Method Article

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w plemnikach ludzkich

DOI:

10.3791/65493

⸱

June 23rd, 2023

 ,  , 
1Departamento de Histología y Embriología, Unidad Académica Histología y Embriología, 2Departamento de Bioquímica, Unidad Académica Bioquímica, 3Centro de Investigaciones Biomédicas (CEINBIO), Facultad de Medicina, Universidad de la República

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza funkcji mitochondriów plemników za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości pozwala na pomiar zużycia tlenu przez swobodnie poruszające się plemniki w systemie zamkniętym komorowym. Technika ta może być stosowana do pomiaru oddychania w plemnikach ludzkich, co dostarcza informacji na temat cech mitochondriów i integralności plemników.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jakość nasienia jest często badana za pomocą rutynowych analiz nasienia, które są opisowe i często niejednoznaczne. Niepłodność męska wiąże się ze zmienioną aktywnością mitochondriów plemników, więc pomiar funkcji mitochondriów plemników jest wskaźnikiem jakości nasienia. Respirometria o wysokiej rozdzielczości to metoda pomiaru zużycia tlenu przez komórki lub tkanki w układzie zamkniętym komorowym. Technika ta może być stosowana do pomiaru oddychania w ludzkim nasieniu i dostarcza informacji o jakości i integralności mitochondriów plemników. Respirometria o wysokiej rozdzielczości pozwala komórkom na swobodne poruszanie się, co jest a priori zaletą w przypadku plemników. Technika ta może być stosowana w przypadku nienaruszonych lub przepuszczalnych plemników i pozwala na badanie nienaruszonej funkcji mitochondriów plemników oraz aktywności poszczególnych kompleksów łańcuchów oddechowych. Przyrząd oksygraficzny o wysokiej rozdzielczości wykorzystuje czujniki do pomiaru stężenia tlenu w połączeniu z czułym oprogramowaniem do obliczania zużycia tlenu. Dane służą do obliczania wskaźników oddechowych na podstawie wskaźników zużycia tlenu. W związku z tym wskaźniki są proporcjami dwóch wskaźników zużycia tlenu i są wewnętrznie znormalizowane do liczby komórek lub masy białka. Wskaźniki oddechowe są wskaźnikiem funkcji i dysfunkcji mitochondriów plemników.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szacuje się, że niepłodność męska stanowi 40%-50% wszystkich przypadków niepłodności u par1. Konwencjonalna analiza nasienia odgrywa kluczową rolę w określaniu męskiej płodności; Jednak około 15% niepłodnych mężczyzn ma prawidłowe parametry nasienia2. Ponadto rutynowe badanie nasienia dostarcza ograniczonych informacji na temat funkcji plemników i nie odzwierciedla subtelnych wad nasienia3.

Mitochondria plemników mają specjalną strukturę, ponieważ są ułożone jako spiralna osłonka wokół wici. Osłonka mitochondrialna zawiera zmienną liczbę mitochondriów połączonych łącznikami międzymitochondrialnymi i zakotwiczonych w cytoszkielecie przez uporządkowane układy białek na zewnętrznej błonie mitochondrialnej4,5. Taka budowa sprawia, że szczególnie trudno jest wyizolować mitochondria plemników. Dlatego większość badań nad funkcją mitochondriów plemników wykorzystuje analizy in situ lub demembranated sperm6.

Struktura i funkcja mitochondriów plemników są konsekwentnie powiązane z niepłodnością męską7,8,9,10,11, co sugeruje, że analiza struktury i funkcji tych organelli może być dobrym kandydatem do włączenia do analizy nasienia.

Mitochondria odgrywają ważną rolę w metabolizmie energii komórkowej, szczególnie poprzez wykorzystanie tlenu do produkcji trifosforanu adenozyny (ATP) poprzez fosforylację oksydacyjną (OXPHOS). W szczególności w przypadku plemników źródło ATP (glikoliza vs. OXPHOS) jest kwestionowane, a wiele danych pozostaje kontrowersyjnych i zależy od różnych podejść eksperymentalnych4,12,13. Pomiary oddychania za pomocą oksymetrii dostarczają istotnych informacji na temat wydolności oddechowej mitochondriów, integralności mitochondriów i metabolizmu energetycznego komórki14,15,16. Tradycyjnie technika ta była wykonywana przy użyciu elektrody tlenowej Clarka - instrumentu, który jest używany do pomiaru oddychania mitochondrialnego od ponad 50 lat17,18. Ponadto zużycie tlenu w mitochondriach plemników zostało przeanalizowane przy użyciu klasycznej elektrody tlenowej Clarka19,20,21. Respirometria o wysokiej rozdzielczości (HRR) przy użyciu oksygrafów (Oroboros) zapewnia wyższą czułość niż przy użyciu klasycznych urządzeń do respirometrii22. Oksygramy składają się z dwóch komór z portami iniekcyjnymi, a każda komora posiada polarograficzny czujnik tlenu. Dzięki tej technice możliwa jest analiza preparatów tkankowych, komórek i izolowanych zawiesin mitochondrialnych. Próbka jest stale mieszana w komorze, a podczas eksperymentu mierzone jest zużycie tlenu, a dawki tlenu są obliczane za pomocą specjalnego oprogramowania. Komory wykazują zmniejszony wyciek tlenu, co jest zaletą w porównaniu z konwencjonalnymi elektrodami tlenowymi14,23.

Podobnie jak w przypadku innych komórek, w przypadku plemników, czułość sprzętu HRR jest wyższa niż w przypadku konwencjonalnej respirometrii, co oznacza, że sprzęt HRR może być używany do analizy ograniczonej liczby nienaruszonych lub przepuszczalnych plemników. Istnieją dwie główne strategie oceny funkcji mitochondriów plemników za pomocą HRR: (a) pomiar zużycia tlenu w nienaruszonych komórkach, który polega na odtwarzaniu funkcji oddechowej w pożywce zawierającej substraty, takie jak glukoza, lub (b) pomiar zużycia tlenu w przepuszczalnych komórkach przy użyciu jednego z kompleksów OXPHOS, z dodatkiem określonych substratów w celu monitorowania każdej funkcji osobno.

W niniejszym badaniu opisujemy użycie HRR do określenia oddychania mitochondrialnego w ludzkich plemnikach.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Facultad de Medicina de la Universidad de la República, Montevideo, Urugwaj.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przebieg pracy dla respirometrii o wysokiej rozdzielczości w celu oceny funkcji mitochondriów w nienaruszonym i przepuszczalnym plemniku ludzkim. Protokół został podzielony na cztery różne etapy: 1) przygotowanie próbki, 2) kalibracja tlenu w instrumencie Oroboros, 3) pomiar zużycia tlenu dla nienaruszonych i przepuszczalnych komórek oraz 4) ekstrakcja danych ze sprzętu i analiza. Skróty: CASA = komputerowa analiza nasienia; BWW = Biggers Whitten Whittingham średni; MRM = mitochondrialne medium oddechowe; ADP = difosforan adenozyny; FCCP = cyjanek karbonylu -p-trifluorometoksyfenylohydrazon; AA = antymycyna A. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

UWAGA: Proces pomiaru zużycia tlenu w plemnikach za pomocą HRR jest pokazany w Rysunek 1. Informacje o materiałach, sprzęcie i odczynnikach użytych w protokole znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie próbki

  1. Pobieranie próbek
    1. Zbierz świeżo wytryskujące ludzkie nasienie przez masturbację po zalecanej 3-dniowej abstynencji w sterylnym plastikowym pojemniku. Próbki należy natychmiast przetransportować do laboratorium.
    2. Inkubuj próbki przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej (RT) do całkowitego upłynnienia24.
    3. Po upłynnieniu próbki należy przechowywać w temperaturze 37 °C do czasu rozpoczęcia doświadczenia.
  2. Ocena nasienia za pomocą komputerowej analizy nasienia (CASA)
    1. Wymieszaj próbkę i załaduj 7 μl do wstępnie podgrzanej komory do liczenia plemników.
    2. Umieścić komorę na wstępnie ogrzanym (37 °C) stoliku mikroskopu światła bezpośredniego.
    3. Otwórz skomputeryzowane oprogramowanie do analizy nasienia i wejdź do modułu ruchliwości i koncentracji (kliknij Mot).
    4. Wybierz konfigurację odpowiadającą warunkom plemników ludzkich.
      UWAGA: Konfiguracja musi być dostosowana do rodzaju i głębokości komory, a także do gatunku próbki i systemu CASA.
    5. Losowo przeanalizuj 10 różnych pól na komorę, klikając przycisk Analizuj.
    6. Kliknij Wyniki, aby uzyskać stężenie i ruchliwość próbki.
  3. Przygotowanie komórek
    UWAGA: Jeśli HRR nie jest skalibrowany, zacznij od kroków 2.1-2.2 przed przygotowaniem ogniw (krok 1.3). Ważne jest, aby zmierzyć zużycie tlenu natychmiast po ponownym zawieszeniu plemników w pożywce.
    1. Odwirować próbki o masie 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Usuń osocze nasienne i ponownie zawieś plemniki w 2 ml Biggers Whitten Whittingham (BWW) do eksperymentów z nienaruszonymi komórkami lub mitochondrialnym podłożem oddechowym (MRM) do badań z komórkami przepuszczalnymi. Skład pożywek przedstawiono w tabeli 1.
    3. Powtórz czynności opisane w kroku 1.2 dla badań koncentracji plemników.

2. Respirometria o wysokiej rozdzielczości: analiza OXPHOS

UWAGA: HRR integruje bardzo czułe oksygrafy (Oxygraph-2 K; Oroboros Instruments GmbH, Innsbruck, Austria) wraz z oprogramowaniem (DatLab, wersja 4.2; Oroboros Instruments GmbH). Dane eksperymentalne są wyświetlane jako stężenie tlenu w funkcji czasu (jako pmol komórek O2/106 ·min−1) oraz jako transformacje tych danych w czasie rzeczywistym, co pozwala eksperymentatorowi śledzić oddychanie (zużycie tlenu, strumień tlenu) próbek biologicznych i biochemicznych podczas trwania eksperymentu. HRR może być używany do śledzenia oddychania żywych i ruchliwych komórek, co jest szczególnie przydatne w przypadku plemników, których ruchliwość jest związana z jakością plemników i potencjałem płodności. W laboratorium używany jest HRR Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments, z dwiema komorami. Czynności opisane w niniejszym protokole należy wykonać niezależnie dla obu komór o pojemności 2 ml.

  1. Przygotowanie sprzętu
    1. Włącz HRR i podłącz go do oprogramowania do respirometrii (DatLab) w celu gromadzenia i analizy danych.
    2. Zastąp 70% etanol w komorze oksygraficznej ddH2O. Mieszaj go w sposób ciągły za pomocą mieszadła magnetycznego w komorze z prędkością 750 obr./min. Odstawić na 10 minut, a następnie odessać podwójnie destylowany (dd)H2O.
    3. Umyć komorę trzykrotnie ddH2O przez 5 minut za każdym razem.
      UWAGA: Ten krok jest konieczny do usunięcia pozostałego etanolu z komór. Plemniki są bardzo wrażliwe na etanol. Nagranie może zostać naruszone, jeśli ten krok zostanie pominięty.
  2. Kalibracja czujników tlenu
    UWAGA: Procedura kalibracji różni się nieznacznie w zależności od instrumentu. Wykonaj kalibrację powietrza polarograficznego czujnika tlenu zgodnie z opisem producenta25. W tej sekcji pokrótce wyjaśniono protokół kalibracji.
    1. Wyjąć ddH2O i odpipetować 2 ml tego samego podłoża, które zostało użyte do przygotowania komórek do komory. Umieść korki, pozostawiając pęcherzyk wymiany powietrza.
      UWAGA: Ważne jest, aby znać objętość komory, aby określić dokładną objętość potrzebnego medium.
    2. Zapisz wartości kalibracji tlenu (kliknij na Layout > 01 Calibration Exp. Gr3-Temp), aby monitorować działanie membrany czujnika, mieszając medium z mieszadłem przy 750 obr./min przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C. Użyj innych ustawień, jak wspomniano: wzmocnienie dla czujnika: 2; napięcie polaryzacji: 800 mV; Interwał zapisu danych: 2.0 s.
      UWAGA: Oczekuje się, że uzyska nieskorygowane nachylenie O2 (czerwona linia) w zakresie ±2 pmol∙s−1∙mL−1 ze stabilnym sygnałem z czujnika polarograficznego.
    3. Przeciągnij myszą, przytrzymując lewy przycisk myszy i Shift, aby wybrać obszar, w którym zmiana stężenia tlenu (Stężenie Y1 O2, niebieska linia) jest stabilna.
    4. Otwórz okno KalibracjaO2 (kliknij Oxygraph > O2 Calibration). W obszarze Air Calibration (Kalibracja powietrza) zmień wybrany znacznik na obszar wybrany w kroku 2.2.3. Zakończ, klikając Kalibruj i kopiuj do schowka.
    5. Zatrzymaj nagrywanie i zapisz, klikając Oxygraph > Ok Control > Save and Disconnect.
      UWAGA: Ten zestaw danych musi zostać zapisany, aby można go było używać we wszystkich eksperymentach w danym dniu. Kalibracja jest wykonywana tylko raz dziennie dla każdego medium.
  3. Miareczkowanie do przepuszczalności digitoniny
    1. Otwórz komorę i zassaj pożywkę do środka.
    2. Załadować do komory co najmniej 24 x 106 i nie więcej niż 70 x 106 plemników w końcowej objętości 2 ml MRM.
      UWAGA: Ważne jest, aby zmierzyć liczbę komórek w komorze, aby dostosować zużycie tlenu pod koniec eksperymentu. Nie można zmierzyć mniejszej liczby komórek niż zalecana.
    3. Zamknij komorę, wciskając korki do końca, i zassaj pozostały płyn u góry. Rozpocznij eksperyment z tymi samymi ustawieniami, co przy kalibracji: prędkość mieszania: 750 obr./min; temperatura: 37 °C; zysk dla czujnika: 2; napięcie polaryzacji: 800 mV; i interwał zapisu danych: 2,0 s.
    4. Aby załadować kalibrację, kliknij dwukrotnie pole Pos Calib w dolnym rogu. Otwórz kalibrację wykonaną w kroku 2.2 (kliknij Oxygraph > O2 Calibration > Copy from File) i kliknij Kalibruj i kopiuj do schowka.
      UWAGA: Pole> POS Calib zmieni kolor z żółtego na zielony. Dane są wyświetlane na wykresach przepływu tlenu skorygowanych na objętość (Układ 05 Strumień na objętość nieskorygowany). W Oxygraph > Layout dostępne są różne układy.
    5. Dodać 5 μl 0,5 M difosforanu adenozyny (ADP), 10 μl 2 M glutaminianu i 2,5 μl 0,4 M jabłczanu (stężenia końcowe: 1,25 mM, 10 mM i 0,5 mM). Mierz zużycie tlenu, aż sygnał się ustabilizuje.
      UWAGA: Mikrostrzykawki Precision Hamilton służą do wstrzykiwania przez otwór załadowczy w korku. Należy użyć jednej strzykawki na lek, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Kliknij F4, aby się zarejestrować i zaznacz w rejestrze tlenu, kiedy dodano leczenie.
      UWAGA: Podłoża przygotowuje się w ultraczystej wodzie i przechowuje w temperaturze -20 °C przez 3 miesiące.
    6. Trytować dodając 1 μl 10 mM digitoniny w kolejnych krokach, aż zużycie tlenu osiągnie maksymalny poziom.
      UWAGA: Dokładne mycie wodą, 70% etanolem i 100% etanolem jest niezbędne, jeśli ta sama komora jest używana do dwóch eksperymentów tego samego dnia.
      UWAGA: Digitoninę przygotowuje się w ultraczystej wodzie i przechowuje w temperaturze -20 °C przez 3 miesiące.
  4. Protokół rutynowej oceny układu oddechowego dla nienaruszonych i przepuszczalnych plemników (kompleks I lub kompleks II)
    1. Otwórz komorę i zassaj pożywkę do środka.
    2. Załadować do komory co najmniej 24 x 106 i nie więcej niż 70 x 106 plemników w końcowej objętości 2 ml BWW (analiza komórek nienaruszonych) lub MRM (analiza komórek przepuszczalnych).
    3. Rozpocznij eksperyment z tymi samymi ustawieniami, co w przypadku kalibracji (jest to opisane w kroku 2.3.3).
    4. Załaduj kalibrację wykonaną w kroku 2.2 zgodnie z opisem w kroku 2.3.4.
    5. Rejestruj oddech komórek przez co najmniej 5 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału. Pomiar ten odpowiada oddychaniu podstawowemu w nienaruszonych komórkach.
    6. Jeśli eksperyment dotyczy nienaruszonych komórek, przejdź do kroku 2.4.9. W przypadku komórek przepuszczalnych wstrzyknąć 4,5 μl 10 mM digitoniny (stężenie końcowe: 22,5 μM). Przepuszczaj komórki przez 5 minut.
    7. Dodać substraty: 10 μl 2 M glutaminianu i 2,5 μl 0,4 M jabłczanu (stężenia końcowe: odpowiednio 10 mM i 0,5 mM) dla kompleksu I lub 20 μl 1 M bursztynianu (stężenie końcowe: 10 mM) dla kompleksu II. Mierz zużycie tlenu, aż sygnał wzrośnie i ustabilizuje się. Jest to stan 4, co oznacza oddychanie wspomagane kompleksem podstawowym I lub kompleksem podstawowym II przy braku ADP.
      UWAGA: Podłoża przygotowuje się w ultraczystej wodzie i przechowuje w temperaturze -20 °C przez 3 miesiące.
    8. Wstrzyknąć 5 μL 0,5 M ADP (końcowe stężenie: 1,25 mM). Mierz zużycie tlenu, aż sygnał wzrośnie i ustabilizuje się. Dodanie ADP zwiększa sygnał odpowiadający maksymalnemu zużyciu tlenu przez kompleks I lub kompleks II (stan 3, w komórkach przepuszczalnych).
    9. Dodać 1 μl oligomycyny 4 mg/ml (końcowe stężenie: 2 μg/ml), inhibitora syntetazy ATP. Mierz zużycie tlenu, aż sygnał zmniejszy się i ustabilizuje.
      UWAGA: Oligomycyna jest przygotowywana w etanolu i przechowywana w temperaturze -20 °C przez 3 miesiące.
    10. Miareczkować przez dodanie 1 μl 0,1 mM do 1 mM cyjanku karbonylu-P-trifluorometoksy-fenylohydrazonu (FCCP) w kolejnych etapach, aż do osiągnięcia maksymalnej szybkości oddychania bez sprzężenia. Mierz zużycie tlenu, aż sygnał wzrośnie i ustabilizuje się.
      UWAGA: FCCP jest przygotowywany w etanolu i przechowywany w temperaturze -20 °C przez 3 miesiące.
    11. Końcowe stężenie FCCP jest zależne od próbki. Przestań wstrzykiwać lek, gdy zużycie tlenu zacznie się zmniejszać.
    12. Na koniec wstrzyknąć 1 μl 5 mM antymycyny A (2,5 μM stężenie końcowe). Jest to inhibitor kompleksu III do rozróżniania między mitochondrialnym a resztkowym zużyciem tlenu (oddychanie niemitochondrialne). Do analizy kompleksu I dodać 1 μl 1 mM rotenonu (0,5 μM stężenia końcowego), inhibitora tego kompleksu, zamiast AA. Mierz zużycie tlenu, aż sygnał zmniejszy się i ustabilizuje.
      UWAGA: Leki są przygotowywane w etanolu i przechowywane w temperaturze -20 °C przez 3 miesiące.

3. Ekstrakcja i analiza danych

figure-protocol-2
Rysunek 2: Akwizycja parametrów oddechowych z eksperymentu respirometrycznego o wysokiej rozdzielczości. (A,B) Schematyczne reprezentacje uzyskanych wykresów, zgodnie z opisem w Rysunek 1, odpowiednio dla komórek nienaruszonych i przepuszczalnych. Te parametry zostały już wcześniej opisane15. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Przeciągnij myszą, naciskając lewy przycisk myszy i Shift, aby wybrać obszary, w których strumień tlenu na objętość jest skorelowany (Y2 Nachylenie O2 niekorzystna, czerwona linia) jest stabilny po wstrzyknięciu substratu lub inhibitora. Rysunek 2 pokazuje różne parametry uzyskane z wcześniej opisanego rejestru15.
    UWAGA: Parametry zależą od eksperymentu; wszystkie z nich są następujące: oddychanie podstawowe w nienaruszonych komórkach i oddychanie w obecności glutaminianu/jabłczanu lub bursztynianu (stan 4), ADP (stan 3), oligomycyny (wyciek protonów), FCCP (maksymalna częstość oddychania), rotenon/AA (oddychanie niemitochondrialne). W komórkach przepuszczalnych oddychanie podstawowe odpowiada stanowi 3.
  2. Kliknij okna Znaczniki > Statystyki, a następnie wyeksportuj dane.
  3. Normalizuj dane uzyskane na 1 milion plemników. Jednostkami nachyleń są pmolO2·s−1·mL−1·10−6 komórek.
  4. Odejmij niemitochondrialne zużycie tlenu od wszystkich wartości przed obliczeniem wskaźników.
  5. Oblicz indeksy, korzystając z różnych równań opisanych wcześniej15:
    figure-protocol-3

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Określenie optymalnego stężenia digitoniny w plemnikach
W niniejszym protokole przedstawiamy zastosowanie HRR do monitorowania zmian OXPHOS w czasie rzeczywistym w plemnikach ludzkich. Ponieważ metoda ta może być stosowana do analizy plemników w stanie nienaruszonym lub przepuszczalnym digitoniną, najpierw przedstawiamy standaryzację stężenia digitoniny wymaganego do przenikania plemników (Rysunek 3).

Digitonina jest używana do chemicznej przepu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HRR zależy od kilku etapów: (a) konserwacji sprzętu, (b) dokładnej kalibracji czujników tlenu, (c) miareczkowania rozprzęgającego26 i wreszcie (d) odpowiedniego wykorzystania wskaźników reprezentujących funkcję mitochondriów. Konserwacja sprzętu ma kluczowe znaczenie. Zaleca się regularną wymianę membran polarograficznego czujnika tlenu i korygowanie tła instrumentu. Dokładne płukanie po pobraniu plemników z komór jest niezbędne do uzyskania dobrych powtórzeń, zwłaszcza w laboratoriach, w których ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować klinice andrologii Fertilab, szczególnie José Maríi Montes i Andrei Torrents, za umożliwienie nam dostępu do dawców. Finansowanie: A.C. jest wspierane przez granty z Universidad de la República (CSIC_2018, Espacio Interdisciplinario_2021). Dodatkowe fundusze uzyskano z Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA, Urugwaj). P.I. i R.S. są wspierani przez Universidad de la República (I+D, CSIC 2014; I+D, CSIC 2016, Iniciación a la Investigación, CSIC 2019 oraz FMV_1_2017_1_136490 ANII- Urugwaj). P.I. jest wspierany przez POS_FMV_2018_1_1007814 i CAP-UDELAR 2020. Rysunki zostały zilustrowane za pomocą Biorender.com.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Bezkwasowe- Surowica bydlęca albuminaSigma AldrichA8806
Adenozyno5'-difosforan monopotasowy sól dwuwodnaSigma AldrichA5285
Animycyna A ze streptomyces sp.Sigma AldrichA8674
Chlorek wapniaSigma AldrichC4901
cyjanek karbonylu-P-trifluorometoksy-fenylohydrazonSigma AldrichC2920
DatLab sofware wersja 4,2Oroboros Instruments GmbHN/
A D-glukozaSigma AldrichG7021
DigitoninaSigma AldrichD141
EGTASigma AldrichE4378
HEPESSigma AldrichH3375
L Kwas glutaminowySigma AldrichG1251
L Kwas jabłkowySigma AldrichM1000
Siarczan magnezuSigma AldrichM7506
Mikrolitrowe strzykawkiHamilton87900 lub 80400
Kamera mikroskopowaBasleracA780-75gc
Mikroskop Eclipse E200 z kontrastem fazowym 10X Ph+NikonN/A
Fosforan monopotasowySigma AldrichP5655
MOPSSigma AldrichM1254
Oligomycyna ASigma Aldrich75351
Oxygraph-2 KOroboros Instruments GmbHN/A
Chlorek potasuSigma AldrichP3911
Power O2k-RespirometrOroboros Intruments10033-01
RotenonSigma AldrichR8875
SacharozaSigma AldrichS0389
Wodorowęglan soduSigma AldrichS5761
Mleczan soduSigma AldrichL7022
Pirogronian soduSigma AldrichP2256
Analizator klasy plemników 6.3.0.59 Evolution-SCA ResearchMikroskopowakomora
DRM-600Millennium Sciences CELL-VUN/A
Bursztynian sól disodowaSigma AldrichW327700
do liczenia plemników bez dotyczy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 37(2015).
  2. Guzick, D. S., et al. Sperm morphology, motility, and concentration in fertile and infertile men. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1388-1393 (2001).
  3. Wang, C., Swerdloff, R. S. Limitations of semen analysis as a test of male fertility and anticipated needs from newer tests. Fertility and Sterility. 102 (6), 1502-1507 (2014).
  4. Amaral, A. Energy metabolism in mammalian sperm motility. WIREs Mechanisms of Disease. 14 (5), e1569(2022).
  5. Leung, M. R., et al. In-cell structures of conserved supramolecular protein arrays at the mitochondria-cytoskeleton interface in mammalian sperm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (45), e2110996118(2021).
  6. Moraes, C. R., Meyers, S. The sperm mitochondrion: Organelle of many functions. Animal Reproduction Science. 194, 71-80 (2018).
  7. Cassina, A., et al. Defective human sperm cells are associated with mitochondrial dysfunction and oxidant production. Biology of Reproduction. 93 (5), 119(2015).
  8. Marchetti, C., Obert, G., Deffosez, A., Formstecher, P., Marchetti, P. Study of mitochondrial membrane potential, reactive oxygen species, DNA fragmentation and cell viability by flow cytometry in human sperm. Human Reproduction. 17 (5), 1257-1265 (2002).
  9. Amaral, A., Lourenço, B., Marques, M., Ramalho-Santos, J. Mitochondria functionality and sperm quality. Reproduction. 146 (5), R163-R174 (2013).
  10. Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction. Andrologia. 53 (1), e13666(2021).
  11. Uribe, P., et al. Use of the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester perchlorate for mitochondrial membrane potential assessment in human spermatozoa. Andrologia. 49 (9), e12753(2017).
  12. Storey, B. T. Mammalian sperm metabolism: Oxygen and sugar, friend and foe. The International Journal of Developmental Biology. 52 (5-6), 427-437 (2008).
  13. Tourmente, M., Sansegundo, E., Rial, E., Roldan, E. R. S. Capacitation promotes a shift in energy metabolism in murine sperm. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 950979(2022).
  14. Gnaiger, E. Chapter 12 - Polarographic oxygen sensors, the oxygraph, and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. Dykens, J. A., Will, Y. , Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. 325-352 (2008).
  15. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  16. Awadhpersad, R., Jackson, C. B. High-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e63000(2021).
  17. Chance, B., Williams, G. R. A simple and rapid assay of oxidative phosphorylation. Nature. 175 (4469), 1120-1121 (1955).
  18. Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
  19. Stendardi, A., et al. Evaluation of mitochondrial respiratory efficiency during in vitro capacitation of human spermatozoa. International Journal of Andrology. 34 (3), 247-255 (2011).
  20. Ferramosca, A., Focarelli, R., Piomboni, P., Coppola, L., Zara, V. Oxygen uptake by mitochondria in demembranated human spermatozoa: A reliable tool for the evaluation of sperm respiratory efficiency. International Journal of Andrology. 31 (3), 337-345 (2008).
  21. Ferramosca, A., et al. Modulation of human sperm mitochondrial respiration efficiency by plant polyphenols. Antioxidants. 10 (2), 217(2021).
  22. Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Méndez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 27 (6), 583-596 (1995).
  23. Gnaiger, E. O2k Quality Control 1: Polarographic oxygen sensors and accuracy of calibration. , Available from: https://www.bioblst.at/images/archive/7/77/20210819114548%21MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP.pdf (2020).
  24. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787 (2010).
  25. Gnaiger, E. O2k-protocols SOP: O2k quality control 1. , Available from: https://www.bioblast.at/images/9/9c/MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP_DatLab8.pdf (2021).
  26. Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck, Austria. (2012).
  27. Steinlechner-Maran, R., Eberl, T., Kunc, M., Margreiter, R., Gnaiger, E. Oxygen dependence of respiration in coupled and uncoupled endothelial cells. The American Journal of Physiology. 271, C2053-C2061 (1996).
  28. Holt, W. V., Van Look, K. J. W. Concepts in sperm heterogeneity, sperm selection and sperm competition as biological foundations for laboratory tests of semen quality. Reproduction. 127 (5), 527-535 (2004).
  29. Sousa, A. P., et al. Not all sperm are equal: Functional mitochondria characterize a subpopulation of human sperm with better fertilization potential. PloS One. 6 (3), e18112(2011).
  30. Moscatelli, N., et al. Single-cell-based evaluation of sperm progressive motility via fluorescent assessment of mitochondria membrane potential. Scientific Reports. 7, 17931(2017).
  31. Ferreira, J. J., et al. Increased mitochondrial activity upon CatSper channel activation is required for mouse sperm capacitation. Redox Biology. 48, 102176(2021).
  32. Irigoyen, P., et al. Mitochondrial metabolism determines the functional status of human sperm and correlates with semen parameters. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 926684(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa
Posted by JoVE Editors on 9/26/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. The Protocol and Representative Result sections were updated.

Step 2.4.12 of the Protocol was updated from:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex II inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

to:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex III inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

Figure 3 in the Representative Results section was updated from:

Oxygen concentration analysis; graphs showing O₂ levels vs. time and digitonin effect; data chart.
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Oxygen consumption analysis; graph shows O₂ concentration and flux (A) and rate vs. digitonin (B).
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

Tags

High Resolution RespirometryMitochondrial FunctionHuman SpermatozoaSperm MitochondriaOxygen ConsumptionMale InfertilitySperm QualityRespiratory IndicesATP ProductionSperm Energy Metabolism

Related Articles