Method Article

Podstawowy trójwymiarowy (3D) model jelitowy z komponentem odpornościowym

DOI:

10.3791/65484

⸱

September 1st, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Agricultural and Food Sciences, Alma Mater Studiorum-University of Bologna

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy konstrukcję podstawowego, trójwymiarowego (3D) modelu linii komórkowej jelitowej oraz protokołu osadzania parafiny do mikroskopowej oceny stałych jelitowych odpowiedników. Barwienie wybranych białek umożliwia analizę wielu parametrów wzrokowych z jednego eksperymentu do potencjalnego wykorzystania w przedklinicznych badaniach przesiewowych leków.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wzrosło wykorzystanie modeli jelit in vivo i in vitro do badania patofizjologii zapalnych chorób jelit, do badań farmakologicznych potencjalnie korzystnych substancji oraz badań nad toksycznością potencjalnie szkodliwych składników żywności. Istotne jest obecne zapotrzebowanie na rozwój modeli in vitro opartych na komórkach, które zastępują modele zwierzęce. Tutaj przedstawiono protokół dla podstawowego, "zdrowego tkankowego" trójwymiarowego (3D) modelu jelitowego równoważnego z liniami komórkowymi, oferującym podwójną korzyść – zapewnia zarówno eksperymentalną prostotę (ustandaryzowany i łatwo powtarzalny system), jak i złożoność fizjologiczną (enterocyty Caco-2 z wspierającym komponentem odpornościowym monoocytów U937 i fibroblastów L929). Protokół obejmuje również osadzanie parafiny do mikroskopowej oceny stałych jelit, co daje przewagę analizy wielu parametrów wzrokowych z jednego eksperymentu. Do weryfikacji skuteczności modelu jako systemu eksperymentalnego używa się przekrojów barwionych hematoksyliną i eozyną (H&E), ukazujących komórki kolumnowe Caco-2 tworzące zwartą i regularną monowarstwę w leczeniach kontrolnych. Stosując gluten jako prozapalny składnik żywności, parametry analizowane z przekrojów obejmują zmniejszenie grubości monowarstwy, a także zaburzenia i odłączenie od podstawowej matrycy (H&E), zmniejszoną ekspresję białek styku ścisłego, co wykazano podczas barwienia okludyną (mierzalne statystycznie), oraz aktywację immunologiczną migrujących komórek U937, co potwierdza klaster barwienia różnicowania 14 (CD14) oraz różnicowania związanego z CD11b do makrofagów. Jak pokazano, stosując lipopolisacharyd do symulacji zapalenia jelit, dodatkowe parametry, które można zmierzyć, to zwiększone barwienie śluzu oraz ekspresja cytokin (np. midkine), które można wydobyć z ośrodka przed utrwaleniem. Podstawowy trójwymiarowy (3D) model błony śluzowej jelit oraz stałe cięcia mogą być zalecane do badań stanu zapalnego i integralności bariery z możliwością analizy wielu parametrów wizualnych mierzalnych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bariera nabłonkowa jelitowa, czyli wewnętrzna wyściółka o grubości jednej komórki zawierająca różne typy komórek nabłonkowych, stanowi pierwszą fizyczną barierę obronną lub interfejs między zewnętrznym a wewnętrznym środowiskiem ciała 1,2. Enterocyty typu kolumnowego stanowią najliczniejszy typ komórek nabłonkowych. Odpowiadają one za utrzymanie integralności bariery nabłonkowej poprzez interakcje między kilkoma elementami bariery, w tym stykami ścisłymi (TJ), odgrywając istotną rolę w zaciskaniu bariery 1,3. Struktura TJ składa się z wewnątrzkomórkowych białek płytki nazębnej, takich jak zonula occludens (ZO) i cyngulina, współpracujących z białkami transbłonowymi, w tym okludynami, klaudynami oraz cząsteczkami adhezji złącznej (JAM), które tworzą strukturę przypominającą zamek i ściśle łączącą sąsiednie komórki 3,4. Białka transbłonowe regulują pasywną dyfuzję parakomórkową małych związków i wykluczają toksyczne duże cząsteczki.

Potencjalnie toksyczne związki pokarmowe i zanieczyszczenia żywności stymulują produkcję cytokin zapalnych, które zaburzają przepuszczalność nabłonka, aktywując komórki odpornościowe i powodując przewlekłe zapalenie tkanek jelit 5,6,7. Dla porównania, różne fitochemikalia przeciwutleniacze i przeciwzapalne zgłaszano, które zmniejszają ekspresję cytokin zapalnych i wzmacniają integralność bariery TJ jelitowej poprzez przywrócenie ekspresji i składania białek TJ 4,6,8. W związku z tym regulacja integralności bariery nabłonkowej zarówno przez związki korzystne, jak i szkodliwe spowodowała wzrost stosowania zarówno modeli in vivo, jak i in vitro, mających na celu naśladowanie bariery jelitowej do badań przesiewowych i toksyczności farmaceutycznej. Jest to szczególnie istotne w kontekście rosnącego zainteresowania patofizjologią chorób jelit (IBD), martwiczego zapalenia jelit oraz nowotworów, które można symulować w modelach eksperymentalnych 8,9,10.

Istnieje zapotrzebowanie na rozwój modeli in vitro opartych na komórkach, aby osiągnąć cel "3R" w testach na zwierzętach. Należą do nich alternatywy zastępcze dla zwierząt, zmniejszenie liczby wykorzystywanych zwierząt oraz udoskonalenie w przyjmowaniu metod łagodzących trudności 11,12,13. Ponadto mechanizmy molekularne, komórkowe i fizjologiczne pomiędzy modelami ludzkimi a myszymi (gryzonie są najczęściej stosowanym gatunkiem) są odrębne, co prowadzi do kontrowersji dotyczących skuteczności modeli mysich jako predyktorów w reakcjach ludzkich12,13. Liczne zalety modeli in vitro ludzkich linii komórkowych obejmują eksperymenty ograniczone z celem, bezpośrednią obserwację oraz ciągłą analizę13.

Monowarstwy typu jednokomórkowego w kulturach dwuwymiarowych (2D) służyły jako potężne modele. Jednak nie są one w stanie dokładnie oddać złożoności fizjologicznej tkanek ludzkich 8,13,14. W rezultacie rozwijane są systemy hodowli 3D z coraz większymi ulepszeniami, aby odtworzyć złożoność fizjologiczną zarówno zdrowych, jak i chorych tkanek jelit, jako narzędzia nowej generacji do oceny ryzyka13,14. Modele te obejmują 3D rusztowania Transwella z różnorodnymi liniami komórkowymi, kultury organoidów oraz urządzenia mikrofluidyczne (jelito na chipie) wykorzystujące zarówno linie komórkowe, jak i organoidy (pochodzące zarówno ze zdrowych, jak i chorych tkanek)8,13,14.

Trójwymiarowy protokół jelitowy "zdrowej tkanki" przedstawiony w niniejszym badaniu opierał się na znalezieniu równowagi między złożonością fizjologiczną a prostotą eksperymentalną13. Model reprezentuje trójwymiarowy rusztowanie Transwella, składające się z trzech linii komórkowych (enterocytów [złoty standard linii gruczolakoraka jelita grubego Caco-2] z komponentem wspierającym [monocyty U937 i fibroblasty L929]), tworząc standaryzowany i łatwo powtarzalny system przydatny do wstępnego badania cząsteczek dietetycznych interesujących integralność bariery nabłonkowej jelita oraz odpowiedzi immunologicznej. Protokół obejmuje osadzenie parafiny do mikroskopowej oceny integralności bariery nabłonkowej z użyciem stałych odpowiedników jelitowych. Zaletą obecnego podejścia jest to, że wiele sekcji tkanek osadzonych można zabarwić pod kątem wielu parametrów z jednego eksperymentu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie podstawowego, 3D zrekonstruowanego modelu błony śluzowej jelit

UWAGA: Cały zabieg musi być przeprowadzony w sterylnym laminarnym okapu. Wszystkie etapy procedury obejmujące użycie inkubatora komórkowego oznaczają, że hodowle są inkubowane w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze zawierającej 5% CO2 (chyba że protokół zaznacza inaczej).

  1. Wcześniejsze przygotowanie linii komórkowych używanych w modelu jelitowym
    1. Nasiono komórki fibroblastu myszy L929 w stężeniu 5 x 105 mL zmodyfikowanego podłoża orłego (DMEM) Dulbecco zawierającego 2 mM L-glutaminy, 10% płodowego surowika bydłego (FBS) oraz 1% penicylin-streptomycyny (Pen-Streptokok) w kolbice F25 i hodowlało je w inkubatorze 4 dni przed wykonaniem modeli jelitowych. Po 48 godzinach usuń medium pipetą. Następnie dodaj świeże podłoże (5 mL) i inkubuj komórki przez 48 godzin.
      UWAGA: Komórki muszą być w 80% zbieżne przed użyciem.
    2. Nasiać komórki Caco-2 (stężenie 2 x 106) w 10 mL pożywki DMEM (z 10% FBS i 1% Pen-Strep) w kolbie z komórkami F75 i hodować je w inkubatorze 4 dni przed wykonaniem modelu błony śluzowej jelit. Po 48 godzinach zmień ośrodek zgodnie z krokiem 1.1.1 i inkubuj przez 48 godzin do konfluencji 80%.
      UWAGA: Komórki muszą znajdować się w aktywnej fazie proliferacji: nie zbyt rzadkiej ani zbyt zbiegowej. Zaleca się zbieg 50-60%. Komórek nie wolno wysiewać dzień przed tworzeniem modelu, ponieważ mogłoby to spowolnić ich zdolność proliferacji, która nie zakorzeniłaby się idealnie w zrekonstruowanym modelu 3D.
    3. Należy dodać komórki U937 rosnące w zawiesie (stężenie 1 x 106) do 10 ml medium Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (zawierającego 2 mM L-glutaminy, 1% piropirianianu sodu, 10% FBS i 1% anginy Pen-Strep) do kolby z komórkami F75 2 dni przed ustawieniem modelu i umieścić w inkubatorze na 48 godzin.
  2. Przygotowanie wkładek płyt ko-kultury Transwella
    1. Wybierz płytkę 24-dołkową zawierającą wkłady z filtrami 0,4 μm.
      UWAGA: Filtr 0,4 μm jest standardowym wyborem w badaniach transportu leków. Nie zaleca się filtrów o średnicy 3 μm i 8 μm, aby zapobiec ewentualnym utratom komórek osadzonych w kolagenie.
    2. Za pomocą pipety nawilżaj filtry Transwell (dalej nazywane wstawkami membranowymi) 500 μL roztworu Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) poniżej i nad wkładką filtra.
    3. Zamknąć płytę wielodołową i umieścić ją w inkubatorze na minimum 2 godziny.
      UWAGA: Wkładki błonowe mogą pozostawać w HBSS do 24 godzin. Operację tę można wykonać dzień przed konstrukcją modelu. Ważne jest, aby wkładki membranowe były całkowicie nawodnione i aby filtr nie wysychał, ponieważ może to utrudnić prawidłowe przyleganie próbki.
    4. Po 2 godzinach (lub 24 godzinach) wyjmijcie talerze z inkubatora. Ostrożnie zasysaj HBSS od góry i od spodu wkładek membranowych pipetą i pozostawij do wyschnięcia przez 10 minut.
  3. Przygotowanie bezkomórkowego kolagenu lamina propria podstawowego trójwymiarowego modelu jelit (DZIEŃ 1)
    1. Przygotuj bezkomórkowy roztwór kolagenu w 50 mL sterylnej probówce na lodzie, zawierającej następujące składniki DMEM: 10% płodowego surowika bydłego (FBS), 200 mM L-glutaminy, 1% wodorowęglanu sodu oraz 1,35 mg/mL kolagenu z ogonu szczura typu 1.
      UWAGA: Wszystkie te składniki muszą być przechowywane w lodzie i dodawane do DMEM za pomocą schłodzonych końcówek pipet. Kolagen z ogonu szczura typu 1 należy dodać na końcu, ponieważ polimeryzuje wraz ze wzrostem temperatury i pH. Ilość przygotowanego roztworu bezkomórkowego kolagenu zależy od liczby potrzebnych odpowiedników jelitowych.
    2. Dodaj 250 μL roztworu do każdej wkładki płytkowej (nad filtrem membranowym) dla liczby wybranych odpowiedników jelitowych i załóż pokrywkę na płytkę wielodołową. Pozwól roztworowi kolagenowemu polimeryzować się w temperaturze pokojowej (RT) pod laminarnym okapem.
      UWAGA: Poza przejściem do fazy stałej, polimeryzacja jest również widoczna w wyniku zmiany koloru z żółtego na różowy. Polimeryzacja zwykle kończy się w ciągu 10-15 minut.
  4. Przygotowanie, liczenie komórek oraz dodawanie komórek fibroblastu (L929) i monocytów (U937) do systemu modelowego (DZIEŃ 1)
    1. Usuń hodowlę komórek L929 (krok 1.1.1) z inkubatora. Za pomocą pompy próżniowej aspiruj medium, zastąp je 5 mL soli buforowej z jałowym fosforanem (PBS; bez Ca i Mg) i przepłucz komórki.
    2. Aspiruj PBS za pomocą pompy próżniowej. Dodaj 2 mL przygotowanego wcześniej roztworu trypsyny-EDTA (0,05% trypsyny i 0,02% EDTA w PBS) i umieść w inkubatorze na 3-5 minut.
    3. Użyj mikroskopu odwróconego (na przykład Eclipse Ts2, Nikon), aby sprawdzić, czy komórki odłączają się od powierzchni adhezji. Jeśli tak się dzieje, natychmiast dodaj 2 mL DMEM (zawierającego 10% FBS), aby zablokować reakcję trypsyny i przepłukać komórki.
    4. Przelej roztwór ogniwa do sterylnej probówki 15 mL i wiruj w 645 x g przez 5 minut. Za pomocą pompy próżniowej zasysaj supernatant.
      UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby nie ruszyć granulek. Wpływ DMEM został przetestowany na komórkach L929 i U937 i nie wykazano negatywnego wpływu na wzrost.
    5. Dodaj 1 mL DMEM do pelletu i zawiesij komórki.
      UWAGA: Komórki muszą być jednorodnie zawieszone w roztworze.
    6. Usuń 20 μL komórek z DMEM i dodaj 20 μL roztworu Trypan. Usuń 20 μL mieszanki i mikroskopowo oceń gęstość komórek za pomocą komory liczącej komórki.
    7. Usuń hodowlę komórek U937 (krok 1.1.3) z inkubatora. Wiruj roztwór ogniwa w stężeniu 645 x g przez 5 minut. Za pomocą pompy próżniowej zasysaj supernatant, aby nie zakłócać pelletu.
    8. Zawieś ogniwa w 1 mL RPMI. Podobnie jak w przypadku komórek L929, upewnij się, że komórki są jednorodnie zawieszone w roztworze.
    9. Podobnie ustalmy gęstość komórek podaną w kroku 1.4.6.
    10. Przygotuj roztwór kolagenowy zgodnie z krokiem 1.3.1.
      UWAGA: Ilość roztworu, który ma być wykonana, musi uwzględniać 450 μL dla każdej wkładki (lub modelu).
    11. Przygotuj roztwór DMEM zawierający odpowiednio 50 000 komórek L929 i 15 000 komórek U937, w objętości 50 μL, aby każdy model jelitowy miał zostać skonstruowany.
      UWAGA: Liczba komórek jest czynnikiem kluczowym. Zbyt wiele obu typów komórek skutkowałoby powstaniem lamina propria nadmiernie wypełnioną komórkami, które nie byłyby odpowiednio zorganizowane. Niewielka liczba fibroblastów (generujących kolagen) skutkowałaby mniej zwartą laminą propria, podczas gdy zbyt mała liczba monocytów utrudniałaby odpowiedź immunologiczną na bodźce. Pod warunkiem, że w każdej aliquotze 50 μL jest prawidłowa liczba komórek – dla 12 wkładek filtrujących w każdej 24-dołkowej płytce można przygotować całkowitą objętość 600 μL.
    12. Dodaj każdą 50 μL aliquot zawierającą komórki do 450 μL roztworu kolagenu w kroku 1.4.10. Wymieszaj dokładnie.
    13. Nałóż na wcześniej powlekaną warstwę kolagenu bez komórek 500 μL roztworu komórkowego zawierającego kolagen dla każdego modelu.
      UWAGA: Ważne jest, aby szybko dodawać objętości do każdej wkładki, dlatego zaleca się ograniczenie liczby modeli rekonstruowanych modeli błony śluzowej jelita do 12 lub mniej jednocześnie.
    14. Zamknij płytkę i umieść ją w inkubatorze na 2 godziny, aby roztwór się związał.
  5. Przygotowanie, liczenie komórek i dodawanie komórek nabłonkowych Caco-2 do modelu jelitowego (DZIEŃ 1)
    1. Wyjmij hodowlę komórek Caco-2 (krok 1.1.2) z inkubatora. Powtórz procedurę od kroku 1.4.1, używając 10 mL PBS do wstępnego płukania. Następnie dodaj 5 ml przygotowanego roztworu trypsyny-EDTA (0,05% trypsyny i 0,02% EDTA w PBS bez Ca i Mg) i umieść w inkubatorze na 5-8 minut.
    2. Powtarzaj kroki 1.4.3 (ale używając 5 mL DMEM do blokowania reakcji trypsyny) do 1.4.6, aby policzyć komórki za pomocą komory liczącej komórki.
    3. Przygotuj roztwór DMEM zawierający liczbę 150 000 komórek Caco-2 w 50 μL.
      UWAGA: Liczba użytych komórek jest kluczowa. Przekroczenie liczby komórek 150 000 może skutkować powstaniem zwartej nieuporządkowanej warstwy nabłonkowej, natomiast przy zbyt małej liczbie (mniej niż 100 000) komórki mają trudności z wzrostem i nie pokrywają odpowiednio błony podstawnej, tworząc nieciągłą warstwę nabłonkową jelit. Upewnij się, że komórki są skutecznie zawieszone. Końcówka pipety o pojemności 200 μL może być użyta do zapewnienia jednorodnego rozkładu. Biorąc pod uwagę, że w danym momencie można skonstruować 12 modeli, można przygotować roztwór ogniwa o pojemności 600 μL.
    4. Po 2 godzinach wymaganych w kroku 1.4.14 dodaj 50 μL komórek Caco-2 zawieszonych w DMEM do środka każdej błony podstawnej. Zamknij pokrywę płyty wielodołkowej.
    5. Inkubuj pod sterylnym laminarnym kapturem przez 10 minut. Następnie przenieś je do inkubatora na 30 minut.
    6. Przygotuj roztwór DMEM zawierający 10% FBS i 1% Pen/Streptokok.
      UWAGA: Przygotuj wystarczający roztwór, aby użyć objętości 1 mL na model.
    7. Dodaj 500 μL ośrodka nad zrekonstruowanym modelem i 500 μL poniżej filtra.
      UWAGA: Należy zachować ostrożność przy dodawaniu medium nad filtrem, aby nie odłączać lub nie obciążać komórek.
    8. Zamknij system wielodołkowy i umieść go w inkubatorze.
  6. Przygotowanie/formowanie i użycie modelu (DZIEŃ 2 do DZIEŃ 6)
    1. DZIEŃ 2: Ostrożnie usuń roztwór zarówno z góry zrekonstruowanego modelu, jak i pod filtrem za pomocą pipety. Zamień na świeże 500 μL świeżego DMEM (10% FBS i 1% Pen/Strep) nad i pod filtrem.
    2. DZIEŃ 3: Powtórz jak powyżej w kroku 1.6.1.
    3. DZIEŃ 4: Powtórz jak powyżej w kroku 1.6.1.
      UWAGA: Ten model jelitowy jest statycznym modelem komórkowym; Dlatego, aby sprzyjać uwalnianiu cząsteczek oraz wzrostowi i stymulacji komórek, bardzo ważne jest, aby podłoże było zmieniane każdego dnia.
    4. DZIEŃ 5: Na tym etapie model jest w pełni ukształtowany/rozwinięty. Wykorzystaj te modele do dalszych badań.
      UWAGA: Najlepszy czas na użycie modelu to 5 dni. Chociaż komórki mogą być utrzymywane w inkubatorze przez dłuższy czas, im więcej czasu mija, tym większe prawdopodobieństwo, że komórki nabłonkowe będą rosły w niekontrolowany sposób, co skutkuje powstaniem nieuporządkowanej i zwartej warstwy, trudnej w użyciu.
    5. Po 5 dniach inkubuj modele z toksycznymi (gluten lub lipopolisacharyd [LPS]) lub korzystnymi składnikami (polifenolami), które budzą interesujące tematy. Dodaj je do górnej części zrekonstruowanego modelu zawieszonego w medium DMEM.
      UWAGA: Odpowiednie stężenie każdego interesującego komponentu musi być obliczone i zawieszone w ośrodku DMEM. Należy skonfigurować kontrole, które nie są traktowane wyłącznie z nośnikiem DMEM, aby porównać je z modelami eksperymentalnymi.
    6. Inkubuj modele kontrolne i eksperymentalne przez 24 godziny w inkubatorze.
    7. DZIEŃ 6: Usuń podłoże powyżej i pod filtrem pipetą.
      UWAGA: Nośnik ten może być przechowywany do kolejnych testów immunosorbentnych związanych z enzymami (ELISA), aby zmierzyć uwalnianie cytokin zapalnych. W tym celu medium należy dodać do fiolek sterylnych i przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszej analizy.

2. Osadzanie parafiny w zrekonstruowanych modelach błony śluzowej jelit

UWAGA: Cały zabieg musi być przeprowadzony pod okapem chemicznym. Każdy etap i odpowiedni przydział czasu muszą być ściśle przestrzegane. Z tego powodu ważne jest, aby wszystkie odczynniki były przygotowane z wyprzedzeniem.

  1. Ustaw maszynę do parafiny na 58 °C, aby była gotowa do użycia.
  2. Przenieś wkładki membranowe do czyszczących dołków za pomocą szczypiec na sterylnej płycie z 24 dołkami.
  3. Dodaj 500 μL 37% buforowanej formaliny do PBS nad filtrem i 1 mL pod filtr. Zamknij pokrywkę i zostaw ją pod okapem chemicznym na 2 godziny w RT.
    UWAGA: Alternatywnie można stosować 4% buforowanej formaliny w RT przez 1 godzinę.
  4. Usuń formalinę i dodaj roztwór HBSS zarówno nad, jak i pod filtrem. Następnie usuń HBSS.
  5. Odłącz lamina propria od wkładu błonowego.
    UWAGA: Komórki błony śluzowej jelita zwykle bardzo łatwo odłączają się od wkładki błonowej, ponieważ nie są do niej przyczepione. Dodatkowo dwa przedziały próbek (wierzchołkowy i podstawowy) pozostają przymocowane, zachowując strukturę 3D. Jeśli z jakiegoś powodu nie są łatwo odłączane, ważne będzie użycie sterylnego, jednorazowego ostrza skalpela do usunięcia błony śluzowej z błony jelitowej. Wkład membranowy można przeciąć, odłączając go od plastiku. Uważaj, by nigdy nie dotykać próbki skalpelem. Motywacją usunięcia wstawki błonowej z komórek osadzonych w kolagenie jest to, że filtr ten może ulec odłączeniu w kolejnych fazach wiązania lub osadzania parafiny, co powoduje nieproporcjonalne porównania między modelami błony śluzowej jelit. Ponadto wstawki membranowe w przekroju osadzonym mają inną konsystencję, co może zakłócać przekrojowanie.
  6. Umieść 100 mL zlewki pod okap chemiczny, każdy poprawnie oznaczony, aby uwzględnić jeden rekonstruowany model błony śluzowej jelita będący badany. Dodaj 25 ml 35% ETOH do każdej zlewki, a następnie zrekonstruowaną błonę śluzową jelit. Inkubuj przez 10 minut.
  7. Zamień 35% etanolu na 25 mL 50% etanolu i inkubuj przez 10 minut.
  8. Zamień 50% etanolu na 25 mL 70% etanolu i inkubuj przez 10 minut.
  9. Zamień 70% etanolu na 25 mL 80% etanolu i inkubuj przez 10 minut.
  10. Zamień 80% etanolu na 25 ml etanolu 95% i inkubuj przez 10 minut.
  11. Zamień 95% etanolu na 25 ml 100% etanolu i inkubuj przez 10 minut.
  12. Zamień 100% etanolu na kolejną 25 mL wymianę 100% etanolu i inkubuj przez 10 minut.
  13. Umieść 100 ml zlewki pod maską oparową, każda poprawnie oznaczona, aby uwzględnić jeden model w trakcie badania. Dodaj 50 ml ksylenu lub preparatu histologicznego oczyszczającego przez 10-20 minut.
    UWAGA: Zaleca się Histo-Clear (środek oczyszczający histologiczny), ponieważ zwiększa klarowność i żywość barwników kwasowo-filowych. Czas oczyszczania może się różnić w zależności od rekonstruowanej próbki błony śluzowej jelit i należy sprawdzać przezroczystość co 2-3 minuty.
  14. Gdy próbki są przezroczyste, umieść je w metalowym pojemniku na kasetę na papier, który następnie zanurza się w ciekłej parafinie wewnątrz podgrzewanej maszyny na 45 minut.
  15. Wymień parafinę i pozostawij próbki w podgrzewanej maszynie na kolejne 45 minut.
  16. Zdejmij uchwyt na kasetę na chusteczkę i połóż na lodzie, aby ostygł. Gdy schłodzone bloki próbek odłączają się od metalowego uchwytu, można je dodatkowo schładzić w temperaturze pokojowej.
  17. Przechowuj bloki w RT.
    UWAGA: Jeśli celem jest natychmiastowe przygotowanie sekcji, bloki można umieścić w temperaturze 4°C, aby dobrze schłodziły się podczas użycia.
  18. Wytnij przekroje o wymiarach 4 μm za pomocą mikrotomu.
  19. Umieść pocięte fragmenty na pałkach i susz je w piekarniku w 37 °C przez 24 godziny.
  20. Slajdy są gotowe do użycia. Przechowuj je w RT do czasu wykonania histologicznego barwienia H&E lub reakcji immunofienzymatycznej (typ antygen-przeciwciało).
    1. Do barwienia immunofistenchemicznego wybierz przeciwciała zainteresowania (do badania białek TJ, takich jak okludyna, albo do aktywacji, migracji i różnicowania monocytatów) i wykrywaj ekspresję (za pomocą barwienia) za pomocą komercyjnych zestawów.
    2. Podobnie zmierz śluz za pomocą zestawu do barwienia błękitu alckiego i kwasu okresowego Schiffa (PAS).
    3. Ilościowo określ zabarwione białka TJ interesujące, takie jak oklumenyna, obliczając procent dodatnich pikseli na mikrografiach wykonanych z mikroskopu.
    4. Analizuj obrazy komórek za pomocą oprogramowania do analizy obrazu (np. oprogramowania ImageJ2 [Wayne Rasband, wersja 2.9.0/1.53t]).
      1. Aby przeprowadzić analizę pikseli, przetworz cyfrowe obrazy do 300 pikseli na cal i przekonwertuj je na 8 bitów. Następnie przetwarzaj obrazy binarne za pomocą wtyczki Color Deconvolution , aby przeanalizować barwienie interesującego białka, w tym przypadku trwałego czerwonego barwienia okludyny.
      2. Zapisz wybrane zdjęcie jako tiff i poddaj je procedurze "czyszczenia" w celu usunięcia artefaktów za pomocą edytora graficznego (np. Adobe PhotoshopCC [wersja 20.0.4]).
      3. Następnie mierz wszystkie interesujące pola za pomocą aplikacji Analyze Particle of ImageJ2 i raportuj dane jako liczbę pikseli.
        UWAGA: Każdy eksperyment powinien być przeprowadzany w trzech egzemplarzach z trzema wewnętrznymi polami replikacyjnymi dla każdego replikatu. Do ilościowego określenia śluzu tę samą zasadę pomiaru pikseli można zastosować do zdjęć wykonanych odpowiednio na zdjęciach śluzu obojętnego fioletowo-magentowym oraz kwaśnego śluzu o jasnym niebieskim barwieniu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwszym ważnym aspektem jest określenie akceptowalności podstawowej trójwymiarowej równoważnej błony śluzowej jelitowej do celów eksperymentalnych. Jest to wykonywane za pomocą najczęściej stosowanego barwienia w laboratoriach histologicznych i histopatologicznych, mianowicie hematoksylyny (barwi materiał jądrowy głębokim niebiesko-fioletowym) oraz eozyny (barwi materiał cytoplazmatyczny w różnych odcieniach różu). Barwienie H&E najpierw wykonuje się na nieprzeleczonej kontroli, która jest hodowana w tych samych warunk...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podstawowy, zrekonstruowany model błony śluzowej jelit przedstawiony tutaj (Rysunek 6) łączy złożoność fizjologiczną (bardziej istotne fizjologicznie hodowle komórek 3D zawierające monowarstwę Caco-2 z bogatym w ECM podparciem lamina propria zawierającym fibroblasty i monocyty) z eksperymentalną prostotą (wykorzystanie komercyjnych linii komórkowych ludzkich do uzyskania standaryzowanego i łatwo powtarzalnego systemu)13. W związku z tym ten system modelowy jest uznawa...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Fundacji Umberto Veronesi za stypendium wspierające pracę badaczy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Zestaw Alcian Blue/PASScyTek Laboratories, Inc.APS-1, APS-2Zestaw do barwienia immunohistochemicznego
Roztwór Blue TrypanThermo Fisher15250061Analizy liczby komórek
Komórki gruczolakoraka jelita grubego-2ATCCATCC HTB-37Linia komórkowa
Na bazie limonu Citro-Histo-ClearLaboratoria histolinoweR0050CITROOdczynnik do osadzania parafiny
Dulbecco' Zmodyfikowany Eagle Medium (DMEM)GIBCO11965092Odczynnik kolturowy komórkowy
Centrum OsadzaniaLaboratoria histolinoweTEC2900Instrument do osadzania parafiny
Serum bydła płodu (FBS)GIBCOA5256701Odczynnik kolturowy komórkowy
Hanks' Zrównoważony roztwór soli (HBSS)GIBCO12350039Odczynnik kolturowy komórkowy
Zestaw ELISA Human MidkineSpójne nauki biologiczneCEK1270kit ELISA
Mikroskop odwróconyEclipse Ts2, NikonMFA34100Mikroskop
Fibroblasty myszy L929ATCCATCC ®-CCL1Linia komórkowa
LC3-IINovus BiologicalsNB910-40752SuperNovusPackPrzeciwciało
L-GlutaminaGIBCOA2916801Odczynnik kolturowy komórkowy
OklumenynaNovus BiologicalsNBP1-87402Przeciwciało
Parafina Lab-O-Wax PLUS 56 & #176; C– 58 & #176; CLaboratoria histolinoweR0040 PLUSInstrument do osadzania parafiny
Penicylina-StreptomycynaGIBCO15070063Odczynnik kolturowy komórkowy
Penicylina-StreptomycynaGIBCO15070063Odczynnik kolturowy komórkowy
Kolagen typu I z ogonem szczuraGIBCOA1048301Odczynnik kolturowy komórkowy
Medium Instytutu Pamięci Roswell Park (RPMI)GIBCO21870076Odczynnik kolturowy komórkowy
Pirorotroczan soduGIBCO11360070Odczynnik kolturowy komórkowy
Automatyczny licznik komórek Thermo Fisher Countess II FLThermo FisherTF-CACC2FLInstrument do liczenia komórek
TranswellWspółgwiazda Corning3413Plastik do koltury komórkowej
TrypsynaGIBCO15090046Odczynnik kolturowy komórkowy
U937 to pro-monocytowa, ludzka linia komórkowa białaczki szpikowejATCCATCC CRL-1593.2Linia komórkowa
UltraTek Alk-Phos Anti-Polyvalent (permanentna czerwień) do bejcScyTek Laboratories, Inc.AMH080Zestaw do barwienia immunohistochemicznego

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chelakkot, C., Ghim, J., Ryu, S. H. Mechanisms regulating intestinal barrier integrity and its pathological implications. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
  2. Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909(1909).
  3. Bednarek, R. In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers. Methods and Protocols. 5 (1), 17(2022).
  4. Suzuki, T. Regulation of the intestinal barrier by nutrients: The role of tight junctions. Animal Science Journal. 91 (1), e13357(2020).
  5. Guibourdenche, M., et al. Food contaminants effects on an in vitro model of human intestinal epithelium. Toxics. 9 (6), 135(2021).
  6. Panwar, S., Sharma, S., Tripathi, P. Role of barrier integrity and dysfunctions in maintaining the healthy gut and their health outcomes. Frontiers in Physiology. 12, 715611(2021).
  7. Truzzi, F., et al. Pro-inflammatory effect of gliadins and glutenins extracted from different wheat cultivars on an in vitro 3D intestinal epithelium model. International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 172(2020).
  8. Fedi, A., et al. In vitro models replicating the human intestinal epithelium for absorption and metabolism studies: A systematic review. Journal of Controlled Release. 335, 247-268 (2021).
  9. De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761(2021).
  10. Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell & Bioscience. 12 (1), 155(2022).
  11. Russell, W., Burch, R. The principles of humane experimental technique. Available online. , http://altweb.jhsph.edu/pubs/books/humane_exp/het-toc (2023).
  12. Ingber, D. E. Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies. Advanced Science. 7 (22), 2002030(2020).
  13. Jung, S. M., Kim, S. In vitro models of the small intestine for studying intestinal diseases. Frontiers in Microbiology. 12, 767038(2022).
  14. Nitsche, K. S., Müller, I., Malcomber, S., Carmichael, P. L., Bouwmeester, H. Implementing organ-on-chip in a next-generation risk assessment of chemicals: a review. Archives of Toxicology. 96 (3), 711-741 (2022).
  15. Kekilli, M., et al. Midkine level may be used as a noninvasive biomarker in Crohn's disease. Turkish Journal of Medical Sciences. 50, 324-329 (2020).
  16. Truzzi, F., et al. Spermidine-eugenol supplement preserved inflammation-challenged intestinal cells by stimulating autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 4131(2023).
  17. Truzzi, F., et al. Are supplements safe? Effects of gallic and ferulic acids on in vitro cell models. Nutrients. 12 (6), 1591(2020).
  18. Buckley, A. G., et al. Visualisation of multiple tight junctional complexes in human airway epithelial cells. Biological Procedures. Online. 20, 3(2018).
  19. Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Review of Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3D Intestinal ModelIn Vitro IntestineCaco 2 CellsU937 MonocytesL929 FibroblastsParaffin EmbeddingTight Junction ProteinsGluten Induced InflammationOccludin StainingImmune Cell Migration

Related Articles