Method Article

Dostosowany test mikropłytkowy oparty na gęstości optycznej do charakteryzowania zakażenia promieniowcem

DOI:

10.3791/65482

⸱

June 30th, 2023

 ,  , 
1Department of Biology, Ouachita Baptist University, 2Department of Mathematical Sciences, University of Arkansas

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano metodę mikropłytek opartą na gęstości optycznej, która pozwala określić ilościowo długoterminowy wzrost bakterii w obecności bakteriofagów, odpowiednich dla promieniowców i innych wolno rosnących bakterii. Metoda ta obejmuje modyfikacje mające na celu zmniejszenie parowania i kondensacji pokrywy oraz kod R do obliczania wskaźników infekcji wirusowej, w tym obszaru pod krzywą, maksimum wzrostu i względnej zjadliwości.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriofagi są kluczowym elementem naturalnego środowiska i mają potężną zdolność do kształtowania populacji bakterii. Aby zrozumieć, w jaki sposób poszczególne fagi oddziałują z wolno rosnącymi gospodarzami bakteryjnymi, takimi jak promieniowce, potrzebna jest łatwa i niezawodna metoda ilościowego określania długoterminowego wzrostu bakterii w obecności fagów. Czytniki mikropłytek spektrofotometrycznych pozwalają na powtarzalne pomiary o wysokiej przepustowości, ale inkubacja małej objętości przez dłuższy czas może stanowić wyzwanie techniczne. Procedura ta dostosowuje standardową 96-dołkową mikropłytkę, aby umożliwić kohodowlę fagów i bakterii bez pobierania podpróbek przez 96 godzin, przy czym wzrost bakterii rejestruje się co 8 godzin przy użyciu spektrofotometrycznych wartości absorbancji. Te wartości gęstości optycznej są analizowane przy użyciu R w celu uzyskania wskaźników infekcji, w tym procentowego zahamowania wzrostu, względnej zjadliwości i wskaźnika Stacy'ego-Ceballosa. Przedstawione tutaj metody zapewniają skuteczny sposób przeprowadzania i analizowania eksperymentów z krzywą wzrostu mikropłytek o wydłużonym czasie trwania i obejmują modyfikacje w celu zmniejszenia parowania i kondensacji pokrywy. Protokoły te ułatwiają przeprowadzanie testów interakcji między wolno rosnącymi gospodarzami bakteryjnymi a ich bakteriofagami.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriofagi lub fagi to wirusy, które infekują bakterie. Są to najliczniejsze jednostki biologiczne na świecie1, i ogólnie przyjmuje się, że bakteriofagi wpływają na ewolucję bakterii i procesy ekosystemowe2,3,4. Istnieje kilka metod opisujących, mierzących i analizujących zakres gospodarzy bakteriofagów8 i dynamika infekcji5,6, w tym metody oparte na agarze, takie jak metoda agaru dwuwarstwowego7 oraz metody mikropłytek oparte na gęstości optycznej8,9,10,11,12. Każda metoda ma swoje wady i zalety. Ze względu na swoją skuteczność, testy galwaniczne przy użyciu metody agaru dwuwarstwowego są "złotym standardem" dla testów zakresu żywicieli, ale ta metoda jest czasochłonna i pracochłonna9. Szybkie metody mikropłytkowe, które zwracają wyniki w ciągu 24 godzin lub krócej, dają doskonałe wyniki dla szybko rosnących gospodarzy bakteryjnych, takich jak Escherichia coli9,10,11,12 ale są zbyt krótkie, aby pokazać postęp infekcji bakteriofagowej u wolniej rosnących gospodarzy bakteryjnych, takich jak promieniowce7,13,14,15.

Test mikropłytek oparty na gęstości optycznej, przeznaczony dla szybko rosnących bakterii, nie może być prowadzony przez wiele dni wymaganych do scharakteryzowania dynamiki infekcji w wolno rosnącej bakterii gospodarza bez wystąpienia parowania i sztucznie wysokiego zagęszczenia bakterii. W związku z tym uzyskanie porównywalnych danych o wysokiej przepustowości dotyczących dynamiki infekcji bakteriofagami dla wolno rosnących gatunków bakterii wymaga specjalistycznych technik dostosowanych do tych bakterii.

Przedstawiona tutaj metoda mikropłytek zmniejsza parowanie, umożliwiając w ten sposób współhodowlę wolno rosnących bakterii z fagiem przez dłuższy okres 96 godzin i umożliwiając badania dynamiki infekcji fagów i zakresu gospodarzy. Ta metoda prezentuje również indeks Stacy'ego-Ceballosa 16, metrykę opartą na gęstości optycznej, która umożliwia porównanie wirulencji między różnymi systemami gospodarz-wirus

.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż ten protokół został napisany dla Gordonia terrae, został również z powodzeniem wykorzystany dla Gordonia lacunae, Gordonia rubripertincta i Gordonia westfalica.

1. Przygotowanie bakterii

  1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego użyj dobrej praktyki mikrobiologicznej17, aby zaszczepić pojedynczą kolonię Gordonia terrae CAG3 w sterylnej kolbie z przegrodą o pojemności 1 l z 200 ml bulionu wapniowego z drożdży peptonowych18(PYCa) zawierającego 0,01 mg/ml cykloheksymidu (patrz Tabela Materiałów).
  2. Inkubować kolbę w temperaturze 30 °C, wytrząsając z prędkością 250 obr./min, aż do nasycenia kultury lub przez 3 dni7.
  3. Nasyconą kulturę G. terrae rozcieńczyć seryjnie w bulionie PYCa i rozprowadzić na płytce po 100 μl z rozcieńczeń 10−4, 10−5 i 10−6 na płytkach PYCa19,20. Nierozcieńczoną nasyconą kulturę przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.
  4. Inkubować odwrócone płytki rozsiewające przez 3 dni w temperaturze 30 °C.
  5. Po inkubacji zidentyfikuj "policzalną płytkę", płytkę z 20-200 koloniami. Policz liczbę kolonii na tej płytce i oblicz jednostki tworzące kolonie na mililitr (jtk/ml)19,20.
  6. Rozcieńczyć nasyconą kulturę bulionem PYCa do 4,0 x 106 jtk/ml bakterii.

2. Przygotowanie faga

UWAGA: Przedstawione reprezentatywne wyniki uzyskano za pomocą faga Gordonia DelRio21, umiarkowanego bakteriofaga wyizolowanego na G. terrae. Metody te są również z powodzeniem stosowane w przypadku innych fagów Gordonia.

  1. Zaczynając od wyizolowanego bakteriofaga, seryjnie rozcieńczyć próbkę faga w buforze fagowym7 do rozcieńczenia 1 x 10−8. Przeprowadzić dwuwarstwowy test miana fagów agarowych7, zakażając 0,3 ml nasyconej kultury G. terrae 10 μl każdego rozcieńczenia faga. Po 5-10 minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej połącz mieszaninę bakterii i fagów z 3 ml górnego agaru PYCa i wylej na płytki agarowe PYCa.
  2. Inkubować płytki odwrócone do góry dnem w temperaturze 30 °C przez 3 dni lub do momentu, gdy utworzą się blaszki miażdżycowe7.
  3. Po inkubacji zidentyfikuj "policzalną płytkę", płytkę z 20-200 blaszkami. Policz liczbę tabliczek na tej płytce i oblicz jednostki tworzące płytkę na mililitr (pfu/ml)7.

3. Przygotowanie mikropłytek

UWAGA: Do tej metody powinny być używane płaskie 96-dołkowe mikropłytki (patrz Tabela Materiałów). Całe przygotowanie i załadunek płytki musi zostać zakończone w komorze bezpieczeństwa biologicznego i należy stosować dobrą praktykę mikrobiologiczną17.

  1. Przygotuj roztwór do powlekania pokrywy przeciwmgielnej, łącząc 100 μl Triton-X 100, 40 ml 100% izopropanolu i 160 ml wody dejonizowanej22. Wymieszaj do wymieszania i przechowuj w temperaturze pokojowej.
  2. W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj 6 ml roztworu do powlekania pokrywki na wewnętrzną powierzchnię sterylnej 96-dołkowej pokrywki mikropłytki, trzymając pokrywkę za krawędzie i obracając ją, aby upewnić się, że jest pokryta roztworem. Pozostaw roztwór na pokrywce na 20 s, a następnie odlej roztwór i odwróć pokrywkę na autoklawowanym ręczniku papierowym pod kątem, aż pokrywka całkowicie wyschnie, co zwykle zajmuje 35-45 minut. Uważaj, aby trzymać pokrywę za krawędzie.
  3. Przygotuj 20 ml 0,1% agarozy w wodzie na każdą 96-dołkową mikropłytkę, podgrzewając w kuchence mikrofalowej, aby stopić agarozę.
  4. Gdy agaroza ostygnie do 50-60 °C, odpipetuj 100 μl 0,1% agarozy do wszystkich przestrzeni między dołkami płytki i 200 μl agarozy do studzienek w rzędzie A i rzędzie H oraz w kolumnie 1, kolumnie 2, kolumnie 11 i kolumnie 1223 (Rysunek 1).

4. Ładowanie płytki bakteriami i fagami

UWAGA: Wszystkie czynności związane z przygotowaniem i załadunkiem płytki muszą być zakończone w komorze bezpieczeństwa biologicznego, a dobra praktyka mikrobiologiczna17 powinna być stosowana.

  1. Płytka 96-dołkowa będzie zawierała 75 μl bakterii 2,0 x 106 jtk/ml w każdym dołku9. Rozcieńczyć kulturę bakteryjną 4,0 x 106 jtk/ml w stosunku 1:1 bulionem 2x PYCa do 2,0 x 106 jtk/ml. Przygotować 5 ml na płytkę 96-dołkową.
  2. Rozcieńczyć lizat fagowy za pomocą buforu fagowego7, aby uzyskać po 1 ml o stężeniach 2,0 x 106 pfu/ml, 2,0 x 105 pfu/ml i 2,0 x 104 pfu/ml. Pozwoli to na wielokrotność infekcji (MOI) 1, 0,1 i 0,01 w obrębie klasy microplate9.
  3. Aby załadować mikropłytkę, weź płytkę, która została przygotowana z roztworem przeciwmgielnym i agarozą, a następnie odpipetuj 75 μl bakterii 2,0 x 106 jtk/ml do kolumn 3-10, postępując zgodnie z Rysunek 1.
  4. Do kolumny 3 i kolumny 4 dodaj 75 μl sterylnego buforu fagowego do każdej studzienki, aby służyła jako kontrola pozytywna bez fagów, postępując zgodnie z Rysunek 1, a po każdym dodaniu pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Dodać 75 μl faga 2,0 x 106 pfu/ml do kolumny 5 i kolumny 6, 75 μl faga 2,0 x10 5 pfu/ml do kolumny 7 i kolumny 8 oraz 75 μl faga 2,0 x 104 pfu/ml do kolumny 9 i kolumny 10, pipetowanie w górę i w dół, aby wymieszać po każdym dodaniu.
  5. Zaklej oba krótsze boki tabliczki taśmą etykietującą o grubości 0,5 cala, aby częściowo uszczelnić płytkę, umożliwiając jednocześnie wymianę gazową.

5. Inkubacja i pomiar absorbancji

  1. Po załadowaniu płytek bakteriami i fagami umieść je na wytrząsarce do mikropłytek z prędkością 250 obr./min i inkubuj w temperaturze 30 °C.
  2. Inkubować płytki przez 96 godzin, wykonując pomiar gęstości optycznej przy długości fali 600 nm na czytniku mikropłytek co 8 godzin, począwszy od godziny 16. Włóż płytki do wytrząsarki między pomiarami.
    UWAGA: Oceniono okresy pomiarowe wynoszące 4, h, 6 h, 8 h i 12 h, rozpoczynające się o godzinie 0, i ustalono, że 8-godzinny okres pobierania próbek rozpoczynający się o 16 h po zakażeniu najlepiej uchwycił interakcje Gordonia-.
  3. Monitoruj pokrywę pod kątem kondensacji przez cały czas trwania eksperymentu. Jeśli zaobserwuje się kondensację, załóż pokrywę na inną pokrytą zgodnie z krokiem 3.2.
  4. Wygeneruj krzywe wzrostu kontrolnego i zakażonego zgodnie z sekcją 6 protokołu.

6. Analiza danych

  1. Użyj programu arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć średnią i odchylenie standardowe dla każdego rozcieńczenia faga, postępując zgodnie z układem arkusza kalkulacyjnego w repozytorium GitHub Stacy-Ceballos-Index (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index).
  2. Utwórz krzywe kontroli i zainfekowanego wzrostu oraz oblicz metryki infekcji za pomocą R (patrz Tabela materiałów) z pakietami DescTools24, dplyr25, ggplot226 i readxl27 i postępuj zgodnie ze skryptem R w repozytorium GitHub Stacy-Ceballos-Index (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index).
    1. AUCcon to obszar pod krzywą kontrolnej niezainfekowanej, podczas gdy AUCinf to obszar pod krzywą zakażenia16. Oblicz AUC, a następnie oblicz procentowe zahamowanie wzrostu na podstawie wartości obszaru pod krzywą, PIAUC16, używając następującego równania:
      (1 - [AUCinf/AUC con]) × 100
    2. Przerywane poziome linie na każdej krzywej pokazują szczytowy wzrost, przy czym niezainfekowany szczyt wzrostu oznaczony jest jako Nasymptote(con), a zainfekowany szczyt wzrostu jest oznaczony jako Nasymptote(inf). Zidentyfikuj wartościasymptoty N, a następnie oblicz procentowe zahamowanie wzrostu na podstawie tych szczytowych wartości wzrostu, PImax16, używając następującego równania:
      (1 - [Nasymptote(inf)/ Nasymptote(con)]) × 100
    3. Oblicz indeks Stacy'ego-Ceballosa, ISC16, na podstawie wartościPI AUC iPI max, w następujący sposób:
      (PIAUC × PImaks.)0,5< BR /> Oblicz względną zjadliwość, całkując indeks Stacy'ego-Ceballosa w czasie16.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperyment jest udany, jeśli wynikowa krzywa wzrostu wykazuje wzrost populacji bakterii kontroli pozytywnej w czasie, bez nagłych wahań absorbancji. Przykłady udanego eksperymentu przy MOI równym 1 z produktywną infekcją fagową i bez niej przedstawiono odpowiednio na Rysunek 2 i Rysunek 3. Produktywna infekcja przy MOI 0,01 jest reprezentowana przez Rysunek 4. Wzorzec wzrostu kontroli pozytywnej (zielona krzywa) widoczny na wszystkich trzech rysunkach wskazuje, że bakterie rosną, nie zbrylają się podczas wzrostu i nie ma żadnych zanieczyszczeń. Zbrylanie i zanieczyszczenie są wskazywane przez niezwykle wysoką absorbancję w jednym punkcie czasowym. Odchylenia standardowe zazwyczaj zwiększają się w czasie trwania eksperymentu; Jednak drastyczny wzrost lub odchylenia standardowe nakładające się na krzywą kontrolną i zakażoną mogą wskazywać na zanieczyszczenie lub zbrylanie się w jednym lub kilku dołkach.

Krzywa wzrostu przedstawiająca produktywną infekcję fagową, reprezentowana przez Rysunek 2, pokazuje zmniejszoną absorbancję bakterii w czasie w studzienkach z dodatkiem faga. To zmniejszenie gęstości bakterii nie będzie widoczne, jeśli bakteria znajduje się poza zakresem żywiciela faga, jak pokazano na Rysunek 3.

Metryki infekcji są pokazane dla wszystkich reprezentatywnych eksperymentów, ze stosunkowo dużymI SC dla produktywnych infekcji w Rysunek 2 i Rysunek 4 i bardzo małyI SC w Rysunek 3 dla faga, który nie zainfekował skutecznie bakterii gospodarza.

figure-results-1
Rysunek 1: Układ mikropłytek. Szare obszary są wypełnione 0,1% agarozą. Studzienki ślepe w kolumnie 3 i kolumnie 4 są studzienkami kontroli pozytywnej bez fagów, zawierającymi tylko bufor fagowy i bakterie 2,0 x 106 jtk/ml. Kropkowane studzienki zawierają fagi i bakterie 2,0 x 106 jtk/ml; duże kropki w kolumnie 5 i kolumnie 6 wskazują MOI równy 1 przy fagu 2,0 x 106 pfu/ml; średnie kropki w kolumnie 7 i kolumnie 8 wskazują MOI 0,1 przy fagu 2,0 x 105 pfu/ml; a małe kropki w kolumnie 9 i kolumnie 10 wskazują MOI 0,01 przy fagu 2,0 x 104 pfu/ml. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Udany eksperyment z krzywą wzrostu z fagiem o MOI równym 1, który skutecznie infekuje bakterię gospodarza. Średnie wartości absorbancji (odchylenie standardowe ±) są pokazane dla bakterii niezakażonych (kolor zielony) i bakterii z dodatkiem faga (kolor niebieski). Skróty: AUC = obszar pod krzywą; PIAUC = procentowe zahamowanie wzrostu obliczone na podstawie obszaru pod krzywą; Asymptota N = szczytowa wartość wzrostu; PImax = procentowe zahamowanie wzrostu obliczone na podstawie szczytowych wartości wzrostu; ISC = wskaźnik Stacy'ego-Ceballosa. Ten wykres przedstawia umiarkowanego faga Gordonia DelRio infekującego G. terrae, bakterię, na której został wyizolowany. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Udany eksperyment z krzywą wzrostu z fagiem o MOI równym 1, który nie infekuje skutecznie bakterii gospodarza. Średnie wartości absorbancji (odchylenie standardowe ±) są pokazane dla bakterii niezakażonych (kolor zielony) i bakterii z dodatkiem faga (kolor niebieski). Skróty: AUC = obszar pod krzywą; PIAUC = procentowe zahamowanie wzrostu obliczone na podstawie obszaru pod krzywą; Asymptota N = szczytowa wartość wzrostu; PImax = procentowe zahamowanie wzrostu obliczone na podstawie szczytowych wartości wzrostu; ISC = wskaźnik Stacy'ego-Ceballosa. Ten wykres przedstawia zakażenie G. rubripertincta przez DelRio. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Udany eksperyment z krzywą wzrostu z fagiem o MOI 0,01. Średnie wartości absorbancji (odchylenie standardowe ±) są pokazane dla bakterii niezakażonych (kolor zielony) i bakterii z dodatkiem faga (kolor niebieski). Skróty: AUC = obszar pod krzywą; PIAUC = procentowe zahamowanie wzrostu obliczone na podstawie obszaru pod krzywą; Asymptota N = szczytowa wartość wzrostu; PImax = procentowe zahamowanie wzrostu obliczone na podstawie szczytowych wartości wzrostu; ISC = wskaźnik Stacy'ego-Ceballosa. Ten wykres przedstawia zakażenie G. terrae przez DelRio. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda mikropłytek oparta na gęstości optycznej pozwala na badanie zakresu gospodarzy bakteriofagów i dynamiki infekcji11 oraz pokazuje użyteczność wskaźnika Stacy-Ceballosa16 jako miary zjadliwości bakteriofagów. Chociaż metoda ta może być stosowana z dowolnym systemem bakteriofag-gospodarz, została zaprojektowana specjalnie w celu dostosowania testów szybkiego wzrostu mikropłytek 9,10,11 do stosowania z wolniej rosnącymi bakteriami, takimi jak promieniowce. Szybkie testy mikropłytek nie mogą być stosowane w przypadku wolno rosnących bakterii bez modyfikacji w celu rozwiązania problemu parowania i kondensacji pokrywy. Metoda ta opisuje te niezbędne modyfikacje i po raz pierwszy demonstruje zastosowanie wskaźnika Stacy'ego-Ceballosa i powiązanych wskaźników16 do opisu zakażenia bakteriofagami.

Parowanie może być poważnym wyzwaniem w wielodniowych testach 96-dołkowej krzywej wzrostu płytki; Ta metoda rozwiązuje ten problem poprzez dodanie agarozy do studzienek granicznych i przestrzeni między studzienkami. Margines agarozowy w połączeniu z powłoką przeciwmgielną22 zapewnia niezbędną wilgotność wewnątrz mikropłytki i pozwala na wiarygodne pomiary gęstości optycznej. Bez dodatkowej wilgotności dochodzi do znacznego parowania z efektem krawędziowym23 podczas wymaganego długiego okresu inkubacji, co prowadzi do sztucznie zawyżonych odczytów gęstości optycznej. Powłoka przeciwmgielna pokrywy jest konieczną modyfikacją, ponieważ kondensacja pokrywy może również sztucznie podnieść wartości gęstości optycznej. Zalecaną modyfikacją jest potrząsanie płytkami w okresie inkubacji, ponieważ bakterie promieniowcowe mogą zbrylać się podczas wzrostu, dając sztucznie zawyżone wartości gęstości optycznej i skutecznie zmniejszając mnogość infekcji.

Stosunek bakterii do fagów w eksperymentach charakteryzujących dynamikę infekcji ma kluczowe znaczenie, ponieważ musi być wystarczająco dużo fagów, aby wykazać efekt infekcji, ale nie tak wiele, aby populacja bakterii gospodarza natychmiast się załamała9 lub częstotliwość lizogenii dramatycznie wzrosła28. W tej metodzie stosunkiem, który okazał się najbardziej skuteczny w uzyskiwaniu spójnych wyników, był MOI równy 1, ale użyteczne wyniki uzyskano również przy MOI 0,1 i 0,01. Przy wdrażaniu tej metody zaleca się wybór jednego stężenia bakterii i badanie wielu stężeń fagów w zakresie MOI 0,01-1 9,10,11.

Ta opisana tutaj technika pozwala na ocenę interakcji bakteriofag-gospodarz pod kątem wolno rosnących bakterii w wysokoprzepustowych testach mikropłytek, a nie przy pobieraniu podpróbek z większej kolby hodowlanej w każdym interwale pomiarowym29. Ponadto, demonstrując, w jaki sposób można dostosować testy wzrostu mikropłytek 9,10,11, technika ta zwiększa użyteczność innych testów bakteriofagowych opartych na mikropłytkach dla wolniej rosnących bakterii, w tym charakterystyki fagów 5,6,12 i badań ewolucji30,31. Wreszcie, metoda ta demonstruje użycie wskaźnika Stacy-Ceballosa16 do opisania infekcji bakteriofagowej. Metryka ta została początkowo opracowana na podstawie danych z archeonowego systemu modeli wirusów i jest obliczana na podstawie wartości gęstości optycznej, co zapewnia jej szerokie zastosowanie w różnych systemach wirusowych.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta grantem NSF DBI Biology Integration Institute (BII) (nagroda nr 2119968; PI-Ceballos) oraz w ramach programu Arkansas INBRE, z grantem z National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), P20 GM103429 z National Institutes of Health. Autorzy doceniają również wsparcie programu badawczego Patterson Summer Undergraduate Research Program na Uniwersytecie Baptystycznym Ouachita.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgarozaOmni-Pur2090do napełniania studzienek granicznych mikropłytek 
Costar 96 Well Lid Low Eparation Corner NotchCorning3931wymienna pokrywka mikropłytki
IsopropanolFisher ChemicalA461-4do powlekania pokrywki
Czytnik mikropłytekTecan Spark 20M
Wytrząsarka do mikropłytek z 4-miejscową platformąThermo Fisher Scientific88-861-023do potrząsania płytkami podczas inkubacji
Non-Tissue Płytka poddana kulturze 96-dołkowaFalcon (marka Corning)351172mikropłytka do oznaczania krzywej wzrostu
Agar z drożdży peptonowych wapniowych (PYCa)domowej roboty1 g peptonu
15 g ekstraktu drożdżowego
15 g agaru
990 ml dd H2O
4,5 ml 1 M CaCl2
2,5 ml 40% dekstrozy
1 ml 10 mg/ml cykloheksymidu
Peptonowy bulion drożdżowy wapniowy (PYCa)domowej roboty, z numeru referencyjnego 161 g peptonu
15 g ekstraktu drożdżowego
990 ml dd H2O
4,5 ml 1 M CaCl2
2,5 ml 40% dekstrozy
1 ml 10 mg/ml cykloheksymidu
Pepton drożdży wapń ( PYCa) agar górnyDomowe1 g peptonu
15 g ekstraktu drożdżowego
4 g agaru
990 ml dd H2O
4,5 ml 1M CaCl2
2,5 ml 40% dekstrozy
Płytki PetriegoThermo Fisher ScientificFB0875713do oznaczania stężenia bakterii i oznaczania miana fagów
Bufor fagowydomowej roboty, z Odniesienie 710 ml 1 M Tris, pH 7,5
10 ml 1 M MgSO4
4 g NaCl
980 ml dd Oprogramowanie H2O
Rhttps://www.r-project.org/wersja 4.3.0
Sterylna jednorazowa kolba PETG z przegrodowym dnem z wentylowanym zamknięciemThermo Fisher Scientific4116-1000do hodowli bakteryjnych
Triton X-100Sigma Aldrich9036-19-5do powlekania pokrywy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mushegian, A. R. Are there 1031 virus particles on Earth, or more, or fewer. Journal of Bacteriology. 202 (9), e00052-e00020 (2020).
  2. Chevallereau, A., Pons, B. J., van Houte, S., Westra, E. R. Interactions between bacterial and phage communities in natural environments. Nature Reviews Microbiology. 20 (1), 49-62 (2022).
  3. Olszak, T., Latka, A., Roszniowski, B., Valvano, M. A., Drulis-Kawa, Z. Phage life cycles behind bacterial biodiversity. Current Medicinal Chemistry. 24 (36), 3987-4001 (2017).
  4. Weitz, J. S., et al. Phage-bacteria infection networks. Trends in Microbiology. 21 (2), 82-91 (2013).
  5. Turner, P. E., Draghi, J. A., Wilpiszeski, R. High-throughput analysis of growth differences among phage strains. Journal of Microbiological Methods. 88 (1), 117-121 (2012).
  6. Storms, Z. J., Teel, M. R., Mercurio, K., Sauvageau, D. The virulence index: A metric for quantitative analysis of phage virulence. PHAGE. 1 (1), 27-36 (2020).
  7. Poxleitner, M., Pope, W., Jacobs-Sera, D., Sivanathan, V., Hatfull, G. Phage Discovery Guide. , Available from: https://seaphagesphagediscoveryguide.helpdocsonline.com/home (2012).
  8. Martinez-Soto, C. E., et al. PHIDA: A high throughput turbidimetric data analytic tool to compare host range profiles of bacteriophages isolated using different enrichment methods. Viruses. 13 (11), 2120-2137 (2021).
  9. Rajnovic, D., Muñoz-Berbel, X., Mas, J. Fast phage detection and quantification: An optical density-based approach. PLoS One. 14 (5), e0216292(2019).
  10. Xie, Y., Wahab, L., Gill, J. J. Development and validation of a microtiter plate-based assay for determination of bacteriophage host range and virulence. Viruses. 10 (4), 189-204 (2018).
  11. Sørensen, P. E., et al. Classification of in vitro phage-host population growth dynamics. Microorganisms. 9 (12), 2470-2486 (2021).
  12. Konopacki, M., Grygorcewicz, B., Dołęgowska, B., Kordas, M., Rakoczy, R. PhageScore: A simple method for comparative evaluation of bacteriophages lytic activity. Biochemical Engineering Journal. 161, 107652(2020).
  13. Holt, J. G., Krieg, N. R., Sneath, P. H. A., Staley, J. T., Williams, S. T. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology., 9th edition. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (1994).
  14. Fusconi, R., Godinho, M. J. L., Bossolan, N. R. S. Culture and exopolysaccharide production from sugarcane molasses by Gordonia polyisoprenivorans CCT 7137, isolated from contaminated groundwater in Brazil. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (7), 937-943 (2007).
  15. Bujold, A. R., Lani, N. R., Sanz, M. G. Strain-to-strain variation of Rhodococcus equi growth and biofilm formation in vitro. BMC Research Notes. 12 (1), 519(2019).
  16. Ceballos, R. M., Stacy, C. L. Quantifying relative virulence: When µmax fails and AUC alone just is not enough. Journal of General Virology. 102 (1), 001515(2021).
  17. Siddiquee, S. The basic concept of microbiology. Practical Handbook of the Biology and Molecular Diversity of Trichoderma Species from Tropical Regions. , Springer. Cham, Switzerland. 1-15 (2017).
  18. Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. Genome sequence and characterization of the Tsukamurella bacteriophage TPA2. Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1389-1398 (2011).
  19. Van Alst, A. J., LeVeque, R. M., Martin, N., DiRita, V. J. Growth curves: Generating growth curves using colony forming units and optical density measurements. JoVE Science Education Database. Microbiology. , Available from: https://www.jove.com/v/10511/growth-curvesgenerating-growth-curves-using-colony-forming-units (2023).
  20. Wise, K. Preparing spread plates protocols. American Society for Microbiology. , Available from: https://asm.org/ASM/media/Protocol-Images/Preparing-Spread-Plates-Protocols.pdf (2006).
  21. Mathes, H. N., et al. Complete genome sequences of Chop, DelRio, and GrandSlam, three Gordonia phages isolated from soil in Central Arkansas. Microbiology Resource Announcements. 12 (5), e0002323(2023).
  22. Krishnamurthi, V. R., Niyonshuti, I. I., Chen, J., Wang, Y. A new analysis method for evaluating bacterial growth with microplate readers. PLoS One. 16 (1), 0245205(2021).
  23. Evoluted New Media. Beating the edge effect. Laboratory News. , Available from: http://www.labnews.co.uk/article/2028052/beating_the_edge_effect (2011).
  24. Signorell, A. DescTools: Tools for descriptive statistics, R package version 0.99.49. DescTools. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=DescTools (2023).
  25. Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K., Vaughan, D. dplyr: A grammar of data manipulation, R package version 1.1.2. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2023).
  26. Wickham, H., et al. ggplot2: Create elegant data visualisations using the grammar of graphics, R package version 3.4.2. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggplot2 (2023).
  27. Wickham, H., Bryan, J. readxl: Read excel files, R package version 1.4.2. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=readxl (2023).
  28. Yao, T., Coleman, S., Nguyen, T. V. P., Golding, I., Igoshin, O. A. Bacteriophage self-counting in the presence of viral replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (51), 2104163118(2021).
  29. Fang, Q., Feng, Y., McNally, A., Zong, Z. Characterization of phage resistance and phages capable of intestinal decolonization of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in mice. Communications Biology. 5, 48(2022).
  30. Burrowes, B. H., Molineux, I. J., Fralick, J. A. Directed in vitro evolution of therapeutic bacteriophages: The Appelmans protocol. Viruses. 11 (3), 241(2019).
  31. Shapiro, J. W., Williams, E. S. C. P., Turner, P. E. Evolution of parasitism and mutualism between filamentous phage M13 and Escherichia coli. PeerJ. 4, e2060(2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bacteriophage InfectionOptical Density AssayMicroplate ReaderActinobacteriophage AssaySlow Growing BacteriaGrowth Curve AnalysisPhage Host InteractionSpectrophotometric MeasurementBacterial Growth Inhibition96 Well Microplate

Related Articles