Podwójna immunofluorescencja γH2AX i 53BP1 w ludzkich limfocytach obwodowych

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia metodę oceny powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA poprzez jednoczesne wykrywanie ognisk γH2AX i 53BP1 w jądrach interfazowych ludzkich limfocytów obwodowych traktowanych bleomycyną.

Streszczenie

Pęknięcia podwójnej nici (DSB) są jednym z najpoważniejszych uszkodzeń, jakie mogą wystąpić w jądrach komórkowych, a jeśli nie zostaną naprawione, mogą prowadzić do poważnych skutków, w tym raka. Komórka jest zatem wyposażona w złożone mechanizmy naprawy DSB, a szlaki te obejmują histon H2AX w swojej fosforylowanej formie w Ser-139 (a mianowicie γH2AX) i białko wiążące p53 1 (53BP1). Ponieważ oba białka mogą tworzyć ogniska w miejscach DSB, identyfikacja tych markerów jest uważana za odpowiednią metodę badania zarówno DSB, jak i ich kinetyki naprawy. Zgodnie z procesami molekularnymi, które prowadzą do powstawania ognisk γH2AX i 53BP1, bardziej przydatne może być zbadanie ich kolokalizacji w pobliżu DSB w celu opracowania alternatywnego podejścia, które umożliwia ilościowe określenie DSB poprzez jednoczesne wykrycie dwóch markerów uszkodzenia DNA. W związku z tym protokół ten ma na celu ocenę uszkodzeń genomowych indukowanych w ludzkich limfocytach przez czynnik radiomimetyczny bleomycynę poprzez obecność ognisk γH2AX i 53BP1 w podwójnej immunofluorescencji. Korzystając z tej metodologii, określiliśmy również zmienność liczby ognisk γH2AX i 53BP1 w czasie, jako wstępną próbę zbadania kinetyki naprawy DSB indukowanych bleomycyną.

Wprowadzenie

Uszkodzenia DNA są stale indukowane przez czynniki, które mogą być endogenne, takie jak ROS generowane przez komórkowy metabolizm oksydacyjny, lub egzogenne, zarówno chemiczne, jak i fizyczne¹. Do najbardziej szkodliwych zmian chorobowych należą pęknięcia dwuniciowe (DSB), które odgrywają zasadniczą rolę w przyczynianiu się do niestabilności genomu, ponieważ powodują aberracje chromosomowe, które z kolei mogą zainicjować proces karcynogenezy. W ten sposób komórki są wyposażone w złożone i wydajne mechanizmy naprawy DSBs².

Gdy dochodzi do DSB, komórka uruchamia odpowiedź na uszkodzenie DNA (DDR), gdzie wraz z kompleksem MRE11/RAD50/NBS1 rekrutowane są kinazy ATM lub ATR do aktywacji innych białek, które spowalniają lub zatrzymują cykl komórkowy³. Istotnym celem tych kinaz jest histon H2AX, który jest fosforylowany na Ser-139 w ciągu kilku megazasad od DSB (a mianowicie γH2AX), umożliwiając w ten sposób rekrutację kilku czynników naprawczych, takich jak m.in. białko wiążące BRCA1 i p53 1 (53BP1)³. Później uruchamiana jest jedna ścieżka między rekombinacją homologiczną (HR), niehomologicznym łączeniem końców (NHEJ) lub wyżarzaniem jednoniciowym (SSA) w celu naprawy DSBs^4,5. W związku z tym 53BP1 jest zaangażowany w dyktowanie wyboru między HR a NHEJ, głównie promując aktywację NHEJ, a nie HR⁶. Co więcej, zarówno ufosforylowana forma histonu H2AX, jak i 53BP1 mogą tworzyć ogniska w miejscach DSB. Ponieważ ogniska te utrzymują się do momentu przywrócenia integralności podwójnej nici, ocena pojawienia się/zaniku ognisk γH2AX lub 53BP1 w pewnym przedziale czasu jest uważana za użyteczną metodę oceny występowania i naprawy DSB w systemie komórkowym^6,7. Jednakże, zgodnie z opisanymi powyżej procesami molekularnymi, ponieważ oczekuje się, że ogniska γH2AX i 53BP1 będą kolokalizować się w pobliżu DSB podczas DDR^8,9, przydatne może być jednoczesne wykrycie obecności tych markerów w podwójnej immunofluorescencji.

Tak więc, celem tego manuskryptu było oszacowanie przydatności jednoczesnej kwantyfikacji ognisk γH2AX i 53BP1 do oceny uszkodzeń genomowych indukowanych w ludzkich limfocytach obwodowych przez radiomimetyczny czynnik bleomycynę. Korzystając z tej samej metodologii, podjęliśmy również próbę nakreślenia kinetyki naprawy DSB indukowanych bleomycyną zgodnie z wcześniej ustaloną procedurą eksperymentalną¹⁰.

Protokół

Badanie zostało zatwierdzone przez komisję etyczną Uniwersytetu w, a od każdego dawcy uzyskano świadomą i podpisaną zgodę.

1. Powstawanie ognisk γH2AX i 53BP1

1. Przygotowanie próbek i postępowanie mutagenne
   1. Pobrać próbki krwi pełnej przez nakłucie żyły od zdrowych dorosłych osób w probówkach do pobierania krwi (np. Vacutainer) zawierających heparynę litową jako antykoagulant.
   2. W celu zapewnienia właściwego zachowania próbki krwi należy rozpocząć procedurę w ciągu 24 godzin od pobrania
   próbki.
   3. Dodać 300 μl próbki do probówki zawierającej 4,7 ml kompletnej pożywki (0,5% penicylina-streptomycyna, 0,75% fitohemaglutynina, 10% FBS wcześniej inaktywowane, 88,75% RPMI 1640).
   4. Następnie dodać siarczan bleomycyny do końcowego stężenia 5 μg/ml.
      UWAGA: Siarczan bleomycyny jest mutagenem. Unikać kontaktu ze skórą i wdychania. Przygotować roztwór i dodać próbkę pod maską.
   5. Dla każdej próbki należy ustanowić kontrolę ujemną (brak mutagenu).
   6. Umieść rurkę w termostacie w temperaturze 37 °C na 2 godziny.
2. Utrwalenie
   1. Odwirować próbki o masie 540 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą wiru.
   3. Dodać 5 ml roztworu hipotonicznego (2,87 g KCl rozpuszczonego w 500 ml wody dejonizowanej) i 400 μl roztworu wstępnego utrwalającego (kwas octowy 5:3: metanol), aby spowodować hemolizę czerwonych krwinek.
   4. Odwirować próbki o masie 540 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml metanolu w temperaturze pokojowej na co najmniej 30 minut w celu utrwalenia komórek.
   6. Alternatywnie, przechowuj ogniwa w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
3. Przygotowanie preparatów
   1. Odwirować próbki o masie 540 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml roztworu metanolu i kwasu octowego w proporcji 3:1. Powtórz te kroki jeszcze raz.
   3. Na koniec ponownie odwirować roztwór o stężeniu 540 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Ponownie odessać supernatant, pozostawiając wystarczającą ilość roztworu (0,5 ml) do ponownego zawieszenia osadu, energicznie pipetować, upuścić zawieszone osady komórkowe na szkiełka i wysuszyć na powietrzu. Przechowywać szkiełka w temperaturze 4 °C.
4. Immunofluorescencja
   UWAGA: Immunofluorescencja to immunologiczna metoda identyfikacji określonych celów komórkowych za pomocą przeciwciała pierwszorzędowego wiążącego sam cel i przeciwciała fluorescencyjnego drugorzędowego wiążącego podstawowe, które umożliwia lokalizację celu¹¹. W tym przypadku mysie monoklonalne anty-53BP1 (1:50) i królicze poliklonalne anty-γH2AX (1:50) są stosowane jako przeciwciała pierwszorzędowe, podczas gdy AlexaFluor568 anty-mysie (1:400) i DyLight488 anty-królik (1:200) są stosowane odpowiednio jako przeciwciała drugorzędowe.
   1. Umyj szkiełka dwa razy w 50 ml 1x PBS przez 5 minut w słoiku couplin (16 szkiełek tyłem do siebie).
   2. Następnie trzymaj je przez 30 minut w roztworze blokującym (10 ml FBS, 10 ml 10x PBS, 80 ml wody dejonizowanej, 300 μl Triton-X).
   3. Do każdego szkiełka dodać 10 μl każdego z dwóch roztworów zawierających przeciwciała pierwszorzędowe rozpuszczone w roztworze blokującym. Przykryć szkiełka taśmą parafinową i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
   4. Po inkubacji wykonać trzy płukania w 1x PBS przez 5 min.
   5. Do każdego szkiełka dodać 10 μl każdego z dwóch roztworów zawierających przeciwciała drugorzędowe rozpuszczone w roztworze blokującym. Przykryj szkiełka taśmą parafinową i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
   6. Wykonaj trzy prania w 1x PBS przez 5 min.
   7. Dodać 2,5 μl roztworu zapobiegającego blaknięciu z DAPI na szkiełka nakrywkowe przed montażem, aby przeciwdziałać barwieniu jąder.
      UWAGA: W celu oceny kinetyki ognisk, procedura jest taka sama, jak opisana od 1,1 do 1,4, zauważając, że pobieranie komórek i podwójna immunofluorescencja są wykonywane po 0 godzinach, po 2 godzinach po leczeniu bleomycyną, a następnie, po usunięciu mutagenu, po 4 godzinach, 6 godzinach i 24 godzinach po zabiegu.

2. Analiza za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego

UWAGA: "Mikroskop fluorescencyjny" odnosi się do dowolnego mikroskopu, który wykorzystuje fluorescencję do generowania obrazu. Próbka jest oświetlana światłem o określonej długości fali (lub długościach fal), które jest pochłaniane przez fluorofory, powodując emitowanie światła o dłuższych długościach fal¹². AlexaFluor568 i DyLight 488 pochłaniają światło o długości fali około 568 i 488 nm oraz emitują światło o długości fali odpowiednio 603 i 520 nm. W związku z tym są one widoczne jako czerwona lub zielona fluorescencja przy użyciu odpowiednio filtra TRITC lub FITC.

1. Oceń obecność ognisk na każdym slajdzie pod 100-krotnym obiektywem zanurzenia (Rysunek 1).
2. Oceń 200 jąder na szkiełko i policz liczbę ognisk γH2AX/53BP1 w każdym jądrze.
3. Wyraż wyniki pod względem średniej liczby ognisk na łączną liczbę uzyskanych jąder. Należą do nich zarówno jądra γH2AX/53BP1 dodatnie (wykazujące co najmniej jeden sygnał fluorescencyjny), jak i ujemne (niewykazujące żadnego sygnału fluorescencji).

Wyniki

Dane uzyskane przez analizę limfocytów obwodowych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego pozwalają nam ocenić trzy główne aspekty: skuteczność leczenia bleomycyną w zwiększaniu liczby ognisk γH2AX i 53BP1 (a tym samym DSB) ze względu na jej działanie mutagenne, w jakim stopniu oba ogniska kolokalizowały się w miejscu DSB, oraz przebieg czasowy ognisk γH2AX i 53BP1 w celu określenia kinetyki naprawy DSB indukowanych bleomycyną. Zgodnie z oczekiwaniami, zaobserwowano bardzo wyższą częstość ognisk zarówno γH2AX, jak i 53BP1...

Dyskusja

Analiza immunofluorescencyjna ognisk γH2AX i 53BP1 jest odpowiednią metodą oceny uszkodzeń genomu w jądrach międzyfazowych układu komórkowego. Procedura ta ma kilka krytycznych punktów, które mogą mieć wpływ na wynik eksperymentów, głównie środki stosowane w utrwalaniu i przepuszczalności, rodzaj przeciwciał i ich czynniki rozcieńczające oraz stężenie mutagenu.

Utrzymanie integralności białka ma fundamentalne znaczenie, ponieważ metoda immunofluorescencyjna zakłada identyfikację antygenów, któ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
AlexaFluor 568 kozia anty-mysia IgG (γ 1)	Invitrogen	A21124	53BP1
Bleoprim	Sanofi		Siarczan bleomycyny (mutagen)
Roztwór penicyliny i streptomycyny 100X	Euroclone	ECB3001D	antybiotyki do pożywki
hodowlanej PBS 10X	Termofisher	14200075	Sól fizjologiczna buforowana fosforanami
	FBS Euroclone	EC20180L	Płodowa surowica bydlęca do immunofluorescencji
Kozia anty-królicza IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated	Termofisher	#35552	γ Przeciwciało drugorzędowe H2AX
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-53BP1	Merck	MAB 3802	53BP1 przeciwciało pierwszorzędowe
Labophot 2	fluorescencyjny	Nikon
Histon H2AX (Ser139) przeciwciało królika	Sygnalizacja komórkowa	# 2577	i gamma; Przeciwciało pierwszorzędowe H2AX
Fitohemoaglutynina	Termofisher	R30852801	składnik pożywki
hodowlanej Przedłuż złoty odczynnik zapobiegający blaknięciu z DAPI	Cell Signaling	#8961	Roztwór zapobiegający blaknięciu z DAPI do barwienia przeciwdziałającego
barwieniu RPMI 1640	Euroclone	ECB9006L	Pożywka
hodowlana Triton-X100	Sigma	T9284	Niejonowy detergent do przepuszczalność