Ten protokół opisuje model kriouszkodzeń w celu wywołania głębokiego uszkodzenia kilku miomerów ogonowych u dorosłego danio pręgowanego. Metoda ta zapewnia nowe podejście do badania regeneracji mięśni szkieletowych po ciężkiej utracie tkanki u kręgowców innych niż ssaki.
Artykuł metodologiczny
Model kriouszkodzeń do badania regeneracji mięśni szkieletowych szypułki ogonowej u dorosłych danio pręgowanych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mięśnie szkieletowe przechodzą odnowę i odbudowę po drobnych urazach poprzez aktywację satelitarnych komórek macierzystych. Ciężkie urazy mięśni często prowadzą do zwłóknienia u ludzi. W porównaniu ze ssakami, danio pręgowany ma wyższą wrodzoną zdolność do regeneracji narządów, co stanowi potężny model do badania odbudowy tkanek po rozległym uszkodzeniu narządu. Tutaj opisano model kriouszkodzenia, który wywołuje głębokie uszkodzenie czterech miomerów szypułki ogonowej u dorosłego danio pręgowanego. Wykonana na zamówienie kriosonda została zaprojektowana tak, aby pasowała do kształtu ciała i powtarzalnie uszkadzała mięśnie boczne od skóry do linii środkowej. Co ważne, integralność ciała pozostała nienaruszona, a ryby kontynuowały swoją aktywność pływacką. Zmiany w mięśniach szkieletowych oceniano za pomocą barwienia histologicznego i barwienia fluorescencyjnego białek sarkomerowych na skrawkach tkanek. Metoda ta otworzy nowe kierunki badań mających na celu zrozumienie, w jaki sposób degeneracja mięśni szkieletowych indukuje reakcje naprawcze, a tym samym reaktywację programu miogennego u dorosłych danio pręgowanego.
Wprowadzenie
U kręgowców uszkodzone części różnych tkanek przechodzą odnowę homeostatyczną i odbudowę w ciągu całego życia. Ta zdolność do odnawiania i odbudowy zazwyczaj zależy od obecności kompetentnych komórek macierzystych lub zdolności proliferacyjnej dojrzałych komórek1,2. Mięśnie szkieletowe składają się z postmitotycznych włókien mięśniowych, które są związane z lokalnymi komórkami macierzystymi, zwanymi komórkami satelitarnymi3,4,5,6. W ten sposób tkanka ta zawiera źródła komórkowe do skutecznego uszczelniania obszarów przerwanej ciągłości lub do naprawy drobnych ran. Jednak po większych stratach objętościowych w mięśniach szkieletowych ssaków często następuje naprawa nieregeneracyjna, taka jak zwłóknienie7. Modele zwierzęce mogą dostarczyć nowych informacji na temat mechanizmów biologicznych, które sprzyjają regeneracji rozlegle uszkodzonych narządów.
Danio pręgowany to dobrze znany organizm modelowy o wysokiej zdolności regeneracyjnej. Dorosłe rybo pręgowane mogą zregenerować amputowaną część płetwy ogonowej lub wycięty wierzchołek komory serca8,9,10,11. Ponadto metoda kriouszkodzeń została wcześniej zastosowana do badania regeneracji płetw i serca u danio pręgowanego12,13,14,15. W przypadku narządów wewnętrznych metoda kriouszkodzeń ma tę zaletę, że indukuje śmierć komórki bez naruszania integralności narządu, naśladując w ten sposób warunki fizjologiczne16,17. Szczątki tkankowe są rozkładane przez naturalny klirens podczas gojenia się ran, po którym następują procesy naprawcze. Nie wiadomo jednak, czy metodę tę można zastosować do mięśni szkieletowych.
U ryb muskulatura boczna umożliwia zginanie tułowia na boki podczas pływania18. Mięśnie szkieletowe są zorganizowane w jednostki metameryczne, zwane miomerami, które są oddzielone tkanką łączną5,19. Danio pręgowany może regenerować mięśnie po drobnych zakłóceniach tkanek, takich jak te spowodowane ablacją laserową lub raną kłutą20,21,22,23,24, ale nie wiadomo, czy całe miomery mogą się zregenerować po rozległym urazie. Ta luka w wiedzy wynika prawdopodobnie z braku odpowiedniego modelu urazu. Protokół ten ustanawia nowe podejście do wywoływania rozległych uszkodzeń mięśni szkieletowych, obejmujących wiele miomerów. Opisana metoda kriouszkodzeń opiera się na szybkim zamrażaniu i rozmrażaniu włókien mięśniowych za pomocą wstępnie schłodzonego instrumentu ze stali nierdzewnej. Pomimo rozległych uszkodzeń dobrostan ryb nie został poważnie pogorszony. Całe miomery mogą zostać odtworzone, a zatem praca ta dostarcza nowego systemu modelowego do badania mechanizmów regeneracji mięśni u dorosłych ryb danio pręgowanego.
Protokół
To badanie zostało przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi przepisami etycznymi. Danio pręgowany był hodowany, hodowany i utrzymywany zgodnie z wytycznymi Federacji Europejskich Stowarzyszeń Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (FELASA)25. Pomieszczenia dla zwierząt i wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez kantonalny urząd weterynaryjny we Fryburgu w Szwajcarii.
1. Wyposażenie i konfiguracja
- Zorganizuj produkcję kriosondy ze stali nierdzewnej w warsztacie technicznym, który może wytwarzać instrumenty do badań.
UWAGA: Podaj projekt instrumentu o określonych wymiarach (Rysunek 1A). - Aby uniknąć odmrożeń podczas obsługi sondy podczas zabiegu, włóż uchwyt do końcówki pipety i owiń go taśmą.
- Przygotuj zlewkę na roztwór roboczy do znieczulenia, łyżkę do obchodzenia się z rybą, wilgotną gąbkę i zbiornik z wodą systemową, aby ryba mogła dojść do siebie po zabiegu.
- Przygotuj roztwór roboczy na świeżo przed każdym eksperymentem. Aby przygotować roztwór roboczy, dodać 4 ml roztworu podstawowego Trikainy do 100 ml wody systemowej w zlewce.
UWAGA: Podstawowy roztwór znieczulający składa się z 4 g trikainy rozpuszczonej w 980 ml wody destylowanej. Po dostosowaniu pH do 7 za pomocą 1 M Tris-HCl, pH 9, napełnić roztwór do 1 l wodą destylowaną. Roztwór podstawowy jest wrażliwy na światło i powinien być przechowywany w temperaturze 4 °C w bursztynowej butelce.
2. Procedura kriouszkodzenia mięśni
- Procedurę należy rozpocząć od zanurzenia sondy w ciekłym azocie na minimum 3 minuty. Zwilż gąbkę w wodzie systemowej i umieść ją na płaskiej powierzchni.
- Przenieś pojedynczego dorosłego danio pręgowanego do roztworu roboczego Tricaine i potwierdź jego brak reakcji, delikatnie dotykając ryby łyżką po 1 minutach lub 2 minutach. Jeśli ryba jest nadal reaktywna, poczekaj trochę dłużej.
- Umieść znieczuloną rybę na mokrej gąbce. Zlokalizuj szypułkę ogonową za płetwą odbytową i przed płetwą ogonową.
- Wyjmij kriosondę z ciekłego azotu. Delikatnie potrząśnij sondą, aby upewnić się, że na końcówce nie pozostały resztki ciekłego azotu.
- Umieść krawędź szpatułki prostopadle do ciała na szypułce ogonowej (Rysunek 1C). Utrzymuj sondę w tej pozycji przez 6 sekund bez wywierania nacisku (Rysunek 1D).
UWAGA: Waga kriosondy jest wystarczająca, aby zapewnić kontakt między instrumentem a tkanką. - Uwolnij kriosondę z tkanki i przenieś rybę do zbiornika z wodą systemową.
- Monitoruj rybę, gdy wznawia oddychanie i pływanie po przebudzeniu ze znieczulenia. Jeśli ruchy operkularne nie wystąpią po 30 sekundach, stymuluj rybę, pipetując wodę z systemu do skrzeli, aż zwierzę samo rozpocznie oddychanie.
UWAGA: Ryba powinna wznowić pływanie w ciągu kilku minut w zbiorniku regeneracyjnym.
UWAGA: W kolejnych dniach ryby można filmować w celu monitorowania ich aktywności pływackiej (Wideo 1 i Wideo 2). Przed nagraniem wideo przenieś ryby kontrolne i ranne do półprzezroczystego zbiornika godowego i pozwól im przyzwyczaić się przez co najmniej 1 minutę.
3. Zbieranie i utrwalanie szypułki ogonowej
- Przygotuj 2 ml 4% formaliny lub innego utrwalacza, który jest odpowiedni do kolejnych testów, szalkę Petriego, kleszcze i nożyczki chirurgiczne.
- Poddaj rybę eutanazji w wybranym punkcie czasowym po kriourazie zgodnie z pozwoleniem prawnym wydanym przez regionalne biuro weterynaryjne.
UWAGA: Eutanazja polega na przedawkowaniu roztworu tricainy (300 mg/l) przez około 10 minut. Utrata ruchu skrzeli i odruch szczypania płetwy ogonowej potwierdzają śmierć. Punkty czasowe eutanazji powinny być dobrane w zależności od fazy regeneracji: na przykład od 1 dnia po kriourazie (dpci) do 3 dpci w celu usunięcia rany; od 3 dpci do 10 dpci w celu zainicjowania regeneracji mięśni; od 10 dpci do 30 dpci dla postępującej regeneracji; i po 30 dpci w celu zakończenia odbudowy tkanki. Tak więc, aby ocenić różne etapy i procesy biologiczne degeneracji i regeneracji mięśni, grupy ryb muszą zostać poddane eutanazji w różnych punktach czasowych po kriourazie. - Umieść uśpioną rybę na szalce Petriego zawierającej wodę dejonizowaną. Użyj nożyczek, aby wykonać cięcie przez ciało z przodu i z tyłu szypułki ogonowej (Rysunek 1E). Pozwól, aby tkanka wykrwawiła się w dejonizowanej wodzie na szalce Petriego.
- Zebrać szypułkę ogonową i przenieść ją kleszczami do przygotowanego roztworu utrwalającego w probówce do mikrowirówki.
UWAGA: Ostrożnie odwróć probówki kilka razy i przechowuj je przez noc w temperaturze 4 °C.
4. Montaż szypułki ogonowej
- Umyj utrwaloną chusteczkę w 1x PBS przez 10 minut na bujaku. Następnie przenieś ją do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml ze wstępnie schłodzoną 30% sacharozą w wodzie dejonizowanej o temperaturze 4 °C i delikatnie odwróć probówkę kilka razy. Probówki do mikrowirówek należy pozostawić w pozycji pionowej na co najmniej 24 godziny w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Szypułka ogonowa będzie unosić się na roztworze sacharozy i zacznie opadać, gdy tkanka się odwadnia. - Wypełnij formę do zatapiania 5 mm warstwą podłoża montażowego OCT. Użyj kleszczy, aby wyregulować szypułkę ogonową w podłożu. Umieść go na dole formy i dostosuj jego orientację do przekroju poprzecznego lub czołowego (Rysunek 1F).
- Pozwól pożywce zamarznąć w pudełku z suchym lodem. Gdy tylko tkanka ustabilizuje się w żądanej pozycji, wypełnij resztę formy, zanim O.C.T. całkowicie zamarznie. Przechowuj formę przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze -80 °C.
UWAGA: W tych warunkach tkanki mogą być przechowywane przez wiele miesięcy.
5. Cięcie odcinków kriostatem
- Ustaw kriostat o grubości cięcia 25 μm. Ustaw temperaturę komory na −26°C, temperaturę próbki na −24°C, a kąt cięcia na 12°.
- Umieść zamrożony blok z próbką w kriostacie i ustal jego orientację, aby ciąć równolegle do dna bloku. Tnij, aż dotrzesz do próbki, a następnie przytnij blok, aby ułatwić pobieranie próbki.
- Przygotuj sześć szkiełek adhezyjnych. Oznaczyć szkiełka kolejnymi numerami w celu przygotowania powtórzeń próbki.
- Rozpocznij cięcie i zbierz skrawki tkanki na oznaczonych szkiełkach adhezyjnych. Ułóż sekcje na slajdach zgodnie z dalszymi wymaganiami eksperymentalnymi.
- Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przechowywać je w zamkniętych opakowaniach w temperaturze -20 °C.
UWAGA: Szkiełka można bezpiecznie przechowywać w tym stanie do 1 roku.
Wyniki
Monitorowanie ryb po kriourazie
Aby określić wpływ kriourazu miomerów na zwierzęta, wykonano nagrania wideo ryb z grupy kontrolnej oraz ryb z kriourazem w 1. dniu po kriourazie (dpci) oraz w 5. dniu po kriourazie (dpci). Każda grupa składała się z pięciu ryb. W 1. dpci ryby z kriourazem pływały mniej aktywnie, ale nie wykazywały żadnych nieprawidłowych ruchów, takich jak wirowanie, konwulsje czy zaburzenia równowagi (Wideo 1). W systemie hodowlanym ich pozycja w zbiorniku oraz pobieranie pokarmu były zbliżone do tych obserwowanych u ryb nieurazowanych. Prawidłowe zachowanie utrzymywało się w kolejnych dniach, co zilustrowano na nagraniu z 5. dpci (Wideo 2). Podsumowując, procedura kriourazu ogonka nie wpłynęła znacząco na dobrostan zwierząt.
Analiza histologiczna przekrojów ogonka ogonowego
W celu oceny zakresu uszkodzenia wybrano punkt czasowy 4 dpci, ponieważ w tym momencie szczątki włókien mięśniowych zostają całkowicie wchłonięte w ranie. Aby przeanalizować skutki kriouszkodzenia wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej i przednio-tylnej ciała, wykorzystano dwie grupy ryb (odpowiednio: przekroje czołowe i poprzeczne ogonka ogonowego) (Rysunek 1F).
Przekroje analizowano za pomocą barwienia trichromowego składającego się z błękitu anilinowego, fuksyny kwasowej i pomarańczowego G (AFOG). Przy zastosowaniu tej kombinacji odczynników nienaruszone mięśnie barwiły się na pomarańczowo, rdzeń kręgowy na ciemnoczerwono, a macierz kolagenowa na niebiesko. Aby określić liczbę uszkodzonych miomerów, które są jednostkami metamerycznymi mięśni ryb, przeanalizowano serię przekrojów (Rysunek 2). Granice miomerów, zwane myokommatami, zidentyfikowano na podstawie złogów kolagenu, wykrytych dzięki niebieskiemu zabarwieniu. Obszary uszkodzone określono na podstawie braku pomarańczowego barwienia. Dokładniejsza analiza okazów z wyraźnymi myokommatami wykazała, że uszkodzone były około cztery kolejne miomery, co wywnioskowano z braku pomarańczowego barwienia (n, liczba ryb = 4; Rysunek 3A,A'). Nienaruszona strona tej samej ryby służyła jako referencja wewnętrzna.
Aby zbadać głębokość rany prostopadle do osi ciała, przygotowano przekroje poprzeczne z rybek zebrafish w 4 dpci i 7 dpci. Ten drugi punkt czasowy odpowiada aktywacji programu miogenicznego, a tym samym rozpoczynaniu regeneracji mięśni. Barwienie AFOG tych preparatów wykazało rozległy brak barwienia pomarańczowego w krio-uszkodzonym boku ciała, co wyznaczyło strefę zdegenerowanego mięśnia szkieletowego (Rysunek 3B,C). W 4 dpci i 7 dpci obszar rany obejmował tkanki od skóry w kierunku przegrody pionowej. Świadczy to o tym, że metoda krio-uszkodzenia głęboko celowała w jedną połowę boczną ogonka ogonowego, która pozostawała pozbawiona funkcjonalnego mięśnia przez 7 dni po zabiegu. Podsumowując, po jednej stronie ogonka ogonowego głęboko uszkodzone zostały cztery miomery.
Analiza immunofluorescencyjna przekrojów poprzecznych
W celu oceny dynamiki regeneracji mięśni, grupy eksperymentalne ryb poddano eutanazji w 4, 7, 10 i 30 dpci. Przekroje poprzeczne ogonka ogonowego oznakowano za pomocą wielokolorowego barwienia fluorescencyjnego z użyciem faloidyny (która wiąże się z aktyną filamentarną [F-actin]), przeciwciała przeciwko tropomiozynie-1, która wykrywa białko sarkomerów, oraz DAPI, służącego do barwienia jąder komórkowych. We wszystkich punktach czasowych nieuszkodzona połowa ciała służyła jako kontrola wewnętrzna; zarówno F-actin, jak i tropomiozyna 1 były silnie wykrywane w nieuszkodzonych częściach kontrolnych, co wskazuje na nieuszkodzoną tkankę (Rysunek 4).
W 4 dpci po stronie uszkodzonej ogona zawierało liczne komórki wybarwione DAPI, lecz nie zaobserwowano lub zaobserwowano niewielką immunofluoroscencję F-aktyny i tropomiozyny 1, co wskazywało na strefę rany z degenerującymi się mięśniami (Rycina 4A-B'). W 7 dpci tropomiozynę 1 i F-aktynę można było wykryć w części rany blisko pionowej linii środkowej ciała (Rycina 4C-D'). Ten wzorzec ekspresji wyznacza miejsce, w którym w ogonie rozpoczyna się tworzenie nowych włókien mięśniowych. W 10 dpci oba markery mięśniowe rozszerzyły się w kierunku powierzchni ciała, co sugeruje postępującą regenerację mięśni szkieletowych (Rycina 4E-F'). W 30 dpci po obu stronach ciała widoczny był podobny rozkład barwienia F-aktyny (Rycina 4G-H'). Wynik ten wskazuje, że mięśnie szkieletowe zostały efektywnie odtworzone po kriotraumatyzacji ogona.
Rysunek 1: Układ eksperymentalny dla krioobrzwy miomeru. (A) Wymiary specjalnie wykonanej kriosondy z nierdzewnej stali. Dystalna część instrumentu składa się z łopatki z wklęsłą krawędzią na głębokości 1 mm, aby uwzględnić krzywiznę ciała zebrafish. Środkowa część narzędzia obejmuje cylinder, który pełni funkcję obciążnika i zbiornika utrzymującego niską temperaturę łopatki podczas procedury. Proksymalny koniec instrumentu ma postać cienkiego metalowego uchwytu. (B,C) Zznieczone dorosłe ryby na wilgotnej gąbce z kriosondą na szypule ogonowej. Sonda znajdowała się w temperaturze pokojowej. (B) Krawędź sondy jest umieszczona poziomo w pobliżu szypuły ogonowej, aby pokazać relatywny rozmiar ryby w stosunku do narzędzia. (C) W celu wykonania krioobrzwy końcówka narzędzia jest ustawiona prostopadle do ryby. (D) Schematyczna ilustracja procedury krioobrzwy od strony brzusznej ryby, przedstawiająca manipulacje w sposób kompleksowy. Kriosonda została uprzednio schłodzona w ciekłym azocie i natychmiast przyłożona do jednego boku ryby na 6 s. (E) W określonym punkcie czasowym po krioobrzwie ryby zostały uśmiercone, a ich szypuły ogonowe pobrano do utrwalania. (F) Utrwalony materiał został poddany obróbce histologicznej i pocięty w płaszczyznach czołowych lub poprzecznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Analiza histologiczna uszkodzonych miomerów w ogonie, od strony grzbietowej do brzusznej ciała. Barwienie AFOG serii przekrojów czołowych w 4 dni po kriourazie (dpci). Przekroje wykonano od strony grzbietowej w kierunku brzusznej, co zaznaczono na górze pierwszego i ostatniego panelu. Przekroje nie są sąsiadujące, a odstęp między nimi wynosi około 150 µm. Nieuszkodzony mięsień rozpoznaje się po pomarańczowym barwieniu, natomiast tkanka uszkodzona nie wykazuje tego barwienia i ma kolor szarawy (obszar otoczony przerywaną linią). Tkanki zawierające kolagen, takie jak skóra, są zabarwione na niebiesko. Rdzeń kręgowy widoczny jest jako struktura pręcikowata i zabarwiony na czerwono. Liczba ryb, n = 4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rycina 3: Ocena głębokości urazu w ogonowej części ciała przy użyciu barwienia AFOG.(A,A') Przekrój czołowy na poziomie rdzenia kręgowego (czerwona pozioma prętowata struktura). Dolny obraz przedstawia powiększony obszar objęty ramką na górnym obrazie. Kolejne granice miomerów widoczne są jako kolagenowe pasma (niebieskie), ułożone ukośnie względem rdzenia kręgowego (czerwone strzałki na powiększonym obrazie A').(B,C) Przekroje poprzeczne przedstawiają nieuszkodzony bok z mięśniami zabarwionymi na pomarańczowo oraz bok po urazie kriogenicznym z zabarwieniem szarym. Obszar uszkodzony obwiedziono czarną przerywaną linią. Przegroda pionowa (oznaczona czerwoną przerywaną linią) dzieli ciało na stronę kontrolną i stronę z urazem kriogenicznym. Liczba ryb, n = 4 dla każdego punktu czasowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Detekcja immunofluorescencyjna białek mięśniowych po urazie krioindukowanym. Barwienie fluorescencyjne przekrojów w 4 dpci, 7 dpci, 10 dpci i 30 dpci, zgodnie z oznaczeniami po lewej stronie i na górze paneli (A-B'). W 4 dpci tkanka uszkodzona (otoczona przerywaną linią) jest DAPI-dodatnia (niebieska), lecz pozbawiona barwienia faloidyną (zielona) lub immunoreaktywności tropomiozyny-1 (czerwona), co sugeruje degenerację włókien mięśniowych po urazie krioindukowanym. (C-D') W 7 dpci oba markery mięśniowe stopniowo pojawiają się w obszarze rany, co wskazuje na proces regeneracji. Tropomiozyna-1 wykazuje większą intensywność niż F-aktyna w nowo powstałych włóknach. (E-F') W 10 dpci strefa urazu jest wypełniona nowymi miofibrymi, które wykazują wyższą intensywność immunoreaktywności tropomiozyny-1 w porównaniu do F-aktyny. (G-H') W 30 dpci podobny wzorzec miofibry jest wykrywalny po obu stronach ciała. Ramki w panelach A, C, E i H obejmują obszary powiększone na sąsiednich obrazach po prawej stronie. Łuski skóry, emitujące fluorescencję poza miomerem, zostały usunięte z obrazów za pomocą programu Adobe Photoshop. Liczba ryb, n = 4 dla każdego punktu czasowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Danio pręgowany stanowi model organizmu kręgowców anamniote do badania mechanizmów regeneracji mięśni. Większość istniejących metod urazów, takich jak ablacja laserowa lub ranienie kłute, powoduje stosunkowo niewielkie uszkodzenie tkanek 20,21,22,23. Duże resekcje przeprowadzono na mięśniu zewnątrzgałkowym26. Jednak to podejście chirurgiczne byłoby prawdopodobnie mniej odpowiednie dla mięśni bocznych ze względu na zagrożenia dla zdrowia związane z przecięciem ściany ciała. Aby uniknąć takich inwazyjnych procedur, protokół ten opisuje łagodniejszą formę urazu, która jednak prowadzi do głębokiego uszkodzenia szypułki ogonowej. Podejście to opiera się na powierzchownej manipulacji, która pozwala na bardzo precyzyjne ukierunkowanie kilku miomerów po jednej stronie ciała. Mocne strony modelu kriourazów polegają na jego odtwarzalności i zdolności do wywoływania rozległej degeneracji mięśni; Opierając się na tych mocnych stronach, model ten zapewnia nową ścieżkę do badania, jak organizm reaguje na znaczną utratę mięśni.
Zastosowanie ekstremalnego zimna prowadzi do szoku termicznego, który niszczy błonę plazmatyczną i organelle w dotkniętej tkance mięśniowej27. W rezultacie uszkodzone włókna mięśniowe ulegają "przypadkowej" śmierci komórki28. W związku z tym uszkodzona tkanka może zostać wchłonięta przez naturalne mechanizmy oczyszczania rany. Danio pręgowany dobrze znosi procedurę kriouszkodzenia, ponieważ wskaźnik przeżycia w tym badaniu wynosił prawie 100%, biorąc pod uwagę, że wstępnie schłodzona sonda była prawidłowo umieszczona na ciele przez dokładny czas. Jeśli jednak rana jest zbyt rozległa (np. jeśli zostanie przyłożony zbyt duży nacisk lub czas trwania kriouszkodzenia jest zbyt długi), ryba może wykazywać nieprawidłowe ruchy pływania wkrótce po zabiegu, a zwierzę powinno zostać poddane eutanazji jako humanitarny punkt końcowy. W przypadku innych gatunków ryb czas ekspozycji na kriosondę należy dostosować do wielkości ciała.
Po kriourazie ryby mogą wznowić aktywność pływacką bez żadnych objawów nieprawidłowego ruchu. Jednak ryby kriouszkodzone pływają mniej dynamicznie niż ryby kontrolne, co wskazuje na pewne łagodne upośledzenia. Dalsza kwantyfikacja zachowania ryb w różnych punktach czasowych po kriourazie będzie konieczna, aby określić czasowe zmiany w wydajności pływania.
Wpływ metody kriouszkodzeń na inne niemięśniowe tkanki szypułki ogonowej pozostaje do wyjaśnienia. Oczywiście najbardziej zewnętrzna warstwa ciała (tj. skóra) jest uszkadzana przez zabieg. W tym kontekście metoda kriourazów może zapewnić nową strategię badania gojenia się ran, regeneracji łuski i przywracania wzoru pigmentacji. Co więcej, kriouszkodzenie może również wpływać na unaczynienie i unerwienie miomerów, a tematy te wymagają dalszych badań.
Model kriouszkodzeń był wcześniej używany do badania regeneracji serca danio pręgowanego 13,14,15,29. Metoda ta wykazała pewne zalety w porównaniu z metodą resekcji komorowej10 ze względu na przejściowe odkładanie się blizny bogatej w kolagen, która lepiej naśladuje reakcję gojenia się zawału u ludzi30. Co ciekawe, danio pręgowany może zregenerować swoje serce po licznych kriourazach31. Co ciekawe, kriouraz został również zastosowany do płetwy danio pręgowanego, co spowodowało procesy histolityczne12. W przeciwieństwie do klasycznej amputacji płetwy, pozostały kikut kriouszkodzony zawiera zniekształcony brzeg z mieszaniną martwego materiału i zdrowych komórek. Badania na obu narządach danio pręgowanego, sercu i płetwie, ujawniły potężną zdolność danio pręgowanego do przywracania ich pierwotnych składników funkcjonalnych nawet po rozległym uszkodzeniu tkanek. To, czy kriouszkodzony mięsień szkieletowy aktywuje wzajemne oddziaływanie między procesami naprawczymi i regeneracyjnymi, zasługuje na przyszłe badania.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy V. Zimmermannowi za opiekę nad rybami, a także dr Thomasowi Bise, dr Catherine Pfefferli i Lei Gigon za zainicjowanie tego projektu i ich wstępne wyniki. Prace te były wspierane przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki, grant o numerze 310030_208170.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Program | |||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Photoshop Wersja 23.5.3 | Adobe | ||
| Materiał/ Sprzęt | |||
| 35/10 mm Szalka Petriego | Greiner Bio-one | Przedmiot nr 627102 | |
| Aparat fotograficzny | Sony | / | HDR-PJ410 |
| Cryostat | Histcom | HRA C50 | |
| Formaldehyd ~36% | Sigma-Aldrich | 47630 | |
| Makro 50 mm f/2.8 EX DG | obiektyw Sigma | / | Wycofany z produkcji |
| Peel-A-Way Osadzanie Ścięte formy T8 | Polyscience, Inc. | 18985 | |
| Slajdy Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Gąbka | dowolna | dowolna | płaska gąbka, ok. 7 cm x 3 cm x 1 cm |
| Kriosonda ze stali nierdzewnej | Wykonane na zamówienie | / | szczegóły w artykule |
| Sacharoza | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Nożyczki chirurgiczne | Dowolne | / | |
| TCS SP2 | Leica | / | Discontinoued produkt |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tricaine (Anestethic) | Sigma | E10521 | |
| Barwniki i przeciwciała | |||
| Dapi | Sigma | 10236276001 | Stężenie: 1/2000 |
| Phalloidin-Atto-565 (F-aktyna) | Sigma | 94072 | Stężenie: 1 / 500 |
| Tropomiozyna (TPM1) | DHSB | CH1 | Stężenie: 1 / 50 |
| Przepisy/Roztwory | |||
| 1x PBS | 123 mM NaCl | Sigma | |
| 2,7 mM KCl | Sigma | ||
| 10 mM Na2HPO4 | Sigma | ||
| 1,8 mM KH2PO4 | Sigma | ||
| AFOG roztwór | 3 g Fuchsin | Fisher Scientific | |
| 2 g Pomarańczowy G | Sigma | ||
| 1 g Błękit anilinowy | Fulka AG | ||
| 200 ml Nasycony destylowany H2O (pH 1,1) |
Bibliografia
- Muneoka, K., Allan, C. H., Yang, X., Lee, J., Han, M. Mammalian regeneration and regenerative medicine. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 84 (4), 265-280 (2008).
- Carlson, B. M. Some principles of regeneration in mammalian systems. Anatomical Record. Part B, New Anatomist. 287 (1), 4-13 (2005).
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. -C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692(2021).
- Tulenko, F. J., Currie, P. Zebrafish myology. The Zebrafish in Biomedical Research. Cartner, S. C. , Academic Press. Cambridge, MA. 115-121 (2020).
- Siegel, A. L., Gurevich, D. B., Currie, P. D. A myogenic precursor cell that could contribute to regeneration in zebrafish and its similarity to the satellite cell. The FEBS Journal. 280 (17), 4074-4088 (2013).
- Corona, B. T., Wenke, J. C., Ward, C. L. Pathophysiology of volumetric muscle loss injury. Cells Tissues Organs. 202 (3-4), 180-188 (2016).
- Pfefferli, C., Jaźwińska, A. The art of fin regeneration in zebrafish. Regeneration. 2 (2), 72-83 (2015).
- Sehring, I. M., Weidinger, G. Recent advancements in understanding fin regeneration in zebrafish. WIREs Developmental Biology. 9 (1), 367(2020).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
- Sanz-Morejón, A., Mercader, N. Recent insights into zebrafish cardiac regeneration. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 37-43 (2020).
- Chassot, B., Pury, D., Jaźwińska, A. Zebrafish fin regeneration after cryoinjury-induced tissue damage. Biology Open. 5 (6), 819-828 (2016).
- Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jaźwińska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Developmental Biology. 11, 21(2011).
- Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), e18503(2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
- Ryan, R., Moyse, B. R., Richardson, R. J. Zebrafish cardiac regeneration-Looking beyond cardiomyocytes to a complex microenvironment. Histochemistry and Cell Biology. 154 (5), 533-548 (2020).
- Jaźwińska, A., Sallin, P. Regeneration versus scarring in vertebrate appendages and heart. Journal of Pathology. 238 (2), 233-246 (2016).
- Alexander, R. The orientation of muscle fibres in the myomeres of fishes. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 49, 163-290 (1969).
- Morin-Kensicki, E. M., Melancon, E., Eisen, J. S. Segmental relationship between somites and vertebral column in zebrafish. Development. 129 (16), 3851-3860 (2002).
- Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
- Montandon, M., Currie, P. D., Ruparelia, A. A. Examining muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62071(2021).
- Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
- Ratnayake, D., et al. Macrophages provide a transient muscle stem cell niche via NAMPT secretion. Nature. 591 (7849), 281-287 (2021).
- Kaliya-Perumal, A. -K., Ingham, P. W. Musculoskeletal regeneration: A zebrafish perspective. Biochimie. 196, 171-181 (2022).
- Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Laboratory Animals. 54 (3), 213-224 (2019).
- Saera-Vila, A., et al. Myocyte dedifferentiation drives extraocular muscle regeneration in adult zebrafish. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4977-4993 (2015).
- Baust, J. G., Gage, A. A. The molecular basis of cryosurgery. BJU International. 95 (9), 1187-1191 (2005).
- Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).
- Chablais, F., Jaźwińska, A. Induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury. Journal of Visualized Experiments. (62), e3666(2012).
- Chablais, F., Jaźwińska, A. The regenerative capacity of the zebrafish heart is dependent on TGFbeta signaling. Development. 139 (11), 1921-1930 (2012).
- Bise, T., Sallin, P., Pfefferli, C., Jaźwińska, A. Multiple cryoinjuries modulate the efficiency of zebrafish heart regeneration. Scientific Reports. 10 (1), 11551(2020).
Przedruki i uprawnienia
