Utrzymanie integralności genomu oocytu jest niezbędne do zapewnienia genetycznej wierności powstałego zarodka. W tym miejscu przedstawiamy dokładny protokół wykrywania pęknięć dwuniciowych DNA w żeńskich komórkach rozrodczych ssaków.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie dwuniciowych pęknięć DNA w oocytach myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Oocyty są jednymi z największych i najbardziej długowiecznych komórek w kobiecym ciele. Powstają w jajnikach podczas rozwoju embrionalnego i pozostają zatrzymane w profazie mejozy I. Stan spoczynku może trwać latami, dopóki oocyty nie otrzymają bodźca do wzrostu i nie uzyskają kompetencji do wznowienia mejozy. Ten przedłużający się stan zatrzymania sprawia, że są one niezwykle podatne na gromadzenie się uszkodzeń DNA, które wpływają na integralność genetyczną żeńskich gamet, a tym samym na integralność genetyczną przyszłego zarodka.
W związku z tym, opracowanie dokładnej metody wykrywania uszkodzeń DNA, która jest pierwszym krokiem do ustanowienia mechanizmów odpowiedzi na uszkodzenia DNA, ma kluczowe znaczenie. W pracy opisano powszechny protokół badania obecności i postępu uszkodzeń DNA w oocytach zatrzymanych przez profazę w okresie 20 godzin. W szczególności przeprowadzamy sekcję jajników myszy, odzyskujemy kompleksy wzgórek-oocyty (COC), usuwamy komórki wzgórka z COC i hodujemy oocyty w pożywce Μ2 zawierającej 3-izobutylo-1-metyloksantynę, aby utrzymać stan zatrzymania. Następnie oocyty są traktowane cytotoksycznym, przeciwnowotworowym lekiem, etopozydem, w celu wywołania pęknięć podwójnej nici (DSB).
Korzystając z immunofluorescencji i mikroskopii konfokalnej, wykrywamy i określamy ilościowo poziomy białka rdzeniowego γH2AX, które jest ufosforylowaną formą histonu H2AX. H2AX ulega fosforylacji w miejscach DSB po uszkodzeniu DNA. Niezdolność do przywrócenia integralności DNA po uszkodzeniu DNA w oocytach może prowadzić do niepłodności, wad wrodzonych i zwiększonej liczby poronień samoistnych. Dlatego zrozumienie mechanizmów odpowiedzi na uszkodzenia DNA, a jednocześnie ustanowienie nienaruszonej metody badania tych mechanizmów, ma zasadnicze znaczenie dla badań z zakresu biologii rozrodu.
Wprowadzenie
Proces mejozy w żeńskich komórkach rozrodczych ssaków jest inicjowany w jajnikach przed urodzeniem. Całkowita liczba oocytów ustala się w jajnikach przede wszystkim podczas embriogenezy. Oocyty wchodzą w mejozę i pozostają zatrzymane w profazie I1. Po nadejściu okresu dojrzewania oraz produkcji i działaniu hormonalnym hormonu folikulotropowego (FSH) i hormonu luteinizującego (LH), oocyty mogą ponownie zainicjować i zakończyć mejozę2. U ludzi zatrzymanie profazy może trwać do 50 lat3. Podziały komórkowe po wejściu w mejozę I są asymetryczne, co skutkuje wytwarzaniem małego ciała polarnego i oocytu, który zachowuje swoją wielkość. Tak więc większość składników cytoplazmatycznych jest przechowywana w ooplazmie podczas wczesnej embriogenezy4. Następnie oocyty wchodzą w mejozę II, bez reformowania jądra lub dekondensacji chromosomów, i pozostają zatrzymane w metafazie II do momentu zapłodnienia5.
Unikalną cechą, która odróżnia oocyty od komórek somatycznych, jest stan zatrzymania w profazie I, kiedy oocyt posiada nienaruszone jądro (zatrzymanie pęcherzyków rozrodczych [GV])), określany jako stadium GV6. W oparciu o organizację chromatyny, oocyty w stadium GV dzielą się na dwie kategorie: jąderko nieotoczone (NSN) i jąderko otoczone (SN)7,8. W oocytach NSN w stadium GV chromatyna rozprzestrzenia się po całym regionie jądrowym, a transkrypcja jest aktywna, podczas gdy w oocytach SN chromatyna tworzy zwarty pierścień otaczający jąderko, a transkrypcja jest cicha9. Oba typy oocytów w stadium GV wykazują kompetencje mejotyczne; wchodzą w mejozę w tym samym tempie, ale oocyty NSN wykazują niską zdolność rozwojową i nie mogą rozwinąć się poza stadium dwukomórkowe embryo10.
Przedłużający się stan zatrzymania profazy I zwiększa częstość występowania akumulacji uszkodzeń DNA11. W związku z tym mechanizmy odpowiedzi na uszkodzenia DNA w oocytach są niezbędne do umożliwienia produkcji gamet o integralności genetycznej i zapewnienia, że powstały zarodek ma fizjologiczną zawartość chromosomów.
Centralnym aspektem odpowiedzi na uszkodzenia DNA jest naprawa DNA. Główne szlaki naprawy DSB w komórkach eukariotycznych obejmują niehomologiczne łączenie końców (NHEJ), rekombinację homologiczną (HR) i alternatywne NHEJ12,13,14,15. NHEJ jest szybszym, ale bardziej podatnym na błędy mechanizmem, podczas gdy HR wymaga więcej czasu na ukończenie, ale ma wysoką wierność16.
Nie ma wystarczającej wiedzy na temat mechanizmów, które oocyty wykorzystują do naprawy uszkodzeń DNA. Badania wykazały, że uszkodzenia DNA wywołane w pełni rozwiniętych oocytach ssaków przez użycie czynników genotoksycznych, takich jak etopozyd, doksorubicyna lub promieniowanie UVB lub promieniowanie jonizujące, nie wpływają na czas i szybkość wychodzenia z profazy I arrest17. Oocyty mogą ulegać rozpadowi GV (GVBD) nawet w przypadku podwyższonego poziomu uszkodzenia. Uszkodzenie to można określić na podstawie obserwacji γH2AX. Ta fosforylowana forma H2AX (γΗ2ΑΧ) jest markerem DSB, który znajduje się w miejscu pęknięć i działa jak rusztowanie, pomagając w naprawie czynników i białek gromadzących się na złamanych końcach18.
Brak zatrzymania cyklu komórkowego po uszkodzeniu DNA wynika z niewystarczającego punktu kontrolnego uszkodzenia DNA, który pozwala oocytom z nienaprawionym DNA na ponowne wejście w mejozę. Po wysokim poziomie uszkodzenia DNA, punkt kontrolny może utrzymać zatrzymanie profazy poprzez aktywację szlaku zależnego od ATM / Chk1. Ograniczona odpowiedź punktu kontrolnego na DSB wynika z ograniczonej aktywacji ATM17,19. W fazie M mejozy I badania wykazały, że uszkodzenie DNA może aktywować punkt kontrolny mejozy I wywołany przez punkt kontrolny montażu wrzeciona (SAC), który zapobiega aktywacji kompleksu / cyklosomu promującego anafazę ligazy ubikwityny E3 (APC / C), a tym samym wyjściu fazy M. Co więcej, ablacja białek SAC przezwycięża stan zatrzymania fazy M, podkreślając w ten sposób znaczenie SAC w ustanowieniu mejozy I chekpoint20.
Jak wyraźnie pokazują poprzednie badania, DSB nie są w stanie wywołać silnego punktu kontrolnego profazy w oocytach myszy. Jeśli takie uszkodzenie nie zostanie naprawione, może to prowadzić do tego, że zarodki będą nosicielami nieprawidłowości chromosomalnych. Dlatego ważne jest, aby zbadać reakcję na uszkodzenie DNA na różnych etapach żeńskiej gametogenezy, aby lepiej zrozumieć unikalne szlaki, których oocyty używają do radzenia sobie z potencjalnymi zniewagami genetycznymi.
Protokół
Wszystkie eksperymenty z udziałem myszy zostały zatwierdzone przez lokalne organy nadzorcze (Region Ioannina, Grecja) i przeprowadzone zgodnie z dyrektywami Rady Wspólnot Europejskich 2010/63/EU. Eksperymenty przeprowadzono z poszanowaniem zasad 3R. Wszystkie myszy CD-1 wykorzystane w badaniach były utrzymywane w animalarium Uniwersytetu w Ioanninie w Grecji, w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (22 °C) i wilgotności (60%) oraz karmione ad libitum. Animalarium posiada licencję na prowadzenie placówki do hodowli (EL33-BIObr01), dostarczania zwierząt (EL33-BIOsup01) oraz przeprowadzania eksperymentów (EL33BIO-exp01).
1. Przygotowanie odczynników
- Rozpuścić proszek 3-izobutyl-1-metylksantyny (IBMX) (patrz Tabela materiałów) w dimetylosulfotlenku (DMSO) (patrz Tabela materiałów) do uzyskania stężenia końcowego 200 mM. Przygotować alikwoty po 10 µL i przechowywać w temperaturze −20 °C. Roztwór należy wykorzystać w ciągu 1 miesiąca.
UWAGA: Proszek IBMX przechowywany jest w temperaturze −20 °C. - Przygotować wszystkie bufory do immunofluorescencji i przechowywać je w temperaturze 4 °C.
- Przygotować sterylny roztwór soli fizjologicznej fosforanowej (PBS), rozpuszczając jedną tabletkę PBS (patrz Tabela materiałów) w 200 mL ddH2Ο.
- Przygotować bufor PHEM, dodając do 80 mL ddH2Ο 0,59575 g HEPES, 1,81422 g PIPES, 0,38035 g EGTA oraz 0,04066 g MgCl2 (patrz Tabela materiałów) przy jednoczesnym mieszaniu za pomocą mieszadła magnetycznego (patrz Tabela materiałów), a następnie dodając NaOH (patrz Tabela materiałów) aż do osiągnięcia pH 6,9 (sprawdzić za pomocą miernika pH/ORP [patrz Tabela materiałów]). Następnie dopełnić ddH2Ο do końcowej objętości 100 mL.
- Przygotować bufor paraformaldehyd-Triton-X-100 (PFA-Tx-100), rozpuszczając proszek PFA (patrz Tabela materiałów) w buforze PHEM przy mieszaniu magnetycznym i podgrzewaniu do uzyskania końcowego stężenia 4% PFA. Następnie przefiltrować bufor za pomocą strzykawki i filtra 0,2 µm (patrz Tabela materiałów), a następnie dodać 0,5% Tx-100 (patrz Tabela materiałów). Przygotować około 10 mL PFA-Tx-100 (0,4 g PFA, 50 µL Tx-100), co jest ilością wystarczającą na jeden eksperyment. Przechowywać w temperaturze 4 °C maksymalnie przez 1 tydzień.
OSTROŻNIE: Podczas pracy z PFA należy używać rękawiczek i unikać kontaktu z skórą oraz oczami. - Przygotować bufor do płukania, dodając albuminę surowicy bydlęcej (stężenie końcowe: 0,5% w/v BSA) (patrz Tabela materiałów) do PBS i mieszając mechanicznie. Dodać bufor 10% w/v NaN3 (azotek sodu) w rozcieńczeniu 1:1 000, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia grzybiczego i bakteryjnego. Bufor 10% w/v NaN3 przygotować, dodając 1 g proszku NaN3 (patrz Tabela materiałów) do 10 mL ddH2O; bufor NaN3 przechowywać w temperaturze pokojowej.
- Przygotować bufor blokujący, dodając BSA (stężenie końcowe: 3% w/v) do PBS i mieszając mechanicznie. Dodać bufor 10% NaN3 w rozcieńczeniu 1:1 000.
2. Izolacja oocytów w stadium GV z wypreparowanych jajników i indukcja DSB
UWAGA: Wszystkie narzędzia i roztwory powinny być sterylne. Praca z oocytami jest prowadzona przy użyciu pipety ustnej pod mikroskopem stereoskopowym (patrz Tabela materiałów), a wszystkie krople są przykryte olejem mineralnym (patrz Tabela materiałów oraz Rycina 1E).
- Wstrzyknąć myszom dootrzewnowo 7 jednostek międzynarodowych (IU) gonadotropiny z surowicy klaczy w ciąży (PMSG) (patrz Tabela materiałów) na 46-48 h przed uśmierceniem myszy poprzez zwichnięcie stawów szyjnych.
UWAGA: Wszystkie użyte myszy powinny być w wieku 8-12 tygodni. - Przefiltrować pożywkę hodowlaną M2 (patrz Tabela materiałów) za pomocą strzykawki i filtra 0,2 µm, a następnie dodać IBMX 200 mM do końcowego stężenia 200 µM w probówce z okrągłym dnem o pojemności 14 mL (patrz Tabela materiałów), aby utrzymać oocyty w fazie profazy I. Następnie przygotować krople pożywki M2-IBMX w plastikowej szalce do hodowli tkanek (patrz Tabela materiałów) i umieścić ją na bloku grzejnym (patrz Tabela materiałów) w temperaturze 37 °C na co najmniej 30 min przed izolacją oocytów. Pożywkę M2 przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Uśmiercić myszy poprzez zwichnięcie stawów szyjnych, wypreparować jajniki i umieścić je w probówce z okrągłym dnem o pojemności 5 mL (patrz Tabela materiałów) z pożywką M2-IBMX.
- Przenieść jajniki na plastikową pokrywkę zawierającą 1,5 mL pożywki M2-IBMX, usunąć tkankę tłuszczową okołojajnikową lub fragmenty jajowodów i uwolnić kompleksy oocyt-cumulus (COC) poprzez mechaniczną perforację jajników igłą 27 G (patrz Tabela materiałów i Rycina 1A-C).
- Przenieść COC do szalki hodowlanej z kroplami M2-IBMX (każda około 25-30 µL) i usunąć komórki cumulusa poprzez wielokrotne pipetowanie za pomocą szklanej pipety Pasteura o wąskim wylocie (patrz Tabela materiałów i Rycina 1D).
- Wybrać oocyty w stadium GV z jądrem centralnie położonym (SN) i przenieść je do kropli (25 µL) pożywki M2-IBMX na blok grzejny w temperaturze 37 °C, chroniąc je przed światłem (Rycina 1F).
- Oocyty SN rozpoznawać po większym rozmiarze i centralnie położonych jądrach w przeciwieństwie do oocytów NSN, w których jądra są rozmieszczone peryferyjnie21. W każdym przypadku obserwować konfigurację DNA pod mikroskopem konfokalnym przed podjęciem ostatecznej decyzji co do typu oocytu GV (SN lub NSN).
- Indukować pęknięcia dwuniciowe (DSB) za pomocą etopozydu (patrz Tabela materiałów). Umieścić oocyty w stadium GV w kroplach (każda 25 µL) czynnika genotoksycznego na 1 h na bloku grzejnym w temperaturze 37 °C w ciemności.
UWAGA: Etopozyd jest inhibitorem topoizomerazy II, który wprowadza DSB do DNA22. Przechowywać etopozyd w aliquotach 10 µL o stężeniu 20 mg/mL w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Przetestowane stężenia to 5 µg/mL, 20 µg/mL i 50 µg/mL. - Aby utrzymać oocyty w stadium GV w stanie zahamowania przez dłuższy czas, umieścić je w kroplach pożywki hodowlanej M16 (patrz Tabela materiałów) uzupełnionej o 400 µM IBMX w inkubatorze (patrz Tabela materiałów) w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Pożywkę M16 przechowywać w 4 °C, przefiltrować pożywkę za pomocą strzykawki i filtra 0,2 µm oraz inkubować przez co najmniej 1 h przed użyciem.
Rysunek 1: Proces izolacji oocytów. (A) Usuwanie okołojajnikowej tkanki tłuszczowej i pozostałości segmentów jajowodów z jajników w medium M2 z IBMX. Zdjęcie wykonane przez okulary mikroskopu stereoskopowego. Pasek skali = 1 mm. (B) Izolowane jajniki w medium M2 z IBMX. Obraz uzyskany przez okulary mikroskopu stereoskopowego. Pasek skali = 1 mm. (C) Mechaniczna perforacja jajników przy użyciu igły 27 G w medium M2 z IBMX. Obraz uzyskany przez okulary mikroskopu stereoskopowego. Pasek skali = 1 mm. (D) Kompleksy oocyt-cumulus (COCs) uwolnione z jajników po perforacji w medium M2 z IBMX. Obraz uzyskany przez okulary mikroskopu stereoskopowego. Pasek skali = 100 µm. (E) Zbieranie oocytów za pomocą pipety ustnej. (F) Oocyty denudowane, po usunięciu otaczających komórek cumulus, w medium M2 z IBMX. Obraz uzyskany przez okulary mikroskopu stereoskopowego. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
3. Fixacja oocytów i immunofluorescencja
UWAGA: Manipulacje z oocytami są przeprowadzane przy użyciu pipety ustnej pod mikroskopem stereoskopowym, a wszystkie krople są przykryte olejem mineralnym.
- Umieścić oocyty w stadium GV z grupy kontrolnej oraz traktowane etoposydem w oddzielnych plastikowych szalkach do hodowli tkanek w buforze PFA-Tx-100 na 40 min w temperaturze pokojowej.
- Przepłukać oocyty w trzech oddzielnych kroplach buforu płuczącego (po 50 µL każda) w temperaturze pokojowej. Pozostawić oocyty na 5 min w każdej kropli.
- Umieścić oocyty w kroplach buforu blokującego (po 25 µL każda) na 1 h na bloku grzewczym w temperaturze 37 °C.
- Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe rozpoznające γH2AX (rabbit phospho-Η2ΑΧ) (Ser139) (patrz Tabela materiałów) (roztwór stokowy: 1 mg/mL). Zastosować rozcieńczenie 1:200 w buforze blokującym i umieścić oocyty w kroplach przeciwciała pierwszorzędowego (po 15 µL każda) w temperaturze 4 °C przez noc.
UWAGA: Phospho-Η2ΑΧ (γH2AX) jest powszechnym markerem służącym do wykrywania DSBs zarówno w komórkach somatycznych, jak i oocytach w stadium GV18,23. - Następnego dnia przepłukać oocyty w trzech oddzielnych kroplach buforu płuczącego (po 50 µL każda) w temperaturze pokojowej. Pozostawić oocyty na 5 min w każdej kropli.
- Przygotować przeciwciało drugorzędowe, sprzężone z Alexa Fluor 488 przeciwko królikom z kozy (patrz Tabela materiałów) (roztwór stokowy: 2 mg/mL). Zastosować rozcieńczenie 1:200 w buforze blokującym i umieścić oocyty w kroplach przeciwciała drugorzędowego (po 15 µL każda) na 1 h na bloku grzewczym w temperaturze 37 °C, chroniąc je przed światłem.
- Przenieść oocyty do kropli DRAQ7 (po 25 µL każda) (roztwór stokowy: 0.3 mM; patrz Tabela materiałów), który jest dalekoczerwonym fluorescencyjnym barwnikiem DNA, barwiącym DNA wyłącznie w komórkach permeabilizowanych. Zastosować rozcieńczenie 1:250 w buforze płuczącym przez 10 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
- Przepłukać oocyty w trzech oddzielnych kroplach buforu płuczącego (po 50 µL każda) w temperaturze pokojowej. Pozostawić je na 5 min w każdej kropli, a następnie przenieść do małych kropli (około 5 µL każda) buforu płuczącego w szalce Petriego z szklanym dnem o średnicy 35 mm (patrz Tabela materiałów) do mikroskopii konfokalnej (Rycina 2A).
UWAGA: Płukanie z barwnika DNA oraz przeciwciała drugorzędowego wykonuje się jednocześnie.
4. Mikroskopia konfokalna
UWAGA: Mikroskopię konfokalną należy przeprowadzić niezwłocznie, aby uniknąć spadku intensywności fluorescencji po umieszczeniu oocytów w szalkach z szklanym dnem. Wymagany jest dostęp do mikroskopu konfokalnego (patrz Tabela materiałów) z zmotoryzowanym stolikiem.
- Konfiguracja mikroskopu
- W systemie konfokalnym włącz sterownik laserów, lasery, sterownik mikroskopu, lampy światła przechodzącego oraz komputer (Rycina 2B, D).
- Otwórz oprogramowanie konfokalne i wybierz obiektyw olejowy 40x.
- Umieść szalkę w uchwycie na preparat i spróbuj ustawić ostrość na oocyty, przesuwając stolik w osiach XY i Z za pomocą joysticka (Rycina 2C).
- Skanowanie oocytów
- Ustaw moc lasera, wzmocnienie (gain) oraz rozmiar otworu pinhole osobno dla każdego eksperymentu, aby zminimalizować zjawisko nasycenia.
- Dla każdego oocytu określ obszar zainteresowania, a konkretnie obszar DNA w jądrze komórkowym. Zdefiniuj granice obszaru DNA i ustaw wielkość kroku z na 3 µm. Następnie rozpocznij skanowanie.
- Zapisz obrazy dla każdej komórki w wybranym folderze.
- Po zakończeniu skanowania wyjdź z oprogramowania, wyłącz komputer, a następnie wyłącz sterownik laserów, lasery, sterownik mikroskopu oraz lampy światła przechodzącego.
Rycina 2: Mikroskopia konfokalna. (A) Utrwalone oocyty po wykonaniu protokołu immunofluorescencji i barwienia DNA, znajdujące się w oddzielnych kroplach buforu płuczącego, przykryte olejem mineralnym, umieszczone w szkiełku z dnem szklanym i przygotowane do obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej. Każda kropla zawiera inną kategorię eksperymentalną. Obraz uzyskany przez okulary mikroskopu stereoskopowego. Pasek skali = 1 mm/100 µm dla fragmentu powiększonego. (B) Płytka z dnem szklanym umieszczona na stoliku mikroskopu konfokalnego. (C) Obraz oocytów w polu jasnym uzyskany za pomocą mikroskopii konfokalnej. Pasek skali = 100 µm. (D) System mikroskopii konfokalnej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
5. Analiza obrazowania
- Pobierz program Fiji ImageJ-win64 przez przeglądarkę (https://imagej.net/software/fiji/downloads), otwórz go i zaimportuj dane jako pliki stosu TIFF.
UWAGA: Otwieraj każdy plik oocytu oddzielnie. - Kliknij Image | Color | Split Channels, aby rozdzielić wszystkie kanały.
- Kliknij LUT (Look up Table) i wybierz preferowane kolory dla każdego kanału.
- Kliknij Image | Color | Merge Channels, aby połączyć kanały dla γΗ2ΑΧ i DNA. Pozostaw kanał w jasnym polu nierozdzielony.
- W oocytach NSN oraz w oocytach SN z niskim poziomem uszkodzeń DNA, γΗ2ΑΧ jest wykrywany jako ogniska (foci) w obszarze DNA. W takim przypadku kliknij polecenie "Multi-point" lub point i zaznacz każde ognisko γΗ2ΑΧ pokrywające się z DNA. Powtórz ten krok dla wszystkich stosów.
- W oocytach SN z wysokim poziomem uszkodzeń DNA sygnał γΗ2ΑΧ jest rozłożony w całym obszarze DNA. W takim przypadku kliknij Image | Stacks | Z project, a następnie za pomocą polecenia Freehand selections zaznacz cały obszar DNA.
- Aby zmierzyć fluorescencję γΗ2ΑΧ, kliknij Analyze | Measure i skopiuj pomiary do pliku .xlsx. Następnie oblicz średnią fluorescencję, znormalizuj wartości i policz liczbę ognisk przed utworzeniem wykresów.
- Kliknij Analyze | Set Scale, aby ustawić skalę, a następnie Analyze | Tools | Scale bar, aby dodać pasek skali do kanałów.
Wyniki
Stosując zaprezentowaną tutaj procedurę, wypreparowano jajniki mysie, usunięto tkankę tłuszczową i zebrano w pełni wykształcone oocyty w stadium GV. Następnie, za pomocą wąskiej pipety i wielokrotnego pipetowania, usunięto komórki cumulus, a oocyty przeniesiono do świeżych kropel pożywki M2-IBMX i przykryto olejem mineralnym na bloku grzewczym (37 °C) (Ryc. 1A-F). Przygotowano trzy różne stężenia etoposydu (5 µg/mL, 20 µg/mL i 50 µg/mL), korzystając ze stężenia zapasu etoposydu wynoszącego 20 mg/mL. Oocyty w stadium GV umieszczono w trzech różnych stężeniach etoposydu na 1 h w kroplach przykrytych olejem mineralnym, w temperaturze 37 °C, chroniąc je przed światłem. Następnie przeprowadzono protokół immunofluorescencji, szczegółowo opisany w sekcji protokołu, a oocyty umieszczono w szalkach z szklanym dnem i obserwowano przy użyciu mikroskopii konfokalnej (Ryc. 2).
W oocytach w stadium GV zwierząt SN, bezpośrednio po uszkodzeniu DNA, obecność γH2AX wzrosła przy wszystkich stężeniach etopozydu (5 µg/mL, 20 µg/mL i 50 µg/mL), a γH2AX rozłożył się w całym obszarze DNA (Rycina 3). Kwantyfikacja i szacowanie DSB zostały przeprowadzone poprzez obserwację intensywności fluorescencji γH2AX w miejscach występowania DNA. Fluorescencja γH2AX nasilała się proporcjonalnie do wzrostu stężeń etopozydu. Co więcej, po przedłużonym zatrzymaniu w profazie (20 h po traktowaniu etopozydem), oocyty w stadium GV wykazały zdolność do redukcji liczby i intensywności ognisk γH2AX, co sugeruje obecność aktywnych procesów naprawczych w oocytach z zatrzymaniem w stadium GV (Rycina 3E).
W przeciwieństwie do oocytów SN, w których fluorescencja γH2AX była rozłożona w obrębie DNA, w oocytach NSN γH2AX występowała w formie ognisk (foci) bezpośrednio po podaniu etoposydu w stężeniu 20 µg/mL. Oszacowano liczbę ognisk pokrywających się z obszarem DNA, obliczono fluorescencję każdego ogniska i przedstawiono średnią fluorescencję dla wszystkich oocytów. Zarówno fluorescencja, jak i liczba ognisk wykazały statystycznie istotne różnice pomiędzy dwiema kategoriami oocytów (Rysunek 4).
Mikroskopia konfokalna dostarcza informacji o liczbie i intensywności ognisk w różnych seriach obrazów Z (Z-stacks), co pomaga w identyfikacji obecności uszkodzeń DNA oraz dynamiki naprawy w określonych punktach czasowych. Skanowanie galwanometryczne zapewnia precyzyjne skanowanie przy niskim poziomie tła i lepszą analizę uzyskanych obrazów.
Rycina 3: Redukcja γH2AX w oocytach w stadium GV z SN traktowanych trzema różnymi stężeniami etoposydu po przedłużonym zatrzymaniu w stadium GV. (A) Fluorescencja γH2AX w oocytach w stadium GV z SN 0 h po traktowaniu etoposydem. Poziom γH2AX wzrasta natychmiast po ekspozycji przy wszystkich stężeniach etoposydu, a wzrost ten jest zależny od stężenia (zielony: γΗ2ΑΧ, purpurowy: DNA). Obrazy są projekcjami stosu Z, a jasność/kontrast zostały dostosowane dla każdego kanału przy użyciu programu Fiji / ImageJ. Pasek skali = 10 µm. (B) Wykres fluorescencji γH2AX w oocytach w stadium GV z SN 0 h po traktowaniu różnymi stężeniami etoposydu. Dane przedstawiają średnią ± SEM. Każda kropka reprezentuje jeden oocyt (liczba oocytów jest podana na wykresie), (ns = brak istotności, ** p < 0.005, **** p < 0.0001, jednoczynnikowa ANOVA z testem wielokrotnych porównań Tukeya). (C) Fluorescencja γH2AX w oocytach w stadium GV z SN 20 h po traktowaniu etoposydem. Poziom γH2AX spada 20 h po ekspozycji przy wszystkich stężeniach etoposydu (zielony: γΗ2ΑΧ, purpurowy: DNA). Obrazy są projekcjami stosu Z, a jasność/kontrast zostały dostosowane dla każdego kanału przy użyciu programu Fiji/ImageJ. Pasek skali = 10 µm. (D) Wykres fluorescencji γH2AX w oocytach w stadium GV z SN 20 h po traktowaniu różnymi stężeniami etoposydu. Dane przedstawiają średnią ± SEM. Każda kropka reprezentuje jeden oocyt (liczba oocytów jest podana na wykresie), (ns = brak istotności, * p < 0.05, ** p < 0.005, *** p < 0.0005, **** p < 0.0001, jednoczynnikowa ANOVA z testem wielokrotnych porównań Tukeya). (E) Wykres słupkowy redukcji fluorescencji γH2AX w oocytach w stadium GV z SN po zatrzymaniu w profazie u oocytów traktowanych etoposydem. Liczba nad każdą kolumną wskazuje procentowy spadek fluorescencji γH2AX. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Fosforylacja Η2ΑΧ w oocytach NSN w stadium GV po traktowaniu etoposydem w stężeniu 20 µg/mL. (A) Reprezentatywne obrazy konfokalne jednego kontrolnego oocytu NSN w stadium GV (zielony: γΗ2ΑΧ, magenta: DNA). Obrazy są projekcjami stosu Z, a jasność/kontrast zostały dostosowane dla każdego kanału przy użyciu programu Fiji/ImageJ. Pasek skali = 10 µm. (B) Reprezentatywne obrazy konfokalne jednego oocytu NSN w stadium GV traktowanego etoposydem (zielony: γΗ2ΑΧ, magenta: DNA). Oocyty utrwalono 0 h po traktowaniu etoposydem. Obrazy są projekcjami stosu Z, a jasność/kontrast zostały dostosowane dla każdego kanału przy użyciu programu Fiji/ImageJ. Pasek skali = 10 µm. (C) Znormalizowana fluorescencja γΗ2ΑΧ w oocytach NSN w stadium GV po traktowaniu etoposydem w stężeniu 20 µg/mL. Dane przedstawiają średnią ± SEM. Każda kropka reprezentuje jeden oocyt (liczba oocytów jest podana na wykresie), pobrany z dwóch niezależnych eksperymentów (**** p < 0.0001, nieparzysty nieparametryczny test t, test U Mann-Whitneya). (D) Liczba ognisk γΗ2ΑΧ w oocytach NSN w stadium GV po traktowaniu etoposydem w stężeniu 20 µg/mL. Dane przedstawiają średnią ± SEM. Każda kropka reprezentuje jeden oocyt (liczba oocytów jest podana na wykresie), pobrany z dwóch niezależnych eksperymentów (**** p < 0.0001, nieparzysty nieparametryczny test t, test U Mann-Whitneya). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Korzystając z opisanej tutaj metody, wykryliśmy DSB w oocytach ssaków. Metoda ta pozwala na wykrycie i zbadanie procesu naprawy DNA w oocytach. Ten sam protokół może być również wykorzystany do analizy innych białek, które uczestniczą w procesach fizjologicznych w oocytach ssaków. Ważne jest, aby zbadać, w jaki sposób oocyty reagują na potencjalne uszkodzenia DNA, aby lepiej zrozumieć przyczynę niepłodności kobiet u ludzi.
Badanie odpowiedzi na uszkodzenia DNA w oocytach ssaków może być trudne ze względu na wrażliwość oocytów. Postępowanie z oocytami wymaga określonych temperatur oraz stężeń CO2 iO2 . Jednocześnie oocyty muszą być chronione przed światłem. Cała obsługa powinna odbywać się przy użyciu szklanych pipet, które nie są zbyt wąskie, ponieważ może to być szkodliwe dla oocytów, ale także nie są zbyt szerokie, ponieważ może to spowodować rozcieńczenie pożywki, a tym samym negatywnie wpłynąć na procedurę utrwalania. Na każdym etapie utrwalania stosuje się kilka kropli, aby zminimalizować efekt rozcieńczenia. Alternatywnym sposobem obserwacji DSB jest test Comet24. Mimo że ta technika jest bardziej czuła, jest bardziej skomplikowana. Jednocześnie, przy użyciu testu Comet, nie jest możliwe wykrycie dokładnego regionu DNA, w którym dochodzi do uszkodzenia, a w komórkach z dużą ilością cząsteczek RNA, takich jak oocyty w stadium GV25, tło może zostać zwiększone, co prowadzi do fałszywego sygnału uszkodzenia DNA26.
Korzystając z opisanego tutaj protokołu immunofluorescencji, możemy z dokładnością wykrywać DSB i oszacować postęp naprawy oocytów w stadium GV, na co wskazuje zmniejszenie fluorescencji γH2AX w czasie. Niemniej jednak jednym z ograniczeń tej metody jest to, że niektóre przeciwciała mogą wykazywać niespecyficzną dystrybucję w ooplazmie, co prowadzi do obrazów o wysokiej fluorescencji tła. Bufor PFA-Tx-100 jest używany zamiast sekwencyjnego PFA i Tx-100, ponieważ zaobserwowaliśmy, że poprawia proces utrwalania, umożliwiając wykrywanie mniejszej ilości tła i niespecyficznej fluorescencji. Drugim ograniczeniem stosowania γH2AX do wykrywania DSB jest to, że uszkodzenia nie można oszacować po GVBD z powodu spontanicznej fosforylacji γH2AX w mejozie23.
W tym protokole immunofluorescencji oocyty pozostają w płynnym buforze i nie mogą być przechowywane w szkiełkach. Fakt ten utrudnia zachowanie utrwalonych komórek przez kilka dni po dodaniu przeciwciała drugorzędowego. Aby uzyskać obrazy dobrej jakości i nie stracić sygnału, zaleca się wykonanie obrazowania w ciągu kilku godzin po dodaniu przeciwciała wtórnego. Należy również zauważyć, że skanowanie jąder przez oś Z może spowodować, że sygnał stanie się słabszy z powodu prześwietlenia. Z tego powodu lepiej jest obniżyć moc lasera i zwiększyć prędkość skanowania.
Wreszcie, kolejnym ograniczeniem protokołu immunofluorescencji jest to, że może on być stosowany tylko w przypadku stałych/nieożywionych komórek. W związku z tym możemy oszacować tylko obecność i brak czynników w określonych punktach czasowych, nie wiedząc, czy występują jakiekolwiek wahania w ich koncentracji lub zmiany w ich zachowaniu w czasie. Problem ten można rozwiązać, stosując obrazowanie żywych komórek i markery znakowane fluorescencyjnie.
Oświadczenia
Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 3 ml pipety Pasteura z LDPE, z podziałką | APTACA | 1502 | |
| Strzykawki 10 cc | SoftCare | 114.104.21 | |
| Alexa Fluor 488-sprzężony kozioł anty-królik Wtórny Ab | Biotium | 20012 | |
| Anty-fosfo-H2A.X (Ser139) | Merck Millipore | 07-164 | |
| ARE Podgrzewanie mieszadła magnetycznego | VELP Scientifica | ||
| BD FALCON 5 ml probówki z okrągłym dnem z polistyrenu | BD Biosciences | 352054 | |
| BD Microlance 3 igły 27 g - 0,40 x 13 mm | Becton Dickinson | 300635 | |
| Surowica bydlęca Frakcja albuminy V | Roche | 10735078001 | |
| DMSO Bezwodny | Biotium | 90082 | |
| DRAQ7 Barwnik DNA | BioStatus | DR71000 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-25G | |
| EMSURE MgCl2. 6H2O | Merck Millipore | 1058330250 | |
| Etopozyd | CHEMIPHARM | L01CB01 | |
| FALCON 14 mL Polistyrenowe probówki okrągłodenne | Corning Science | 532057 | |
| FALCON Naczynia do hodowli tkankowych, Easy-Grip, 35 x 10 mm Styl | Corning Science | 353001 | |
| Naczynia do hodowli zwierząt ze szklanym dnem (szalka Petriego 35 mm / mikrostudzienka 14 mm, szkło nakrywkowe nr 0) | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147-25G | |
| HERACELL 150i | ThermoFisher Scientific | 50116048 | |
| IBMX w proszku | Sigma-Aldrich | I5879-100MG | |
| Leica M125 Mikroskop stereoskopowy | Leica Microsystems | ||
| M16 Medium | Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Olej mineralny | Sigma-Aldrich | M5310 | |
| NaN3 | Honeywell | 13412H | |
| NaOH | Merck Millipore | 1064981000 | |
| Nikon AX ECLIPSE Ti2 Mikroskop konfokalny | Nikon Corporation | ||
| Nikon SMZ800N Mikroskop stereoskopowy | Nikon Corporation | ||
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Pipety Pasteura, szklane, długie 230 mm | DURAN WHEATON KIMBLE | ||
| miernik pH/redoks | Hanna Instruments Ltd | HI2211 | |
| Tabletki soli fizjologicznej buforowane fosforanami | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| RURY | Sigma-Aldrich | P1851 | |
| PMSG Liofilizowane białko | Genway Biotech (obecnie AVIVA Systems Biology) | GWB-2AE30A (obecnie OPPA01037) | |
| QBD4 Suchy grzejnik blokowy | Grant Instruments (Cambridge) Ltd | A25218 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Whatman Puradisc 25 mm 0,2 μ m | filtry GE Healthcare | 6780-2502 |
Bibliografia
- Wang, X., Pepling, M. E. Regulation of meiotic prophase one in mammalian oocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 667306(2021).
- Filatov, M., Khramova, Y., Semenova, M. Molecular mechanisms of prophase I meiotic arrest maintenance and meiotic resumption in mammalian oocytes. Reproductive Sciences. 26 (11), 1519-1537 (2019).
- Adhikari, D., et al. Inhibitory phosphorylation of Cdk1 mediates prolonged prophase I arrest in female germ cells and is essential for female reproductive lifespan. Cell Research. 26 (11), 1212-1225 (2016).
- Sun, S. C., Kim, N. H. Molecular mechanisms of asymmetric division in oocytes. Microscopy and Microanalysis. 19 (4), 883-897 (2013).
- Jones, K. T. Mammalian egg activation: From Ca2+ spiking to cell cycle progression. Reproduction. 130 (6), 813-823 (2005).
- Solc, P., Schultz, R. M., Motlik, J. Prophase I arrest and progression to metaphase I in mouse oocytes: comparison of resumption of meiosis and recovery from G2-arrest in somatic cells. Molecular Human Reproduction. 16 (9), 654-664 (2010).
- Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Research. 22 (2), 219-231 (1989).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Molecular Reproduction and Development. 41 (4), 479-485 (1995).
- Sun, X., et al. Comprehensive analysis of nonsurrounded nucleolus and surrounded nucleolus oocytes on chromatin accessibility using ATAC-seq. Molecular Reproduction and Development. 90 (2), 87-97 (2023).
- Zuccotti, M., Bellone, M., Longo, F., Redi, C. A., Garagna, S. Fully-mature antral mouse oocytes are transcriptionally silent but their heterochromatin maintains a transcriptional permissive histone acetylation profile. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (12), 1193-1196 (2011).
- Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing. Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).
- Lieber, M. R. The mechanism of human nonhomologous DNA end joining. The Journal of Biological Chemistry. 283 (1), 1-5 (2008).
- Chiruvella, K. K., Liang, Z., Wilson, T. E. Repair of double-strand breaks by end joining. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (5), 012757(2013).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Shibata, A., Jeggo, P. A. Roles for the DNA-PK complex and 53BP1 in protecting ends from resection during DNA double-strand break repair. Journal of Radiation Research. 61 (5), 718-726 (2020).
- Mohiuddin, I. S., Kang, M. H. DNA-PK as an emerging therapeutic target in cancer. Frontiers in Oncology. 9, 635(2019).
- Marangos, P., Carroll, J. Oocytes progress beyond prophase in the presence of DNA damage. Current Biology. 22 (11), 989-994 (2012).
- Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
- Bakkenist, C. J., Kastan, M. B. DNA damage activates ATM through intermolecular autophosphorylation and dimer dissociation. Nature. 421 (6922), 499-506 (2003).
- Marangos, P., et al. DNA damage-induced metaphase I arrest is mediated by the spindle assembly checkpoint and maternal age. Nature Communications. 6, 8706(2015).
- Lavrentyeva, E. A., Shishova, K. V., Zatsepina, O. V. Differences in nuclear dynamics in mouse GV oocytes with a diverse chromatin configuration. Biology Bulletin Russian Academy of Sciences. 46, 332-341 (2019).
- Montecucco, A., Zanetta, F., Biamonti, G. Molecular mechanisms of etoposide. EXCLI Journal. 14, 95-108 (1998).
- Mayer, A., et al. DNA damage response during mouse oocyte maturation. Cell Cycle. 15 (4), 546-558 (2016).
- Olive, P., Banáth, J. The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells. Nature Protocols. 1, 23-29 (2006).
- Wu, D., Dean, J. EXOSC10 sculpts the transcriptome during the growth-to-maturation transition in mouse oocytes. Nucleic Acids Research. 48 (10), 5349-5365 (2020).
- Simon, L., Emery, B., Carrell, D. DNA damage: COMET assay. Manual of Sperm Function Testing in Human Assisted Reproduction. Agarwal, A., Henkel, R., Majzoub, A. , 202-212 (2021).
Przedruki i uprawnienia
