Artykuł metodologiczny

Wywoływanie ciąży rzekomej u samic myszy bez konieczności wazektomii samców przed niechirurgicznym transferem zarodków lub sztucznym zapłodnieniem

8.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65477

⸱

7 lipca 2023

 , 
1ParaTechs Corporation

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiona metoda manipulacji szyjką macicy może wywołać pseudociążę u myszy bez potrzeby rozmnażania samic z samcami po wazektomii. Indukcja ciąży rzekomej jest niezbędna do powodzenia niechirurgicznego transferu zarodków i niechirurgicznego sztucznego zapłodnienia, które również zostały przedstawione.

Streszczenie

Aby pomyślnie utrzymać ciążę za pomocą transferu zarodków lub sztucznego zapłodnienia, samice myszy biorców muszą zostać wprowadzone w stan pseudociąży. Samice myszy są tradycyjnie łączone w pary przez noc z samcami po wazektomii, a następnego ranka ocenia się obecność korka kopulacyjnego. Aby zwiększyć wydajność produkcji samic w ciąży rzekomej, ustandaryzowano technikę manipulacji szyjki macicy, która może być stosowana w połączeniu z niechirurgicznym transferem zarodków lub technikami sztucznego zapłodnienia u myszy. koniec małego plastikowego pręta jest wkładany dopochwowo, aby zetknąć się z szyjką macicy i jest wibrowany przez 30 sekund przez kontakt z trymerem. Zabieg jest szybki i nie wymaga znieczulenia ani znieczulenia. Technika ta zwiększa niezawodność i przewidywalność produkcji samic w ciąży rzekomej i całkowicie eliminuje konieczność przeprowadzania wazektomii samców. W przypadku myszy z CD1 skuteczność indukcji pseudociąży przy użyciu manipulacji szyjki macicy wynosiła 83% dla samic w rui (N = 76), ale tylko 38% samic w rui zostało zatkanych przez samce po wazektomii (N = 24). Sztuczne zapłodnienie u myszy CD1 przeprowadzono poprzez synchronizację rui z hormonami, manipulację szyjki macicy i transfer plemników do macicy. Biorcy sztucznego zapłodnienia poddawani manipulacji szyjki macicy (N = 76) mieli wskaźnik ciąż wynoszący 72% i średnią wielkość miotu 8,3 młodego. Metoda ta może być również stosowana do produkcji samic w ciąży rzekomej do niechirurgicznego transferu zarodków. Dlatego wywołanie ciąży rzekomej poprzez manipulację szyjki macicy jest wygodną i skuteczną alternatywą dla krycia z samcem po wazektomii podczas wykonywania niechirurgicznych technik wspomaganego rozrodu. Stosowanie manipulacji szyjki macicy zapewnia korzyści 3R (wymiana, redukcja i udoskonalenie) dla technik wspomaganego rozrodu poprzez zmniejszenie liczby wymaganych zwierząt i wyeliminowanie konieczności chirurgicznie zmienionych samców.

Wprowadzenie

Technologie wspomaganego rozrodu są wykorzystywane do produkcji genetycznie modyfikowanych modeli myszy, jak również do odzyskiwania szczepów z krioprezerwacji, wyprowadzania szczepów z pogorszonego stanu zdrowia oraz strategicznego zarządzania wiwariami, w tym do produkcji kohort dopasowanych do wieku. Wszystkie techniki wspomaganego rozrodu u myszy wymagają wykorzystania do rozwoju zarodka biorczyń pseudociężarnych. Historycznie rzecz biorąc, biorczycy w ciąży rzekomej byli generowani przez kojarzenie ze sterylnymi samcami, które są albo chirurgicznie wazektomizowane, albo genetycznie bezpłodne, a obecność czopa kopulacyjnego jest oceniana następnego ranka1. Ostatnio opracowano protokół stymulacji dźwiękowej u myszy do chirurgicznego transferu zarodków myszy projądrowych lub dwukomórkowych myszy2. Opracowaliśmy również protokół manipulacji szyjki macicy (CM) do stosowania ze sztucznym zapłodnieniem i niechirurgicznym transferem zarodków blastocyst. Uzasadnieniem dla zastosowania tej procedury jest zapewnienie zmniejszenia o 3R wymaganej liczby zwierząt (nie wymaga już samców myszy) oraz udoskonalenie stosowanych technik (brak konieczności przeprowadzania zabiegu wazektomii chirurgicznej u samców myszy). Opis tego protokołu obejmuje powiązaną technikę wspomaganego rozrodu, która ma pomóc w integracji CM z normalnym przepływem pracy. Ogólnym celem metody CM jest zastąpienie wykorzystywania samców myszy w generowaniu samic w ciąży rzekomej do technik wspomaganego rozrodu, w tym sztucznego zapłodnienia i transferu zarodków.

Opisany tutaj protokół CM został po raz pierwszy opracowany w celu wspomagania sztucznego zapłodnienia u myszy. Protokół sztucznego zapłodnienia, zgodnie z pierwotnym opisem, osiągnął wskaźnik ciąż na poziomie 50%, przy średniej wielkości miotu 7 szczeniąt3. Myszy biorcy CD1 były zsynchronizowane rujowo z niską dawką hormonów, w tym gonadotropiną surowicy ciężarnej klaczy (PMSG) i ludzką gonadotropiną kosmówkową (hCG), w odstępie 47 godzin przed inseminacją. Zaletą synchronizacji rujowej było to, że pozwalała na korzystanie z protokołu w normalnych godzinach pracy. Samice łączono z samcami poddanymi wazektomii natychmiast po sztucznym zapłodnieniu, a krycie potwierdzono obecnością korka kopulacyjnego. Niezgodność we wskaźniku krycia z biorcami została zgłoszona jako trudność w procedurze. W związku z tym poszukiwano alternatyw dla krycia w celu indukcji ciąży rzekomej.

Niniejsze badanie przedstawia ustandaryzowaną technikę CM w celu zwiększenia efektywności produkcji samic w ciąży rzekomej. W przypadku samic w rui lub proestrusie koniec małego plastikowego pręta jest wkładany dopochwowo, aby zetknąć się z szyjką macicy i jest wibrowany przez 30 sekund przez kontakt z trymerem. Zabieg wykonywany jest na klatce z drutu. Nie jest wymagane znieczulenie ani analgezja. Technika CM jest wygodna do produkcji samic w ciąży rzekomej, które mogą produkować mioty po niechirurgicznym sztucznym zapłodnieniu bez konieczności krycia samcami po wazektomii. CM może być również stosowany do produkcji samic w ciąży rzekomej jako biorców transferu zarodków. W szczególności technikę CM można połączyć z niechirurgicznym transferem zarodków, jak opisano tutaj. Wykazano, że metody niechirurgiczne są skuteczne w transferze zarodków w stadium blastocysty u myszy4,5i rats6,7. Ponieważ ta niechirurgiczna metoda jest skuteczną alternatywą dla metod chirurgicznych, uważa się ją za udoskonalenie techniki 3R. Opierając się na wcześniejszych badaniach, poziom kortykosteronu w kale, jako miara stresu, wskazuje, że niechirurgiczny charakter zabiegu nie zwiększa poziomu stresu u gryzoni7,8. Zabiegi te są mniej trudne technicznie niż chirurgiczny transfer zarodków i są znacznie szybsze do wykonania. Ponieważ zarodki są przenoszone do macicy, zarodki w stadium prawidłowym dla rozwoju macicy muszą zostać przeniesione. W przypadku myszy blastocysty są przenoszone do biorczyń w ciąży rzekomej 2,5 dnia po stosunku (dpc).

Dla dwóch opisanych tutaj technik niechirurgicznych, czas podawania hormonu i technika CM różnią się. Czas wykonania CM w odniesieniu do rui jest ważny dla sukcesu, ponieważ zastępuje on naturalne krycie w celu produkcji biorców w ciąży rzekomej. Eliminując potrzebę samców poddanych wazektomii w celu wywołania ciąży rzekomej, procedura ta zapewnia korzyści 3R, zarówno zmniejszając liczbę wymaganych zwierząt, jak i eliminując konieczność chirurgicznie zmienionych samców. Sam zabieg jest szybki (30 s) i nie wymaga znieczulenia ani znieczulenia. Technika ta znacznie zwiększa niezawodność i przewidywalność produkcji samic w ciąży rzekomej do wspomaganego rozrodu.

Protokół

Przestrzegano wszystkich obowiązujących międzynarodowych, krajowych i instytucjonalnych wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami i ich wykorzystywania. Wszystkie procedury przeprowadzone w badaniach z udziałem zwierząt były zgodne ze standardami etycznymi Komitetu ds. Opieki i Wykorzystywania Zwierząt (IACUC) ParaTechs Corporation i zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami określonymi przez Biuro ds. Dobrostanu Zwierząt Laboratoryjnych (OLAW) Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH), Służby Zdrowia Publicznego oraz Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej Stanów Zjednoczonych. W niniejszym badaniu wykorzystano samce i samice myszy CD1(ICR) oraz samice myszy C57Bl/6J w wieku >8 tygodni. Zwierzęta pozyskano z komercyjnych źródeł (patrz Tabela materiałów).

1. Procedura manipulacji szyjnej do zastosowania przy sztucznej zapłodnieniu myszy CD1

  1. Synchronizacja owulacji u samic myszy w dniu 1. i dniu 3.
    1. W dniu 1., 0,5 h przed rozpoczęciem ciemnego cyklu w wiwariacie, wstrzyknąć samicom drogą doszpaniową (IP) 2,5 IU PMSG (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Każdy samiec-dawca zapewni wystarczającą ilość plemników dla 10 samic-odbiorców.
    2. W dniu 3., 1 h przed rozpoczęciem ciemnego cyklu w wiwariacie, wstrzyknąć samicom drogą IP 2,5 IU hCG (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Wzajemne dopasowanie czasu wstrzyknięć, transferu plemników i cyklu świetlnego jest bardzo istotne. Czas określony dla wszystkich procedur w tym protokole opiera się na 12-godzinnym cyklu światło/ciemność.
  2. Pozyskiwanie i kapacytacja świeżych plemników w dniu 4.
    1. Przygotować kroplę 500 µL podłoża do preinkubacji plemników (PM, patrz Tabela materiałów) w 60-mm naczyniu do hodowli tkankowej pod warstwą oleju parafinowego. Przygotować jedno naczynie na każdego samca-dawcy. Równoważyć przez co najmniej 30 min w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przed pobraniem plemników.
    2. 1 h po rozpoczęciu jasnego cyklu w wiwariacie, uśmiercić samca/samców zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Każdy samiec zapewni wystarczającą ilość plemników dla 10 sztucznych zapłodnień.
    3. Szybko wypreparować ogony naczyń przypawstkowych (cauda epididymidis) z myszy. Wykonać poprzeczne cięcie brzuszne powyżej pęcherza za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety z ząbkami.
      1. Tłuszczowe poduszeczki jajnikowe znajdują się po obu stronach pęcherza. Chwycić jedną z poduszeczek pęsetą zakrzywioną i wyjąć jądro oraz naczynie przypawstkowe z jamy ciała. Zidentyfikować ogon naczynia przypawstkowego jako płaską, owalną strukturę rurkowatą znajdującą się tuż poniżej jądra.
      2. Przytrzymać ogon naczynia przypawstkowego pęsetą zakrzywioną i wyciąć za pomocą małych nożyczek kanciastych. Usunąć oba ogony naczyń przypawstkowych i przenieść je na chłonny papier tkankowy w celu usunięcia tłuszczu i krwi pod mikroskopem stereoskopowym.
    4. Umieścić dwa ogony naczyń przypawstkowych w każdej kropli 500 µL zrównoważonego PM pod warstwą oleju parafinowego w 37 ˚C. Rozciąć tkankę, wykonując sześć nacięć małymi nożyczkami. Jeśli użyto więcej niż jednego samca-dawcy, do każdej próbki plemników należy użyć jednego naczynia przypawstkowego od każdego dawcy, aby zmniejszyć zmienność między próbkami.
    5. Delikatnie zakręcić naczyniem i pozwolić plemnikom wydostać się z tkanki przez 3 min, zakręcając raz na minutę. Usunąć wszystkie resztki tkanek.
    6. Inkubować próbkę plemników przez 45 min do 1 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu przeprowadzenia kapacytacji.
    7. Opcjonalnie: Zmierzyć liczbę plemników i ocenić ich ruchliwość pod mikroskopem przy użyciu komory licznej (hemocytometru). Do liczenia rozcieńczyć plemniki w PM w razie potrzeby.
  3. Potwierdzenie synchronizacji cyklu rujowego poprzez ocenę cytologiczną
    1. Za pomocą małego, uprzednio nawilżonego tamponu (patrz Tabela materiałów), delikatnie pobrać komórki pochwy ze ścianki pochwy, tocząc tampon o tkankę, a następnie rozmazać je w kropli 20 µL sterylnej wody na szkiełku mikroskopowym i wysuszyć na powietrzu.
    2. Pod mikroskopem przy powiększeniu 100x z oświetleniem w polu jasnym ocenić obecność zrogowaciałych komórek nabłonkowych. Samice w rui lub późnym proestrusie będą wykazywać obecność zrogowaciałych komórek nabłonkowych i powinny zostać wybrane do manipulacji szyjnej.
    3. Opcjonalnie: Zarejestrować masę ciał samic-odbiorców przed zapłodnieniem.
  4. Wykonanie manipulacji szyjnej (CM)
    1. Około 0,5 h przed zapłodnieniem umieścić samicę-odbiorcę na górze klatki z drucianą kratką, umożliwiając myszy „chwycenie” powierzchni prętów klatki. Chwycić u nasady ogona kciukiem i palcem wskazującym, kierując ogon ku górze przy jednoczesnej stabilizacji zwierzęcia (Rysunek 1).
      UWAGA: Przy prawidłowej technice trzymania mysz pozostanie nieruchoma przez cały czas trwania procedury. Jeśli mysz zmieni pozycję, delikatnie ją skorygować i kontynuować. Jeśli jako odbiorca wybrana zostanie agresywna mysz, pozwolenie jej na wejście do tunelu wzbogacającego podczas procedury może działać uspokajająco. Użycie tunelu jest opcjonalne, ale może pomóc badaczom w opanowaniu zwierząt, stanowiąc rozproszenie uwagi podczas tej procedury.
    2. Wprowadzić tępym końcem małego plastikowego pręta (patrz Tabela materiałów) do pochwy aż do kontaktu z szyjką macicy i wibrować przez 30 s za pomocą trymera (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Umieścić pręt w pozycji przed uruchomieniem trymera. Oba elementy trzyma się w jednej ręce podczas procedury. Znieczulenie lub analgezja nie są wymagane.
  5. Niechirurgiczny transfer plemników do sztucznego zapłodnienia
    1. Umieścić urządzenie do zapłodnienia (patrz Tabela materiałów) na pipecie P200 ustawionej na 40 µL i zdjąć osłonę ochronną.
    2. Pobrać alikwot kapacytowanej próbki plemników z naczynia w 37 °C i 5% CO2 i przenieść go do 35-mm naczynia do hodowli tkankowej bez oleju w 37 °C. Próbka plemników zostanie użyta do transferu natychmiast.
      UWAGA: Plemniki szybko tracą ruchliwość poza inkubatorem CO2. Próbkę kapacytowanych plemników należy w miarę możliwości utrzymywać w 37 °C i 5% CO2.
    3. Wcisnąć tłok pipety do pierwszego stopnia, obniżyć końcówkę cewnika do próbki plemników w 37 °C i powoli pobrać plemniki do urządzenia transferowego. Unikać powstawania grudek. Usunąć resztki oleju z zewnętrznej powierzchni urządzenia do zapłodnienia za pomocą chłonnego papieru tkankowego. Odłożyć pipetę.
      UWAGA: Należy unikać przeniesienia oleju parafinowego do rogu macicy. Usunąć resztki oleju z zewnętrznej powierzchni urządzenia do zapłodnienia za pomocą chłonnego papieru tkankowego.
    4. Umieścić samicę-odbiorcę na drucianej kratce klatki. Utrzymać mysz w pozycji, stosując tę samą technikę trzymania, która była użyta podczas CM; chwycić u nasady ogona kciukiem i palcem wskazującym, kierując ogon ku górze przy jednoczesnej stabilizacji zwierzęcia.
    5. Wprowadzić małe wziernik (patrz Tabela materiałów) do pochwy.
    6. Wprowadzić cewnik urządzenia do zapłodnienia przez wziernik, przez szyjkę macicy do macicy. Gdy piasta urządzenia zetknie się ze wziernikiem, podać plemniki, wciskając tłok pipety do pierwszego stopnia. Unikać wprowadzenia dodatkowego powietrza do rogu macicy.
      UWAGA: Jeśli cewnik nie zostanie ustawiony prawidłowo, uderzy w tkankę otaczającą szyjkę macicy, powodując jego ugięcie, a ostatecznie zgięcie. Jeśli cewnik nie prześlizgnie się przez szyjkę macicy przy pierwszej próbie, delikatnie go wycofać i ponowić próbę aż do sukcesu. Konieczna może być zmiana pozycji wziernika.
    7. Wyjąć urządzenie i wziernik. Po procedurze nie jest wymagany monitoring.
  6. Opcjonalnie: Sprawdzenie ciąży w dniach 10–12
    1. Wykorzystać przyrost masy ciała do określenia stanu ciąży. Przyrost masy będzie zależał od szczepu, jednak zwiększenie masy o co najmniej 1-2 g koreluje z ciążą.

Protokół obchodzenia się z myszami, dłonie w rękawiczkach, technika unieruchamiania gryzoni do procedury badawczej.
Rycina 1: Technika trzymania myszy do manipulacji szyjką macicy. Mysz spoczywa na górze klatki drucianej i jest stabilizowana za ogon oraz po obu stronach z przodu tylnych kończyn. Tępy koniec małego plastikowego pręta jest wprowadzany dopochwowo w celu kontaktu z szyjką macicy i poddawany wibracjom poprzez kontakt z trymerem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Procedura niechirurgicznego transferu zarodków z zastosowaniem manipulacji szyjką macicy u myszy CD1

  1. Synchronizacja owulacji u samic myszy w dniu 1. i dniu 3.
    1. W dniu 1., około 6 h po rozpoczęciu cyklu świetlnego w wiwarium, wstrzyknąć samicom 2,5 IU PMSG drogą dosytrojną (IP).
    2. W dniu 3., w odstępie 47 h po wstrzyknięciu PMSG lub około 5 h po rozpoczęciu cyklu świetlnego w wiwarium, wstrzyknąć samicom 2,5 IU hCG drogą dosytrojną (IP).
  2. Potwierdzenie synchronizacji cyklu rujowego poprzez ocenę cytologiczną
    1. W dniu 3., około 1 h przed CM, przeprowadzić badanie cytologiczne potencjalnych biorczyń. Używając małego, uprzednio nawilżonego wymazu, delikatnie pobrać komórki z błony śluzowej pochwy, tocząc wymaz o tkankę, a następnie rozmazać je w 20 µL kropli sterylnej wody na szkiełku przedmiotowym i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
    2. Pod mikroskopem przy powiększeniu 100x i oświetleniu w polu jasnym ocenić obecność zrogowaciałych komórek nabłonka. Samice w rui lub późnym proestrusie będą wykazywać obecność zrogowaciałych komórek nabłonka i powinny zostać wybrane do manipulacji szyjką macicy.
    3. Opcjonalnie: zapisać masę ciała potencjalnych biorczyń embrionów.
  3. Wykonanie CM
    1. W dniu 3., 1 h przed rozpoczęciem cyklu ciemnego w wiwarium, umieścić samicę biorczynię na górze klatki z drucianą kratką, pozwalając zwierzęciu „uchwycić się” powierzchni prętów klatki. Chwycić u nasady ogona palcem wskazującym i kciukiem, a następnie skierować ogon ku górze, stabilizując zwierzę (Rycina 1).
      UWAGA: Jeśli technika trzymania jest wykonana prawidłowo, mysz pozostanie w bezruchu przez cały czas trwania procedury. Jeśli mysz zmieni pozycję, należy ją delikatnie skorygować i kontynuować. W przypadku wybrania zwierzęcia agresywnego jako biorczyni, uspokajającym rozwiązaniem może być pozwolenie zwierzęciu na wejście do tunelu wzbogacającego podczas procedury.
    2. Wprowadzić tępym końcem małego plastikowego pręta do pochwy, tak aby dotknął szyjki macicy, i wibrować nim przez 30 s za pomocą trymera.
      UWAGA: Przed uruchomieniem trymera należy umieścić pręt w odpowiedniej pozycji. Oba elementy trzyma się w jednej dłoni podczas procedury. Znieczulenie lub analgesja nie są wymagane.
  4. Bezinwazyjny transfer embrionów w dniu 6.
    1. Nanieść 20 µL kroplę pożywki M2 (patrz Tabela materiałów) na pokrywkę szalki do hodowli tkankowej.
      UWAGA: Wybrano pokrywkę, ponieważ ma ona niższy rant i jest zatem wygodniejsza do pobierania embrionów z kropli. Nigdy nie należy nakładać warstwy oleju parafinowego na kroplę M2, ponieważ wprowadzenie oleju do rogu macicy wydaje się negatywnie wpływać na transfer embrionów.
    2. Pod mikroskopem, przy użyciu oświetlenia refleksyjnego, przenieść 10-20 blastocyst do kropli pożywki za pomocą standardowej pipety do manipulacji embrionami (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Optymalna liczba transferowanych embrionów zależy od szczepu myszy oraz ewentualnych manipulacji, jakim poddano embriony. W przypadku zdrowych, niemanipulowanych embrionów wystarczający powinien być transfer 10-15 embrionów. W przypadku rederywacji lub embrionów zmodyfikowanych genetycznie odpowiedni jest transfer większej liczby embrionów.
    3. Zamocować urządzenie do bezinwazyjnego transferu embrionów (patrz Tabela materiałów) na pipecie P2 ustawionej na 1,8 µL. Zdjąć ochronną osłonkę cewnika.
    4. Wcisnąć tłok pipety do pierwszego stopnia, zanurzyć końcówkę cewnika w pożywce i powoli wessać embriony do końcówki cewnika urządzenia. Wyjąć końcówkę z pożywki.
      UWAGA: Wizualizacja embrionów przy małym powiększeniu ułatwi ich załadowanie do urządzenia. Jeśli embriony są rozproszone w kropli, należy delikatnie potrząsnąć szalką z boku na bok, aby skoncentrować embriony w centrum kropli, lub zmienić ich położenie za pomocą pipety do manipulacji embrionami.
    5. Ustawić objętość pipety na 2,0 µL, aby wytworzyć mały pęcherzyk powietrza na końcówce cewnika. Delikatnie odłożyć załadowaną pipetę z embrionami obok klatki myszy.
    6. Umieścić samicę biorczynię na drucianej kratce klatki. Utrzymać mysz w pozycji, stosując tę samą technikę trzymania, która była używana podczas CM; chwycić u nasady ogona palcem wskazującym i kciukiem, a następnie skierować ogon ku górze, stabilizując zwierzę.
    7. Wprowadzić małe wziernik (patrz Tabela materiałów) do pochwy.
    8. Wprowadzić cewnik urządzenia transferowego przez wziernik, przez szyjkę macicy i do macicy. Gdy nasada urządzenia dotknie wziernika, podać embriony, wciskając tłok pipety do pierwszego stopnia. Należy unikać wprowadzenia nadmiaru powietrza do rogu macicy.
    9. Wyjąć urządzenie i wziernik, nie zwalniając tłoka pipety. Monitorowanie po procedurze nie jest wymagane.

Wyniki

Ponieważ stymulacja elektryczna9 i dźwiękowa10 szyjki macicy była wykorzystywana do indukowania pseudociąży u szczurów, niniejsza praca przedstawia znormalizowaną procedurę mechaniczną, którą można zastosować u myszy. Cytologia pochwy może pomóc w identyfikacji samic w różnych fazach cyklu rujowego. Tę samą metodę zastosowano w celu potwierdzenia pseudociąży u samic. Najpierw porównano profile cytologiczne samic myszy szczepów CD1 i C57Bl/6 w trakcie cykli rujowych, podczas ciąży oraz podczas pseudociąży indukowanej przez kopulację lub CM. Od samic pobrano wymazy z pochwy i zabarwiono je przy użyciu systemu barwienia Papanicolaou (patrz Tabela materiałów). Komórki obserwowano pod powiększeniem 100x przy użyciu oświetlenia w polu jasnym. Zaobserwowane komórki obejmowały leukocyty, jądrowe komórki nabłonka oraz bezjądrowe zrogowaciałe komórki nabłonka. Określenie fazy cyklu rujowego oparto na względnym procencie każdego typu komórek11,12. Dla estrusu charakterystyczna jest przewaga zrogowaciałych komórek nabłonka. Wraz z końcem estrusu rozpoczyna się metestrus, w którym zaczynają pojawiać się leukocyty, a zrogowaciałe komórki nabłonka stają się mniej widoczne. Diestrus charakteryzuje się umiarkowaną lub niską komórkowością, z przewagą leukocytów i pojawianiem się jądrowych komórek nabłonka. Proestrus wyróżnia się zanikiem leukocytów, wzrostem liczby jądrowych komórek nabłonka oraz pojawieniem się zrogowaciałych komórek nabłonka. Po proestrusie rozpoczyna się estrus i cykl trwa nadal.

Aby opracować profil bazowy, przed kopulacją rejestrowano cytologię pochwy przez co najmniej dwa pełne cykle rujowe u każdej samicy (N = 20 dla CD1, N = 20 dla C57Bl/6). Długość cykli i profile indywidualne różniły się między myszami; zaobserwowano jednak oczekiwane trendy ogólne. Średnia długość cyklu rujowego dla myszy CD1 i C57Bl/6 wynosiła 3,8 dnia, w zakresie od 3 do 5 dni. Dzień przed naturalną kopulacją wszystkie samice myszy znajdowały się w fazie proestrusu. Po kopulacji cytologię wykonano ponownie 1,5 dnia po zapłodnieniu (dpc), aż do momentu wznowienia cykli rujowych. Rysunek 2 przedstawia profil cytologiczny pseudociążnych samic CD1 i C57Bl/6 kopulujących z samcami poddanymi wazektomii.

Wykres słupkowy porównujący procentowy udział typów komórek w szczepach CD1 i C57BL/6 w zależności od przedziałów DPC.
Rysunek 2: Profil cytologiczny pseudociążnych myszy żeńskich. Przedstawiono średnie wartości procentowe poszczególnych typów komórek dla leukocytów, jądrzastych komórek nabłonkowych i zrogowaciałych komórek nabłonkowych w funkcji dni po kopulacji (DPC) dla myszy (A) CD1 (N = 20) oraz (B) C57Bl/6 (N = 20). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

W niniejszej pracy ustandaryzowano technikę CM w celu zwiększenia efektywności uzyskiwania samic w stanie pseudociąży. U samic w rui lub proestrusie tępy koniec małego plastikowego pręta jest wprowadzany dopochwowo w celu kontaktu z szyjką macicy i poddawany wibracjom przez 30 s poprzez kontakt z trymerem. Procedura jest wykonywana w klatce z drucianym wierzchem. Znieczulenie lub analgesja nie są wymagane. Aby określić skuteczność procedury CM, porównano cytologię pochwy u samic myszy CD1 (N = 20) i C57Bl/6 (N = 20) po kopulacji z samcami po wazektomii oraz po zastosowaniu CM (łącznie N = 40). Profil cytologiczny pseudociąży wywołanej przez CM był podobny do profilu pseudociąży wywołanej kopulacją, co przedstawiono na Rysunku 3.

Wykres procentowego udziału typów komórek; porównanie leukocytów, komórek nabłonkowych i zrogowaciałych w przypadku kopulacji i manipulacji.
Rycina 3: Profil cytologiczny u pseudociężarnych myszy samic po manipulacji szyjki macicy (CM). Przedstawiono procentowy udział poszczególnych typów komórek – leukocytów, jądrowych komórek nabłonkowych i zrogowaciałych komórek nabłonkowych – w zależności od liczby dni po kopulacji (DPC) lub liczby dni po manipulacji szyjki macicy (DPCM). Średnie wartości procentowe typów komórek pokazano dla myszy CD1 i C57Bl/6 (N = 40) po kopulacji (A) z samcami po wazektomii lub po CM (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Aby ustalić, czy technika CM jest wystarczająca do wywołania ciąży w celu zapłodnienia wspomaganego, CM przeprowadzono jako część protokołu niechirurgicznej inseminacji sztucznej (NSAI) u samic CD1. Protokół inseminacji sztucznej obejmował synchronizację rui samic za pomocą niskich dawek hormonów PMSG i hCG przed transferem plemników. CM wykonano bezpośrednio przed transferem plemników. W przypadku myszy CD1 efektywność indukcji pseudociąży z użyciem CM u samic w rui (N = 76) przy zastosowaniu tej techniki wyniosła 83%. W eksperymencie kontrolnym tylko 38% samic w rui zostało zakopulowane z samcami po wazektomii (N = 24). Odbiorcy inseminacji sztucznej, u których zastosowano manipulację szyjną (N = 76), wykazali 72% wskaźnik ciąż i średnią wielkość miotu wynoszącą 8,3 młodych. Zatem indukcja pseudociąży za pomocą CM jest wygodną i efektywną alternatywą dla kojarzenia z samcem po wazektomii podczas wykonywania NSAI. Zastosowanie CM w celu przygotowania odbiorców CD1 (N = 4) w rui do niechirurgicznego transferu świeżych blastocyst CD1 zaowocowało 100% wskaźnikiem ciąż. Transfer 9-15 embrionów przyniósł trzy zdrowe mioty przy 45% wskaźniku urodzeń i średniej wielkości miotu wynoszącej 6 młodych. Dla porównania, odbiorcy CD1 (N = 20), które zostały zakopulowane z samcami po wazektomii w celu indukcji pseudociąży, wykazały 80% wskaźnik ciąż i 46% wskaźnik urodzeń po transferze 20 świeżych blastocyst B6C3F2.

Wyniki technik wspomaganego rozrodu będą prawdopodobnie specyficzne dla danej linii, ponieważ stwierdzono, że zmienne takie jak dawka i czas podania hormonów w celu superowulacji są zależne od linii13. Ponadto czynniki takie jak wiek i masa ciała biorcy mogą wpływać na reakcję na hormony14. W niniejszej pracy, podczas przeprowadzania procedury CM w celu sztucznego zapłodnienia, stwierdzono, że reakcję wykazywały jedynie samice w późnej fazie proestrusu lub w estrusie. Ogólnie, aby zwiększyć liczbę dostępnych biorców w populacji, samice poddaje się najpierw synchronizacji estrusu za pomocą niskiej dawki hormonów3. Synchronizacja estrusu z zastosowaniem 2,5 IU PMSG i hCG była skuteczna w 78% dla samic CD1 w wieku 11-14 tygodni (N = 27) oraz w 60% dla samic C57Bl/6 w wieku 18-32 tygodni (N = 22) w niniejszej pracy. Efektywność indukcji pseudociąży przy użyciu manipulacji szyjnej u samic CD1 w estrusie wyniosła 83% (N = 76), a dla samic C57Bl/6 w estrusie przy zastosowaniu tej techniki wyniosła 82% (N = 100).

Dyskusja

Zasada 3R to ramy etyczne dla wykorzystywania zwierząt w badaniach, opisane w 1959 roku przez Russela i Burcha w "The Principles of Humane Experimental Technique". Zasada 3R oznacza zastąpienie, redukcję i udoskonalenie w wykorzystaniu zwierząt. Wyróżnione tutaj protokoły są zgodne z zasadą 3R. Technika manipulacji szyjki macicy zmniejsza liczbę potrzebnych zwierząt, ponieważ nie wymaga już wykorzystywania samców do produkcji samic w ciąży rzekomej. Technika ta eliminuje również potrzebę wykonywania wazektomii u mężczyzn, zapewniając w ten sposób wyrafinowanie poprzez zmniejszenie bólu i stresu. Opisane tutaj techniki wspomaganego rozrodu (sztuczne zapłodnienie i transfer zarodków) są niechirurgiczne, a zatem obie zapewniają udoskonalenie 3R poprzez zmniejszenie bólu i stresu8spowodowanych ich chirurgicznymi alternatywami.

Wykorzystanie samic w rzekomej ciąży jest konieczne do odzyskania szczeniąt podczas wykonywania wspomaganego rozrodu u myszy1. Procedura CM jest skuteczną metodą wytwarzania samic w ciąży rzekomej, ale synchronizacja fazy cyklu rujowego samic biorczyni jest krytycznym pierwszym krokiem w tym procesie. Synchronizacja rui może drastycznie zmniejszyć liczbę samic potrzebnych w kolonii do przygotowania potencjalnych biorców i pomaga w produkcji samic w ciąży rzekomej na żądanie. Stosowanie niskiej dawki hormonów nie wydaje się powodować żadnych szkodliwych skutków dla powrotu do zdrowia żywych miotów u myszy CD1. Należy zachować ostrożność w przypadku innych szczepów, aby znaleźć kombinację hormonów i stężeń, która daje najlepszej jakości samice biorców dla przenoszonych zarodków lub nasienia. Synchronizację można osiągnąć za pomocą PMSG i hCG16, ale dawki, które powodują superowulację samic, mogą nie być odpowiednie dla utrzymującej się ciąży17.

Aby ustalić, czy samica jest w rui, w tej pracy przeprowadzono ocenę cytologiczną. Fazę rujową można również ocenić na podstawie obserwacji ujścia pochwy11,18. Chociaż metoda ta jest niezwykle pomocna i może być stosowana samodzielnie lub jako potwierdzenie, jest bardziej subiektywna niż stosowanie cytologii. Cytologia pochwy bez barwienia jest zarówno szybka, jak i skuteczna w wyborze samic w rui, ponieważ zrogowaciałe komórki nabłonkowe można łatwo zidentyfikować. W tym protokole ocena cytologiczna jest wykonywana przed CM w celu określenia potencjalnych biorców. Ważne jest, aby wykonać cytologię przed CM, ponieważ zabieg ma tendencję do fragmentacji komórek złuszczonych z obszaru pochwy, co utrudnia identyfikację. Ocenę cytologiczną w kierunku ciąży rzekomej lub ciąży można przeprowadzić po 3,5-11,5 dniu po CM (dpcm) przez 3 kolejne dni. Profil samicy rujowej na rowerze powinien mieć co najmniej 1 dzień ze znacznym naciekiem zrogowaciałych komórek nabłonka. Samice w ciąży rzekomej/ciężarnej powinny wykazywać profil diestrus (głównie leukocyty z potencjalnie niską liczbą komórek) przez 3 kolejne dni.

Dzięki opracowaniu techniki CM stwierdzono, że niektóre myszy są bardziej otwarte na procedurę niż inne. Samice myszy CD1 są doskonałymi kandydatami ze względu na ich spokojną naturę i doskonałe instynkty opiekuńcze. Odmiana ta jest łatwa w obsłudze i dobrze radzi sobie podczas CM i niechirurgicznych technik wspomaganego rozrodu. Myszy C57Bl/6 są zwykle bardziej agresywne i mniej opiekuńcze. Chociaż protokół ten skutecznie wyprodukował samice C57Bl/6 w ciąży rzekomej przy użyciu CM, były one mniej skłonne do konsekwentnego tolerowania procedury. Wydawało się, że koreluje to nieco z fazą rujową podczas CM. Samice w rui lub proestrus były bardziej otwarte. Użycie rurki wzbogacającej, aby zwierzę mogło wejść, umożliwiło dostęp do pochwy na czas zabiegu i pomogło uspokoić samicę. Sam zabieg nie krępuje w pełni samicy, więc zwierzę może się wycofać w dowolnym momencie. W takim przypadku zwierzę można zmienić pozycję, a następnie kontynuować procedurę. Czas zabiegu zatrzymuje się, jeśli samica odejdzie i wznawia się, gdy procedura zostanie wznowiona. Decydujące znaczenie dla powodzenia zabiegu ma faza cyklu rujowego (późna ruja i ruja) oraz kontakt pręcika z szyjką macicy. Wibracje trymera zapewniają ustandaryzowany CM. Aby zapewnić kontakt z szyjką macicy, na pręt wywierany jest delikatny nacisk, a ustawienie pręta względem szyjki macicy jest zapewnione dzięki niewielkim ruchom pręta w przód iw tył.

Zastosowanie CM poprawiło protokół NSAI, ponieważ samice w prawidłowej fazie cyklu rujowego mogą być wybrane przed transferem plemników, a protokół nie jest już uzależniony od krycia z samcami po wazektomii. Synchronizacja cyklu rujowego sztucznego zapłodnienia jest zaplanowana w taki sposób, aby dojrzewanie oocytów odpowiadało transferowi plemników rano w 4. dniu. Kluczowe znaczenie dla powodzenia protokołu ma dostosowanie czasu owulacji w taki sposób, aby mogło dojść do zapłodnienia. Należy zachować ostrożność, aby podać hCG 15-17 godzin przed spodziewanym transferem plemników, zgodnie z zaleceniami dotyczącymi czasu zapłodnienia in vitro 1. Jakość próbki nasienia będzie miała bezpośredni wpływ na wynik sztucznego zapłodnienia. Świeże plemniki, które zostały zpojemnościowe, będą działać najlepiej. Kriokonserwowane plemniki dobrej jakości mogą produkować zapłodnione zarodki in vivo. Należy jednak zachować ostrożność przy bezpośrednim przenoszeniu rozmrożonych plemników, ponieważ resztki krioprotektantów przeniesione do rogu macicy mogą hamować zagnieżdżenie się (obserwacje niepublikowane).

Stosowanie CM w połączeniu z transferem zarodków jest koncepcyjnie łatwą adaptacją. Synchronizacja cyklu rujowego zmniejsza liczbę samic niezbędnych do wytworzenia puli biorców. Określenie stadium rujowego przed CM zwiększa prawdopodobieństwo uzyskania biorczyń w ciąży rzekomej. Jedną z wad tej metody jest to, że cytologia biorców w momencie transferu zarodków jest w fazie zmian. Wszystkie typy komórek są obecne, jeśli samica przechodzi z profilu rui do profilu pseudociąży, a ciąża rzekoma staje się oczywista tylko wtedy, gdy cytologia jest śledzona przez kilka dni. Opierając się na powodzeniu (>80%) przejścia od rui do pseudociąży u myszy CD1 i C57Bl/6, oczekuje się, że metoda ta będzie odpowiednia dla biorców transferu zarodków. Wstępne wyniki wskazują na dobry sukces przy ograniczonym niechirurgicznym transferze zarodków. Ogólnie rzecz biorąc, skuteczność niechirurgicznego transferu zarodków jest porównywalna z wydajnością techniki chirurgicznej 4,5, a transfer niechirurgiczny może zastąpić chirurgiczny transfer zarodków w stadium blastocysty. W przypadku zarodków we wcześniejszym stadium wymagana jest hodowla zarodków do stadium blastocysty. Jeśli jednak preferowany jest transfer chirurgiczny, możliwe jest dostosowanie techniki CM do właściwego czasu potrzebnego dla odpowiednich biorczyń ciąży rzekomej2. Ogólnie rzecz biorąc, biorcy zarodków są o 1 dzień mniej zaawansowani niż zarodek. Na przykład blastocysty są zbierane w dawcach 3,5 dpc od dawców i przenoszone do biorców 2,5 dpc. W związku z tym CM będzie musiało być wykonane w taki sposób, aby biorczyni była w słabiej rozwiniętym stanie ciąży rzekomej niż zarodki.

Podsumowując, przedstawiona tutaj technika CM jest bardzo obiecująca pod względem integracji z innymi technikami wspomaganego rozrodu u myszy. Dostarczyliśmy skuteczne protokoły sztucznego zapłodnienia i transferu zarodków przy użyciu technik niechirurgicznych. W połączeniu, technika CM zapewnia korzyści 3R, w tym (1) zmniejszenie liczby zwierząt poprzez wyeliminowanie potrzeby samców poddanych wazektomii oraz (2) udoskonalenie technik poprzez zastąpienie technik chirurgicznych alternatywami niechirurgicznymi.

Oświadczenia

Barbara Stone i Sarah Śródulski są zatrudnione w ParaTechs Corporation, Lexington, KY, USA. ParaTechs posiada wyłączne prawa licencyjne do produkcji urządzenia mNSET dla myszy. Firma ParaTechs Corp opracowała i sprzedaje urządzenia mNSET i mC&I, które mogą być używane odpowiednio do niechirurgicznego transferu zarodków i niechirurgicznego sztucznego zapłodnienia.

Podziękowania

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez Biuro Dyrektora, Biuro Programów Infrastruktury Badawczej, Narodowych Instytutów Zdrowia pod numerem Nagrody R43OD020304 oraz Narodowy Instytut Zdrowia Psychicznego Narodowych Instytutów Zdrowia pod Nagrodą Numer R44MH122117. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
w stadium blastocysty
KARTA Pożywka preinkubacyjna Fertiup (PM)CosmoBioKYD-002-EXDo kapacytacji plemników
Pipeta do obsługi zarodkówCook MedicalK-FPIP-1120-10BSFlexipet jest dostępna w różnych średnicach
Zespół pipet do obsługi zarodkówParatechs90010
Samice myszy, Crl: CD1 (ICR)Charles River Laboratories22>8 tygodni
KleszczeFine Science Tools11053-10Ząbkowane, do preparowania
KleszczeFine Science Tools11052-10Zakrzywione, do preparacji
KleszczeFine Science ToolsDumont #5Fine, do rozwarstwienia
HemocytometrFisher Scientific267110Opcjonalnie
ludzka gonadotropina kosmówkowa (hCG)Prospechor-250Do inkubatora synchronizacji rui
, 37 & deg; C 5% CO2Thermo Inkubator Naukowy
, 37 stopni; C, stacjonarnyCookK-MINC-1000
KimwipesKimberly-Clark34155Tkanki chłonne
M2 mediumMilliporeMR-015-DPożywka do obsługi zarodków
Samce myszy, Crl:CD1(ICR)Charles River Laboratories22>8 tygodni
mC& I urządzenieParaTechs60020Do transferu nasienia, wzierniki w zestawie
pręt mCMParaTechs90050Gładki,, o średnicy @3 mm
MikroskopOlympusSZX7Powiększenie 20x i 40x z przechodzącym i odbitym źródłem oświetlenia do pracy i rozwarstwiania zarodków
MikroskopACCU-SCOPE3032100-krotne powiększenie z jasnym oświetleniem pola
Szkiełka mikroskopoweFisher Scientific12-544-7
Urządzenie mNSETParaTechs60010Do transferu zarodków, wzierniki w zestawie
Igły, 26 GExel26402
System barwienia PapanicolaouVWR76265-730
Opcjonalny olej parafinowySigma-Aldrich18512
Pipeta, P200Corning4074pasuje do C& I urządzenie do transferu nasienia
Pipeta, PR-2Rainin17008648Pasuje do urządzenia NSET do transferu zarodków
Gonadotropina surowicy klaczy w ciąży (PMSG)Prospechor-272Do synchronizacji rui
SkalaAmerykańskie wagiLB-1000
NożyczkiNarzędzia do14068-12
Nożyczki Science Tools14081-09do rozwarstwiania
, ConstixContecSC-4Do cytologii pochwy
Strzykawki, 1 ccBecton Dickenson and Company309659
Naczynia do hodowli tkankowych, 35 mmFalcon353001
Naczynia do hodowli tkankowych, 60 mmFalcon353004
trymerWahlChroMini Klatka
Zarodki nauki preparacyjne Kątowe waciki na mysz z drutu T-Cut

Bibliografia

  1. Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, fourth edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2014).
  2. Wake, Y., et al. Successful induction of pseudopregnancy using sonic vibration in mice. Scientific Reports. 13 (1), 3604(2023).
  3. Stone, B. J., Steele, K. H., Fath-Goodin, A. A rapid and effective nonsurgical artificial insemination protocol using the NSET device for sperm transfer in mice without anesthesia. Transgenic Research. 24 (4), 775-781 (2015).
  4. Green, M., Bass, S., Spear, B. A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. BioTechniques. 47 (5), 919-924 (2009).
  5. Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).
  6. Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro. Theriogenology. 151, 81-85 (2020).
  7. Stone, B. J., et al. A nonsurgical embryo transfer technique for fresh and cultured blastocysts in rats. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (5), 488-495 (2020).
  8. Steele, K. H., et al. Nonsurgical embryo transfer device compared with surgery for embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (1), 17-21 (2013).
  9. Terkel, J., Witcher, J. A., Adler, N. T. Evidence for "memory" of cervical stimulation for the promotion of pregnancy in rats. Hormones and Behavior. 24 (1), 40-49 (1990).
  10. Kaneko, T., Endo, M., Tsunoda, S., Nakagawa, Y., Abe, H. Simple induction of pseudopregnancy by artificial stimulation using a sonic vibration in rats. Scientific Reports. 10 (1), 2729(2020).
  11. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538(2012).
  12. Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: Review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
  13. Luo, C., et al. Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (4), 471-478 (2011).
  14. Gates, A. H. Viability and developmental capacity of eggs from immature mice treated with gonadotrophins. Nature. 177 (4512), 754-755 (1956).
  15. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen & Co., Ltd. London, UK. (1959).
  16. Hasegawa, A., et al. Efficient and scheduled production of pseudopregnant female mice for embryo transfer by estrous cycle synchronization. Journal of Reproduction and Development. 63 (6), 539-545 (2017).
  17. Beaumont, H. M., Smith, A. F. Embryonic mortality during the pre- and post-implantation periods of pregnancy in mature mice after superovulation. Journal of Reproduction and Fertility. 45 (3), 437-448 (1975).
  18. Champlin, A. K., Dorr, D. L., Gates, A. H. Determining the stage of the estrous cycle in the mouse by the appearance of the vagina. Biology of Reproduction. 8 (4), 491-494 (1973).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Manipulacja szyjk macicyindukcja pseudoci ywspomagana prokreacjasynchronizacja ruitransfer nasieniapost powanie z embrionamizasady 3R w badaniach na zwierz tach
Wywoływanie ciąży rzekomej u samic myszy bez konieczności wazektomii samców przed niechirurgicznym transferem zarodków lub sztucznym zapłodnieniem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.