Artykuł metodologiczny

Wywoływanie ciąży rzekomej u samic myszy bez konieczności wazektomii samców przed niechirurgicznym transferem zarodków lub sztucznym zapłodnieniem

DOI:

10.3791/65477

⸱

7 lipca 2023

 , 
1ParaTechs Corporation

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona metoda manipulacji szyjką macicy może wywołać pseudociążę u myszy bez potrzeby rozmnażania samic z samcami po wazektomii. Indukcja ciąży rzekomej jest niezbędna do powodzenia niechirurgicznego transferu zarodków i niechirurgicznego sztucznego zapłodnienia, które również zostały przedstawione.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby pomyślnie utrzymać ciążę za pomocą transferu zarodków lub sztucznego zapłodnienia, samice myszy biorców muszą zostać wprowadzone w stan pseudociąży. Samice myszy są tradycyjnie łączone w pary przez noc z samcami po wazektomii, a następnego ranka ocenia się obecność korka kopulacyjnego. Aby zwiększyć wydajność produkcji samic w ciąży rzekomej, ustandaryzowano technikę manipulacji szyjki macicy, która może być stosowana w połączeniu z niechirurgicznym transferem zarodków lub technikami sztucznego zapłodnienia u myszy. koniec małego plastikowego pręta jest wkładany dopochwowo, aby zetknąć się z szyjką macicy i jest wibrowany przez 30 sekund przez kontakt z trymerem. Zabieg jest szybki i nie wymaga znieczulenia ani znieczulenia. Technika ta zwiększa niezawodność i przewidywalność produkcji samic w ciąży rzekomej i całkowicie eliminuje konieczność przeprowadzania wazektomii samców. W przypadku myszy z CD1 skuteczność indukcji pseudociąży przy użyciu manipulacji szyjki macicy wynosiła 83% dla samic w rui (N = 76), ale tylko 38% samic w rui zostało zatkanych przez samce po wazektomii (N = 24). Sztuczne zapłodnienie u myszy CD1 przeprowadzono poprzez synchronizację rui z hormonami, manipulację szyjki macicy i transfer plemników do macicy. Biorcy sztucznego zapłodnienia poddawani manipulacji szyjki macicy (N = 76) mieli wskaźnik ciąż wynoszący 72% i średnią wielkość miotu 8,3 młodego. Metoda ta może być również stosowana do produkcji samic w ciąży rzekomej do niechirurgicznego transferu zarodków. Dlatego wywołanie ciąży rzekomej poprzez manipulację szyjki macicy jest wygodną i skuteczną alternatywą dla krycia z samcem po wazektomii podczas wykonywania niechirurgicznych technik wspomaganego rozrodu. Stosowanie manipulacji szyjki macicy zapewnia korzyści 3R (wymiana, redukcja i udoskonalenie) dla technik wspomaganego rozrodu poprzez zmniejszenie liczby wymaganych zwierząt i wyeliminowanie konieczności chirurgicznie zmienionych samców.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologie wspomaganego rozrodu są wykorzystywane do produkcji genetycznie modyfikowanych modeli myszy, jak również do odzyskiwania szczepów z krioprezerwacji, wyprowadzania szczepów z pogorszonego stanu zdrowia oraz strategicznego zarządzania wiwariami, w tym do produkcji kohort dopasowanych do wieku. Wszystkie techniki wspomaganego rozrodu u myszy wymagają wykorzystania do rozwoju zarodka biorczyń pseudociężarnych. Historycznie rzecz biorąc, biorczycy w ciąży rzekomej byli generowani przez kojarzenie ze sterylnymi samcami, które są albo chirurgicznie wazektomizowane, albo genetycznie bezpłodne, a obecność czopa kopulacyjnego jest oceniana następnego ranka1. Ostatnio opracowano protokół stymulacji dźwiękowej u myszy do chirurgicznego transferu zarodków myszy projądrowych lub dwukomórkowych myszy2. Opracowaliśmy również protokół manipulacji szyjki macicy (CM) do stosowania ze sztucznym zapłodnieniem i niechirurgicznym transferem zarodków blastocyst. Uzasadnieniem dla zastosowania tej procedury jest zapewnienie zmniejszenia o 3R wymaganej liczby zwierząt (nie wymaga już samców myszy) oraz udoskonalenie stosowanych technik (brak konieczności przeprowadzania zabiegu wazektomii chirurgicznej u samców myszy). Opis tego protokołu obejmuje powiązaną technikę wspomaganego rozrodu, która ma pomóc w integracji CM z normalnym przepływem pracy. Ogólnym celem metody CM jest zastąpienie wykorzystywania samców myszy w generowaniu samic w ciąży rzekomej do technik wspomaganego rozrodu, w tym sztucznego zapłodnienia i transferu zarodków.

Opisany tutaj protokół CM został po raz pierwszy opracowany w celu wspomagania sztucznego zapłodnienia u myszy. Protokół sztucznego zapłodnienia, zgodnie z pierwotnym opisem, osiągnął wskaźnik ciąż na poziomie 50%, przy średniej wielkości miotu 7 szczeniąt3. Myszy biorcy CD1 były zsynchronizowane rujowo z niską dawką hormonów, w tym gonadotropiną surowicy ciężarnej klaczy (PMSG) i ludzką gonadotropiną kosmówkową (hCG), w odstępie 47 godzin przed inseminacją. Zaletą synchronizacji rujowej było to, że pozwalała na korzystanie z protokołu w normalnych godzinach pracy. Samice łączono z samcami poddanymi wazektomii natychmiast po sztucznym zapłodnieniu, a krycie potwierdzono obecnością korka kopulacyjnego. Niezgodność we wskaźniku krycia z biorcami została zgłoszona jako trudność w procedurze. W związku z tym poszukiwano alternatyw dla krycia w celu indukcji ciąży rzekomej.

Niniejsze badanie przedstawia ustandaryzowaną technikę CM w celu zwiększenia efektywności produkcji samic w ciąży rzekomej. W przypadku samic w rui lub proestrusie koniec małego plastikowego pręta jest wkładany dopochwowo, aby zetknąć się z szyjką macicy i jest wibrowany przez 30 sekund przez kontakt z trymerem. Zabieg wykonywany jest na klatce z drutu. Nie jest wymagane znieczulenie ani analgezja. Technika CM jest wygodna do produkcji samic w ciąży rzekomej, które mogą produkować mioty po niechirurgicznym sztucznym zapłodnieniu bez konieczności krycia samcami po wazektomii. CM może być również stosowany do produkcji samic w ciąży rzekomej jako biorców transferu zarodków. W szczególności technikę CM można połączyć z niechirurgicznym transferem zarodków, jak opisano tutaj. Wykazano, że metody niechirurgiczne są skuteczne w transferze zarodków w stadium blastocysty u myszy4,5i rats6,7. Ponieważ ta niechirurgiczna metoda jest skuteczną alternatywą dla metod chirurgicznych, uważa się ją za udoskonalenie techniki 3R. Opierając się na wcześniejszych badaniach, poziom kortykosteronu w kale, jako miara stresu, wskazuje, że niechirurgiczny charakter zabiegu nie zwiększa poziomu stresu u gryzoni7,8. Zabiegi te są mniej trudne technicznie niż chirurgiczny transfer zarodków i są znacznie szybsze do wykonania. Ponieważ zarodki są przenoszone do macicy, zarodki w stadium prawidłowym dla rozwoju macicy muszą zostać przeniesione. W przypadku myszy blastocysty są przenoszone do biorczyń w ciąży rzekomej 2,5 dnia po stosunku (dpc).

Dla dwóch opisanych tutaj technik niechirurgicznych, czas podawania hormonu i technika CM różnią się. Czas wykonania CM w odniesieniu do rui jest ważny dla sukcesu, ponieważ zastępuje on naturalne krycie w celu produkcji biorców w ciąży rzekomej. Eliminując potrzebę samców poddanych wazektomii w celu wywołania ciąży rzekomej, procedura ta zapewnia korzyści 3R, zarówno zmniejszając liczbę wymaganych zwierząt, jak i eliminując konieczność chirurgicznie zmienionych samców. Sam zabieg jest szybki (30 s) i nie wymaga znieczulenia ani znieczulenia. Technika ta znacznie zwiększa niezawodność i przewidywalność produkcji samic w ciąży rzekomej do wspomaganego rozrodu.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie obowiązujące międzynarodowe, krajowe i instytucjonalne wytyczne dotyczące opieki i użytkowania zwierząt były przestrzegane. Wszystkie procedury wykonywane w badaniach na zwierzętach były zgodne ze standardami etycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt ParaTechs Corporation i przeprowadzone zgodnie ze standardami podyktowanymi przez Biuro ds. Dobrostanu Zwierząt Laboratoryjnych, National Institutes of Health, Public Health Service, Departament Zdrowia i Opieki Społecznej Stanów Zjednoczonych. W niniejszym badaniu wykorzystano samce i samice myszy CD1(ICR) oraz samice myszy C57Bl/6J w wieku >8 tygodni. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródeł komercyjnych (patrz tabela materiałów).

1. Procedura manipulacji szyjki macicy do stosowania ze sztucznym zapłodnieniem u myszy CD1

  1. Zsynchronizowana owulacja samic myszy w dniu 1 i dniu 3
    1. Samicom myszy wstrzyknąć 2,5 j.m. PMSG (patrz tabela materiałów) we wstrzyknięciu dootrzewnowym (IP) w 1. dniu, 0,5 godziny przed rozpoczęciem cyklu ciemnego wiwarium.
      UWAGA: Każdy dawca płci męskiej dostarczy wystarczającą ilość nasienia dla 10 biorczyń.
    2. Wstrzyknąć samicom 2,5 j.m. hCG (patrz tabela materiałów) przez wstrzyknięcie IP w dniu 3, 1 godzinę przed rozpoczęciem cyklu ciemnego wiwarium.
      UWAGA: Czas wstrzyknięć, transfer plemników i cykl świetlny względem siebie są bardzo ważne. Czasy określone dla wszystkich procedur w niniejszym protokole opierają się na 12-godzinnym cyklu światła/ciemności.
  2. Pobranie i zpojemnościa świeżego nasienia w 4 dniu
    1. Przygotować 500 μl kropli pożywki do wstępnej inkubacji nasienia (PM, patrz tabela materiałów) w naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 60 mm pod olejem parafinowym. Przygotuj jedno danie na dawcę płci męskiej. Utrzymuj równowagę przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przed pobraniem nasienia.
    2. Po 1 godzinie od rozpoczęcia cyklu świetlnego wiwarium należy poddać samca (samców) eutanazji zgodnie z wytycznymi instytucji. Każdy samiec dostarczy wystarczającą ilość nasienia na 10 sztucznych zapłodnień.
    3. Szybko wypreparuj najądrza ogona od myszy. Wykonaj poprzeczne nacięcie brzucha nad pęcherzem za pomocą nożyczek preparacyjnych i kleszczy zębatych.
      1. Poduszki tłuszczowe jąder znajdują się po obu stronach pęcherza moczowego. Chwyć jedną z poduszek tłuszczowych jąder zakrzywionymi kleszczami i usuń jądro i najądrze z jamy ciała. Zidentyfikuj najądrze ogona jako płaską owalną strukturę rurkową tuż pod jądrem.
      2. Przytrzymaj najądrze ogona zakrzywionymi kleszczami i wytnij za pomocą małych, ustawionych pod kątem nożyczek. Usuń oba najądrza ogona i przenieś je do tkanki chłonnej w celu usunięcia tłuszczu i krwi pod mikroskopem preparacyjnym.
    4. Umieścić dwa najądrza ogona w każdej kropli 500 μl zrównoważonego PM w oleju parafinowym w temperaturze 37 °C. Przeciąć tkankę, wykonując sześć nacięć małymi nożyczkami. Jeśli wykorzystuje się więcej niż jednego dawcę płci męskiej, należy użyć jednego najądrza od każdego dawcy dla każdej próbki nasienia, aby zmniejszyć różnice między próbkami.
    5. Delikatnie zakręć naczyniem i pozwól plemnikom opuścić tkankę przez 3 minuty, wirując raz na minutę. Usuń wszystkie tkanki.
    6. Inkubować próbkę nasienia przez 45 minut do 1 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu uzyskania pojemności.
    7. Opcjonalnie: Zmierz liczbę plemników i oceń ruchliwość pod mikroskopem za pomocą hemocytometru. Aby policzyć, w razie potrzeby rozcieńczyć plemniki w PM.
  3. Potwierdzenie synchronizacji cyklu rujowego za pomocą oceny cytologicznej
    1. Za pomocą małego, wstępnie zwilżonego wacika (patrz tabela materiałów) delikatnie zbierz komórki pochwy ze ściany pochwy, tocząc wacik po tkance, rozsmaruj je w 20 μl kropli sterylnej wody na szkiełku mikroskopowym i wysusz na powietrzu.
    2. Pod mikroskopem przy 100-krotnym powiększeniu i oświetleniu jasnym polem oceń obecność zrogowaciałych komórek nabłonka. Samice w rui lub późnej rui będą miały obecne zrogowaciałe komórki nabłonkowe i powinny być wybrane do manipulacji szyjki macicy.
    3. Opcjonalnie: Należy zanotować masę ciała biorczyń przed inseminacją.
  4. Wykonywanie manipulacji szyjki macicy (CM)
    1. Około 0,5 godziny przed inseminacją umieść samicę biorcy na szczycie klatki z rusztem, umożliwiając myszy "złapanie" powierzchni pręta klatki. Chwyć kciukiem i palcem wskazującym w pobliżu nasady ogona i ustaw ogon pod kątem do góry, jednocześnie stabilizując zwierzę (Rysunek 1).
      UWAGA: Mysz pozostanie nieruchomo przez cały czas trwania zabiegu, jeśli technika obsługi zostanie wykonana prawidłowo. Jeśli mysz przesunie się z pozycji, delikatnie zmień położenie i kontynuuj. Jeśli jako biorca zostanie wybrane agresywne zwierzę, pozwolenie mu na wejście do tunelu wzbogacającego podczas zabiegu może być uspokajające. Korzystanie z tunelu jest opcjonalne, ale może pomóc naukowcom w obchodzeniu się ze zwierzętami, zapewniając rozproszenie uwagi podczas tej procedury.
    2. Włóż koniec małego plastikowego pręta (patrz Tabela materiałów) dopochwowo, aby zetknął się z szyjką macicy i wibruj przez 30 sekund, kontaktując się z trymerem (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Umieść pręt na miejscu przed uruchomieniem trymera. Podczas zabiegu oba trzymane są w jednej ręce. Nie jest wymagane znieczulenie ani analgezja.
  5. Niechirurgiczny transfer nasienia do sztucznego zapłodnienia
    1. Umieścić przyrząd do inseminacji (patrz tabela materiałów) na pipecie P200 o pojemności 40 μl i zdjąć osłonę ochronną.
    2. Wyjąć podwielokrotność zpojemnościowej próbki nasienia z naczynia w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i przenieść ją do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm bez oleju w temperaturze 37 °C. Próbka nasienia zostanie natychmiast wykorzystana do transferu.
      UWAGA: Plemniki szybko tracą ruchliwość poza inkubatorem CO2 . Utrzymuj zpojemnościową próbkę nasienia w temperaturze 37 °C i 5% CO2 tak bardzo, jak to możliwe.
    3. Docisnąć tłok pipety do pierwszego oporu, opuścić końcówkę cewnika do próbki nasienia w temperaturze 37 °C i powoli załadować plemniki do urządzenia do przenoszenia. Unikaj wszelkich grudek. Usunąć resztki oleju z zewnętrznej części urządzenia do inseminacji za pomocą tkanki chłonnej. Odłóż pipetę.
      UWAGA: Należy unikać przenoszenia oleju parafinowego do rogu macicy. Usunąć resztki oleju z zewnętrznej części urządzenia do inseminacji za pomocą tkanki chłonnej.
    4. Umieść kobietę odbiorcy na górze drucianej klatki stojaka. Przytrzymaj mysz w odpowiedniej pozycji, używając tej samej techniki obsługi, która jest używana w przypadku CM; Chwyć w pobliżu podstawy ogona kciukiem i palcem wskazującym, a następnie odchyl ogon do góry, jednocześnie stabilizując zwierzę.
    5. Umieść mały wziernik (patrz Tabela materiałów) w pochwie.
    6. Wprowadzić cewnik urządzenia do inseminacji do wziernika, przez szyjkę macicy i do macicy. Gdy koncentrator urządzenia zetknie się ze wziernikiem, dozuj nasienie, naciskając tłok pipety do pierwszego oporu. Unikaj przedostawania się dodatkowego powietrza do rogu macicy.
      UWAGA: Jeśli cewnik nie zostanie prawidłowo ustawiony, uderzy w tkankę otaczającą szyjkę macicy, powodując jej zgięcie i ostatecznie zgięcie. Jeśli cewnik nie przesuwa się przez szyjkę macicy przy pierwszej próbie, delikatnie wycofaj cewnik i spróbuj ponownie, aż się powiedzie. Może być konieczna zmiana położenia wziernika.
    7. Wyjmij urządzenie i wziernik. Nie jest wymagane monitorowanie po zabiegu.
  6. Opcjonalnie: kontrola ciąży w 10-12 dniu
    1. Użyj przyrostu masy ciała, aby określić stan ciąży. Przyrost masy ciała będzie zależny od szczepu, ale wzrost o co najmniej 1-2 g koreluje z ciążą.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Technika trzymania myszy w manipulacji szyjką macicy. Mysz spoczywa na drucianej klatce i jest stabilizowana na ogonie oraz po obu stronach z przodu tylnych nóg. koniec małego plastikowego pręta jest wkładany dopochwowo, aby zetknąć się z szyjką macicy i jest wibrowany przez kontakt z trymerem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Niechirurgiczna procedura transferu zarodków do stosowania z manipulacją szyjki macicy u myszy CD1

  1. Zsynchronizowana owulacja samic myszy w dniu 1 i dniu 3
    1. Wstrzyknąć samicom myszy 2,5 IU PMSG przez wstrzyknięcie IP w 1 dniu, około 6 godzin po rozpoczęciu cyklu świetlnego wiwarium.
    2. Wstrzyknąć samicom 2,5 j.m. hCG przez wstrzyknięcie IP w 3 dniu, w odstępie 47 godzin po wstrzyknięciu PMSG lub około 5 godzin po rozpoczęciu cyklu świetlnego wiwarium.
  2. Potwierdzenie synchronizacji cyklu rujowego za pomocą oceny cytologicznej
    1. W 3 dobie, około 1 godzinę przed CM, należy wykonać cytologię u potencjalnych biorców. Za pomocą małego, wstępnie zwilżonego wacika delikatnie zbierz komórki pochwy ze ściany pochwy, tocząc wacik po tkance, rozsmaruj je w kropli 20 μl sterylnej wody na szkiełku mikroskopowym i wysusz na powietrzu.
    2. Pod mikroskopem przy 100-krotnym powiększeniu i oświetleniu jasnym polem oceń obecność zrogowaciałych komórek nabłonka. Samice w rui lub późnej rui będą miały obecne zrogowaciałe komórki nabłonkowe i powinny być wybrane do manipulacji szyjki macicy.
    3. Opcjonalnie: Należy zanotować masę ciała potencjalnych biorczyń zarodków.
  3. Wykonywanie CM
    1. W dniu 3, 1 godzinę przed rozpoczęciem cyklu ciemności wiwarium, umieść samicę biorcy na szczycie klatki z rusztem, pozwalając zwierzęciu "chwycić" powierzchnię pręta klatki. Chwyć w pobliżu podstawy ogona za pomocą palca wskazującego i kciuka, a następnie ustaw ogon w górę, jednocześnie stabilizując zwierzę (Rysunek 1).
      UWAGA: Mysz pozostanie nieruchomo przez cały czas trwania zabiegu, jeśli technika obsługi zostanie wykonana prawidłowo. Jeśli mysz przesunie się z pozycji, delikatnie zmień położenie i kontynuuj. Jeśli jako biorca zostanie wybrane agresywne zwierzę, pozwolenie mu na wejście do tunelu wzbogacającego podczas zabiegu może być uspokajające.
    2. Włóż koniec małego plastikowego pręta do pochwy, aby zetknął się z szyjką macicy i wibruj nim przez 30 sekund, kontaktując się z trymerem.
      UWAGA: Umieść pręt na miejscu przed uruchomieniem trymera. Podczas zabiegu oba trzymane są w jednej ręce. Nie jest wymagane znieczulenie ani analgezja.
  4. Niechirurgiczny transfer zarodków w 6 dniu
    1. Umieścić 20 μl kropli pożywki M2 (patrz Tabela materiałów) na pokrywce naczynia do hodowli tkankowych.
      UWAGA: Pokrywka została wybrana, ponieważ ma krótszą krawędź, dzięki czemu jest wygodna w dostępie do zarodków w kropli. W żadnym momencie nie nakładaj oleju parafinowego na kroplę M2, ponieważ wprowadzenie oleju do rogu macicy wydaje się negatywnie wpływać na transfer zarodków.
    2. Pod mikroskopem i przy użyciu oświetlenia odblaskowego załadować 10-20 blastocyst do kropli pożywki za pomocą standardowej pipety do obsługi zarodków (patrz Tabela Materiałów).
      UWAGA: Optymalna liczba zarodków do przeniesienia zależy od szczepu myszy i wszelkich manipulacji, którym zostały poddane zarodki. W przypadku zdrowych, niezmanipulowanych zarodków powinno wystarczyć przeniesienie 10-15 zarodków. W przypadku zarodków rederywacyjnych lub genetycznie zmodyfikowanych właściwe jest przeniesienie większej liczby zarodków.
    3. Przymocuj niechirurgiczne urządzenie do transferu zarodków (patrz Tabela materiałów) na pipecie P2 o pojemności 1,8 μl. Zdejmij osłonę cewnika ochronnego.
    4. Dociśnij tłok pipety do pierwszego oporu, opuść końcówkę cewnika do podłoża i powoli wciągnij zarodki do końcówki cewnika urządzenia. Zdejmij końcówkę z medium.
      UWAGA: Wizualizacja zarodków w małym powiększeniu pozwoli na łatwiejsze załadowanie zarodków do urządzenia. Jeśli zarodki są rozrzucone w kropli, delikatnie potrząśnij naczyniem z boku na bok, aby skoncentrować zarodki w środku kropli, lub zmień ich położenie za pomocą pipety do obsługi zarodków.
    5. Ustawić objętość pipety na 2,0 μl, aby wytworzyć mały pęcherzyk powietrza na końcówce cewnika. Delikatnie połóż pipetę z załadowanymi zarodkami w pobliżu klatki dla myszy.
    6. Umieść kobietę odbiorcy na górze drucianej klatki stojaka. Przytrzymaj mysz w tej pozycji, używając tej samej techniki obsługi, która jest używana w przypadku CM; Chwyć w pobliżu podstawy ogona palcem wskazującym i kciukiem, a następnie ustaw ogon pod kątem do góry, stabilizując zwierzę.
    7. Umieść mały wziernik (patrz Tabela materiałów) do pochwy.
    8. Wprowadzić cewnik urządzenia do przenoszenia do wziernika, przez szyjkę macicy i do macicy. Gdy koncentrator urządzenia zetknie się ze wziernikiem, należy dozować zarodki, naciskając tłok pipety do pierwszego oporu. Unikaj przenoszenia dodatkowego powietrza do rogu macicy.
    9. Nie zwalniając tłoka pipety, wyjmij urządzenie i wziernik. Nie jest wymagane monitorowanie po zabiegu.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako electrical9 i sonic10 stymulacja szyjki macicy została wykorzystana do wywołania pseudociąży u szczurów, ta praca przedstawia standaryzowaną procedurę mechaniczną, która może być stosowana u myszy. Cytologia pochwy może pomóc w identyfikacji samic w różnych stadiach rui. Aby potwierdzić ciążę rzekomą u kobiet, zastosowano tę samą metodę. Po pierwsze, porównano profile cytologiczne samic dla myszy CD1 i C57Bl/6 w cyklach rujowych, podczas ciąży i podczas pseudociąży wywołanej kryciem lub CM. Wymazy z pochwy pobrano od samic i wybarwiono za pomocą systemu barwienia Papanicolaou (patrz tabela materiałów). Komórki obserwowano pod 100-krotnym powiększeniem przy oświetleniu jasnym polem. Obserwowane komórki obejmowały leukocyty, jądrzaste komórki nabłonkowe i bezjądrzaste zrogowaciałe komórki nabłonkowe. Określenie etapu cyklu rujowego opierało się na względnym procencie każdego typu komórki11,12. Ruja charakteryzuje się przewagą zrogowaciałych komórek nabłonka. Gdy ruja się kończy, zaczyna się metestrus i zaczynają pojawiać się leukocyty, podczas gdy zrogowaciałe komórki nabłonkowe stają się mniej widoczne. Diestrus ma umiarkowaną lub niską komórkowość, z dominacją leukocytów i zaczynają pojawiać się jądrzaste komórki nabłonkowe. Proestrus wyróżnia się utratą leukocytów, wzrostem jądrzastych komórek nabłonka i pojawieniem się zrogowaciałych komórek nabłonka. Po rui zaczyna się ruja i cykl trwa dalej.

Aby opracować profil wyjściowy, cytologia pochwy była rejestrowana przez co najmniej dwa pełne cykle rujowe dla każdej samicy (N = 20 dla CD1, N = 20 dla C57Bl/6) przed kryciem. Długość cyklu i indywidualne profile różniły się u myszy; Zaobserwowano jednak oczekiwane ogólne tendencje. Średnia długość cyklu rujowego dla myszy CD1 i C57Bl/6 wynosiła 3,8 dnia, w zakresie 3-5 dni. Dzień przed naturalnym kryciem wszystkie samice myszy były w rui. Po kryciu cytologię wykonywano ponownie 1,5 dnia po stosunku (dpc), aż do wznowienia cyklu rujowego. Rysunek 2 pokazuje profil cytologiczny dla kobiet w ciąży rzekomej CD1 i C57Bl/6 krzyżowanych z samcami po wazektomii.

figure-results-1
Rysunek 2: Profil cytologiczny samic myszy w ciąży rzekomej. Średni procent każdego typu komórek dla leukocytów, jądrzastych komórek nabłonkowych i zrogowaciałych komórek nabłonka pokazano jako funkcję dni po stosunku (DPC) dla myszy (A) CD1 (N = 20) i (B) C57Bl / 6 (N = 20). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W tej pracy technika CM została ustandaryzowana, aby zwiększyć efektywność produkcji samic w ciąży rzekomej. W przypadku samic w rui lub proestrusie koniec małego plastikowego pręta jest wkładany dopochwowo, aby zetknąć się z szyjką macicy i jest wibrowany przez 30 sekund przez kontakt z trymerem. Zabieg wykonywany jest na klatce z drutu. Nie jest wymagane znieczulenie ani analgezja. Aby określić skuteczność procedury CM, porównano cytologię pochwy dla samic myszy CD1 (N = 20) i C57Bl/6 (N = 20) po kryciu z samcami po wazektomii i po CM (całkowita N = 40). Profil cytologiczny ciąży rzekomej wywołanej przez CM był podobny do profilu ciąży rzekomej wywołanej przez krycie, jak pokazano na Rycina 3.

figure-results-2
Rysunek 3: Profil cytologiczny dla samic myszy w ciąży rzekomej po manipulacji szyjki macicy (CM). Procent każdego typu komórek dla leukocytów, jądrzastych komórek nabłonka i zrogowaciałych komórek nabłonka jest pokazany jako funkcja dni po stosunku (DPC) lub dni po manipulacji szyjki macicy (DPCM). Średni procentowy typ komórek pokazano dla myszy CD1 i C57Bl/6 (N = 40) (A) kojarzonych z samcami po wazektomii lub (B) po CM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Aby ustalić, czy technika CM jest wystarczająca do ustalenia ciąży do wspomaganego rozrodu, CM została wykonana jako część niechirurgicznego protokołu sztucznego zapłodnienia (NSAI) u samic CD1. Protokół sztucznego zapłodnienia obejmował synchronizację rui samic z niską dawką hormonów PMSG i hCG przed transferem nasienia. CM wykonano tuż przed transferem nasienia. W przypadku myszy z CD1 skuteczność indukcji ciąży rzekomej przy użyciu CM u samic w rui (N = 76) przy użyciu tej techniki wynosiła 83%. W eksperymencie kontrolnym tylko 38% samic w rui zostało zatkanych przez samców poddanych wazektomii (N = 24). Biorcy sztucznego zapłodnienia poddawani manipulacji szyjki macicy (N = 76) mieli 72% wskaźnik ciąż i średnią wielkość miotu wynoszącą 8,3 młodych. Tak więc indukcja ciąży rzekomej przez CM jest wygodnym i skutecznym zamiennikiem krycia z samcem po wazektomii podczas wykonywania NSAI. Zastosowanie CM do przygotowania biorców CD1 (N = 4) w rui do niechirurgicznego transferu zarodków świeżych blastocyst CD1 spowodowało 100% wskaźnik ciąż. Transfer 9-15 zarodków dał trzy zdrowe mioty o 45% wskaźniku urodzeń i średniej wielkości miotu wynoszącej 6 młodych. Dla porównania, biorcy CD1 (N = 20), którzy zostali kojarzeni z samcami poddanymi wazektomii w celu wywołania ciąży rzekomej, mieli 80% wskaźnik ciąż i 46% wskaźnik urodzeń po przeniesieniu 20 świeżych blastocyst B6C3F2.

Wyniki dla technik wspomaganego rozrodu będą prawdopodobnie zależne od szczepu, ponieważ zmienne takie jak dawka i czas podawania hormonów do superowulacji okazały się zależne od szczepu13. Ponadto czynniki takie jak wiek i waga biorcy mogą wpływać na reakcję na hormony14. W tej pracy, podczas wykonywania procedury CM do sztucznego zapłodnienia, stwierdzono, że tylko samice w późnym okresie rui lub rui reagują. Ogólnie rzecz biorąc, aby zwiększyć liczbę dostępnych biorców w populacji, samice są najpierw synchronizowane z niską dawką hormonów3. Synchronizacja rui z 2,5 j.m. PMSG i hCG była w tej pracy skuteczna w 78% u samic CD1 w wieku 11-14 tygodni (N = 27) i w 60% skuteczna u samic C57Bl/6 w wieku 18-32 tygodni (N = 22). Skuteczność indukcji ciąży rzekomej z zastosowaniem manipulacji szyjki macicy u samic z CD1 wyniosła 83% dla samic w rui (N = 76) i 82% (N = 100) dla samic C57Bl/6 w rui tą techniką.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zasada 3R to ramy etyczne dla wykorzystywania zwierząt w badaniach, opisane w 1959 roku przez Russela i Burcha w "The Principles of Humane Experimental Technique". Zasada 3R oznacza zastąpienie, redukcję i udoskonalenie w wykorzystaniu zwierząt. Wyróżnione tutaj protokoły są zgodne z zasadą 3R. Technika manipulacji szyjki macicy zmniejsza liczbę potrzebnych zwierząt, ponieważ nie wymaga już wykorzystywania samców do produkcji samic w ciąży rzekomej. Technika ta eliminuje również potrzebę wykonywania wazektomii u mężczyzn, zapewniając w ten sposób wyrafinowanie poprzez zmniejszenie bólu i stresu. Opisane tutaj techniki wspomaganego rozrodu (sztuczne zapłodnienie i transfer zarodków) są niechirurgiczne, a zatem obie zapewniają udoskonalenie 3R poprzez zmniejszenie bólu i stresu8spowodowanych ich chirurgicznymi alternatywami.

Wykorzystanie samic w rzekomej ciąży jest konieczne do odzyskania szczeniąt podczas wykonywania wspomaganego rozrodu u myszy1. Procedura CM jest skuteczną metodą wytwarzania samic w ciąży rzekomej, ale synchronizacja fazy cyklu rujowego samic biorczyni jest krytycznym pierwszym krokiem w tym procesie. Synchronizacja rui może drastycznie zmniejszyć liczbę samic potrzebnych w kolonii do przygotowania potencjalnych biorców i pomaga w produkcji samic w ciąży rzekomej na żądanie. Stosowanie niskiej dawki hormonów nie wydaje się powodować żadnych szkodliwych skutków dla powrotu do zdrowia żywych miotów u myszy CD1. Należy zachować ostrożność w przypadku innych szczepów, aby znaleźć kombinację hormonów i stężeń, która daje najlepszej jakości samice biorców dla przenoszonych zarodków lub nasienia. Synchronizację można osiągnąć za pomocą PMSG i hCG16, ale dawki, które powodują superowulację samic, mogą nie być odpowiednie dla utrzymującej się ciąży17.

Aby ustalić, czy samica jest w rui, w tej pracy przeprowadzono ocenę cytologiczną. Fazę rujową można również ocenić na podstawie obserwacji ujścia pochwy11,18. Chociaż metoda ta jest niezwykle pomocna i może być stosowana samodzielnie lub jako potwierdzenie, jest bardziej subiektywna niż stosowanie cytologii. Cytologia pochwy bez barwienia jest zarówno szybka, jak i skuteczna w wyborze samic w rui, ponieważ zrogowaciałe komórki nabłonkowe można łatwo zidentyfikować. W tym protokole ocena cytologiczna jest wykonywana przed CM w celu określenia potencjalnych biorców. Ważne jest, aby wykonać cytologię przed CM, ponieważ zabieg ma tendencję do fragmentacji komórek złuszczonych z obszaru pochwy, co utrudnia identyfikację. Ocenę cytologiczną w kierunku ciąży rzekomej lub ciąży można przeprowadzić po 3,5-11,5 dniu po CM (dpcm) przez 3 kolejne dni. Profil samicy rujowej na rowerze powinien mieć co najmniej 1 dzień ze znacznym naciekiem zrogowaciałych komórek nabłonka. Samice w ciąży rzekomej/ciężarnej powinny wykazywać profil diestrus (głównie leukocyty z potencjalnie niską liczbą komórek) przez 3 kolejne dni.

Dzięki opracowaniu techniki CM stwierdzono, że niektóre myszy są bardziej otwarte na procedurę niż inne. Samice myszy CD1 są doskonałymi kandydatami ze względu na ich spokojną naturę i doskonałe instynkty opiekuńcze. Odmiana ta jest łatwa w obsłudze i dobrze radzi sobie podczas CM i niechirurgicznych technik wspomaganego rozrodu. Myszy C57Bl/6 są zwykle bardziej agresywne i mniej opiekuńcze. Chociaż protokół ten skutecznie wyprodukował samice C57Bl/6 w ciąży rzekomej przy użyciu CM, były one mniej skłonne do konsekwentnego tolerowania procedury. Wydawało się, że koreluje to nieco z fazą rujową podczas CM. Samice w rui lub proestrus były bardziej otwarte. Użycie rurki wzbogacającej, aby zwierzę mogło wejść, umożliwiło dostęp do pochwy na czas zabiegu i pomogło uspokoić samicę. Sam zabieg nie krępuje w pełni samicy, więc zwierzę może się wycofać w dowolnym momencie. W takim przypadku zwierzę można zmienić pozycję, a następnie kontynuować procedurę. Czas zabiegu zatrzymuje się, jeśli samica odejdzie i wznawia się, gdy procedura zostanie wznowiona. Decydujące znaczenie dla powodzenia zabiegu ma faza cyklu rujowego (późna ruja i ruja) oraz kontakt pręcika z szyjką macicy. Wibracje trymera zapewniają ustandaryzowany CM. Aby zapewnić kontakt z szyjką macicy, na pręt wywierany jest delikatny nacisk, a ustawienie pręta względem szyjki macicy jest zapewnione dzięki niewielkim ruchom pręta w przód iw tył.

Zastosowanie CM poprawiło protokół NSAI, ponieważ samice w prawidłowej fazie cyklu rujowego mogą być wybrane przed transferem plemników, a protokół nie jest już uzależniony od krycia z samcami po wazektomii. Synchronizacja cyklu rujowego sztucznego zapłodnienia jest zaplanowana w taki sposób, aby dojrzewanie oocytów odpowiadało transferowi plemników rano w 4. dniu. Kluczowe znaczenie dla powodzenia protokołu ma dostosowanie czasu owulacji w taki sposób, aby mogło dojść do zapłodnienia. Należy zachować ostrożność, aby podać hCG 15-17 godzin przed spodziewanym transferem plemników, zgodnie z zaleceniami dotyczącymi czasu zapłodnienia in vitro 1. Jakość próbki nasienia będzie miała bezpośredni wpływ na wynik sztucznego zapłodnienia. Świeże plemniki, które zostały zpojemnościowe, będą działać najlepiej. Kriokonserwowane plemniki dobrej jakości mogą produkować zapłodnione zarodki in vivo. Należy jednak zachować ostrożność przy bezpośrednim przenoszeniu rozmrożonych plemników, ponieważ resztki krioprotektantów przeniesione do rogu macicy mogą hamować zagnieżdżenie się (obserwacje niepublikowane).

Stosowanie CM w połączeniu z transferem zarodków jest koncepcyjnie łatwą adaptacją. Synchronizacja cyklu rujowego zmniejsza liczbę samic niezbędnych do wytworzenia puli biorców. Określenie stadium rujowego przed CM zwiększa prawdopodobieństwo uzyskania biorczyń w ciąży rzekomej. Jedną z wad tej metody jest to, że cytologia biorców w momencie transferu zarodków jest w fazie zmian. Wszystkie typy komórek są obecne, jeśli samica przechodzi z profilu rui do profilu pseudociąży, a ciąża rzekoma staje się oczywista tylko wtedy, gdy cytologia jest śledzona przez kilka dni. Opierając się na powodzeniu (>80%) przejścia od rui do pseudociąży u myszy CD1 i C57Bl/6, oczekuje się, że metoda ta będzie odpowiednia dla biorców transferu zarodków. Wstępne wyniki wskazują na dobry sukces przy ograniczonym niechirurgicznym transferze zarodków. Ogólnie rzecz biorąc, skuteczność niechirurgicznego transferu zarodków jest porównywalna z wydajnością techniki chirurgicznej 4,5, a transfer niechirurgiczny może zastąpić chirurgiczny transfer zarodków w stadium blastocysty. W przypadku zarodków we wcześniejszym stadium wymagana jest hodowla zarodków do stadium blastocysty. Jeśli jednak preferowany jest transfer chirurgiczny, możliwe jest dostosowanie techniki CM do właściwego czasu potrzebnego dla odpowiednich biorczyń ciąży rzekomej2. Ogólnie rzecz biorąc, biorcy zarodków są o 1 dzień mniej zaawansowani niż zarodek. Na przykład blastocysty są zbierane w dawcach 3,5 dpc od dawców i przenoszone do biorców 2,5 dpc. W związku z tym CM będzie musiało być wykonane w taki sposób, aby biorczyni była w słabiej rozwiniętym stanie ciąży rzekomej niż zarodki.

Podsumowując, przedstawiona tutaj technika CM jest bardzo obiecująca pod względem integracji z innymi technikami wspomaganego rozrodu u myszy. Dostarczyliśmy skuteczne protokoły sztucznego zapłodnienia i transferu zarodków przy użyciu technik niechirurgicznych. W połączeniu, technika CM zapewnia korzyści 3R, w tym (1) zmniejszenie liczby zwierząt poprzez wyeliminowanie potrzeby samców poddanych wazektomii oraz (2) udoskonalenie technik poprzez zastąpienie technik chirurgicznych alternatywami niechirurgicznymi.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Barbara Stone i Sarah Śródulski są zatrudnione w ParaTechs Corporation, Lexington, KY, USA. ParaTechs posiada wyłączne prawa licencyjne do produkcji urządzenia mNSET dla myszy. Firma ParaTechs Corp opracowała i sprzedaje urządzenia mNSET i mC&I, które mogą być używane odpowiednio do niechirurgicznego transferu zarodków i niechirurgicznego sztucznego zapłodnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez Biuro Dyrektora, Biuro Programów Infrastruktury Badawczej, Narodowych Instytutów Zdrowia pod numerem Nagrody R43OD020304 oraz Narodowy Instytut Zdrowia Psychicznego Narodowych Instytutów Zdrowia pod Nagrodą Numer R44MH122117. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
w stadium blastocysty
KARTA Pożywka preinkubacyjna Fertiup (PM)CosmoBioKYD-002-EXDo kapacytacji plemników
Pipeta do obsługi zarodkówCook MedicalK-FPIP-1120-10BSFlexipet jest dostępna w różnych średnicach
Zespół pipet do obsługi zarodkówParatechs90010
Samice myszy, Crl: CD1 (ICR)Charles River Laboratories22>8 tygodni
KleszczeFine Science Tools11053-10Ząbkowane, do preparowania
KleszczeFine Science Tools11052-10Zakrzywione, do preparacji
KleszczeFine Science ToolsDumont #5Fine, do rozwarstwienia
HemocytometrFisher Scientific267110Opcjonalnie
ludzka gonadotropina kosmówkowa (hCG)Prospechor-250Do inkubatora synchronizacji rui
, 37 & deg; C 5% CO2Thermo Inkubator Naukowy
, 37 stopni; C, stacjonarnyCookK-MINC-1000
KimwipesKimberly-Clark34155Tkanki chłonne
M2 mediumMilliporeMR-015-DPożywka do obsługi zarodków
Samce myszy, Crl:CD1(ICR)Charles River Laboratories22>8 tygodni
mC& I urządzenieParaTechs60020Do transferu nasienia, wzierniki w zestawie
pręt mCMParaTechs90050Gładki,, o średnicy @3 mm
MikroskopOlympusSZX7Powiększenie 20x i 40x z przechodzącym i odbitym źródłem oświetlenia do pracy i rozwarstwiania zarodków
MikroskopACCU-SCOPE3032100-krotne powiększenie z jasnym oświetleniem pola
Szkiełka mikroskopoweFisher Scientific12-544-7
Urządzenie mNSETParaTechs60010Do transferu zarodków, wzierniki w zestawie
Igły, 26 GExel26402
System barwienia PapanicolaouVWR76265-730
Opcjonalny olej parafinowySigma-Aldrich18512
Pipeta, P200Corning4074pasuje do C& I urządzenie do transferu nasienia
Pipeta, PR-2Rainin17008648Pasuje do urządzenia NSET do transferu zarodków
Gonadotropina surowicy klaczy w ciąży (PMSG)Prospechor-272Do synchronizacji rui
SkalaAmerykańskie wagiLB-1000
NożyczkiNarzędzia do14068-12
Nożyczki Science Tools14081-09do rozwarstwiania
, ConstixContecSC-4Do cytologii pochwy
Strzykawki, 1 ccBecton Dickenson and Company309659
Naczynia do hodowli tkankowych, 35 mmFalcon353001
Naczynia do hodowli tkankowych, 60 mmFalcon353004
trymerWahlChroMini Klatka
Zarodki nauki preparacyjne Kątowe waciki na mysz z drutu T-Cut

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, fourth edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2014).
  2. Wake, Y., et al. Successful induction of pseudopregnancy using sonic vibration in mice. Scientific Reports. 13 (1), 3604(2023).
  3. Stone, B. J., Steele, K. H., Fath-Goodin, A. A rapid and effective nonsurgical artificial insemination protocol using the NSET device for sperm transfer in mice without anesthesia. Transgenic Research. 24 (4), 775-781 (2015).
  4. Green, M., Bass, S., Spear, B. A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. BioTechniques. 47 (5), 919-924 (2009).
  5. Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).
  6. Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro. Theriogenology. 151, 81-85 (2020).
  7. Stone, B. J., et al. A nonsurgical embryo transfer technique for fresh and cultured blastocysts in rats. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (5), 488-495 (2020).
  8. Steele, K. H., et al. Nonsurgical embryo transfer device compared with surgery for embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (1), 17-21 (2013).
  9. Terkel, J., Witcher, J. A., Adler, N. T. Evidence for "memory" of cervical stimulation for the promotion of pregnancy in rats. Hormones and Behavior. 24 (1), 40-49 (1990).
  10. Kaneko, T., Endo, M., Tsunoda, S., Nakagawa, Y., Abe, H. Simple induction of pseudopregnancy by artificial stimulation using a sonic vibration in rats. Scientific Reports. 10 (1), 2729(2020).
  11. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538(2012).
  12. Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: Review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
  13. Luo, C., et al. Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (4), 471-478 (2011).
  14. Gates, A. H. Viability and developmental capacity of eggs from immature mice treated with gonadotrophins. Nature. 177 (4512), 754-755 (1956).
  15. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen & Co., Ltd. London, UK. (1959).
  16. Hasegawa, A., et al. Efficient and scheduled production of pseudopregnant female mice for embryo transfer by estrous cycle synchronization. Journal of Reproduction and Development. 63 (6), 539-545 (2017).
  17. Beaumont, H. M., Smith, A. F. Embryonic mortality during the pre- and post-implantation periods of pregnancy in mature mice after superovulation. Journal of Reproduction and Fertility. 45 (3), 437-448 (1975).
  18. Champlin, A. K., Dorr, D. L., Gates, A. H. Determining the stage of the estrous cycle in the mouse by the appearance of the vagina. Biology of Reproduction. 8 (4), 491-494 (1973).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Manipulacja szyjk macicyindukcja pseudoci ywspomagana prokreacjasynchronizacja ruitransfer nasieniapost powanie z embrionamizasady 3R w badaniach na zwierz tach

Powiązane artykuły