Method Article

Generowanie linii komórkowych nokautujących związanych z centromerem Protein-E CENP-E-/- przy użyciu systemu CRISPR/Cas9

DOI:

10.3791/65476

⸱

June 23rd, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine, Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics, Fujian Medical University, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje budowę komórek nokautujących białko-E związanych z centromerem (CENP-E) przy użyciu systemu CRISPR/Cas9 i trzech strategii przesiewowych opartych na fenotypie. Wykorzystaliśmy linię komórkową z nokautem CENP-E do opracowania nowatorskiego podejścia do walidacji swoistości i toksyczności inhibitorów CENP-E, co jest przydatne przy opracowywaniu leków i badaniach biologicznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 okazał się potężnym narzędziem do precyzyjnej i efektywnej edycji genów w różnych organizmach. Białko E ZWIĄZANE Z CENTROMEREM (CENP-E) jest kinezyną skierowaną na koniec dodatni, wymaganą do wychwytywania mikrotubul kinetochorowych, wyrównania chromosomów i punktu kontrolnego montażu wrzeciona. Chociaż funkcje komórkowe białek CENP-E zostały dobrze zbadane, trudno było badać bezpośrednie funkcje białek CENP-E przy użyciu tradycyjnych protokołów, ponieważ ablacja CENP-E zwykle prowadzi do aktywacji punktu kontrolnego składania wrzeciona, zatrzymania cyklu komórkowego i śmierci komórki. W tym badaniu całkowicie wyeliminowaliśmy gen CENP-E w ludzkich komórkach HeLa i z powodzeniem wygenerowaliśmy komórki CENP-E-/- HeLa za pomocą systemu CRISPR/Cas9.

Ustalono trzy zoptymalizowane strategie przesiewowe oparte na fenotypie, w tym badania przesiewowe kolonii komórkowych, fenotypy dopasowania chromosomów oraz intensywności fluorescencji białek CENP-E, które skutecznie poprawiają skuteczność badań przesiewowych i wskaźnik sukcesu eksperymentalnego komórek nokautujących CENP-E. Co ważne, delecja CENP-E powoduje niewspółosiowość chromosomów, nieprawidłową lokalizację białek mitotycznego punktu kontrolnego BUB1 kinazy serynowo-treoninowej B (BubR1) oraz defekty mitotyczne. Ponadto wykorzystaliśmy model komórki HeLa z nokautem CENP-E do opracowania metody identyfikacji inhibitorów specyficznych dla CENP-E.

W tym badaniu ustalono użyteczne podejście do walidacji specyficzności i toksyczności inhibitorów CENP-E. Ponadto w pracy przedstawiono protokoły edycji genów CENP-E z wykorzystaniem systemu CRISPR/Cas9, który może być potężnym narzędziem do badania mechanizmów CENP-E w podziale komórek. Co więcej, linia komórkowa z nokautem CENP-E przyczyni się do odkrycia i walidacji inhibitorów CENP-E, co ma ważne implikacje dla opracowywania leków przeciwnowotworowych, badań nad mechanizmami podziału komórek w biologii komórki oraz zastosowań klinicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inżynieria edycji genomu pośredniczy w ukierunkowanych modyfikacjach genów w różnych komórkach i organizmach. U eukariontów mutageneza specyficzna dla miejsca może być wprowadzona przez zastosowanie nukleaz specyficznych dla sekwencji, które stymulują homologiczną rekombinację docelowego DNA1. W ostatnich latach pojawiło się kilka technologii edycji genomu, w tym nukleazy palców cynkowych (ZFN)2,3, aktywatory transkrypcji podobne do efektorów nukleazy (TALENs)4,5, oraz homing meganukleazy6,7, zostały zaprojektowane tak, aby rozszczepiać genomy w określonych miejscach, ale podejścia te wymagają złożonej inżynierii białek i zbędnych procedur eksperymentalnych. Badania wykazały, że system prokariotyczny typu II zgrupowany regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR)/Cas jest wydajną technologią edycji genów, która w szczególności pośredniczy w kierowanym przez RNA, specyficznym dla miejsca rozszczepieniu DNA w wielu różnych komórkach i gatunkach8,9,10,11. Technologia nokautu genów CRISPR/Cas9 zrewolucjonizowała dziedziny podstawowej biologii, biotechnologii i medycyny12.

Bakterie i większość archeonów wykształciły adaptacyjny system odpornościowy oparty na RNA, który wykorzystuje białka CRISPR i Cas do identyfikacji i niszczenia wirusów i plazmidów13. Streptococcus pyogenes (paciorkowiec pospolity) Endonukleaza Cas9 (SpCas9) zawiera podobną do RuvC resollawazę połączeniową Hollidaya (RuvC) i domenę His-Asn-His (HNH), które mogą skutecznie pośredniczyć w specyficznych dla sekwencji, dwuniciowych pęknięciach (DSB), dostarczając syntetyczny jednoprowadnicowy RNA (sgRNA) zawierający RNA CRISPR (crRNA) i transaktywujący crRNA (tracrRNA)14,15,16. DSB mogą być naprawiane przez niehomologiczny szlak łączenia końców tworzący indel (NHEJ) lub naprawę kierowaną homologią (HDR), który wprowadza wiele mutacji, w tym insercje, delecje lub substytucje pojedynczych nukleotydów bez blizn, w komórkach ssaków1,8. Zarówno podatny na błędy NHEJ, jak i szlak HDR o wysokiej wierności mogą być używane do pośredniczenia w nokautowaniu genów poprzez insercje lub delecje, co może powodować mutacje z przesunięciem ramki i przedwczesne kodony stop10.

Kinesin-7 CENP-E jest wymagany do przyłączania kinetochoru-mikrotubul i wyrównywania chromosomów podczas podziału komórki17,18,19. Mikroiniekcja przeciwciał20,21, zubożenie siRNA22,23, inhibicja chemiczna24,25,26 i delecja genetyczna27,28,29 CENP-E prowadzi do niewspółosiowości chromosomów, aktywacji punktu kontrolnego składania wrzeciona i defektów mitotycznych, co skutkuje aneuploidią i niestabilnością chromosomów19,30. U myszy delecja CENP-E powoduje nieprawidłowy rozwój i śmiertelność zarodka na bardzo wczesnych etapach rozwoju27,29,31. Genetyczna delecja CENP-E zwykle prowadzi do niewspółosiowości chromosomów i śmierci komórki26,27,29, co stanowi przeszkodę w badaniu funkcji i mechanizmów białek CENP-E.

Niedawne badanie ustaliło warunkową linię komórkową nokautującą CENP-E przy użyciu indukowanej auksyną metody edycji genów CRISPR/Cas932, która umożliwia szybką degradację białek CENP-E w stosunkowo krótkim czasie33. Jednak do tej pory nie ustalono stabilnych linii komórkowych z nokautem CENP-E, co jest nierozwiązanym wyzwaniem technicznym w biologii CENP-E. Biorąc pod uwagę odporność genetyczną34, odpowiedzi kompensacji genetycznej35,36,37, oraz złożone środowiska wewnątrzkomórkowe, ponieważ bezpośrednie konsekwencje całkowitego usunięcia CENP-E mogą być złożone i nieprzewidywalne, ważne jest ustalenie CENP-E Linie komórkowe nokautu do badania mechanizmów wyrównania chromosomów, punktu kontrolnego składania wrzeciona i dalszych szlaków sygnałowych.

Odkrycie i zastosowanie inhibitorów CENP-E są ważne w leczeniu raka. Do tej pory odkryto i zsyntetyzowano siedem typów inhibitorów CENP-E, w tym GSK923295 i jego pochodne24,25, PF-277138,39, imidazo[1,2-a]pochodne rusztowania pirydynowego40,41, compound-A42,43, syntelin44,45, UA6278446 i pochodne benzo[d]pyrrolo[2,1-b]tiazolu47. Wśród tych inhibitorów GSK923295 jest allosterycznym i skutecznym inhibitorem CENP-E, który wiąże się z domeną motoryczną CENP-E i hamuje aktywność ATPazy stymulowanej mikrotubulami CENP-E o Ki wynoszącym 3,2 ± 0,2 nM24,25. Jednak w porównaniu z hamującym działaniem GSK923295 na hodowane komórki nowotworowe, efekty terapeutyczne GSK923295 u pacjentów klinicznych z rakiem nie są idealne48,49, co również wzbudziło obawy co do specyficzności GSK923295 dla CENP-E. Co więcej, specyficzność i skutki uboczne innych inhibitorów CENP-E dla białek CENP-E są kluczowymi kwestiami w badaniach nad rakiem.

W tym badaniu całkowicie wyeliminowaliśmy gen CENP-E w komórkach HeLa za pomocą systemu CRISPR/Cas9. Ustanowiono trzy zoptymalizowane strategie badań przesiewowych opartych na fenotypie, w tym badania przesiewowe kolonii komórkowych, fenotypy dopasowania chromosomów i intensywność fluorescencji białek CENP-E, w celu poprawy skuteczności badań przesiewowych i wskaźnika powodzenia edycji genu CENP-E. Co więcej, linie komórkowe z nokautem CENP-E mogą być wykorzystywane do badania specyficzności związków kandydujących do CENP-E.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa wektorów nokautu genu CRISPR/Cas9

  1. Należy wybrać docelową sekwencję genomowego DNA na ludzkim genie CENP-E (GenBank Accession No. NM_001286734.2) i zaprojektuj sgRNA za pomocą internetowego narzędzia do projektowania CRISPR (http://crispor.tefor.net/).
  2. Wprowadź pojedynczą sekwencję genomową, wybierz genom "Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (zestaw analiz hg38) + polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP): dbSNP148" i wybierz motyw sąsiadujący z protospacerem "20 bp-NGG-spCas9". Wybierz dwie sekwencje prowadzące, w tym sgRNA-1, 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' i sgRNA-2 5'-TTCTTTAGAGACGCGGGCTC-3', zgodnie z wynikami swoistości50, przewidywaną wydajnością10 i minimalnymi niecelami.
  3. Uporządkuj i zsyntetyzuj jednoniciowe oligonukleotydy DNA (ssODN). Rozcieńczyć ssODN w ddH2O do końcowego stężenia 100 μM. Aby fosforylować i wyżarzać oligonukleotydy sgRNA, dodać 1 μl oligonukleotydu do przodu, 1 μl odwróconego oligonukleotydu, 0,5 μl kinazy polinukleotydowej T4, 1 μl buforu kinazy polinukleotydowej T4 i 6,5 μl wody wolnej od RNaz w probówce do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut, 95 °C przez 5 min; następnie obniżyć do 25 °C przy 5 °C min-1.
  4. Trawić plazmid pX458 za pomocą enzymu restrykcyjnego Bbsfigure-protocol-1 enzymu restrykcyjnego. Dodaj 1 μg plazmidu pX458, 2 μl 10x buforu G, 1 μl Bbsfigure-protocol-2, i dodaj wolne od RNaz ddH2O do 20 μL w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Następnie oczyść liniowy plazmid za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu kolumnowego DNA zgodnie z protokołami producenta.
  5. Zligować oligonukleotydy sgRNA do plazmidu pX458 (plazmid pSpCas9(BB)-2A-zielone białko fluorescencyjne (GFP), Addgene ID. 48138). Dodać 1 μl wyżarzonych oligonukleotydów, 25 ng liniowego plazmidu, 1 μl 10x buforu ligacyjnego T4 DNA, 0,5 μl ligazy DNA T4 (350 U/μL) i uzupełnić do 10 μl ddH2O w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Inkubować roztwór do ligacji w temperaturze 16 °C przez 2 godziny.
  6. Inkubować 10 μl zbudowanego plazmidu z właściwymi komórkami DH5α na lodzie przez 30 minut, szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 45 s i natychmiast umieścić je na lodzie na 5 minut. Dodać 500 μl pożywki Luria-Bertani (LB) i wysiać komórki na płytce LB zawierającej ampicylinę (100 μg/ml). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godzin i przesiewać odporne klony.
  7. Wybierz 5-10 pojedynczych kolonii za pomocą wysterylizowanej końcówki pipety i przenieś je do 1 ml kultury pożywki LB z ampicyliną (100 μg/ml). Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C i wytrząsać ją z prędkością 180 obr./min przez 12–16 godzin.
  8. Wyizoluj DNA plazmidu za pomocą zestawu do ekstrakcji plazmidu zgodnie z protokołami producenta. Zwaliduj plazmidowe DNA każdej kolonii przez sekwencjonowanie Sangera z miejsca promotora U6 przy użyciu startera U6-Fwd 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3'.
  9. Ekstrahuj i oczyść plazmidy za pomocą zestawu endo-free plasmidowego DNA zgodnie z protokołami producenta.

2. Transfekcja, izolacja i badanie przesiewowe komórek HeLa z nokautem CENP-E

  1. Hodowla komórek HeLa w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną/streptomycyną w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  2. Inkubować komórki HeLa przy użyciu 0,25% trypsyny/etylenodiaminotetraoctowego kwasu (EDTA) w temperaturze 37 °C przez 2-3 minuty, dysocjować komórki przez delikatne pipetowanie, a następnie umieścić komórki na nowych płytkach w stosunku rozcieńczenia 1:4 w celu przejścia przez komórkę.
  3. Wysiewaj komórki na 12-dołkowej płytce i hoduj do 60-70% zbiegu przed transfekcją. Transfekować plazmidy pX458-sgRNA do komórek HeLa za pomocą odczynników, do których się odnoszą, zgodnie z protokołami producenta (patrz tabela materiałów).
    1. Delikatnie wymieszać 1 μg zwalidowanego plazmidu pX458-sgRNA i 50 μl zredukowanej pożywki surowicy w probówce A. Następnie delikatnie wymieszać 2 μl odczynnika do transfekcji i 50 μl zredukowanej pożywki surowicy w probówce B. Probówki A i B inkubować oddzielnie w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    2. Delikatnie wymieszać probówkę A i probówkę B i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Dodać mieszaninę do płytki 12-dołkowej, inkubować komórki przez 6 godzin i zastąpić pożywkę świeżą pożywką DMEM.
  4. Zbadaj komórki HeLa po 24 godzinach lub 48 godzinach za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego pod kątem skuteczności transfekcji. Po transfekcji przez 48 godzin, całkowicie zdysocjuj transfekowane komórki HeLa za pomocą 0,25% trypsyny/EDTA w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut, policz liczbę komórek za pomocą komory Neubauera lub automatycznego licznika komórek i umieść komórki na trzech oddzielnych 96-dołkowych płytkach dla każdej transfekowanej populacji zgodnie z metodami seryjnego rozcieńczania10.
  5. Umieść komórki z powrotem w nawilżonym inkubatorze, a następnie hoduj je przez kolejne 1-2 tygodnie. Zmieniaj pożywkę hodowlaną raz na 3 dni. W celu przeprowadzenia badań przesiewowych opartych na fenotypie i walidacji nokautu CENP-E, należy zdysocjować i roznręczyć komórki na płytkach 24-dołkowych lub 12-dołkowych przez 5-7 dni.
  6. Przesiewaj zmutowane komórki o mniejszych średnicach kolonii komórek za pomocą odwróconego mikroskopu wyposażonego w soczewki obiektywowe 10x i 20x.
    UWAGA: Mutacje CENP-E zwykle powodują znaczny wzrost liczby dzielących się komórek w koloniach komórkowych, co może być jednym z kluczowych wskaźników przesiewowych komórek zmutowanych CENP-E.
  7. Zbierz komórki do ekstrakcji DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji genomowego DNA zwierzęcego w kolumnie zgodnie z protokołami producenta. Ustaw reakcje PCR w następujący sposób: 0,25 μl polimerazy Taq, 5 μl 10x buforu (Mg2+ plus), 4 μl mieszanin dNTP, 500 ng matrycy DNA, 1 μl oligonugolakotydy do przodu, 1 μl oligonukleotydy odwrotnej i dostosuj ddH2O do 50 μL. Użyj następujących ustawień programu PCR do amplifikacji genu: 98 °C, 10 s; 98 °C, 10 s, 55 °C, 30 s, 72 °C, 60 s przez 33 cykle; 72 °C, 10 min, a następnie utrzymać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Specyficzne startery do klonowania locus docelowego są wymienione w następujący sposób: CENP-E target F1, 5'-GAGGGTCCTGGCCATTTTCCTG-3'; CENP-E cel R1, 5'-AGATCTCCGATCCTCCCCTGTC-3'; CENP-E cel F2, 5'-TGGTAACTGCATTTTGGTGTTCTAC-3'; CENP-E cel R2, 5'-CCTGTTGCAACGTGAGAAG-3'.
  8. Zligować docelowe DNA do wektora pMD18-T zgodnie z protokołami producenta. Transfekować ligowany plazmid do właściwych komórek DH5α i hodowli w celu selekcji klonów.
  9. Wykonaj sekwencjonowanie Sangera, aby określić typy nokautu CENP-E. Wyizoluj DNA plazmidu za pomocą zestawu do ekstrakcji plazmidu zgodnie z protokołami producenta. Przeprowadź sekwencjonowanie Sangera plazmidowego DNA każdej kolonii przy użyciu starterów M13 do przodu i do tyłu. Podkład M13F, 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'; Podkład M13R, 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'.
  10. Wysiewać komórki HeLa typu dzikiego i zmutowane CENP-E odpowiednio na 12-milimetrowych szklanych szkiełkach nakrywkowych na 24-dołkowej płytce. Usuń całe podłoże DMEM i utrwal komórki w 4% roztworze utrwalającym paraformaldehyd/sól fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  11. Wybarwić jądra roztworem 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Przebadać i zwalidować zmutowane komórki CENP-E na podstawie fenotypu wyrównania chromosomów za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw Plan Fluor 40x/ Numerical Aperture (NA) 0,75.
  12. Przeprowadzić badania przesiewowe i walidację komórek nokautujących CENP-E za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i analizy (patrz sekcja 3) białek CENP-E.

3. Barwienie immunofluorescencyjne i mikroskopia konfokalna o wysokiej rozdzielczości

  1. Utrwalić komórki 4% roztworem utrwalającym paraformaldehyd/PBS w temperaturze pokojowej na 10 minut i zanurzyć na 2 x 5 minut w 1x PBS.
    UWAGA: Upewnij się, że komórki są w zdrowym stanie, a komórki są delikatnie zbierane i mocowane, aby uniknąć oderwania komórek metafazy.
  2. Przepuszczać komórki 0,25% Triton X-100/PBS w temperaturze pokojowej przez 10 minut i zanurzać je w 1x PBS na 2 x 5 min.
  3. Zablokować komórki 1% BSA/PBST (0,1% Tween 20 w PBS) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe 1% BSA/PBST i inkubować próbki w temperaturze 4 °C przez 12 godzin.
  4. Odrzucić roztwory przeciwciał pierwszorzędowych, przepłukać komórki 3 x 5 minut 1x PBS i inkubować komórki z rozcieńczonymi przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  5. Odrzuć przeciwciała drugorzędowe i przepłucz komórki w 1x PBS przez 3 x 5 min.
  6. Wybarwić jądra DAPI w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Zamontować szkiełka z medium montażowym. Uszczelnij szkiełka lakierem do paznokci.
  7. Obserwuj i rejestruj obrazy fluorescencyjne za pomocą skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw 63x/NA 1,40.

4. Przygotowanie chromosomów i analiza kariotypu

  1. Hodować komórki typu dzikiego i CENP-E-/- HeLa w kompletnej pożywce DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną/streptomycyną przez 24 godziny, a następnie inkubować komórki typu dzikiego i CENP-E-/- HeLa z kolchicyną 300 nM przez 5 godzin.
  2. Inkubować komórki z 0,25% trypsyną/EDTA w temperaturze 37 °C przez 3 minuty i zebrać komórki do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.
  3. Odwirować komórki w temperaturze 1 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odrzucić supernatanty, dodać 1,2 ml roztworu KCl o stężeniu 0,075 mol/l i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
  4. Odwirować komórki w temperaturze 1 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odrzucić supernatanty, dodać 0,2 ml roztworu utrwalającego (metanol: lodowaty kwas octowy = 3:1) w celu wstępnego utrwalenia i delikatnie mieszać przez 1 minutę.
  5. Odwirować komórki w temperaturze 1 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, zebrać granulki, dodać 1,5 ml roztworu utrwalającego w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie odwirować przy 1000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Odrzucić supernatanty, dodać 0,6 ml roztworów utrwalających i przygotować zawiesinę komórek. Dodaj 3-5 kropli zawiesiny komórkowej z wysokości 35-40 cm na zjeżdżalnie lodowe.
    UWAGA: Wysokość do wypuszczania zawiesin komórek na szkiełka powinna wynosić 35-40 cm; W przeciwnym razie chromosomy mogą być zbyt rozproszone lub nie być oddzielone od siebie.
  7. Szkiełka należy natychmiast osuszyć lampą alkoholową, próbki zabarwić 10% roztworem barwiącym Giemsa przez 7 minut, przepłukać szkiełka bieżącą wodą przez 2 minuty i obserwować próbki za pomocą mikroskopu świetlnego wyposażonego w obiektyw Plan Fluor 40x/NA 0,75.

5. Test tworzenia kolonii komórkowych

  1. Przygotuj zawiesiny komórek na płytkach 6-dołkowych o gęstości komórek 1,000-2,000 komórek/dołek. Delikatnie potrząśnij płytkami, aby równomiernie rozprowadzić komórki.
  2. Umieścić 6-dołkowe płytki w inkubatorze CO2 i inkubować przez 2-3 tygodnie w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Zmieniaj pożywkę hodowlaną raz na 5 dni. Rejestruj obrazy za pomocą odwróconego mikroskopu wyposażonego w soczewki obiektywowe 10x i 20x. Zbierz komórki, gdy widoczne są kolonie (setki komórek w klonie).
  3. Aby zbadać wpływ GSK923295, należy hodować komórki na płytkach 6-dołkowych przez 24 godziny i dodać 2 ml GSK923295 w końcowych stężeniach 10, 25, 50, 100 i 200 nM.
    UWAGA: Nie przesuwaj szalki hodowlanej na wczesnym etapie tworzenia klonów, aby uniknąć zrzucania komórek, które może tworzyć nowe klony i wpływać na badanie przesiewowe transfekowanych komórek.
  4. Wyrzuć pożywkę hodowlaną i utrwal komórki 1% PFA w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Zabarwić kolonie 0,1% roztworem do barwienia fioletu krystalicznego w temperaturze pokojowej przez 15 min. Przepłukać próbki trzykrotnie 1x PBS. Rejestruj obrazy kolonii komórkowych i określ ilościowo średnice każdej kolonii za pomocą oprogramowania ImageJ. Wybierz narzędzie Zaznaczanie linii prostej, kliknij przycisk Analizuj, wybierz opcję Zmierz i zapisz długość.
  5. Przepłukać kolonie 1 ml 10% roztworu kwasu octowego przez 5 minut. Przenieść 200 μl roztworów supernatantu na 96-dołkową płytkę i zmierzyć wartości absorbancji za pomocą spektrofotometru mikropłytki przy A600 nm.

6. Test żywotności komórek

  1. Zasiać komórki na płytkach 24-dołkowych i hodować komórki przez 48 godzin do gęstości 80-90%.
  2. Inkubować komórki ze 100 μl 0,25% trypsyny/EDTA w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.
  3. Wymieszaj 400 μl PBS z komórkami za pomocą pistoletu do pipet. Przenieść 100 μl zawiesin komórek do płytki 96-dołkowej.
  4. Dodać 20 μl roztworu MTS do każdej studzienki o końcowym stężeniu 317 μg/ml i delikatnie wymieszać zgodnie z protokołami producenta. Próbki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 1–3 godziny w inkubatorze z użyciem CO2 .
  5. Zapisać wartości absorbancji każdej studzienki przy piku absorbancji A490 nm za pomocą spektrofotometru z mikropłytkami. Użyj referencyjnej długości fali A630 nm, aby odjąć tło wnoszone przez szczątki komórek i niespecyficzną absorbancję (żywotność komórki = A490nm- A630 nm).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki CENP-E-/- HeLa zostały pomyślnie wygenerowane przy użyciu systemu CRISPR/Cas9 (Rysunek 1). Oś czasu i krytyczne etapy eksperymentalne tej metody są pokazane w Rysunek 1. Najpierw zaprojektowaliśmy i zsyntetyzowaliśmy sgRNA specyficzne dla CENP-E, wyżarzaliśmy i ligalizowaliśmy sgRNA do plazmidu pX458, transfekowaliśmy plazmid do komórek HeLa i hodowaliśmy je przez 48 godzin. Transfekowane komórki zostały zdysocjowane i wysiane na 96-do...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kinesin-7 CENP-E jest kluczowym regulatorem w wyrównaniu chromosomów i punkcie kontrolnym składania wrzeciona podczas podziału komórki 17,19,20. Genetyczna delecja CENP-E zwykle powoduje aktywację punktu kontrolnego montażu wrzeciona, zatrzymanie cyklu komórkowego i śmierć komórki 27,29,51,52. Tak więc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy wszystkim członkom Laboratorium Cytoszkieletu na Uniwersytecie Medycznym Fujian za pomocne dyskusje. Dziękujemy Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin i Min-Xia Wu z Publicznego Centrum Obsługi Technologii Uniwersytetu Medycznego Fujian za ich pomoc techniczną. Dziękujemy Si-Yi Zheng, Ying Lin i Qi Ke z Eksperymentalnego Centrum Nauczania Podstawowych Nauk Medycznych na Uniwersytecie Medycznym Fujian za ich wsparcie. Badanie to było wspierane przez następujące granty: Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych Chin (numer grantu 82001608 i 82101678), Fundacja Nauk Przyrodniczych prowincji Fujian w Chinach (numer grantu 2019J05071), Wspólne Fundusze na rzecz Innowacji w Nauce i Technologii w prowincji Fujian w Chinach (numer grantu 2021Y9160) oraz projekt finansowania start-upów w zakresie talentów naukowych Uniwersytetu Medycznego Fujian (numer grantu XRCZX2017025).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,25% Trypsyna-EDTAGibco25200056
1,5 ml probówka wirówkowaAxygenMCT-150-C
24-dołkowa płytkaCorning3524
4S Gelred, 10 000x w wodzieSangon Biotech (Szanghaj)A616697
50 ml probówka wirówkowaCorning430828
6 cm szalka PetriegoCorning
95% etanolOdczynnik chemiczny Sinopharm10009164
96-dołkowa płytkaCorning3599
Kwas octowyOdczynnik chemiczny Sinopharm10000218Rozpuść w H2O, aby przygotować 10% roztwór roboczy.
AgaroseSangon Biotech (Szanghaj A620014
Alexa Fluor 488 znakowana kozią anty-mysią IgG (H + L)BeyotimeA0428Do immunofluorescencji. Rozpuścić w 1% BSA/PBST. Rozcieńczenie 1:500.
Alexa Fluor 488 znakowany kozią anty-króliczą IgG (H + L)BeyotimeA0423Do immunofluorescencji. Rozpuścić w 1% BSA/PBST. Rozcieńczenie 1:500.
Alexa Fluor 555 znakowany Donkey Anti-Mouse IgG (H + L)BeyotimeA0460Do immunofluorescencji. Rozpuścić w 1% BSA/PBST. Rozcieńczenie 1:500.
Bezwodny etanolSinopharm Odczynnik chemiczny100092690
Przeciwciało monoklonalne królika anty-BubR1Abcamab254326Do immunofluorescencji. Rozpuścić w 1% BSA/PBST. Rozcieńczenie 1:100 
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-CENP-BSanta Cruz Biotechnologysc-376392Do immunofluorescencji. Rozpuścić w 1% BSA/PBST. Rozcieńczenie 1:50.
Przeciwciało monoklonalne królika anty-CENP-EAbcamab133583Do immunofluorescencji. Rozpuścić w 1% BSA/PBST. Rozcieńczenie 1:100.
Medium do montażu zapobiegającego blaknięciuBeyotimeP0131Spowolnienie wygaszania sygnałów fluorescencyjnych.
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-&alfa;-tubulinyAbcamab7291Do immunofluorescencji. Rozpuścić w 1% BSA/PBST. Rozcieńczenie 1:100.
Spektrofotometr mikropłytkowy Biotek EpochBiotek Instruments BiotekEpoch
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Odczynnik chemiczny Sinopharm69003435
BpiI (BbsI)Thermo Fisher ScientificER1011
CellTiter 96 wodny test proliferacji komórek w jednym roztworzePromegaG3580
Eppendorf5424BK745380
Odczynnik chemiczny ColchicineSinopharm61001563
Konfokalny mikroskop skaningowyLeicaLeica TCS SP8
Szkiełko nakrywkoweCITOTEST80344-1220
DAPIBeyotimeC1006
DH5α kompetentne komórkiSangon Biotech (Szanghaj)B528413
Marker DNA DL2000TaKaRa3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)GibcoC11995500BT
Endo-free plasmid mini kit figure-materials-1OmegaD6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification KitSangon Biotech (Shanghai)B518251
Surowica bydlęcapłodu Zhejiang Tianhang Biotechnology11011-8611
Odczynnik chemiczny Sinopharmfiolet goryczkowy71019944Rozpuść w PBS, aby przygotować 0,1% fioletu goryczkowego/PBS.
Roztwór do barwienia GiemsaOdczynnik chemiczny Sinopharm71020260
oprogramowanie GraphPad Prism w wersji 8.0GraphPadwww.graphpad.comAnaliza statystyczna.
GSK923295MedChemExpressHY-10299
Linia komórkowa HeLaATCCCCL-2
Nawilżany inkubatorHeal ForceHF90 / HF240
Image J oprogramowanieNational Institutes of Healthhttps://imagej.nih.gov/ij/Przetwarzanie i analiza obrazu.
Mikroskop odwróconyNanjing Jiangnan Novel OpticsXD-202
LB proszek agarowySangon Biotech (Szanghaj)A507003
Odczynnik do transfekcji Lipo6000BeyotimeC0526
Mikroskop Nikon Ti-S2NikonTi-S2
Opti-MEM  Obniżony  serum  mediumGibco31985070
ParaformaldehydeSinopharm Odczynnik chemiczny80096618Rozpuść w PBS, aby uzyskać 4% paraformaldehydu / PBS.
Roztwór penicyliny i streptomycynyHyCloneSV30010
zestaw do ekstrakcji żelu DNA kolumny SanPrepSangon Biotech (Szanghaj)B518131
SanPrep  Kolumna  plazmid  mini-przygotowania  zestaw Sangon Biotech (Szanghaj)B518191
Ligaza DNA T4TaKaRa2011A
T4TaKaRa2021A
TaKaRa Ex TaqTaKaRaRR001A
Triton X-100Sinopharm Odczynnik chemiczny30188928Rozpuść w PBS, aby otrzymać 0,25% Triton X-100/PBS.
Tween 20Odczynnik chemiczny Sinopharm30189328Rozpuść w PBS, aby przygotować 0,1% Tween 20/PBS.
430166 Wirówka Kinaza polinukleotydowa

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31 (3), 233-239 (2013).
  2. Bibikova, M., Beumer, K., Trautman, J. K., Carroll, D. Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases. Science. 300 (5620), 764(2003).
  3. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  4. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  5. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333 (6040), 307(2011).
  6. Stoddard, B. L. Homing endonuclease structure and function. Quarterly Reviews of Biophysics. 38 (1), 49-95 (2005).
  7. Pâques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
  8. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  9. Shmakov, S., et al. Discovery and functional characterization of diverse class 2 CRISPR-Cas systems. Molecular Cell. 60 (3), 385-397 (2015).
  10. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  11. Jia, N., Patel, D. J. Structure-based functional mechanisms and biotechnology applications of anti-CRISPR proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (8), 563-579 (2021).
  12. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  13. Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
  14. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  15. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  16. Jackson, S. A., et al. CRISPR-Cas: Adapting to change. Science. 356 (6333), eaal5056(2017).
  17. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  18. Craske, B., Welburn, J. P. I. Leaving no-one behind: how CENP-E facilitates chromosome alignment. Essays in Biochemistry. 64 (2), 313-324 (2020).
  19. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  20. Schaar, B. T., Chan, G. K., Maddox, P., Salmon, E. D., Yen, T. J. CENP-E function at kinetochores is essential for chromosome alignment. Journal of Cell Biology. 139 (6), 1373-1382 (1997).
  21. McEwen, B. F., et al. CENP-E is essential for reliable bioriented spindle attachment, but chromosome alignment can be achieved via redundant mechanisms in mammalian cells. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2776-2789 (2001).
  22. Yao, X., Abrieu, A., Zheng, Y., Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. CENP-E forms a link between attachment of spindle microtubules to kinetochores and the mitotic checkpoint. Nature Cell Biology. 2 (8), 484-491 (2000).
  23. Kim, Y., Heuser, J. E., Waterman, C. M., Cleveland, D. W. CENP-E combines a slow, processive motor and a flexible coiled coil to produce an essential motile kinetochore tether. Journal of Cell Biology. 181 (3), 411-419 (2008).
  24. Qian, X., et al. Discovery of the first potent and selective inhibitor of Centromere-Associated Protein E: GSK923295. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (1), 30-34 (2010).
  25. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  26. Pisa, R., Phua, D. Y. Z., Kapoor, T. M. Distinct mechanisms of resistance to a CENP-E inhibitor emerge in near-haploid and diploid cancer cells. Cell Chemical Biology. 27 (7), 850.e6-857.e6 (2020).
  27. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  28. Weaver, B. A., Silk, A. D., Montagna, C., Verdier-Pinard, P., Cleveland, D. W. Aneuploidy acts both oncogenically and as a tumor suppressor. Cancer Cell. 11 (1), 25-36 (2007).
  29. Silk, A. D., et al. Chromosome missegregation rate predicts whether aneuploidy will promote or suppress tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (44), E4134-E4141 (2013).
  30. Guo, Y., Kim, C., Ahmad, S., Zhang, J., Mao, Y. CENP-E-dependent BubR1 autophosphorylation enhances chromosome alignment and the mitotic checkpoint. Journal of Cell Biology. 198 (2), 205-217 (2012).
  31. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Aneuploidy: instigator and inhibitor of tumorigenesis. Cancer Research. 67 (21), 10103-10105 (2007).
  32. Nishimura, K., Fukagawa, T. An efficient method to generate conditional knockout cell lines for essential genes by combination of auxin-inducible degron tag and CRISPR/Cas9. Chromosome Research. 25 (3-4), 253-260 (2017).
  33. Owa, M., Dynlacht, B. A non-canonical function for Centromere-associated protein-E controls centrosome integrity and orientation of cell division. Communications Biology. 4 (1), 358(2021).
  34. Barabási, A. L., Oltvai, Z. N. Network biology: understanding the cell's functional organization. Nature Reviews Genetics. 5 (2), 101-113 (2004).
  35. Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
  36. Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
  37. El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
  38. Kung, P. P., et al. Chemogenetic evaluation of the mitotic kinesin CENP-E reveals a critical role in triple-negative breast cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 13 (8), 2104-2115 (2014).
  39. Kim, J. H., et al. Development of a novel HAC-based "gain of signal" quantitative assay for measuring chromosome instability (CIN) in cancer cells. Oncotarget. 7 (12), 14841-14856 (2016).
  40. Hirayama, T., et al. Synthetic studies of centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 1. Exploration of fused bicyclic core scaffolds using electrostatic potential map. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (17), 5488-5502 (2013).
  41. Hirayama, T., et al. Synthetic studies on Centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 2. Application of electrostatic potential map (EPM) and structure-based modeling to Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives as anti-tumor agents. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (20), 8036-8053 (2015).
  42. Ohashi, A., et al. A novel time-dependent CENP-E inhibitor with potent antitumor activity. PLoS One. 10 (12), e0144675(2015).
  43. Ohashi, A., et al. Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells. Nature Communications. 6, 7668(2015).
  44. Ding, X., et al. Probing CENP-E function in chromosome dynamics using small molecule inhibitor syntelin. Cell Research. 20 (12), 1386-1389 (2010).
  45. Liu, X., et al. Phase separation drives decision making in cell division. Journal of Biological Chemistry. 295 (39), 13419-13431 (2020).
  46. Henderson, M. C., et al. UA62784, a novel inhibitor of centromere protein E kinesin-like protein. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 36-44 (2009).
  47. Yamane, M., et al. Identification of benzo[d]pyrrolo[2,1-b]thiazole derivatives as CENP-E inhibitors. Biochemical and biophysical research communications. 519 (3), 505-511 (2019).
  48. Lock, R. B., et al. Initial testing of the CENP-E inhibitor GSK923295A by the pediatric preclinical testing program. Pediatric Blood & Cancer. 58 (6), 916-923 (2012).
  49. Chung, V., et al. First-time-in-human study of GSK923295, a novel antimitotic inhibitor of centromere-associated protein E (CENP-E), in patients with refractory cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (3), 733-741 (2012).
  50. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  51. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Decoding the links between mitosis, cancer, and chemotherapy: The mitotic checkpoint, adaptation, and cell death. Cancer Cell. 8 (1), 7-12 (2005).
  52. Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell Death and Differentiation. 19 (3), 369-377 (2012).
  53. Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280(2015).
  54. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592(2015).
  55. Koch, B., et al. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  56. Yan, Q., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure. Scientific Reports. 6, 38970(2016).
  57. Cheng, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated chicken TBK1 gene knockout and its essential role in STING-mediated IFN-β induction in chicken cells. Frontiers in Immunology. 9, 3010(2019).
  58. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
  59. Zeng, W., Guo, L., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  60. Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nature Biotechnology. 33 (2), 187-197 (2015).
  61. Kim, D., et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nature Biotechnology. 34 (8), 863-868 (2016).
  62. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  63. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  64. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  65. Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
  66. Pickar-Oliver, A., Gersbach, C. A. The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (8), 490-507 (2019).
  67. Nalawansha, D. A., Gomes, I. D., Wambua, M. K., Pflum, M. K. H. HDAC inhibitor-induced mitotic arrest is mediated by Eg5/KIF11 acetylation. Cell Chemical Biology. 24 (4), 481.e5-492.e5 (2017).
  68. Kavalapure, R. S., et al. Design, synthesis, and molecular docking study of some 2-((7-chloroquinolin-4-yl) amino) benzohydrazide Schiff bases as potential Eg5 inhibitory agents. Bioorganic Chemistry. 116, 105381(2021).
  69. Calligaris, D., Lafitte, D. Chemical inhibitors: the challenge of finding the right target. Chemistry & Biology. 18 (5), 555-557 (2011).
  70. Łomzik, M., et al. Metal-dependent cytotoxic and kinesin spindle protein inhibitory activity of Ru, Os, Rh, and Ir half-sandwich complexes of Ispinesib-derived ligands. Inorganic Chemistry. 59 (20), 14879-14890 (2020).
  71. Ferro, L. S., et al. Structural and functional insight into regulation of kinesin-1 by microtubule-associated protein MAP7. Science (New York, N.Y.). 375 (6578), 326-331 (2022).
  72. Atherton, J., et al. The mechanism of kinesin inhibition by kinesin-binding protein. eLife. 9, e61481(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CENP E KnockoutCRISPR Cas9HeLa CellsGene EditingChromosome AlignmentPhenotype ScreeningMitotic DefectsFluorescence MicroscopyKaryotype AnalysisCell Cycle Arrest

Related Articles