 53BP1 jest odpowiednią metodą oceny uszkodzeń genomu w jądrach międzyfazowych układu komórkowego. Procedura ta ma kilka krytycznych punktów, które mogą mieć wpływ na wynik eksperymentów, głównie środki stosowane w utrwalaniu i przepuszczalności, rodzaj przeciwciał i ich czynniki rozcieńczające oraz stężenie mutagenu.
Utrzymanie integralności białka ma fundamentalne znaczenie, ponieważ metoda immunofluorescencyjna zakłada identyfikację antygenów, któ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Jesteśmy wdzięczni dawcom krwi pełnej oraz całemu personelowi medycznemu, który pobrał próbki krwi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| AlexaFluor 568 kozia anty-mysia IgG (γ 1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 |
| Bleoprim | Sanofi | Siarczan bleomycyny (mutagen) | |
| Roztwór penicyliny i streptomycyny 100X | Euroclone | ECB3001D | antybiotyki do pożywki |
| hodowlanej PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Sól fizjologiczna buforowana fosforanami |
| FBS Euroclone | EC20180L | Płodowa surowica bydlęca do immunofluorescencji | |
| Kozia anty-królicza IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γ Przeciwciało drugorzędowe H2AX |
| Mysie przeciwciało monoklonalne anty-53BP1 | Merck | MAB 3802 | 53BP1 przeciwciało pierwszorzędowe |
| Labophot 2 | fluorescencyjny | Nikon | |
| Histon H2AX (Ser139) przeciwciało królika | Sygnalizacja komórkowa | # 2577 | i gamma; Przeciwciało pierwszorzędowe H2AX |
| Fitohemoaglutynina | Termofisher | R30852801 | składnik pożywki |
| hodowlanej Przedłuż złoty odczynnik zapobiegający blaknięciu z DAPI | Cell Signaling | #8961 | Roztwór zapobiegający blaknięciu z DAPI do barwienia przeciwdziałającego |
| barwieniu RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Pożywka |
| hodowlana Triton-X100 | Sigma | T9284 | Niejonowy detergent do przepuszczalność |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie