Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w plemnikach ludzkich

3.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65493

⸱

23 czerwca 2023

 ,  , 
1Departamento de Histología y Embriología, Unidad Académica Histología y Embriología, 2Departamento de Bioquímica, Unidad Académica Bioquímica, 3Centro de Investigaciones Biomédicas (CEINBIO), Facultad de Medicina, Universidad de la República

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Analiza funkcji mitochondriów plemników za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości pozwala na pomiar zużycia tlenu przez swobodnie poruszające się plemniki w systemie zamkniętym komorowym. Technika ta może być stosowana do pomiaru oddychania w plemnikach ludzkich, co dostarcza informacji na temat cech mitochondriów i integralności plemników.

Streszczenie

Jakość nasienia jest często badana za pomocą rutynowych analiz nasienia, które są opisowe i często niejednoznaczne. Niepłodność męska wiąże się ze zmienioną aktywnością mitochondriów plemników, więc pomiar funkcji mitochondriów plemników jest wskaźnikiem jakości nasienia. Respirometria o wysokiej rozdzielczości to metoda pomiaru zużycia tlenu przez komórki lub tkanki w układzie zamkniętym komorowym. Technika ta może być stosowana do pomiaru oddychania w ludzkim nasieniu i dostarcza informacji o jakości i integralności mitochondriów plemników. Respirometria o wysokiej rozdzielczości pozwala komórkom na swobodne poruszanie się, co jest a priori zaletą w przypadku plemników. Technika ta może być stosowana w przypadku nienaruszonych lub przepuszczalnych plemników i pozwala na badanie nienaruszonej funkcji mitochondriów plemników oraz aktywności poszczególnych kompleksów łańcuchów oddechowych. Przyrząd oksygraficzny o wysokiej rozdzielczości wykorzystuje czujniki do pomiaru stężenia tlenu w połączeniu z czułym oprogramowaniem do obliczania zużycia tlenu. Dane służą do obliczania wskaźników oddechowych na podstawie wskaźników zużycia tlenu. W związku z tym wskaźniki są proporcjami dwóch wskaźników zużycia tlenu i są wewnętrznie znormalizowane do liczby komórek lub masy białka. Wskaźniki oddechowe są wskaźnikiem funkcji i dysfunkcji mitochondriów plemników.

Wprowadzenie

Szacuje się, że niepłodność męska stanowi 40%-50% wszystkich przypadków niepłodności u par1. Konwencjonalna analiza nasienia odgrywa kluczową rolę w określaniu męskiej płodności; Jednak około 15% niepłodnych mężczyzn ma prawidłowe parametry nasienia2. Ponadto rutynowe badanie nasienia dostarcza ograniczonych informacji na temat funkcji plemników i nie odzwierciedla subtelnych wad nasienia3.

Mitochondria plemników mają specjalną strukturę, ponieważ są ułożone jako spiralna osłonka wokół wici. Osłonka mitochondrialna zawiera zmienną liczbę mitochondriów połączonych łącznikami międzymitochondrialnymi i zakotwiczonych w cytoszkielecie przez uporządkowane układy białek na zewnętrznej błonie mitochondrialnej4,5. Taka budowa sprawia, że szczególnie trudno jest wyizolować mitochondria plemników. Dlatego większość badań nad funkcją mitochondriów plemników wykorzystuje analizy in situ lub demembranated sperm6.

Struktura i funkcja mitochondriów plemników są konsekwentnie powiązane z niepłodnością męską7,8,9,10,11, co sugeruje, że analiza struktury i funkcji tych organelli może być dobrym kandydatem do włączenia do analizy nasienia.

Mitochondria odgrywają ważną rolę w metabolizmie energii komórkowej, szczególnie poprzez wykorzystanie tlenu do produkcji trifosforanu adenozyny (ATP) poprzez fosforylację oksydacyjną (OXPHOS). W szczególności w przypadku plemników źródło ATP (glikoliza vs. OXPHOS) jest kwestionowane, a wiele danych pozostaje kontrowersyjnych i zależy od różnych podejść eksperymentalnych4,12,13. Pomiary oddychania za pomocą oksymetrii dostarczają istotnych informacji na temat wydolności oddechowej mitochondriów, integralności mitochondriów i metabolizmu energetycznego komórki14,15,16. Tradycyjnie technika ta była wykonywana przy użyciu elektrody tlenowej Clarka - instrumentu, który jest używany do pomiaru oddychania mitochondrialnego od ponad 50 lat17,18. Ponadto zużycie tlenu w mitochondriach plemników zostało przeanalizowane przy użyciu klasycznej elektrody tlenowej Clarka19,20,21. Respirometria o wysokiej rozdzielczości (HRR) przy użyciu oksygrafów (Oroboros) zapewnia wyższą czułość niż przy użyciu klasycznych urządzeń do respirometrii22. Oksygramy składają się z dwóch komór z portami iniekcyjnymi, a każda komora posiada polarograficzny czujnik tlenu. Dzięki tej technice możliwa jest analiza preparatów tkankowych, komórek i izolowanych zawiesin mitochondrialnych. Próbka jest stale mieszana w komorze, a podczas eksperymentu mierzone jest zużycie tlenu, a dawki tlenu są obliczane za pomocą specjalnego oprogramowania. Komory wykazują zmniejszony wyciek tlenu, co jest zaletą w porównaniu z konwencjonalnymi elektrodami tlenowymi14,23.

Podobnie jak w przypadku innych komórek, w przypadku plemników, czułość sprzętu HRR jest wyższa niż w przypadku konwencjonalnej respirometrii, co oznacza, że sprzęt HRR może być używany do analizy ograniczonej liczby nienaruszonych lub przepuszczalnych plemników. Istnieją dwie główne strategie oceny funkcji mitochondriów plemników za pomocą HRR: (a) pomiar zużycia tlenu w nienaruszonych komórkach, który polega na odtwarzaniu funkcji oddechowej w pożywce zawierającej substraty, takie jak glukoza, lub (b) pomiar zużycia tlenu w przepuszczalnych komórkach przy użyciu jednego z kompleksów OXPHOS, z dodatkiem określonych substratów w celu monitorowania każdej funkcji osobno.

W niniejszym badaniu opisujemy użycie HRR do określenia oddychania mitochondrialnego w ludzkich plemnikach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną Facultad de Medicina de la Universidad de la República w Montevideo w Urugwaju.

Schemat analizy nasienia; CASA, wirówka, kalibracja czujnika tlenu; wykres analizy danych.
Rysunek 1: Schemat wysokorozdzielczej respirometrii do oceny funkcji mitochondriów w nienaruszonych i permeabilizowanych plemnikach ludzkich. Protokół został podzielony na cztery etapy: 1) przygotowanie próbki, 2) kalibracja tlenu w urządzeniu Oroboros, 3) pomiar zużycia tlenu dla komórek nienaruszonych i permeabilizowanych oraz 4) ekstrakcja danych z urządzenia i ich analiza. Skróty: CASA = komputerowa analiza nasienia; BWW = podłoże Biggers Whitten Whittingham; MRM = podłoże do respiracji mitochondrialnej; ADP = difosforan adenozyny; FCCP = karbonylowy cyjanek-p-trifluorometoksyfenylohydrazon; AA = antymycyna A. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

UWAGA: Schemat pomiaru zużycia tlenu w komórkach plemników przy użyciu HRR przedstawiono na Rysunku 1. Informacje na temat materiałów, sprzętu i odczynników wykorzystanych w protokole znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie próbek

  1. Pobieranie próbek
    1. Pobrać świeżo ejakulowany nasienie ludzkie poprzez masturbację po zalecanym 3-dniowym okresie wstrzemięźliwości do sterylnego plastikowego pojemnika. Próbki należy niezwłocznie przetransportować do laboratorium.
    2. Inkubować próbki przez 30-60 min w temperaturze pokojowej (RT) do całkowitego upłynnienia24.
    3. Po upłynnieniu przechowywać próbki w temperaturze 37 °C do momentu rozpoczęcia eksperymentu.
  2. Ocena plemników za pomocą komputerowej analizy nasienia (CASA)
    1. Wymieszać próbkę i nanieść 7 µL do wstępnie ogrzanej komory do liczenia plemników.
    2. Umieścić komorę na wstępnie ogrzanym (37 °C) stoliku mikroskopu świetlnego.
    3. Otworzyć oprogramowanie do komputerowej analizy plemników i przejść do modułu ruchliwości i stężenia (kliknąć Mot).
    4. Wybrać konfigurację odpowiadającą warunkom dla plemników ludzkich.
      UWAGA: Konfiguracja musi być dostosowana do typu i głębokości komory, a także do gatunku próbki i systemu CASA.
    5. Przeanalizować losowo 10 różnych pól na komorę, klikając przycisk Analyze .
    6. Kliknąć Results , aby uzyskać stężenie i ruchliwość próbki.
  3. Przygotowanie komórek
    UWAGA: Jeśli HRR nie jest skalibrowany, należy rozpocząć od kroków 2.1-2.2 przed przygotowaniem komórek (krok 1.3). Ważne jest, aby zmierzyć zużycie tlenu natychmiast po resuspensji plemników w medium.
    1. Wirować próbki z prędkością 400 x g przez 10 min w temperaturze RT.
    2. Usunąć plazmę nasienną i resuspender plemniki w 2 mL medium Biggers Whitten Whittingham (BWW) w przypadku eksperymentów z nienaruszonymi komórkami lub w medium do respiracji mitochondrialnej (MRM) w przypadku badań z komórkami permeabilizowanymi. Skład mediów przedstawiono w tabeli 1.
    3. Powtórzyć czynności opisane w kroku 1.2 w celu badania stężenia plemników.

2. Respirometria wysokiej rozdzielczości: analiza OXPHOS

UWAGA: HRR integruje wysokoczułe oksygrafy (Oxygraph-2 K; Oroboros Instruments GmbH, Innsbruck, Austria) z oprogramowaniem (DatLab, wersja 4.2; Oroboros Instruments GmbH). Dane eksperymentalne są przedstawiane jako stężenie tlenu w funkcji czasu (jako pmol O2/106 cells·min−1) oraz jako transformacje tych danych w czasie rzeczywistym, co pozwala eksperymentatorowi na śledzenie oddychania (zużycia tlenu, strumienia tlenu) próbek biologicznych i biochemicznych podczas trwania eksperymentu. HRR można wykorzystać do monitorowania oddychania żywych i ruchomych komórek, co jest szczególnie przydatne w przypadku plemników, których ruchliwość wiąże się z ich jakością i potencjałem płodności. W laboratorium wykorzystuje się HRR Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments, z dwiema komorami. Kroki opisane w niniejszym protokole muszą być wykonywane niezależnie dla obu komór o pojemności 2 mL.

  1. Przygotowanie sprzętu
    1. Włącz urządzenie HRR i podłącz je do oprogramowania respirometrycznego (DatLab) w celu akwizycji i analizy danych.
    2. Zastąp 70% etanol w komorze oksygrafu wodą ddH2O. Mieszaj ją w sposób ciągły za pomocą magnetycznego mieszadła w komorze z prędkością 750 rpm. Pozostaw na 10 min, a następnie odessij wodę dwukrotnie destylowaną (dd) H2O.
    3. Przemyj komorę trzykrotnie wodą ddH2O przez 5 min za każdym razem.
      UWAGA: Krok ten jest niezbędny do usunięcia pozostałego etanolu z komór. Komórki plemników są bardzo wrażliwe na etanol. Pominięcie tego etapu może zakłócić pomiary.
  2. Kalibracja czujników tlenu
    UWAGA: Procedura kalibracji różni się nieznacznie w zależności od instrumentu. Przeprowadź kalibrację powietrzną polarygraficznego czujnika tlenu zgodnie z opisem producenta25. W tej sekcji protokół kalibracji wyjaśniono krótko.
    1. Usuń wodę ddH2O i pipetuj do komory 2 mL tego samego medium, którego użyto do przygotowania komórek. Zamknij komorę zatyczkami, pozostawiając pęcherzyk powietrza do wymiany gazowej.
      UWAGA: Ważna jest znajomość objętości komory, aby określić dokładną objętość potrzebnego medium.
    2. Zarejestruj wartości kalibracji tlenu (kliknij Layout > 01 Calibration Exp. Gr3-Temp), aby monitorować pracę membrany czujnika, mieszając medium mieszadłem z prędkością 750 rpm przez co najmniej 30 min w temperaturze 37 °C. Zastosuj pozostałe ustawienia: wzmocnienie (gain) czujnika: 2; napięcie polaryzacji: 800 mV; interwał rejestracji danych: 2,0 s.
      UWAGA: Oczekuje się uzyskania niepoprawionego nachylenia krzywej O2 (czerwona linia) w zakresie ±2 pmol∙s−1∙mL−1 przy stabilnym sygnale z czujnika polarygraficznego.
    3. Przeciągnij myszą, trzymając lewy przycisk myszy i klawisz shift, aby zaznaczyć obszar, w którym zmiana stężenia tlenu (Y1 O2 Concentration, niebieska linia) jest stabilna.
    4. Otwórz okno O2 Calibration (kliknij Oxygraph > O2 Calibration). W sekcji Air Calibration zmień wybrany znacznik na obszar zaznaczony w kroku 2.2.3. Zakończ, klikając Calibrate and Copy to Clipboard.
    5. Zatrzymaj pomiar i zapisz dane, klikając Oxygraph > Ok Control > Save and Disconnect.
      UWAGA: Zbiór danych ten musi zostać zapisany, aby można go było wykorzystać we wszystkich eksperymentach w danym dniu. Kalibrację przeprowadza się tylko raz dziennie dla każdego medium.
  3. Miareczkowanie permeabilizacji digitoniną
    1. Otwórz komorę i odessij znajdujące się w niej medium.
    2. Wprowadź do komory co najmniej 24 x 106, a nie więcej niż 70 x 106 komórek plemników w końcowej objętości 2 mL MRM.
      UWAGA: Ważne jest zmierzenie liczby komórek w komorze, aby móc skorygować zużycie tlenu na koniec eksperymentu. Liczby komórek niższej niż zalecana nie można zmierzyć.
    3. Zamknij komorę, dociskając zatyczki do końca, i odessij pozostały płyn z górnej części. Rozpocznij eksperyment z tymi samymi ustawieniami co przy kalibracji: prędkość mieszania: 750 rpm; temperatura: 37 °C; wzmocnienie czujnika: 2; napięcie polaryzacji: 800 mV; interwał rejestracji danych: 2,0 s.
    4. Aby załadować kalibrację, kliknij dwukrotnie pole Pos Calib w dolnym rogu. Otwórz kalibrację wykonaną w kroku 2.2 (kliknij Oxygraph > O2 Calibration > Copy from File) i kliknij Calibrate and Copy to Clipboard.
      UWAGA: Pole POS Calib zmieni kolor z żółtego na zielony. Dane są wyświetlane na wykresach przepływu tlenu skorygowanego względem objętości (Layout 05 Flux per Volume uncorrected). Inne układy są dostępne w Oxygraph > Layout.
    5. Dodaj 5 µL 0,5 M adenozynodifosforanu (ADP), 10 µL 2 M glutaminianu i 2,5 µL 0,4 M malonianu (stężenia końcowe: 1,25 mM, 10 mM i 0,5 mM). Mierz zużycie tlenu do momentu stabilizacji sygnału.
      UWAGA: Do wstrzykiwania przez port w zatyczce używa się precyzyjnych mikrosyring z Hamiltona. Używaj osobnej strzykawki dla każdego odczynnika, aby uniknąć zanieczyszczeń krzyżowych. Kliknij F4 , aby zarejestrować i zaznaczyć w rejestrze tlenu moment dodania substancji.
      UWAGA: Substraty są przygotowywane w wodzie ultrapure i przechowywane w temperaturze −20 °C przez 3 miesiące.
    6. Miareczkuj, dodając 1 µL 10 mM digitoniny w kolejnych krokach, aż zużycie tlenu osiągnie poziom maksymalny.
      UWAGA: Dokładne przemycie wodą, 70% etanolem i 100% etanolem jest niezbędne, jeśli ta sama komora jest używana do dwóch eksperymentów w tym samym dniu.
      UWAGA: Digitonina jest przygotowywana w wodzie ultrapure i przechowywana w temperaturze −20 °C przez 3 miesiące.
  4. Rutynowy protokół oceny oddechowej dla nienaruszonych i permeabilizowanych komórek plemników (kompleks I lub kompleks II)
    1. Otwórz komorę i odessij znajdujące się w niej medium.
    2. Wprowadź do komory co najmniej 24 x 106, a nie więcej niż 70 x 106 komórek plemników w końcowej objętości 2 mL BWW (analiza komórek nienaruszonych) lub MRM (analiza komórek permeabilizowanych).
    3. Rozpocznij eksperyment z tymi samymi ustawieniami co przy kalibracji (opisano w kroku 2.3.3).
    4. Załaduj kalibrację wykonaną w kroku 2.2 zgodnie z opisem w kroku 2.3.4.
    5. Rejestruj oddychanie komórek przez co najmniej 5 min, aż do uzyskania stabilnego sygnału. Pomiar ten odpowiada oddychaniu bazalnemu w komórkach nienaruszonych.
    6. Jeśli eksperyment dotyczy komórek nienaruszonych, przejdź do kroku 2.4.9. W przypadku komórek permeabilizowanych wstrzyknij 4,5 µL 10 mM digitoniny (stężenie końcowe: 22,5 µM). Pozostaw komórki do permeabilizacji na 5 min.
    7. Dodaj substraty: 10 µL 2 M glutaminianu i 2,5 µL 0,4 M malonianu (stężenia końcowe odpowiednio: 10 mM i 0,5 mM) dla kompleksu I lub 20 µL 1 M bursztynianu (stężenie końcowe: 10 mM) dla kompleksu II. Mierz zużycie tlenu do momentu zwiększenia i stabilizacji sygnału. Jest to stan 4, oznaczający bazalne oddychanie zależne od kompleksu I lub kompleksu II w obecności ADP.
      UWAGA: Substraty są przygotowywane w wodzie ultrapure i przechowywane w temperaturze −20 °C przez 3 miesiące.
    8. Wstrzyknij 5 µL 0,5 M ADP (stężenie końcowe: 1,25 mM). Mierz zużycie tlenu do momentu zwiększenia i stabilizacji sygnału. Dodanie ADP zwiększa sygnał odpowiadający maksymalnemu zużyciu tlenu przez kompleks I lub kompleks II (stan 3 w komórkach permeabilizowanych).
    9. Dodaj 1 µL oligomycyny w stężeniu 4 mg/mL (stężenie końcowe: 2 µg/mL), która jest inhibitorem syntetazy ATP. Mierz zużycie tlenu do momentu spadku i stabilizacji sygnału.
      UWAGA: Oligomycyna jest przygotowywana w etanolu i przechowywana w temperaturze −20 °C przez 3 miesiące.
    10. Miareczkuj, dodając 1 µL karbonylowej cyjanidowej P-trifluorometoksy-fenylohydrazony (FCCP) w stężeniu od 0,1 mM do 1 mM w kolejnych krokach, aż do osiągnięcia maksymalnej szybkości oddychania rozsprzężonego. Mierz zużycie tlenu do momentu zwiększenia i stabilizacji sygnału.
      UWAGA: FCCP jest przygotowywany w etanolu i przechowywany w temperaturze −20 °C przez 3 miesiące.
    11. Końcowe stężenie FCCP zależy od próbki. Zaprzestań wstrzykiwania odczynnika, gdy zużycie tlenu zacznie spadać.
    12. Na koniec wstrzyknij 1 µL 5 mM antymycyny A (stężenie końcowe 2,5 µM). Jest to inhibitor kompleksu III służący do rozróżnienia między mitochondrialnym a rezydualnym zużyciem tlenu (oddychanie pozamitochondrialne). Dla analizy kompleksu I zamiast AA dodaj 1 µL 1 mM rotenonu (stężenie końcowe 0,5 µM), inhibitora tego kompleksu. Mierz zużycie tlenu do momentu spadku i stabilizacji sygnału.
      UWAGA: Odczynniki są przygotowywane w etanolu i przechowywane w temperaturze −20 °C przez 3 miesiące.

3. Ekstrakcja i analiza danych

Wykres tempa zużycia tlenu; komórki nienaruszone i permeabilizowane; tempo oddychania; analiza obrotu ATP.
Rycina 2: Pozyskiwanie parametrów oddechowych z eksperymentu respirometrii wysokiej rozdzielczości. (A,B) Schematyczne przedstawienia uzyskanych wykresów, opisanych w Rycini 1, odpowiednio dla komórek nienaruszonych i permeabilizowanych. Parametry te zostały opisane wcześniej15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przeciągnij myszką, trzymając lewy przycisk myszy i klawisz shift, aby zaznaczyć obszary, w których skorelowany strumień tlenu na objętość (Y2 O2 slope uncorr., czerwona linia) jest stabilny po wstrzyknięciu substratu lub inhibitora. Rycina 2 przedstawia różne parametry uzyskane z rejestru opisanego wcześniej15.
    UWAGA: Parametry zależą od eksperymentu; wszystkie z nich są następujące: oddychanie podstawowe w nienaruszonych komórkach oraz oddychanie w obecności glutaminianu/malonianu lub bursztynianu (stan 4), ADP (stan 3), oligomycyny (przeciek protonowy), FCCP (maksymalna szybkość oddychania), rotenonu/AA (oddychanie niemitochondrialne). W komórkach permeabilizowanych oddychanie podstawowe odpowiada stanowi 3.
  2. Kliknij w okna Marks > Statistics i wyeksportuj dane.
  3. Znormalizuj uzyskane dane w przeliczeniu na 1 milion plemników. Jednostkami nachyleń są pmolO2·s−1·mL−1·10−6 cells.
  4. Odejmij niemitochondrialne zużycie tlenu od wszystkich wartości przed obliczeniem wskaźników.
  5. Oblicz wskaźniki, korzystając z różnych równań opisanych wcześniej15:
    Równania wydajności sprzężenia i współczynnika kontroli oddychania; schemat analizy oddychania podstawowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyznaczenie optymalnego stężenia digitoniny w komórkach plemników
W niniejszym protokole przedstawiamy wykorzystanie HRR do monitorowania w czasie rzeczywistym zmian w OXPHOS w ludzkich komórkach plemników. Ponieważ metodę tę można stosować do analizy nienaruszonych lub permeabilizowanych digitoniną plemników, w pierwszej kolejności przedstawiamy standaryzację stężenia digitoniny niezbędnej do permeabilizacji komórek plemników (Rysunek 3).

Dig...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

HRR zależy od kilku etapów: (a) konserwacji sprzętu, (b) dokładnej kalibracji czujników tlenu, (c) miareczkowania rozprzęgającego26 i wreszcie (d) odpowiedniego wykorzystania wskaźników reprezentujących funkcję mitochondriów. Konserwacja sprzętu ma kluczowe znaczenie. Zaleca się regularną wymianę membran polarograficznego czujnika tlenu i korygowanie tła instrumentu. Dokładne płukanie po pobraniu plemników z komór jest niezbędne do uzyskania dobrych powtórzeń, zwłaszcza w laboratoriach, w których ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować klinice andrologii Fertilab, szczególnie José Maríi Montes i Andrei Torrents, za umożliwienie nam dostępu do dawców. Finansowanie: A.C. jest wspierane przez granty z Universidad de la República (CSIC_2018, Espacio Interdisciplinario_2021). Dodatkowe fundusze uzyskano z Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA, Urugwaj). P.I. i R.S. są wspierani przez Universidad de la República (I+D, CSIC 2014; I+D, CSIC 2016, Iniciación a la Investigación, CSIC 2019 oraz FMV_1_2017_1_136490 ANII- Urugwaj). P.I. jest wspierany przez POS_FMV_2018_1_1007814 i CAP-UDELAR 2020. Rysunki zostały zilustrowane za pomocą Biorender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bezkwasowe- Surowica bydlęca albuminaSigma AldrichA8806
Adenozyno5'-difosforan monopotasowy sól dwuwodnaSigma AldrichA5285
Animycyna A ze streptomyces sp.Sigma AldrichA8674
Chlorek wapniaSigma AldrichC4901
cyjanek karbonylu-P-trifluorometoksy-fenylohydrazonSigma AldrichC2920
DatLab sofware wersja 4,2Oroboros Instruments GmbHN/
A D-glukozaSigma AldrichG7021
DigitoninaSigma AldrichD141
EGTASigma AldrichE4378
HEPESSigma AldrichH3375
L Kwas glutaminowySigma AldrichG1251
L Kwas jabłkowySigma AldrichM1000
Siarczan magnezuSigma AldrichM7506
Mikrolitrowe strzykawkiHamilton87900 lub 80400
Kamera mikroskopowaBasleracA780-75gc
Mikroskop Eclipse E200 z kontrastem fazowym 10X Ph+NikonN/A
Fosforan monopotasowySigma AldrichP5655
MOPSSigma AldrichM1254
Oligomycyna ASigma Aldrich75351
Oxygraph-2 KOroboros Instruments GmbHN/A
Chlorek potasuSigma AldrichP3911
Power O2k-RespirometrOroboros Intruments10033-01
RotenonSigma AldrichR8875
SacharozaSigma AldrichS0389
Wodorowęglan soduSigma AldrichS5761
Mleczan soduSigma AldrichL7022
Pirogronian soduSigma AldrichP2256
Analizator klasy plemników 6.3.0.59 Evolution-SCA ResearchMikroskopowakomora
DRM-600Millennium Sciences CELL-VUN/A
Bursztynian sól disodowaSigma AldrichW327700
do liczenia plemników bez dotyczy

Bibliografia

  1. Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 37(2015).
  2. Guzick, D. S., et al. Sperm morphology, motility, and concentration in fertile and infertile men. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1388-1393 (2001).
  3. Wang, C., Swerdloff, R. S. Limitations of semen analysis as a test of male fertility and anticipated needs from newer tests. Fertility and Sterility. 102 (6), 1502-1507 (2014).
  4. Amaral, A. Energy metabolism in mammalian sperm motility. WIREs Mechanisms of Disease. 14 (5), e1569(2022).
  5. Leung, M. R., et al. In-cell structures of conserved supramolecular protein arrays at the mitochondria-cytoskeleton interface in mammalian sperm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (45), e2110996118(2021).
  6. Moraes, C. R., Meyers, S. The sperm mitochondrion: Organelle of many functions. Animal Reproduction Science. 194, 71-80 (2018).
  7. Cassina, A., et al. Defective human sperm cells are associated with mitochondrial dysfunction and oxidant production. Biology of Reproduction. 93 (5), 119(2015).
  8. Marchetti, C., Obert, G., Deffosez, A., Formstecher, P., Marchetti, P. Study of mitochondrial membrane potential, reactive oxygen species, DNA fragmentation and cell viability by flow cytometry in human sperm. Human Reproduction. 17 (5), 1257-1265 (2002).
  9. Amaral, A., Lourenço, B., Marques, M., Ramalho-Santos, J. Mitochondria functionality and sperm quality. Reproduction. 146 (5), R163-R174 (2013).
  10. Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction. Andrologia. 53 (1), e13666(2021).
  11. Uribe, P., et al. Use of the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester perchlorate for mitochondrial membrane potential assessment in human spermatozoa. Andrologia. 49 (9), e12753(2017).
  12. Storey, B. T. Mammalian sperm metabolism: Oxygen and sugar, friend and foe. The International Journal of Developmental Biology. 52 (5-6), 427-437 (2008).
  13. Tourmente, M., Sansegundo, E., Rial, E., Roldan, E. R. S. Capacitation promotes a shift in energy metabolism in murine sperm. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 950979(2022).
  14. Gnaiger, E. Chapter 12 - Polarographic oxygen sensors, the oxygraph, and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. Dykens, J. A., Will, Y. , Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. 325-352 (2008).
  15. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  16. Awadhpersad, R., Jackson, C. B. High-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e63000(2021).
  17. Chance, B., Williams, G. R. A simple and rapid assay of oxidative phosphorylation. Nature. 175 (4469), 1120-1121 (1955).
  18. Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
  19. Stendardi, A., et al. Evaluation of mitochondrial respiratory efficiency during in vitro capacitation of human spermatozoa. International Journal of Andrology. 34 (3), 247-255 (2011).
  20. Ferramosca, A., Focarelli, R., Piomboni, P., Coppola, L., Zara, V. Oxygen uptake by mitochondria in demembranated human spermatozoa: A reliable tool for the evaluation of sperm respiratory efficiency. International Journal of Andrology. 31 (3), 337-345 (2008).
  21. Ferramosca, A., et al. Modulation of human sperm mitochondrial respiration efficiency by plant polyphenols. Antioxidants. 10 (2), 217(2021).
  22. Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Méndez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 27 (6), 583-596 (1995).
  23. Gnaiger, E. O2k Quality Control 1: Polarographic oxygen sensors and accuracy of calibration. , Available from: https://www.bioblst.at/images/archive/7/77/20210819114548%21MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP.pdf (2020).
  24. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787 (2010).
  25. Gnaiger, E. O2k-protocols SOP: O2k quality control 1. , Available from: https://www.bioblast.at/images/9/9c/MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP_DatLab8.pdf (2021).
  26. Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck, Austria. (2012).
  27. Steinlechner-Maran, R., Eberl, T., Kunc, M., Margreiter, R., Gnaiger, E. Oxygen dependence of respiration in coupled and uncoupled endothelial cells. The American Journal of Physiology. 271, C2053-C2061 (1996).
  28. Holt, W. V., Van Look, K. J. W. Concepts in sperm heterogeneity, sperm selection and sperm competition as biological foundations for laboratory tests of semen quality. Reproduction. 127 (5), 527-535 (2004).
  29. Sousa, A. P., et al. Not all sperm are equal: Functional mitochondria characterize a subpopulation of human sperm with better fertilization potential. PloS One. 6 (3), e18112(2011).
  30. Moscatelli, N., et al. Single-cell-based evaluation of sperm progressive motility via fluorescent assessment of mitochondria membrane potential. Scientific Reports. 7, 17931(2017).
  31. Ferreira, J. J., et al. Increased mitochondrial activity upon CatSper channel activation is required for mouse sperm capacitation. Redox Biology. 48, 102176(2021).
  32. Irigoyen, P., et al. Mitochondrial metabolism determines the functional status of human sperm and correlates with semen parameters. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 926684(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa
Posted by JoVE Editors on 9/26/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. The Protocol and Representative Result sections were updated.

Step 2.4.12 of the Protocol was updated from:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex II inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

to:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex III inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

Figure 3 in the Representative Results section was updated from:

Oxygen concentration analysis; graphs showing O₂ levels vs. time and digitonin effect; data chart.
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Oxygen consumption analysis; graph shows O₂ concentration and flux (A) and rate vs. digitonin (B).
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

Tagi

Mitochondria plemnikówzużycie tlenumęska niepłodnośćjakość nasieniawskaźniki oddechoweprodukcja ATPmetabolizm energetyczny plemników
Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w plemnikach ludzkich
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.