Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie linii komórkowych nokautujących związanych z centromerem Protein-E CENP-E-/- przy użyciu systemu CRISPR/Cas9

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65476

⸱

23 czerwca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine, Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics, Fujian Medical University, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje budowę komórek nokautujących białko-E związanych z centromerem (CENP-E) przy użyciu systemu CRISPR/Cas9 i trzech strategii przesiewowych opartych na fenotypie. Wykorzystaliśmy linię komórkową z nokautem CENP-E do opracowania nowatorskiego podejścia do walidacji swoistości i toksyczności inhibitorów CENP-E, co jest przydatne przy opracowywaniu leków i badaniach biologicznych.

Streszczenie

System CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 okazał się potężnym narzędziem do precyzyjnej i efektywnej edycji genów w różnych organizmach. Białko E ZWIĄZANE Z CENTROMEREM (CENP-E) jest kinezyną skierowaną na koniec dodatni, wymaganą do wychwytywania mikrotubul kinetochorowych, wyrównania chromosomów i punktu kontrolnego montażu wrzeciona. Chociaż funkcje komórkowe białek CENP-E zostały dobrze zbadane, trudno było badać bezpośrednie funkcje białek CENP-E przy użyciu tradycyjnych protokołów, ponieważ ablacja CENP-E zwykle prowadzi do aktywacji punktu kontrolnego składania wrzeciona, zatrzymania cyklu komórkowego i śmierci komórki. W tym badaniu całkowicie wyeliminowaliśmy gen CENP-E w ludzkich komórkach HeLa i z powodzeniem wygenerowaliśmy komórki CENP-E-/- HeLa za pomocą systemu CRISPR/Cas9.

Ustalono trzy zoptymalizowane strategie przesiewowe oparte na fenotypie, w tym badania przesiewowe kolonii komórkowych, fenotypy dopasowania chromosomów oraz intensywności fluorescencji białek CENP-E, które skutecznie poprawiają skuteczność badań przesiewowych i wskaźnik sukcesu eksperymentalnego komórek nokautujących CENP-E. Co ważne, delecja CENP-E powoduje niewspółosiowość chromosomów, nieprawidłową lokalizację białek mitotycznego punktu kontrolnego BUB1 kinazy serynowo-treoninowej B (BubR1) oraz defekty mitotyczne. Ponadto wykorzystaliśmy model komórki HeLa z nokautem CENP-E do opracowania metody identyfikacji inhibitorów specyficznych dla CENP-E.

W tym badaniu ustalono użyteczne podejście do walidacji specyficzności i toksyczności inhibitorów CENP-E. Ponadto w pracy przedstawiono protokoły edycji genów CENP-E z wykorzystaniem systemu CRISPR/Cas9, który może być potężnym narzędziem do badania mechanizmów CENP-E w podziale komórek. Co więcej, linia komórkowa z nokautem CENP-E przyczyni się do odkrycia i walidacji inhibitorów CENP-E, co ma ważne implikacje dla opracowywania leków przeciwnowotworowych, badań nad mechanizmami podziału komórek w biologii komórki oraz zastosowań klinicznych.

Wprowadzenie

Inżynieria edycji genomu pośredniczy w ukierunkowanych modyfikacjach genów w różnych komórkach i organizmach. U eukariontów mutageneza specyficzna dla miejsca może być wprowadzona przez zastosowanie nukleaz specyficznych dla sekwencji, które stymulują homologiczną rekombinację docelowego DNA1. W ostatnich latach pojawiło się kilka technologii edycji genomu, w tym nukleazy palców cynkowych (ZFN)2,3, aktywatory transkrypcji podobne do efektorów nukleazy (TALENs)4,5, oraz homing meganukleazy6,7, zostały zaprojektowane tak, aby rozszczepiać genomy w określonych miejscach, ale podejścia te wymagają złożonej inżynierii białek i zbędnych procedur eksperymentalnych. Badania wykazały, że system prokariotyczny typu II zgrupowany regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR)/Cas jest wydajną technologią edycji genów, która w szczególności pośredniczy w kierowanym przez RNA, specyficznym dla miejsca rozszczepieniu DNA w wielu różnych komórkach i gatunkach8,9,10,11. Technologia nokautu genów CRISPR/Cas9 zrewolucjonizowała dziedziny podstawowej biologii, biotechnologii i medycyny12.

Bakterie i większość archeonów wykształciły adaptacyjny system odpornościowy oparty na RNA, który wykorzystuje białka CRISPR i Cas do identyfikacji i niszczenia wirusów i plazmidów13. Streptococcus pyogenes (paciorkowiec pospolity) Endonukleaza Cas9 (SpCas9) zawiera podobną do RuvC resollawazę połączeniową Hollidaya (RuvC) i domenę His-Asn-His (HNH), które mogą skutecznie pośredniczyć w specyficznych dla sekwencji, dwuniciowych pęknięciach (DSB), dostarczając syntetyczny jednoprowadnicowy RNA (sgRNA) zawierający RNA CRISPR (crRNA) i transaktywujący crRNA (tracrRNA)14,15,16. DSB mogą być naprawiane przez niehomologiczny szlak łączenia końców tworzący indel (NHEJ) lub naprawę kierowaną homologią (HDR), który wprowadza wiele mutacji, w tym insercje, delecje lub substytucje pojedynczych nukleotydów bez blizn, w komórkach ssaków1,8. Zarówno podatny na błędy NHEJ, jak i szlak HDR o wysokiej wierności mogą być używane do pośredniczenia w nokautowaniu genów poprzez insercje lub delecje, co może powodować mutacje z przesunięciem ramki i przedwczesne kodony stop10.

Kinesin-7 CENP-E jest wymagany do przyłączania kinetochoru-mikrotubul i wyrównywania chromosomów podczas podziału komórki17,18,19. Mikroiniekcja przeciwciał20,21, zubożenie siRNA22,23, inhibicja chemiczna24,25,26 i delecja genetyczna27,28,29 CENP-E prowadzi do niewspółosiowości chromosomów, aktywacji punktu kontrolnego składania wrzeciona i defektów mitotycznych, co skutkuje aneuploidią i niestabilnością chromosomów19,30. U myszy delecja CENP-E powoduje nieprawidłowy rozwój i śmiertelność zarodka na bardzo wczesnych etapach rozwoju27,29,31. Genetyczna delecja CENP-E zwykle prowadzi do niewspółosiowości chromosomów i śmierci komórki26,27,29, co stanowi przeszkodę w badaniu funkcji i mechanizmów białek CENP-E.

Niedawne badanie ustaliło warunkową linię komórkową nokautującą CENP-E przy użyciu indukowanej auksyną metody edycji genów CRISPR/Cas932, która umożliwia szybką degradację białek CENP-E w stosunkowo krótkim czasie33. Jednak do tej pory nie ustalono stabilnych linii komórkowych z nokautem CENP-E, co jest nierozwiązanym wyzwaniem technicznym w biologii CENP-E. Biorąc pod uwagę odporność genetyczną34, odpowiedzi kompensacji genetycznej35,36,37, oraz złożone środowiska wewnątrzkomórkowe, ponieważ bezpośrednie konsekwencje całkowitego usunięcia CENP-E mogą być złożone i nieprzewidywalne, ważne jest ustalenie CENP-E Linie komórkowe nokautu do badania mechanizmów wyrównania chromosomów, punktu kontrolnego składania wrzeciona i dalszych szlaków sygnałowych.

Odkrycie i zastosowanie inhibitorów CENP-E są ważne w leczeniu raka. Do tej pory odkryto i zsyntetyzowano siedem typów inhibitorów CENP-E, w tym GSK923295 i jego pochodne24,25, PF-277138,39, imidazo[1,2-a]pochodne rusztowania pirydynowego40,41, compound-A42,43, syntelin44,45, UA6278446 i pochodne benzo[d]pyrrolo[2,1-b]tiazolu47. Wśród tych inhibitorów GSK923295 jest allosterycznym i skutecznym inhibitorem CENP-E, który wiąże się z domeną motoryczną CENP-E i hamuje aktywność ATPazy stymulowanej mikrotubulami CENP-E o Ki wynoszącym 3,2 ± 0,2 nM24,25. Jednak w porównaniu z hamującym działaniem GSK923295 na hodowane komórki nowotworowe, efekty terapeutyczne GSK923295 u pacjentów klinicznych z rakiem nie są idealne48,49, co również wzbudziło obawy co do specyficzności GSK923295 dla CENP-E. Co więcej, specyficzność i skutki uboczne innych inhibitorów CENP-E dla białek CENP-E są kluczowymi kwestiami w badaniach nad rakiem.

W tym badaniu całkowicie wyeliminowaliśmy gen CENP-E w komórkach HeLa za pomocą systemu CRISPR/Cas9. Ustanowiono trzy zoptymalizowane strategie badań przesiewowych opartych na fenotypie, w tym badania przesiewowe kolonii komórkowych, fenotypy dopasowania chromosomów i intensywność fluorescencji białek CENP-E, w celu poprawy skuteczności badań przesiewowych i wskaźnika powodzenia edycji genu CENP-E. Co więcej, linie komórkowe z nokautem CENP-E mogą być wykorzystywane do badania specyficzności związków kandydujących do CENP-E.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Konstrukcja wektorów do wyciszania genów CRISPR/Cas9

  1. Wybierz docelową sekwencję genomowego DNA w ludzkim genie CENP-E (numer dostępu GenBank NM_001286734.2) i zaprojektuj sgRNA za pomocą internetowego narzędzia do projektowania CRISPR (http://crispor.tefor.net/).
  2. Wprowadź pojedynczą sekwencję genomową, wybierz genom „Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (hg38 analysis set) + single nucleotide polymorphisms (SNPs): dbSNP148” oraz motyw sąsiedztwa protospacera „20 bp-NGG-spCas9”. Wybierz dwie sekwencje przewodnie, w tym sgRNA-1, 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' oraz sgRNA-2 5'-TTCTTTAGAGACGCGGGCTC-3', na podstawie wyników specyficzności50, przewidywanej wydajności10 oraz minimalnej liczby efektów off-target.
  3. Zamów i zsyntetyzuj jednoniciowe oligonukleotydy DNA (ssODN). Rozcieńcz ssODN w ddH2O do końcowego stężenia 100 µM. Aby sfosforylować i zhybrydyzować oligos sgRNA, dodaj do probówki do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) 1 µL oligosu bezpośredniego (forward), 1 µL oligosu odwrotnego (reverse), 0,5 µL kinazy polinukleotydowej T4, 1 µL buforu do kinazy polinukleotydowej T4 oraz 6,5 µL wody wolnej od RNaz; inkubuj probówkę w 37 °C przez 30 min, w 95 °C przez 5 min, a następnie stopniowo obniżaj temperaturę do 25 °C w tempie 5 °C min-1.
  4. Przetraw plazmid pX458 przy użyciu enzymu restrykcyjnego BbsDiagram równowagi statycznej, ΣFx=0, pokazuje równowagę przy użyciu systemu dźwigni i wektorów siły.. Do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mL dodaj 1 µg plazmidu pX458, 2 µL buforu G (10x), 1 µL BbsDiagram równowagi statycznej, ΣFx=0, pokazuje równowagę przy użyciu systemu dźwigni i wektorów siły. i uzupełnij ddH2O wolnym od RNaz do objętości 20 µL. Inkubuj probówkę w 37 °C przez 2 h. Następnie oczyść liniowy plazmid za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA z żelu kolumnowego zgodnie z protokołami producenta.
  5. Liguj oligos sgRNA w plazmid pX458 (plazmid pSpCas9(BB)-2A-green fluorescent protein (GFP), Addgene ID 48138). Do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mL dodaj 1 µL zhybrydyzowanych oligonukleotydów, 25 ng liniowego plazmidu, 1 µL buforu do ligacji DNA T4 (10x) oraz 0,5 µL ligazy DNA T4 (350 U/µL) i uzupełnij ddH2O do objętości 10 µL. Inkubuj roztwór ligacyjny w 16 °C przez 2 h.
  6. Inkubuj 10 µL skonstruowanego plazmidu z kompetentnymi komórkami DH5α na lodzie przez 30 min, poddaj szokowi termicznemu w 42 °C przez 45 s, a następnie natychmiast umieść na lodzie na 5 min. Dodaj 500 µL pożywki Luria-Bertani (LB) i wysiej komórki na płytkę LB zawierającą ampicylinę (100 µg/mL). Inkubuj w 37 °C przez 16 h i wyselekcjonuj klony oporne.
  7. Wybierz od 5 do 10 pojedynczych kolonii za pomocą wysterylizowanego końcówki pipety i przenieś je do 1 mL hodowli w pożywce LB z ampicyliną (100 µg/mL). Inkubuj hodowlę w 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 180 rpm przez 12-16 h.
  8. Wyizoluj plazmidowe DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji plazmidów zgodnie z protokołami producenta. Zweryfikuj plazmidowe DNA każdej kolonii poprzez sekwencjonowanie metodą Sangera z miejsca promotora U6 przy użyciu primera U6-Fwd 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3'.
  9. Wyekstrahuj i oczyść plazmidy za pomocą zestawu do izolacji plazmidowego DNA wolnego od endonukleaz (endo-free) zgodnie z protokołami producenta.

2. Transfekcja, izolacja i przesiewanie komórek HeLa z nokautem genu CENP-E

  1. Hodować komórki HeLa w podłożu DMEM (Dulbecco Modified Eagle's Medium) uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny/streptomycyny w inkubatorze z nawilżaczem w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.
  2. Inkubować komórki HeLa z zastosowaniem 0,25% trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w temperaturze 37 °C przez 2-3 min, rozdzielić komórki poprzez delikatne pipetowanie, a następnie wysiać komórki na nowe płytki w stosunku rozcieńczenia 1:4 w celu pasażowania komórek.
  3. Wysiać komórki na płytkę 12-dołkową i hodować do osiągnięcia 60-70% konfluencji przed transfekcją. Transfekować plazmidy pX458-sgRNA do komórek HeLa przy użyciu wymienionych odczynników zgodnie z protokołami producenta (patrz: Tabela Materiałów).
    1. Delikatnie zmieszać 1 µg zwalidowanego plazmidu pX458-sgRNA i 50 µL podłoża z obniżoną zawartością surowicy w probówce A. Następnie delikatnie zmieszać 2 µL odczynnika do transfekcji i 50 µL podłoża z obniżoną zawartością surowicy w probówce B. Inkubować probówki A i B oddzielnie w temperaturze pokojowej przez 5 min.
    2. Delikatnie zmieszać zawartość probówki A i probówki B i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min. Dodać mieszaninę do płytki 12-dołkowej, inkubować komórki przez 6 h, a następnie wymienić podłoże na świeże podłoże DMEM.
  4. Ocenić wydajność transfekcji komórek HeLa po 24 h lub 48 h za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Po 48 h od transfekcji całkowicie rozdzielić transfektowane komórki HeLa przy użyciu 0,25% trypsyny/EDTA w temperaturze 37 °C przez 3-5 min, policzyć liczbę komórek za pomocą komory Neubauera lub automatycznego licznika komórek i wysiać komórki na trzy oddzielne płytki 96-dołkowe dla każdej transfektowanej populacji zgodnie z metodami rozcieńczeń seryjnych10.
  5. Przenieść komórki do inkubatora z nawilżaczem, a następnie hodować przez kolejne 1-2 tygodnie. Wymieniać podłoże hodowlane raz na 3 dni. W celu przesiewania opartego na fenotypie i walidacji nokautu CENP-E, rozdzielić i namnożyć komórki na płytkach 24-dołkowych lub 12-dołkowych przez 5-7 dni.
  6. Przesiewać komórki mutanty o mniejszych średnicach kolonii komórkowych za pomocą mikroskopu odwróconego wyposażonego w obiektywy 10x i 20x.
    UWAGA: Mutacje w genie CENP-E zazwyczaj prowadzą do znacznego wzrostu liczby dzielących się komórek w koloniach, co może być jednym z kluczowych wskaźników podczas przesiewania komórek mutantów CENP-E.
  7. Zebrać komórki do ekstrakcji DNA przy użyciu kolumnowego zestawu do ekstrakcji genomowego DNA zwierzęcego zgodnie z protokołami producenta. Przygotować reakcje PCR w następujący sposób: 0,25 µL polimerazy Taq, 5 µL buforu 10x (Mg2+ plus), 4 µL mieszaniny dNTP, 500 ng matrycy DNA, 1 µL oligonukleotydu forward, 1 µL oligonukleotydu reverse i uzupełnić ddH2O do objętości 50 µL. Do amplifikacji genu zastosować następujące ustawienia programu PCR: 98 °C, 10 s; 98 °C, 10 s, 55 °C, 30 s, 72 °C, 60 s przez 33 cykle; 72 °C, 10 min, a następnie utrzymać w 4 °C.
    UWAGA: Specyficzne primery do klonowania locus docelowego są następujące: CENP-E target F1, 5'-GAGGGTCCTGGCCATTTTCCTG-3'; CENP-E target R1, 5'-AGATCTCCGATCCTCCCCTGTC-3'; CENP-E target F2, 5'-TGGTAACTGCATTTTGGTGTTCTAC-3'; CENP-E target R2, 5'-CCTGTTGCAACGTGAGGGAAG-3'.
  8. Zligować docelowe DNA do wektora pMD18-T zgodnie z protokołami producenta. Transfekować zligowany plazmid do kompetentnych komórek DH5α i hodować w celu selekcji klonów.
  9. Przeprowadzić sekwencjonowanie metodą Sangera, aby określić typy nokautu CENP-E. Izolować plazmidowe DNA przy użyciu zestawu do ekstrakcji plazmidów zgodnie z protokołami producenta. Wykonać sekwencjonowanie Sangera DNA plazmidowego każdej kolonii przy użyciu primerów M13 forward i reverse. Primer M13F, 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'; primer M13R, 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'.
  10. Wysiać odpowiednio komórki HeLa typu dzikiego oraz mutanty CENP-E na szklane okrycie o średnicy 12 mm w płytce 24-dołkowej. Usunąć pełne podłoże DMEM i utrwalić komórki w 4% roztworze fiksacyjnym paraformaldehydu w soli fosforanowej (PBS) w temperaturze pokojowej przez 10 min.
  11. Barwić jądra roztworem 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) w temperaturze pokojowej przez 5 min. Przesiewać i walidować komórki mutanty CENP-E na podstawie fenotypu ustawienia chromosomów za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw Plan Fluor 40x/ Apertura Numeryczna (NA) 0,75.
  12. Przesiewać i walidować komórki z nokautem CENP-E za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i analizy (patrz sekcja 3) białek CENP-E.

3. Barwienie immunofluorescencyjne i konfokalna mikroskopia wysokiej rozdzielczości

  1. Utrwalone komórki w 4% roztworze paraformaldehydu w PBS w temperaturze pokojowej przez 10 min, a następnie zanurzono je w 1x PBS (2 x 5 min).
    UWAGA: Należy upewnić się, że komórki są w dobrym stanie; proces zbierania i utrwalania komórek musi przebiegać delikatnie, aby zapobiec odrywaniu się komórek w stadium metafazy.
  2. Przepuszczalność błon komórkowych zwiększono, stosując 0,25% Triton X-100 w PBS w temperaturze pokojowej przez 10 min, po czym komórki zanurzono w 1x PBS (2 x 5 min).
  3. Komórki zablokowano, stosując 1% BSA w PBST (0,1% Tween 20 w PBS) w temperaturze pokojowej przez 1 h. Przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczono w 1% BSA w PBST, a następnie inkubowano próbki w temperaturze 4 °C przez 12 h.
  4. Roztwory przeciwciał pierwszorzędowych usunięto, komórki przemyto 3 x 5 min w 1x PBS, a następnie inkubowano je z rozcieńczonymi przeciwciałami wtórnymi w temperaturze pokojowej przez 2 h.
  5. Przeciwciała wtórne usunięto i przemyto komórki w 1x PBS (3 x 5 min).
  6. Jądra komórkowe barwiono DAPI w temperaturze pokojowej przez 5 min. Preparaty zamknięto za pomocą medium montażowego i zabezpieczono lakierem do paznokci.
  7. Obserwację i rejestrację obrazów fluorescencyjnych przeprowadzono przy użyciu skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw 63x/NA 1,40.

4. Przygotowanie chromosomów i analiza kariotypu

  1. Kulturować komórki HeLa typu dzikiego oraz CENP-E-/- w pełnej pożywce DMEM uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny przez 24 h, a następnie inkubować komórki HeLa typu dzikiego i CENP-E-/- z 300 nM kolchicyną przez 5 h.
  2. Inkubować komórki z 0,25% trypsyną/EDTA w temperaturze 37 °C przez 3 min i zebrać komórki do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 mL.
  3. Wirować komórki przy 1 000 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej, odlać nadsączniki, dodać 1,2 mL roztworu KCl o stężeniu 0,075 mol/L i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 min.
  4. Wirować komórki przy 1 000 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej, odlać nadsączniki, dodać 0,2 mL roztworu utrwalającego (metanol: octowy kwas lodowaty = 3:1) do przedutrwalenia i delikatnie mieszać przez 1 min.
  5. Wirować komórki przy 1 000 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej, zebrać osady, dodać 1,5 mL roztworu utrwalającego w temperaturze pokojowej na 10 min, a następnie wirować przy 1 000 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  6. Odlać nadsączniki, dodać 0,6 mL roztworów utrwalających i przygotować zawiesinę komórkową. Nanieść 3-5 kropli zawiesiny komórkowej z wysokości 35-40 cm na szkiełka lodowe.
    UWAGA: Należy zachować wysokość 35-40 cm podczas nanoszenia zawiesin komórkowych na szkiełka; w przeciwnym razie chromosomy mogą być zbyt rozproszone lub nie odseparowane od siebie.
  7. Niezwłocznie wysuszyć szkiełka lampą alkoholową, zabarwić próbki 10% roztworem barwiącym Giemsy przez 7 min, płukać szkiełka pod bieżącą wodą przez 2 min i obserwować próbki za pomocą mikroskopu świetlnego wyposażonego w obiektyw Plan Fluor 40x/NA 0,75.

5. Test tworzenia kolonii komórkowych

  1. Przygotować zawiesiny komórkowe w płytkach 6-dołkowych przy gęstości 1 000-2 000 komórek/dołek. Delikatnie wstrząsnąć płytkami, aby równomiernie rozprzestrzenić komórki.
  2. Umieścić płytki 6-dołkowe w inkubatorze CO2 i inkubować przez 2-3 tygodnie w temperaturze 37 °C przy 5% CO2. Wymieniać pożywkę hodowlaną raz na 5 dni. Rejestrować obrazy za pomocą mikroskopu odwróconego wyposażonego w obiektywy 10x i 20x. Zebrać komórki, gdy pojawią się widoczne kolonie (setki komórek w obrębie jednego klonu).
  3. Aby zbadać działanie GSK923295, hodować komórki w płytkach 6-dołkowych przez 24 h, a następnie dodać 2 mL GSK923295 w końcowych stężeniach 10, 25, 50, 100 i 200 nM.
    UWAGA: Nie przesuwać naczynia hodowlanego na wczesnym etapie tworzenia się klonów, aby uniknąć odrywania się komórek, co może prowadzić do powstawania nowych klonów i wpływać na przesiewanie komórek transfekowanych.
  4. Usunąć pożywkę hodowlaną i utrwalić komórki 1% PFA w temperaturze pokojowej przez 10 min. Barwić kolonie 0,1% roztworem fioletu krystalicznego w temperaturze pokojowej przez 15 min. Płukać próbki 1x PBS trzykrotnie. Rejestrować obrazy kolonii komórkowych i wyznaczyć średnice każdej kolonii za pomocą oprogramowania ImageJ. Wybrać narzędzie zaznaczania Straight line , kliknąć Analyze, wybrać Measure i zapisać długość.
  5. Płukać kolonie 1 mL 10% roztworem kwasu octowego przez 5 min. Przenieść 200 µL roztworów nadsączu do płytki 96-dołkowej i zmierzyć wartości absorbancji za pomocą spektrofotometru do mikropłytek przy A600 nm.

6. Test żywotności komórek

  1. Wysiać komórki na płytki 24-dołkowe i hodować przez 48 h do uzyskania gęstości 80-90%.
  2. Inkubować komórki z 100 µL 0,25% trypsyny/EDTA w temperaturze 37 °C przez 3 min.
  3. Wymieszać 400 µL PBS z komórkami za pomocą pipety automatycznej. Przenieść 100 µL zawiesiny komórkowej na płytkę 96-dołkową.
  4. Do każdego dołka dodać 20 µL roztworu MTS w końcowym stężeniu 317 µg/mL i delikatnie wymieszać zgodnie z protokołami producenta. Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 1-3 h w inkubatorze CO2.
  5. Pomiar absorbancji każdego dołka przeprowadzić przy piku A490 nm za pomocą spektrofotometru do mikropłytek. Użyć długości fali referencyjnej A630 nm w celu odjęcia tła pochodzącego z fragmentów komórek i niespecyficznej absorbancji (Żywotność komórek = A490nm- A630 nm).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Komórki HeLa CENP-E-/- zostały pomyślnie wygenerowane przy użyciu systemu CRISPR/Cas9 (Rysunek 1). Harmonogram i krytyczne kroki eksperymentalne tej metody przedstawiono na Rysunku 1. Najpierw zaprojektowano i zsyntetyzowano specyficzne dla CENP-E sgRNA, poddano je hybrydyzacji i ligowano w plazmid pX458, a następnie przeprowadzono transfekcję plazmidu do komórek HeLa i inkubowano je przez 48 h. Transfekowane komórki rozdzielono i wy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kinesin-7 CENP-E jest kluczowym regulatorem w wyrównaniu chromosomów i punkcie kontrolnym składania wrzeciona podczas podziału komórki 17,19,20. Genetyczna delecja CENP-E zwykle powoduje aktywację punktu kontrolnego montażu wrzeciona, zatrzymanie cyklu komórkowego i śmierć komórki 27,29,51,52. Tak więc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy wszystkim członkom Laboratorium Cytoszkieletu na Uniwersytecie Medycznym Fujian za pomocne dyskusje. Dziękujemy Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin i Min-Xia Wu z Publicznego Centrum Obsługi Technologii Uniwersytetu Medycznego Fujian za ich pomoc techniczną. Dziękujemy Si-Yi Zheng, Ying Lin i Qi Ke z Eksperymentalnego Centrum Nauczania Podstawowych Nauk Medycznych na Uniwersytecie Medycznym Fujian za ich wsparcie. Badanie to było wspierane przez następujące granty: Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych Chin (numer grantu 82001608 i 82101678), Fundacja Nauk Przyrodniczych prowincji Fujian w Chinach (numer grantu 2019J05071), Wspólne Fundusze na rzecz Innowacji w Nauce i Technologii w prowincji Fujian w Chinach (numer grantu 2021Y9160) oraz projekt finansowania start-upów w zakresie talentów naukowych Uniwersytetu Medycznego Fujian (numer grantu XRCZX2017025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% Trypsyna-EDTAGibco25200056
1,5 ml probówka wirówkowaAxygenMCT-150-C
24-dołkowa płytkaCorning3524
4S Gelred, 10 000x w wodzieSangon Biotech (Szanghaj)A616697
50 ml probówka wirówkowaCorning430828
6 cm szalka PetriegoCorning
95% etanolOdczynnik chemiczny Sinopharm10009164
96-dołkowa płytkaCorning3599
Kwas octowyOdczynnik chemiczny Sinopharm10000218Rozpuść w H2O, aby przygotować 10% roztwór roboczy.
AgaroseSangon Biotech (Szanghaj A620014
Alexa Fluor 488 znakowana kozią anty-mysią IgG (H + L)BeyotimeA0428Do immunofluorescencji. Rozpuścić w 1% BSA/PBST. Rozcieńczenie 1:500.
Alexa Fluor 488 znakowany kozią anty-króliczą IgG (H + L)BeyotimeA0423Do immunofluorescencji. Rozpuścić w 1% BSA/PBST. Rozcieńczenie 1:500.
Alexa Fluor 555 znakowany Donkey Anti-Mouse IgG (H + L)BeyotimeA0460Do immunofluorescencji. Rozpuścić w 1% BSA/PBST. Rozcieńczenie 1:500.
Bezwodny etanolSinopharm Odczynnik chemiczny100092690
Przeciwciało monoklonalne królika anty-BubR1Abcamab254326Do immunofluorescencji. Rozpuścić w 1% BSA/PBST. Rozcieńczenie 1:100 
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-CENP-BSanta Cruz Biotechnologysc-376392Do immunofluorescencji. Rozpuścić w 1% BSA/PBST. Rozcieńczenie 1:50.
Przeciwciało monoklonalne królika anty-CENP-EAbcamab133583Do immunofluorescencji. Rozpuścić w 1% BSA/PBST. Rozcieńczenie 1:100.
Medium do montażu zapobiegającego blaknięciuBeyotimeP0131Spowolnienie wygaszania sygnałów fluorescencyjnych.
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-&alfa;-tubulinyAbcamab7291Do immunofluorescencji. Rozpuścić w 1% BSA/PBST. Rozcieńczenie 1:100.
Spektrofotometr mikropłytkowy Biotek EpochBiotek Instruments BiotekEpoch
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Odczynnik chemiczny Sinopharm69003435
BpiI (BbsI)Thermo Fisher ScientificER1011
CellTiter 96 wodny test proliferacji komórek w jednym roztworzePromegaG3580
Eppendorf5424BK745380
Odczynnik chemiczny ColchicineSinopharm61001563
Konfokalny mikroskop skaningowyLeicaLeica TCS SP8
Szkiełko nakrywkoweCITOTEST80344-1220
DAPIBeyotimeC1006
DH5α kompetentne komórkiSangon Biotech (Szanghaj)B528413
Marker DNA DL2000TaKaRa3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)GibcoC11995500BT
Endo-free plasmid mini kit figure-materials-1OmegaD6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification KitSangon Biotech (Shanghai)B518251
Surowica bydlęcapłodu Zhejiang Tianhang Biotechnology11011-8611
Odczynnik chemiczny Sinopharmfiolet goryczkowy71019944Rozpuść w PBS, aby przygotować 0,1% fioletu goryczkowego/PBS.
Roztwór do barwienia GiemsaOdczynnik chemiczny Sinopharm71020260
oprogramowanie GraphPad Prism w wersji 8.0GraphPadwww.graphpad.comAnaliza statystyczna.
GSK923295MedChemExpressHY-10299
Linia komórkowa HeLaATCCCCL-2
Nawilżany inkubatorHeal ForceHF90 / HF240
Image J oprogramowanieNational Institutes of Healthhttps://imagej.nih.gov/ij/Przetwarzanie i analiza obrazu.
Mikroskop odwróconyNanjing Jiangnan Novel OpticsXD-202
LB proszek agarowySangon Biotech (Szanghaj)A507003
Odczynnik do transfekcji Lipo6000BeyotimeC0526
Mikroskop Nikon Ti-S2NikonTi-S2
Opti-MEM  Obniżony  serum  mediumGibco31985070
ParaformaldehydeSinopharm Odczynnik chemiczny80096618Rozpuść w PBS, aby uzyskać 4% paraformaldehydu / PBS.
Roztwór penicyliny i streptomycynyHyCloneSV30010
zestaw do ekstrakcji żelu DNA kolumny SanPrepSangon Biotech (Szanghaj)B518131
SanPrep  Kolumna  plazmid  mini-przygotowania  zestaw Sangon Biotech (Szanghaj)B518191
Ligaza DNA T4TaKaRa2011A
T4TaKaRa2021A
TaKaRa Ex TaqTaKaRaRR001A
Triton X-100Sinopharm Odczynnik chemiczny30188928Rozpuść w PBS, aby otrzymać 0,25% Triton X-100/PBS.
Tween 20Odczynnik chemiczny Sinopharm30189328Rozpuść w PBS, aby przygotować 0,1% Tween 20/PBS.
430166 Wirówka Kinaza polinukleotydowa

Bibliografia

  1. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31 (3), 233-239 (2013).
  2. Bibikova, M., Beumer, K., Trautman, J. K., Carroll, D. Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases. Science. 300 (5620), 764(2003).
  3. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  4. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  5. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333 (6040), 307(2011).
  6. Stoddard, B. L. Homing endonuclease structure and function. Quarterly Reviews of Biophysics. 38 (1), 49-95 (2005).
  7. Pâques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
  8. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  9. Shmakov, S., et al. Discovery and functional characterization of diverse class 2 CRISPR-Cas systems. Molecular Cell. 60 (3), 385-397 (2015).
  10. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  11. Jia, N., Patel, D. J. Structure-based functional mechanisms and biotechnology applications of anti-CRISPR proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (8), 563-579 (2021).
  12. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  13. Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
  14. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  15. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  16. Jackson, S. A., et al. CRISPR-Cas: Adapting to change. Science. 356 (6333), eaal5056(2017).
  17. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  18. Craske, B., Welburn, J. P. I. Leaving no-one behind: how CENP-E facilitates chromosome alignment. Essays in Biochemistry. 64 (2), 313-324 (2020).
  19. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  20. Schaar, B. T., Chan, G. K., Maddox, P., Salmon, E. D., Yen, T. J. CENP-E function at kinetochores is essential for chromosome alignment. Journal of Cell Biology. 139 (6), 1373-1382 (1997).
  21. McEwen, B. F., et al. CENP-E is essential for reliable bioriented spindle attachment, but chromosome alignment can be achieved via redundant mechanisms in mammalian cells. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2776-2789 (2001).
  22. Yao, X., Abrieu, A., Zheng, Y., Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. CENP-E forms a link between attachment of spindle microtubules to kinetochores and the mitotic checkpoint. Nature Cell Biology. 2 (8), 484-491 (2000).
  23. Kim, Y., Heuser, J. E., Waterman, C. M., Cleveland, D. W. CENP-E combines a slow, processive motor and a flexible coiled coil to produce an essential motile kinetochore tether. Journal of Cell Biology. 181 (3), 411-419 (2008).
  24. Qian, X., et al. Discovery of the first potent and selective inhibitor of Centromere-Associated Protein E: GSK923295. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (1), 30-34 (2010).
  25. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  26. Pisa, R., Phua, D. Y. Z., Kapoor, T. M. Distinct mechanisms of resistance to a CENP-E inhibitor emerge in near-haploid and diploid cancer cells. Cell Chemical Biology. 27 (7), 850.e6-857.e6 (2020).
  27. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  28. Weaver, B. A., Silk, A. D., Montagna, C., Verdier-Pinard, P., Cleveland, D. W. Aneuploidy acts both oncogenically and as a tumor suppressor. Cancer Cell. 11 (1), 25-36 (2007).
  29. Silk, A. D., et al. Chromosome missegregation rate predicts whether aneuploidy will promote or suppress tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (44), E4134-E4141 (2013).
  30. Guo, Y., Kim, C., Ahmad, S., Zhang, J., Mao, Y. CENP-E-dependent BubR1 autophosphorylation enhances chromosome alignment and the mitotic checkpoint. Journal of Cell Biology. 198 (2), 205-217 (2012).
  31. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Aneuploidy: instigator and inhibitor of tumorigenesis. Cancer Research. 67 (21), 10103-10105 (2007).
  32. Nishimura, K., Fukagawa, T. An efficient method to generate conditional knockout cell lines for essential genes by combination of auxin-inducible degron tag and CRISPR/Cas9. Chromosome Research. 25 (3-4), 253-260 (2017).
  33. Owa, M., Dynlacht, B. A non-canonical function for Centromere-associated protein-E controls centrosome integrity and orientation of cell division. Communications Biology. 4 (1), 358(2021).
  34. Barabási, A. L., Oltvai, Z. N. Network biology: understanding the cell's functional organization. Nature Reviews Genetics. 5 (2), 101-113 (2004).
  35. Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
  36. Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
  37. El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
  38. Kung, P. P., et al. Chemogenetic evaluation of the mitotic kinesin CENP-E reveals a critical role in triple-negative breast cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 13 (8), 2104-2115 (2014).
  39. Kim, J. H., et al. Development of a novel HAC-based "gain of signal" quantitative assay for measuring chromosome instability (CIN) in cancer cells. Oncotarget. 7 (12), 14841-14856 (2016).
  40. Hirayama, T., et al. Synthetic studies of centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 1. Exploration of fused bicyclic core scaffolds using electrostatic potential map. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (17), 5488-5502 (2013).
  41. Hirayama, T., et al. Synthetic studies on Centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 2. Application of electrostatic potential map (EPM) and structure-based modeling to Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives as anti-tumor agents. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (20), 8036-8053 (2015).
  42. Ohashi, A., et al. A novel time-dependent CENP-E inhibitor with potent antitumor activity. PLoS One. 10 (12), e0144675(2015).
  43. Ohashi, A., et al. Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells. Nature Communications. 6, 7668(2015).
  44. Ding, X., et al. Probing CENP-E function in chromosome dynamics using small molecule inhibitor syntelin. Cell Research. 20 (12), 1386-1389 (2010).
  45. Liu, X., et al. Phase separation drives decision making in cell division. Journal of Biological Chemistry. 295 (39), 13419-13431 (2020).
  46. Henderson, M. C., et al. UA62784, a novel inhibitor of centromere protein E kinesin-like protein. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 36-44 (2009).
  47. Yamane, M., et al. Identification of benzo[d]pyrrolo[2,1-b]thiazole derivatives as CENP-E inhibitors. Biochemical and biophysical research communications. 519 (3), 505-511 (2019).
  48. Lock, R. B., et al. Initial testing of the CENP-E inhibitor GSK923295A by the pediatric preclinical testing program. Pediatric Blood & Cancer. 58 (6), 916-923 (2012).
  49. Chung, V., et al. First-time-in-human study of GSK923295, a novel antimitotic inhibitor of centromere-associated protein E (CENP-E), in patients with refractory cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (3), 733-741 (2012).
  50. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  51. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Decoding the links between mitosis, cancer, and chemotherapy: The mitotic checkpoint, adaptation, and cell death. Cancer Cell. 8 (1), 7-12 (2005).
  52. Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell Death and Differentiation. 19 (3), 369-377 (2012).
  53. Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280(2015).
  54. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592(2015).
  55. Koch, B., et al. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  56. Yan, Q., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure. Scientific Reports. 6, 38970(2016).
  57. Cheng, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated chicken TBK1 gene knockout and its essential role in STING-mediated IFN-β induction in chicken cells. Frontiers in Immunology. 9, 3010(2019).
  58. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
  59. Zeng, W., Guo, L., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  60. Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nature Biotechnology. 33 (2), 187-197 (2015).
  61. Kim, D., et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nature Biotechnology. 34 (8), 863-868 (2016).
  62. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  63. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  64. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  65. Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
  66. Pickar-Oliver, A., Gersbach, C. A. The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (8), 490-507 (2019).
  67. Nalawansha, D. A., Gomes, I. D., Wambua, M. K., Pflum, M. K. H. HDAC inhibitor-induced mitotic arrest is mediated by Eg5/KIF11 acetylation. Cell Chemical Biology. 24 (4), 481.e5-492.e5 (2017).
  68. Kavalapure, R. S., et al. Design, synthesis, and molecular docking study of some 2-((7-chloroquinolin-4-yl) amino) benzohydrazide Schiff bases as potential Eg5 inhibitory agents. Bioorganic Chemistry. 116, 105381(2021).
  69. Calligaris, D., Lafitte, D. Chemical inhibitors: the challenge of finding the right target. Chemistry & Biology. 18 (5), 555-557 (2011).
  70. Łomzik, M., et al. Metal-dependent cytotoxic and kinesin spindle protein inhibitory activity of Ru, Os, Rh, and Ir half-sandwich complexes of Ispinesib-derived ligands. Inorganic Chemistry. 59 (20), 14879-14890 (2020).
  71. Ferro, L. S., et al. Structural and functional insight into regulation of kinesin-1 by microtubule-associated protein MAP7. Science (New York, N.Y.). 375 (6578), 326-331 (2022).
  72. Atherton, J., et al. The mechanism of kinesin inhibition by kinesin-binding protein. eLife. 9, e61481(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

komórki HeLaedycja genówwyrównanie chromosomówprzesiew fenotypowydefekty mitotycznemikroskopia fluorescencyjnaanaliza kariotypuzatrzymanie cyklu komórkowego
Generowanie linii komórkowych nokautujących związanych z centromerem Protein-E CENP-E-/- przy użyciu systemu CRISPR/Cas9
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.