Walidowalny cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej do wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w badaniach bioliowania łez

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i walidacji dobrych praktyk laboratoryjnych w zakresie zgodnego wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w ludzkich łzach za pomocą kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy w celu wsparcia klinicznego rozwoju wektorów terapii genowej.

Streszczenie

Wykorzystanie wektorów wirusowych w leczeniu chorób genetycznych znacznie wzrosło w ostatnich latach, z ponad 2,000 zarejestrowanych do tej pory badań. Wektory wirusowe związane z adenowirusem (AAV) odniosły szczególny sukces w leczeniu chorób związanych z oczami, czego przykładem jest zatwierdzenie leku voretigene neparvovec-rzyl. Aby wprowadzić nowe terapie na rynek, agencje regulacyjne zazwyczaj wymagają kwalifikowanych lub zwalidowanych badań nad biowydzielaniem w celu oceny uwalniania wektora do środowiska. Jednak Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków nie wydała żadnych oficjalnych wytycznych dotyczących opracowywania testów molekularnych wspierających takie badania nad zrzucaniem, pozostawiając twórcom najlepsze praktyki dla siebie. Celem tego protokołu jest przedstawienie walidowanego protokołu wykrywania wektorów AAV w ludzkich łzach za pomocą kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (ddPCR) w celu wsparcia klinicznych badań nad biowydzielaniem. W niniejszym artykule omówiono obecne podejścia przemysłu do walidacji testów molekularnych i wykazano, że metoda wykracza poza kryteria akceptacji testów docelowych proponowane obecnie w białych księgach. Na koniec omówiono etapy krytyczne w wykonaniu dowolnego testu ddPCR, niezależnie od zastosowania.

Wprowadzenie

Definicje terapii genowej różnią się, ale zazwyczaj wywołują celową i często oczekiwaną trwałą zmianę określonej sekwencji DNA genomu komórkowego w celu modyfikacji lub manipulacji ekspresji genu lub zmiany właściwości biologicznych żywej komórki w celach klinicznych^1,2. Wektory wirusowe są coraz częściej wykorzystywane jako nośniki terapii genowej ze względu na ich skuteczność transdukcji, a jeden raport sugeruje, że ponad 70% obecnych badań klinicznych terapii genowej wykorzystuje wektory wirusowe³. Zainteresowanie wektorami wirusowymi w terapii genowej stale rośnie. Kwartalny raport danych za 4 kwartał 2022 r. na temat krajobrazu terapii genów, komórek i RNA opracowany przez American Society of Gene and Cell Therapy poinformował, że w 2022 r. linia terapii genów, komórek i RNA od przedklinicznej do wstępnej rejestracji wzrosła o 7%, zwiększając całkowitą liczbę opracowywanych terapii do 3 726, z czego 2 053 (55%) stanowiły terapie genowe⁴. Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (USA FDA) zatwierdziła obecnie 27 terapii komórkowych i genowych do użytku klinicznego u ludzi, z których pięć wykorzystuje wektory wirusowe⁵.

Wirusy związane z adenowirusami (AAV) zyskały szczególne zainteresowanie jako nośniki terapii genowej. Niedawna metaanaliza wykazała, że w ciągu ostatnich dwóch dekad przeprowadzono około 136 badań klinicznych badających zastosowanie AAV: ⁶. Ponadto trzy z pięciu zatwierdzonych przez amerykańską FDA terapii genowych są oparte na AAV. Wynika to z ich wysoce edytowalnego charakteru, szerokiego zakresu żywicieli, który można dostroić w oparciu o użycie specyficznych naturalnie występujących lub sztucznie zaprojektowanych wektorów, niskiej patogenności i toksyczności u ludzi oraz ogólnie niskiej immunogenności^7,8. AAV są również z powodzeniem stosowane w leczeniu chorób oczu w zatwierdzonych warunkach klinicznych. Voretigene neparvovec-rzyl jest terapią opartą na AAV2, która została zatwierdzona przez amerykańską FDA w 2017 r. i przez Europejską Agencję Leków (EMA) w 2018 r. do leczenia biallelicznej dystrofii siatkówki związanej z mutacją RPE65⁹.

Wraz z rosnącym zainteresowaniem rozwojem terapii opartych na AAV pojawia się potrzeba wytycznych regulacyjnych dotyczących testów. Dokładne wykrywanie i oznaczanie ilościowe każdego wektora wirusowego jest integralną częścią faz odkrywania, produkcji i testów przedklinicznych/klinicznych w ramach opracowywania produktu. Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) zaczęła wydawać wytyczne dotyczące terapii genowych, w tym dotyczące chemii, produkcji i kontroli nowych leków eksperymentalnych w terapii genowej u ludzi¹⁰, długoterminowa obserwacja po podaniu terapii genowej¹¹, testy retrowirusowe z kompetencjami replikacyjnymi¹², oraz zalecenia dotyczące wektorów mikrobiologicznych stosowanych w terapiach genowych¹³. EMA wydała również szereg wytycznych dotyczących rozwoju produktów terapii genowej, które generalnie są zgodne z zaleceniami FDA, chociaż istnieją pewne różnice¹⁴. Należy zauważyć, że chociaż niniejsze wytyczne nie ustanawiają prawnie egzekwowalnych obowiązków, z wyjątkiem przypadków, w których odniesione są do konkretnych przepisów, zapewniają one jasność co do obecnego sposobu myślenia agencji regulacyjnych na ten temat i ich oczekiwań dotyczących testów wymaganych do składania wniosków o dopuszczenie do obrotu i zatwierdzanie przez organy regulacyjne.

FDA wyraźnie zaleca przeprowadzenie badań w celu oceny dystrybucji, trwałości i usuwania wektora z miejsca podania do docelowych tkanek oka i nieocznego, płynów wewnątrzgałkowych i krwi¹⁵. Przyjmują one formę badań nad biodystrybucją i wydalaniem. Badania biodystrybucji oceniają narażenie, badając, w jaki sposób produkt rozprzestrzenia się po organizmie pacjenta od miejsca podania. Wydalanie w szczególności ocenia uwalnianie produktu od pacjenta do środowiska i zwiększa możliwość przeniesienia wektora na osoby nieleczone¹⁶. FDA wydaje zalecenia dotyczące projektowania badań biodystrybucji i wydalania w odniesieniu do częstotliwości pobierania próbek, czasu trwania pobierania próbek, rodzajów pobieranych próbek i warunków przechowywania.

Dodatkowo, FDA zaleca stosowanie ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR, lub real-time PCR) do ilościowego wykrywania genomów wektorowych ze względu na łatwość wykonania, format o wysokiej przepustowości, szybki czas realizacji i czułość testu. Istnieje jednak względny brak zaleceń dotyczących projektowania i oceny wydajności metod molekularnych w porównaniu z tymi, które istnieją dla małych i dużych cząsteczek. Wiele wytycznych dotyczących takich badań jest trudnych do zastosowania w odniesieniu do metod molekularnych ze względu na unikalną i złożoną konstrukcję zarówno produktów, jak i samych testów, co rodzi pytania co do adekwatności dostępnych platform dla zalecanych ocen i odpowiednich metod walidacji testów. Do tej pory FDA nie wymagała formalnej walidacji testów opartych na PCR, chociaż EMA nałożyła ten wymóg¹⁷. W związku z tą pustką różne grupy i warsztaty wydały białe księgi i zalecenia, których producenci i organizacje badawcze starają się przestrzegać^{18,19,20,21,22,23,24,25}. Większość z tych zaleceń została napisana specjalnie z myślą o testach qPCR, z sugestiami lub zmianami dotyczącymi pojawiających się platform, takich jak cyfrowy PCR kropelkowy (ddPCR), uwzględnionymi tylko wtedy, gdy zostaną uznane za istotne. Nowsze zalecenia koncentrowały się na rozważaniach dotyczących testów ddPCR, ale w dużej mierze koncentrowały się na ich zastosowaniach do kwantyfikacji genomu wektorowego w warunkach produkcyjnych, a nie w złożonych matrycach biologicznych napotkanych w badaniach nad biowydzielaniem.

W zależności od zastosowania klinicznego i celów, ddPCR może być preferowany zamiast qPCR w badaniach nad biodystrybucją i wydalaniem ze względu na zwiększoną czułość ddPCR i jego zdolność do radzenia sobie z zakłóceniami matrycy w porównaniu do qPCR. Ponadto, dzięki podziałowi próbek na około 20 000 kropel, dokładne określenie ilościowe liczby kopii można osiągnąć bez użycia standardowej krzywej przy użyciu statystyki Poissona, co upraszcza opracowywanie i walidację metody. Celem tego protokołu jest opisanie znormalizowanego podejścia do opracowania i walidacji metody opartej na ddPCR do wykrywania wektorów AAV we łzach pobranych z powierzchni oka w celu wsparcia klinicznych badań biowydzielania.

Protokół

1. Przygotowanie syntetycznego fragmentu DNA

1. Zaprojektuj i zamów syntetyczny fragment DNA zawierający docelowy region amplifikacji do wykorzystania jako kontrola jakości.
   1. Upewnij się, że sekwencja zawiera całą sekwencję amplikonu od startera do startera wstecznego docelowego genu będącego przedmiotem zainteresowania, z rozszerzeniem czterech do sześciu par zasad sekwencji na końcach 5' każdej sekwencji wiążącej starter
   .
   2. Unikaj homopolimerów adeniny i tyminy większych niż 12 par zasad lub par zasad guaniny i cytozyny większych niż osiem par zasad, ponieważ długie homopolimery mogą zakłócać syntezę fragmentu genu.
      UWAGA: Jeśli amplikony zawierają takie sekwencje, podstawienia zasad mogą być dokonywane tak długo, jak długo zachowane są miejsca wyżarzania starterów i sond.
   3. Alternatywnie, należy przygotować zlinearyzowany plazmid zawierający amplikon przy użyciu typowych strategii klonowania.
2. Odwirować probówkę zawierającą syntetyczny fragment DNA w mikrowirówce przez ~10 s, aby upewnić się, że materiał został zebrany na dnie probówki.
3. Zawiesić syntetyczny fragment DNA za pomocą buforu tris-EDTA (TE) do stężenia 1,0 ×^{10 10} kopii/μl lub, w zależności od przypadku, w oparciu o docelowy zakres testu.
4. Krótko wirować, następnie inkubować w temperaturze 50 °C przez 20 ± 5 minut. Schłodzić na lodzie.
5. Przygotować wielokrotne, najlepiej jednorazowe porcje i przechowywać w temperaturze od -70 do -90 °C do momentu użycia.
   UWAGA: Syntetyczne fragmenty DNA przygotowane w ten sposób są zazwyczaj stabilne przez co najmniej 24 miesiące od daty ponownego zawieszenia.
6. W razie potrzeby należy określić dokładne stężenie przygotowanego syntetycznego DNA przed użyciem jako kontrola jakości lub oszacować stężenie nominalne na podstawie zastosowanej re-zawiesiny.

2. Przygotowanie starterów i sondy

1. Zaprojektuj i zamów startery oraz sondę hydrolizy, aby celować w pożądany obszar amplifikacji przy użyciu typowych strategii projektowania^26,27.
   1. Użyj 5' fluorescencyjnego barwnika reporterowego (np. FAM) i 3' wygaszacza (np. Iowa Black dark quencher) kompatybilnego z systemem ddPCR.
      UWAGA: Istnieje wiele pakietów oprogramowania do projektowania testów PCR i można je wykorzystać. Na przykład Primer-BLAST opracowany przez National Center for Biotechnology Information²⁸ jest szeroko stosowany ze względu na solidne opcje projektowania testów i łatwość, z jaką można bioinformatyczną ocenić swoistość w celu zidentyfikowania możliwych efektów odbiegających od celu. Należy zauważyć, że przygotowanie starterów i sond może różnić się od wymienionych tutaj kroków w zależności od formatu, w jakim są dostarczane.
2. Odwiruj probówki zawierające starter do przodu, starter wsteczny i sondę w mikrowirówce przez ~ 10 s, aby osadzać materiał na dnie probówki.
3. Zawiesić startery do 20 μM za pomocą buforu TE. Wiruj krótko.
4. Ponownie zawiesić sondę na 10 μM za pomocą bufora TE. Wiruj krótko.
5. Przygotować wielokrotne, najlepiej jednorazowe porcje i przechowywać w temperaturze co najmniej -20 °C do momentu użycia.
   UWAGA: Tak przygotowane startery i sondy są zazwyczaj stabilne przez co najmniej 24 miesiące od daty ponownego wymieszania.

3. Przygotowanie buforu do rozcieńczania próbki

1. Rozmrozić bufor PCR i ścięte DNA plemników łososia w temperaturze pokojowej. Dokładnie wymieszaj, aby wymieszać.
2. Przygotować bufor do rozcieńczania próbki, zgodnie z tabelą 1.
3. Dokładnie wymieszaj. Przechowywać w temperaturze 2-8 °C do 1 miesiąca po przygotowaniu.

Tabela 1: Przygotowanie buforu do rozcieńczania próbki. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

4. Przygotowanie mieszanki wzorcowej

1. Rozmrozić główną mieszankę ddPCR do sond, startera do przodu, startera wstecznego i sondy w temperaturze pokojowej i pozostawić do ogrzania przez co najmniej 10 minut po rozmrożeniu przed użyciem. Przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu użycia.
   UWAGA: Odczynniki te muszą być w pełni doprowadzone do temperatury pokojowej, aby zapewnić skuteczne tworzenie kropel. Nie trzymaj odczynników na lodzie podczas przygotowywania.
   1. Przed użyciem dokładnie i krótko odwirować w mini wirówce.
      UWAGA: Enzymy restrykcyjne są zwykle dostarczane w postaci glicerolu i należy je usunąć z magazynu bezpośrednio przed użyciem. Delikatnie wymieszaj. Nie wirować.
2. Przygotować wzorcową mieszankę PCR dla każdego celu amplifikacji. W Tabeli 2 przedstawiono sugerowany skład głównej mieszanki PCR i w razie potrzeby zmodyfikuj stężenia starterów i sond.
   1. Dokładnie zwirować i krótko odwirować przed dodaniem enzymu restrykcyjnego. Dodaj enzym restrykcyjny i odwróć do mix.
      UWAGA: Na tym etapie wymagane są 22 μl reakcji PCR, aby uzyskać końcową objętość 40 μl reakcji PCR po utworzeniu kropelki (składającej się z 15 μl mieszanki wzorcowej PCR, 5,0 μl matrycy i 20 μl oleju do wytwarzania kropel).
3. Dodać 16,5 μl mieszanki wzorcowej do każdej studzienki zgodnie z mapą płytek. Zobacz Rysunek 1 dla przykładowej mapy płyt dla walidacji dokładności i precyzji.
   1. Upewnij się, że tabliczka zawiera trzy niezależne preparaty z serii kontroli jakości (QC), trzy niezależnie przetestowane endogenne podwielokrotności łez przetestowane, wzbogacone do wysokiego i niskiego poziomu oraz bez wzbogaceń, oraz trzy niezależne kontrole bez matrycy (NTC).
   2. Zmieniaj układ tych studzienek na płycie, gdzie zestaw 1 jest ładowany w kolejności malejącego stężenia, zestaw 2 jest ładowany w kolejności rosnącego stężenia, a zestaw 3 jest ładowany w kolejności losowej, aby ocenić, czy występują jakiekolwiek efekty specyficzne dla lokalizacji płytki.
   3. Ułóż próbki tak, aby wypełniły jak największą część kolumny i wypełnij nieużywane studzienki w kolumnie buforem kontrolnym. W razie potrzeby należy uwzględnić wiele endogennych partii kontrolnych (np. więcej kałuż łez lub łez zebranych od osobników) w pozostałych studzienkach.
   4. Uszczelnij płytkę przezroczystą folią samoprzylepną. Trzymaj płytkę w temperaturze pokojowej podczas przygotowywania szablonu. Alternatywnie, przytrzymać płytkę do 4 godzin w temperaturze 2-8 °C, ale przywrócić ją do temperatury pokojowej na co najmniej 10 minut przed dodaniem szablonu.

Tabela 2: Przykładowe przygotowanie mieszanki wzorcowej PCR. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Rysunek 1: Przykładowa mapa tablic dla dokładności walidacji i precyzji przebiegu. Skróty: ULQC = upper limit quality control; HQC = wysoka kontrola jakości; MQC = średnia kontrola jakości; LQC = niska kontrola jakości; LLQC = dolna granica kontroli jakości; NTC = brak kontroli szablonu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Przygotowanie kontroli jakości

1. Rozmrozić syntetyczne fragmenty DNA lub zlinearyzowane plazmidy w temperaturze pokojowej i pozostawić do ogrzania przez co najmniej 10 minut po rozmrożeniu przed użyciem. Doprowadź szablony do temperatury pokojowej, aby zapewnić skuteczne tworzenie kropel.
   1. Przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu użycia. Przed użyciem dokładnie i krótko odwirować w mini wirówce.
2. Przygotować rozcieńczenia QC, wykorzystując bufor do rozcieńczania próbki jako rozcieńczalnik. Przykład zalecanych stężeń w celu przygotowania do walidacji dokładności i precyzji przedstawiono w tabeli 3.
   UWAGA: Po pomyślnym zakończeniu serii dokładności i precyzji na każdej płycie należy przeprowadzić tylko kontrolę wysokiej jakości (HQC), średnią kontrolę jakości (MQC) i kontrolę niskiej jakości (LQC). W przypadku serii dokładności i precyzji uwzględnia się co najmniej trzy niezależne rozcieńczenia kontroli jakości w celu oceny dokładności i precyzji wewnątrz testu. Po dokładności i precyzji przebiegów należy uwzględnić tylko jedną serię rozcieńczeń.
3. Po przygotowaniu roztwory należy przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu dodania do płytki.
4. Roztwory należy przechowywać na lodzie lub w temperaturze 2-8 °C, jeśli zajdzie taka potrzeba. Przed kolejnym użyciem należy pozostawić rozcieńczone roztwory do ogrzania do temperatury pokojowej przez co najmniej 10 minut przed użyciem. Wyrzuć QC pod koniec dnia.

Tabela 3: Przykładowe przygotowanie do kontroli jakości (QC) przy użyciu syntetycznych dwuniciowych fragmentów DNA. Skróty: ULQC = upper limit quality control; HQC = wysoka kontrola jakości; MQC = średnia kontrola jakości; LQC = niska kontrola jakości; LLQC = dolna granica kontroli jakości; NTC = brak kontroli szablonu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

6. Przygotowanie próbek

1. Rozmrozić próbki pobrane z badania klinicznego w temperaturze pokojowej do momentu rozmrożenia i pozostawić do ogrzania przez co najmniej 10 minut po rozmrożeniu przed użyciem.
   1. Przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu użycia. Przed użyciem dokładnie i krótko odwirować w mikrowirówce.
2. Rozcieńczyć próbki łez w stosunku 1:10 (lub większym) przy użyciu buforu do rozcieńczania próbki jako rozcieńczalnika do 0,2 ml probówek PCR lub 8-dołkowych pasków PCR. Uszczelnij rurki.
   UWAGA: W zależności od oczekiwanego stężenia celu we łzach, może być konieczne dalsze rozcieńczenie próbek lub przetestowanie wielokrotnych rozcieńczeń każdej próbki.
3. Podgrzewać próbki w termocyklerze w temperaturze 95 °C przez 10 minut, a następnie trzymać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 5 minut do ostygnięcia. Stosować szybkość narastania 3 °C/s.
   UWAGA: Próbki mogą pozostać w termocyklerze w temperaturze 4 °C do momentu użycia tego samego dnia lub mogą zostać zamrożone w temperaturze od -70 do -90 °C w celu dłuższego przechowywania. Ten krok służy denaturacji kapsydu wektora, uwalniając genom. Ponieważ syntetyczne fragmenty DNA QC lub zlinearyzowane plazmidy są dwuniciowe, nie powinny być poddawane temu etapowi ogrzewania.
4. Po schłodzeniu próbki należy zwrócić do temperatury pokojowej (lub, w przypadku zamrożenia, rozmrozić w temperaturze pokojowej) i pozostawić do ogrzania na co najmniej 10 minut.
   UWAGA: Próbki muszą być w pełni doprowadzone do temperatury pokojowej, aby zapewnić skuteczne tworzenie kropel.

7. Dodawanie szablonu

1. Pobrać płytkę ddPCR zawierającą mieszaninę wzorcową. Dokładnie wymieszać każdą próbkę lub probówkę rozcieńczającą QC i krótko odwirować w celu odzyskania materiału.
2. Usuń folię samoprzylepną i dodaj 5,5 μl QC lub próbek do odpowiednich dołków płytki 96-dołkowej, zgodnie z mapą płytki.
   UWAGA: Patrz krok 4.2.1, aby uzyskać wyjaśnienie wymaganych objętości
3. Dodać 5,5 μl buforu do rozcieńczania próbki do studzienek NTC.
4. Wytwarzanie kropel wymaga, aby wszystkie studzienki kolumny miały kontrolę reakcji lub buforu. Jeśli którakolwiek ze studzienek kolumny nie zawiera reakcji próbki, rozcieńczyć 2x kontrolę buforu ddPCR 1:2 przy użyciu wody wolnej od nukleaz. Dodać 22 μl 1x kontrolnego buforu ddPCR do wszystkich pustych studzienek kolumny.
   UWAGA: Jeśli cała kolumna nie jest używana, nie jest konieczne dodawanie kontrolki bufora do tych studzienek.
5. Dodaj przebijalną uszczelkę foliową do płytki. Umieścić płytkę w uszczelniarce do płyt i uszczelniać przez 5 s w temperaturze 180 °C.
   1. Alternatywnie należy uszczelnić płytkę zgodnie z zaleceniami producenta systemu ddPCR.
6. Wirować płytkę z maksymalną prędkością przez co najmniej 30 sekund (przy ustawieniu ciągłego wirowania; nie stosować wirowania dotykowego) i krótko odwirować w wirówce do płytek.
   UWAGA: Dokładne i całkowite wymieszanie płytki na tym etapie ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego podziału reakcji PCR na kropelki. Upewnij się, że w studzienkach nie ma widocznych pęcherzyków. W razie potrzeby płytkę można trzymać w temperaturze 2-8 °C przed wytworzeniem kropli przez maksymalnie 4 godziny. W przypadku trzymania należy odczekać, aby płytka osiągnęła temperaturę pokojową przez co najmniej 10 minut przed wytworzeniem kropelki.

8. Automatyczne generowanie kropel, cykl termiczny i odczyt kropelek

1. Generuj kropelki w automatycznym generatorze kropel w następujący sposób.
   1. Na ekranie dotykowym wybierz kolumny na mapie tablic zawierające próbki. Pokład przyrządu zaświeci się, wskazując, które materiały eksploatacyjne (wkłady DG32, końcówki, pojemnik na odpady, olej do wytwarzania kropelek) są wymagane. Żółte światła oznaczają, że konieczne jest dodanie materiału eksploatacyjnego, a zielone światła oznaczają, że dostępna jest wystarczająca ilość materiałów eksploatacyjnych.
   2. Załaduj generator kropel od tyłu do przodu.
   3. W przypadku sond do hydrolizy należy upewnić się, że zainstalowany jest olej wytwarzający kropelki do sond i pozostała wystarczająca ilość oleju na liczbę studzienek. Jeśli stosowane są alternatywne chemikalia PCR, upewnij się, że zainstalowany jest kompatybilny olej do wytwarzania kropel.
   4. Umieść zimny blok w uchwycie płytki kropelkowej. Upewnij się, że blok jest całkowicie niebieski i nie jest widoczny różowy. Umieść nową 96-dołkową płytkę ddPCR w zimnym bloku.
   5. Umieścić przygotowaną płytkę do PCR w uchwycie na płytkę do próbki. Zamknij pokrywę urządzenia. Naciśnij start, aby wygenerować kropelki.
2. Po utworzeniu kropelki łączna ilość 40 μl na reakcję jest automatycznie przenoszona na nową płytkę PCR.
3. W ciągu 30 minut od zakończenia wytwarzania kropel należy wyjąć płytkę zawierającą kropelki z zimnego bloku. Pracuj delikatnie, ponieważ na tym etapie kropelki są najbardziej kruche.
4. Dodaj przebijalną uszczelkę foliową do płytki. Umieścić płytkę w uszczelniarce do płyt i uszczelniać przez 5 s w temperaturze 180 °C.
   1. Alternatywnie należy uszczelnić płytkę zgodnie z zaleceniami producenta systemu ddPCR.
5. Umieść płytkę w kompatybilnym termocyklerze. Wprowadź warunki jazdy na rowerze (patrz tabela 4).
6. Po zakończeniu cykli termicznych należy przytrzymać płytkę w termocyklerze, przełączyć ją na temperaturę 2-8 °C lub natychmiast odczytać .
   UWAGA: Trzymanie płytki przez 12 godzin w temperaturze 4-12 °C może poprawić liczbę kropel, ale nie jest to wymagane. Należy uzyskać wystarczającą ilość kropel bez uchwytu.
7. Załaduj płytkę do czytnika kropelkowego, upewniając się, że pozostała wystarczająca ilość oleju w czytniku, a pojemnik na odpady ma wystarczająco dużo miejsca. Odczytaj kropelki. Wykonaj odczyt kropel w ciągu 24 godzin od zainicjowania cyklu termicznego.

Tabela 4: Typowe warunki cykli termicznych. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

9. Analiza danych

UWAGA: Minimum 10 000 kropel na studzienkę jest niezbędne do prawidłowego obliczenia stężenia za pomocą statystyk Poissona. Nie próbuj analizować na żadnych dołkach zawierających mniej niż 10 000 kropel.

1. Wymagany jest próg, aby zdefiniować kropelki jako dodatnie lub ujemne. Oprogramowanie do analizy ddPCR automatycznie stosuje próg, który może się różnić w zależności od odwiertów. Jednak ręcznie ustaw próg dla wszystkich dołków płytki na nieco powyżej intensywności fluorescencji studzienek NTC, aby uzyskać bardziej spójne, dokładne i precyzyjne wyniki.
   UWAGA: Prawidłowe rozmieszczenie progu może wymagać optymalizacji w zależności od separacji kropli dodatnich i ujemnych oraz ilości kropli deszczu (patrz Rysunek 2). W tym przykładzie wykres amplitudy kropel pokazuje przykładowe studzienki na każdym poziomie kontroli jakości i NTC. Fioletowa linia oznacza próg 1,000, ustawiony nieco powyżej ujemnej populacji kropel.
2. Modelowanie statystyczne Poissona wymaga co najmniej trzech dodatnich kropel do obliczenia stężenia z 95% pewnością. Uznaj, że wszystkie studzienki zawierające zero, jedną lub dwie dodatnie krople są ujemne i ustaw stężenie zero²⁷.
3. Oblicz wstecznie numer kopii w każdej próbce łez.
   1. Stężenie w kopiach/μl jest podane w raporcie danych. Wartość ta służy do określenia stężenia w kopiach/μl oryginalnej próbki (tj. w próbce łez).
   2. Aby obliczyć rozcieńczenie reakcji ddPCR, należy podzielić początkową objętość reakcji PCR przed utworzeniem kropelki przez objętość dodanej matrycy. Po wykorzystaniu objętości przedstawionych w tej metodzie daje to wartość 4,
      
   3. Oznaczyć współczynnik seryjnego rozcieńczenia na podstawie oryginalnej próbki (etap 6.2).
   4. Aby oznaczyć kopie/μl w próbce, pomnóż kopie/μl przez rozcieńczenie reakcji ddPCR, a następnie przez współczynnik rozcieńczenia szeregowego. Na przykład stężenie w kopiach/μl wygenerowane w raporcie danych wynosiło 966; Dodano 5,5 μl matrycy na 22 μl reakcji. Zastosowano seryjne rozcieńczenie próbki w stosunku 1:50 000.
      
      
   5. Jeżeli badano wielokrotne rozcieńczenia tej samej próbki, należy przeanalizować wszystkie ważne rozcieńczenia w zakresie i obliczyć średnią.
4. Dla każdej kontroli jakości należy obliczyć oczekiwane kopie/μl reakcji PCR, dzieląc stężenie danego rozcieńczenia QC (w kopiach/μl) przez objętość reakcji ddPCR (20 μl). Pozwala to na bezpośrednie porównanie tej wartości nominalnej z wartością kopii/μl podaną w raporcie danych bez dalszych obliczeń.
   UWAGA: Podejście to zastosowano również do analizy próbek kolczastych łez wykorzystanych w reprezentatywnych wynikach.
5. Określić wartość średnią, odchylenie standardowe, współczynnik zmienności (%CV) i procentowy błąd względny w stosunku do stężenia nominalnego (%RE) próbki lub wartości QC przy użyciu dołków kontrprób (w stosownych przypadkach uwzględnić wielokrotne rozcieńczenia).
   1. W celu oceny dokładności między odwiertami należy określić ją dla każdego z duplikatów odwiertu, jeśli są uwzględnione.
   2. W celu oceny dokładności i precyzji wewnątrz testu należy określić to dla każdej serii rozcieńczeń lub podwielokrotności wykorzystanej w partii.
   3. W celu oceny dokładności i precyzji między testami należy to określić, stosując średnie z testu wewnętrznego dla każdej z włączonych partii.

Rysunek 2: Przykład ustawienia progu. Skróty: ULQC = upper limit quality control; HQC = wysoka kontrola jakości; MQC = średnia kontrola jakości; LQC = niska kontrola jakości; LLQC = dolna granica kontroli jakości; NTC = brak kontroli szablonu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

10. Kryteria akceptacji testu

1. Wykorzystaj poniższe specyfikacje do obliczonych danych dla każdej partii, aby określić, czy partia jest akceptowalna. Jeśli te warunki nie są spełnione, unieważnij i powtórz batch.
   UWAGA: Kryteria te zostały określone jako konsensus na podstawie opublikowanych białych ksiąg na temat walidacji testów opartych na PCR^{18,19,20,21,22,23,24,25}. Może być konieczna modyfikacja kryteriów docelowych zgodnie z wymogami zastosowania klinicznego.
2. Brak kontroli szablonu (NTC)
   1. Upewnij się, że każda studzienka NTC ma co najmniej 10 000 kropel.
   2. Upewnij się, że każda studzienka NTC ma mniej niż 3 dodatnie krople.
3. Kontrola jakości i zakres testów
   1. Upewnij się, że każda studzienka kontroli jakości ma co najmniej 10 000 kropel.
   2. Upewnij się, że precyzja powtórzonych studzienek o stężeniu QC wynosi ≤25,0% CV, z wyjątkiem górnej i dolnej granicy oznaczalności, gdzie dopuszczalne jest ≤30,0%. Oceń to niezależnie dla każdego zestawu kontroli jakości i poziomu stężenia.
   3. Upewnij się, że błąd względny stężenia obliczonego wstecz na każdym średnim poziomie QC mieści się w zakresie ±25,0% RE od stężenia nominalnego (kopii/reakcję PCR), z wyjątkiem górnej i dolnej granicy oznaczalności, gdzie dopuszczalne jest ±30,0% RE. Oceń to niezależnie dla każdego zestawu kontroli jakości i poziomu stężenia.
   4. Upewnij się, że co najmniej 2/3 próbek QC (np. cztery z sześciu wyników) i 50% próbek QC na każdym poziomie (niski, średni, wysoki) spełniają te wytyczne.
4. Próbki
   1. Upewnij się, że studzienki na próbki, które mają być analizowane, mają co najmniej 10 000 kropel.
   2. Upewnij się, że precyzja dołków replik rozcieńczenia próbki do analizy wynosi ≤25,0% CV.
   3. Upewnij się, że co najmniej jedno włączone rozcieńczenie danej próbki mieści się w określonym zakresie kwantyfikacji testu, jak określono powyżej w oparciu o górną i dolną granicę kontroli jakości.
   4. Jeżeli wszystkie rozcieńczenia zawierały wyniki większe niż określona górna granica oznaczalności i jeżeli pozostała wystarczająca objętość próbki, należy powtórzyć badanie, stosując większe rozcieńczenie próbki.
   5. Jeżeli wszystkie zawarte rozcieńczenia dają wynik niższy niż dolna granica oznaczalności i jeśli pozostała wystarczająca objętość próbki, należy powtórzyć badanie, stosując mniejsze rozcieńczenie próbki.
      UWAGA: Próbki zawierające więcej niż trzy dodatnie kropelki, ale o stężeniu poniżej dolnej granicy oznaczalności, można określić jako wykrywalne, ale nie kwantyfikowalne.

Wyniki

Dla celów demonstracyjnych opracowano test przeznaczony do wykrywania dostępnego na rynku, wzmocnionego wektora AAV2 z ekspresją zielonego białka fluorescencyjnego (eGFP), z syntetycznym dwuniciowym fragmentem DNA zawierającym eGFP jako kontrolę jakości. Obecnie toczy się debata na temat tego, czy sam wektor, czy syntetyczny fragment DNA lub zlinearyzowany plazmid jest najbardziej odpowiedni do użycia jako kontrola jakości. Ogólnie rzecz biorąc, syntetyczny fragment DNA lub zlinearyzowany plazmid może być użyty, jeśli w procesie opracowywania metody zostanie wykazana równoważność z wektorem (dane nie pokazane). Startery i sondy zostały zaprojektowane i zoptymalizowane pod kątem wykrywania transgenu eGFP. Patrz Tabela Uzupełniająca S1, aby zapoznać się z sekwencjami wykorzystanymi w tej pracy. Stężenie zapasu fragmentów QC określono empirycznie za pomocą ddPCR. Wszystkie testy przeprowadzono przy użyciu stężeń i warunków PCR podanych jako przykłady w sekcji protokołu.

Dla testów qPCR zaleca się ocenę liniowości, czułości, zakresu dynamiki, dokładności i precyzji krzywej wzorcowej. Ponieważ ddPCR nie opiera się na krzywej standardowej do oznaczania docelowego oznaczania ilościowego, zalecenia te muszą zostać zmodyfikowane. Zamiast tego wykorzystano QC składające się z syntetycznych dwuniciowych fragmentów DNA rozcieńczonych do różnych stężeń w celu objęcia oczekiwanego wymiernego zakresu reakcji ddPCR w oparciu o modelowanie statystyczne Poissona^29,30,31,32 w celu zdefiniowania zakresu dynamiki i czułości oraz oceny dokładności i precyzji. Wybór stężeń QC opierał się przede wszystkim na oczekiwanym stosunku dodatnich do całkowitych kropel w studzience przy danym stężeniu. Matematycznie ddPCR jest teoretycznie najdokładniejszy, gdy około 80% partycji dodatnio się wzmacnia. Gdy stosunek dodatni do całkowitego stosunku kropel wzrasta powyżej 0,8, dokładność zmniejsza się z powodu nasycenia przegród, przy czym kwantyfikacja nie jest możliwa, gdy 100% kropel jest dodatnich. Z drugiej strony, teoretycznie, można wykryć i określić ilościowo zaledwie jedną dodatnią kroplę, chociaż dokładność jest gorsza, a test jest podatny na fałszywe alarmy na niskim poziomie. Zazwyczaj co najmniej trzy krople muszą być dodatnie, aby wynik został obliczony z 95% pewnością, co jest progiem do obliczenia stężenia, którego tutaj użyliśmy.

Przygotowano serię pięciu różnych stężeń QC, z obliczoną docelową liczbą kopii/objętościami reakcji μL PCR, które mają dać dodatnie proporcje kropel do całkowitej obejmujące mierzalny zakres ddPCR, jak pokazano w Tabeli 5. Wykorzystano je do oceny dokładności i precyzji testu. W tej ocenie górna i dolna granica oznaczalności nie zostały przesunięte do teoretycznego maksimum możliwego w ddPCR. Dokładna kwantyfikacja może być możliwa przy wyższych i niższych poziomach niż wykazane tutaj. Zakres ten powinien być rozwijany zgodnie z dalszymi zastosowaniami tej metody.

Łącznie trzy niezależnie przygotowane serie rozcieńczeń tych QC zostały przygotowane w buforze do rozcieńczania próbki dla każdej partii, aby ocenić dokładność i precyzję testu wewnątrztestowego. Uwzględniono zduplikowane studzienki każdego rozcieńczenia QC. Aby zasymulować rzeczywisty protokół walidacji, wielu analityków przeprowadziło łącznie sześć partii dokładności i precyzji w ciągu kilku dni. Wyniki z tych sześciu partii przeanalizowano w celu określenia dokładności i precyzji metody w teście wewnętrznym i międzytestowym oraz w celu zdefiniowania zakresu dynamicznego testu.

Wydajność testu wewnętrznego została oceniona dla każdej partii na każdym poziomie kontroli jakości. Spodziewaliśmy się, że wszystkie studnie QC i NTC będą miały co najmniej 10 000 kropel. Wymóg ten został spełniony w 216 z 216 badanych studzienek we wszystkich sześciu partiach, przy średniej liczbie kropli wynoszącej 19 748 kropli / studzienkę (Tabela 6). Następnie oczekiwano, że %CV między studzienkami każdego zestawu zduplikowanych studzienek każdej kontroli jakości wyniesie ≤25,0%, z wyjątkiem górnej i dolnej granicy kontroli jakości, gdzie oczekiwano ≤30,0%. Zostało to spełnione w zestawach 90 z 90 dołków testowanych we wszystkich sześciu partiach dla kontroli jakości, ze średnim %CV między studzienkami wynoszącymi 3,9% na wszystkich poziomach kontroli jakości (tabela 7). Wszystkie QC dały średni dodatni stosunek kropli do całkowitej w oczekiwanych zakresach opisanych powyżej (Tabela 6).

W każdej partii, średnia z testu i odchylenie standardowe zostały obliczone dla każdego z niezależnie przygotowanych punktów serii rozcieńczeń, a następnie użyto ich do obliczenia średniej z testu dla każdego stężenia w każdym teście. Wykorzystano to do oceny dokładności i precyzji testu (tabela 8). Precyzja odnosi się do zmienności danych pochodzących z powtórzeń tej samej jednorodnej próbki w normalnych warunkach oznaczania i jest oceniana poprzez obliczenie %CV wielokrotności uwzględnionych podwielokrotności. Spodziewaliśmy się, że trzy podwielokrotności testowane w każdej partii dadzą %CV w teście wewnętrznym ≤25,0%, z wyjątkiem górnej i dolnej granicy kontroli jakości, gdzie oczekiwano ≤30,0%. Zostało to spełnione dla wszystkich pięciu poziomów kontroli jakości w każdej z 60 partii (30 z 30 wszystkich wyników). Ogólnie rzecz biorąc, można było osiągnąć większą precyzję wewnątrz testu niż kryteria docelowe, ze średnią %CV wewnątrz testu wynoszącą 7,7% na wszystkich poziomach kontroli jakości. Dokładność odnosi się do bliskości zgodności między wartością wyznaczoną doświadczalnie a wartością nominalną. Ocenia się to, obliczając procentowy błąd względny (%RE lub %Bias) między obliczonymi stężeniami każdego QC a ich teoretycznie oczekiwanymi stężeniami nominalnymi. Oczekiwano, że średnia z trzech podwielokrotności wyniesie ±25,0% RE stężenia nominalnego, z wyjątkiem górnej i dolnej granicy QC, gdzie oczekiwano ±30,0%. Zostało to spełnione dla wszystkich pięciu poziomów kontroli jakości w każdej z 60 partii (30 z 30 wszystkich wyników). Ogólnie rzecz biorąc, można było osiągnąć większą dokładność testu niż nasz cel, ze średnią bezwzględną %RE wewnątrz testu wynoszącą 4,2% na wszystkich poziomach kontroli jakości. We wszystkich parametrach NTC (łącznie 30) nie wykryto żadnych dodatnich kropel.

Dokładność i precyzja między testami zostały również obliczone przy użyciu średniej z każdego poziomu QC w każdej partii. Oczekiwano, że precyzja między testami wyniesie ≤25,0% CV, z wyjątkiem górnej i dolnej granicy kontroli jakości, gdzie oczekiwano ≤30,0%. Podobnie, w przypadku dokładności między testami, oczekiwano ±25,0% RE, z wyjątkiem górnej i dolnej granicy kontroli jakości, gdzie oczekiwano ±30,0%. Zaobserwowano znacznie większą dokładność i precyzję między testami niż te cele (Tabela 9), z precyzją między testami w zakresie od 4,0% do 8,5% i bezwzględną dokładnością między testami w zakresie od 1,0% do 3,2%. Podsumowując, wyniki te pokazują, że metoda ta może osiągnąć wystarczającą dokładność i precyzję w testach wewnątrz i między nimi, co mieści się w obecnych celach branżowych. Na podstawie tych wyników można określić zakres dynamiczny tego testu wynoszący 2,500-2,5 kopii na μl reakcji PCR, przy ogólnej czułości testu wynoszącej 2,5 kopii na μl reakcji PCR. Jak wspomniano wcześniej, możliwe jest zweryfikowanie szerszych zakresów dynamiki.

Następnie, konieczne było oszacowanie dokładności i precyzji testu w matrycy docelowej - w tym przypadku rozdarcia. Zazwyczaj testy są walidowane przed rozpoczęciem badań klinicznych, co oznacza, że jest mało prawdopodobne, aby łzy pobrane od pacjentów leczonych wektorem były dostępne do celów walidacji. Można to sztucznie stworzyć, wtłaczając docelowy wektor AAV do łez pobranych od ochotniczych dawców w celu wytworzenia QC z kolcami matrycy. Zebrane ludzkie łzy zostały pobrane przez stronę trzecią (BioIVT). Dla udowodnienia zasadności wykorzystano wektor AAV2 z ekspresją eGFP pozyskany ze źródła komercyjnego. Stężenie stada wektorów AAV2 określono empirycznie za pomocą ddPCR, bez użycia etapu izolacji DNA, jak opisano w niniejszym protokole. W każdym przebiegu AAV2 był niezależnie wzbogacany do trzech podwielokrotności łez na wysokim (oczekiwanym 1,41 x 10³ kopii/μl reakcji PCR) i niskim (28,2 kopii/μl reakcji PCR) poziomie. Niewzbogacone podwielokrotności włączono jako kontrolę, aby wykazać specyficzność metody.

Wydajność testu wewnętrznego została oceniona dla każdej partii na każdym poziomie spajka. Spodziewano się, że wszystkie próbki łez będą miały co najmniej 10 000 kropel. Zostało to spełnione w 108 ze 108 studzienek testowanych we wszystkich sześciu partiach, przy średniej całkowitej liczbie kropli wynoszącej 20 208 kropli / studzienkę (Tabela 10). Następnie oczekiwano, że %CV między studzienkami każdego zestawu zduplikowanych studzienek każdej kontroli jakości wyniesie ≤25,0% dla wysokich i niskich poziomów skoków. Zostało to spełnione w 36 z 36 zestawów studzienek testowanych we wszystkich sześciu partiach dla kontroli jakości, ze średnim %CV między studzienkami wynoszącymi 3,2% (tabela 11).

W każdej partii, średnia z testu i odchylenie standardowe zostały obliczone dla każdego z niezależnie przygotowanych kolców łez, a następnie użyto ich do obliczenia średniej z testu dla każdego stężenia w każdym teście. Wykorzystano to do oceny dokładności i precyzji testu w matrycy (tabela 12). Spodziewaliśmy się, że %CV w teście wewnętrznym wyniesie ≤25,0%, a poziomy skoków będą wysokie i niskie. Zostało to spełnione w sześciu z sześciu partii dla każdego poziomu. Ogólnie rzecz biorąc, można było osiągnąć większą precyzję wewnątrz testu w matrycy niż wartość docelowa, przy średnim %CV wewnątrz testu wynoszącym 3,7% na wysokim poziomie i 12,2% na niskim poziomie (ogólnie 8,0%). Oczekiwano również, że %RE w teście wewnętrznym wyniesie ±25,0% przy obu poziomach skoków. Zostało to spełnione w sześciu z sześciu partii dla każdego poziomu. Podobnie, ogólnie stwierdzono, że można osiągnąć większą dokładność w matrycy testu niż wartość docelowa, przy średnim bezwzględnym %RE w teście wewnętrznym wynoszącym 8,1% na niskim poziomie i 11,3% na wysokim poziomie (ogólnie 9,7%). W przypadku kontroli bez wzbogacania nie wykryto sygnału eGFP w żadnej z podwielokrotności (Tabela 12), co świadczy o swoistości metody w ludzkiej macierzy łzowej.

Dokładność i precyzja między testami w matrycy łez została również obliczona przy użyciu średniej z testu każdego poziomu skoku w każdej partii. Oczekiwano, że precyzja między testami wyniesie ≤25,0% CV, a dla dokładności między testami spodziewaliśmy się ±25,0% RE. Zaobserwowano znacznie większą dokładność i precyzję między testami niż te cele (tabela 13), z precyzją między testami 5,5% na wysokim poziomie i 7,1% na niskim poziomie oraz z absolutną dokładnością między testami 11,3% na wysokim poziomie i 8,1% na niskim poziomie. Łącznie wyniki te pokazują dokładność, precyzję i specyficzność metody w matrycy łezowej.

Tabela 5: Kontrole jakości używane do określenia zakresu dynamicznego testu. Skróty: ULQC = upper limit quality control; HQC = wysoka kontrola jakości; MQC = średnia kontrola jakości; LQC = niska kontrola jakości; LLQC = dolna granica kontroli jakości; NTC = brak kontroli szablonu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 6: Całkowita liczba kropel i dodatnie do całkowitego stosunku kropelek w kontroli jakości syntetycznego dwuniciowego DNA i NTC. Skróty: ULQC = upper limit quality control; HQC = wysoka kontrola jakości; MQC = średnia kontrola jakości; LQC = niska kontrola jakości; LLQC = dolna granica kontroli jakości; NTC = brak kontroli szablonu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 7: Statystyki międzydołkowe kontroli jakości (kopiowanie celów/μL reakcji PCR). Skróty: ULQC = upper limit quality control; HQC = wysoka kontrola jakości; MQC = średnia kontrola jakości; LQC = niska kontrola jakości; LLQC = dolna granica kontroli jakości; NTC = brak kontroli szablonu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 8: Dokładność i precyzja testów jakości (copy targets/μL PCR reaction). Skróty: ULQC = upper limit quality control; HQC = wysoka kontrola jakości; MQC = średnia kontrola jakości; LQC = niska kontrola jakości; LLQC = dolna granica kontroli jakości; NTC = brak kontroli szablonu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 9: Dokładność i precyzja między testami QC (copy targets/μL reakcji PCR). Skróty: ULQC = upper limit quality control; HQC = wysoka kontrola jakości; MQC = średnia kontrola jakości; LQC = niska kontrola jakości; LLQC = dolna granica kontroli jakości; NTC = brak kontroli szablonu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 10: Całkowita liczba kropel w próbkach łez. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 11: Statystyki międzydołkowe próbki łez (cele kopiowania/μL reakcji PCR). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 12: Dokładność i precyzja próbek do łez (cele kopiowania/μL reakcji PCR). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 13: Dokładność i precyzja między testami próbek łez (cele kopiowania/μL reakcji PCR). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca S1: Sekwencje starterów, sond i kontroli jakości syntetycznego dwuniciowego DNA wykorzystane w tym badaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Istnieje kilka etapów protokołu ddPCR, które mają kluczowe znaczenie dla prawidłowego wykonania testu. Pierwszym krytycznym krokiem jest zaprojektowanie i optymalizacja podkładów i sondy. Ogólnie rzecz biorąc, zaleca się stosowanie chemii opartej na sondzie hydrolizy zamiast chemii opartej na barwniku (np. SYBR Green) w warunkach przedklinicznych lub klinicznych ze względu na ich lepszą specyficzność. Ponadto wybór celu wzmocnienia ma kluczowe znaczenie. Zazwyczaj celem jest transgen będący przedmiotem zainteresowania wektora. Jednak we wcześniejszych stadiach przedklinicznych lub w wektorach, w których może nie być możliwe odróżnienie transgenu wektora od genomowego DNA, właściwe może być zastosowanie standardowych celów wektorowych. Na przykład, można celować w odwrócony region powtórzeń końcowych, promotor, ogon poli-A lub połączenia międzysegmentowe między tymi składnikami wektorowymi. Wybór celu będzie się różnić w zależności od projektu wektorowego. Tradycyjne strategie i oprogramowanie do projektowania starterów i sond qPCR są zazwyczaj odpowiednie dla ddPCR. Parametry projektowe, które mają zapewnić stałą temperaturę wyżarzania (na przykład 60°C), powinny być tak dobrane, aby zmniejszyć wymaganą optymalizację. Zaleca się również zaprojektowanie, zamówienie i ocenę co najmniej trzech różnych zestawów dla każdego celu. Następnie należy wybrać zestaw, który wykazuje największą swoistość (brak amplifikacji w studzience kontroli ujemnej lub w matrycy pokrewnego docelowego DNA) i czułość (tj. granicę wykrywalności)²⁰.

Jeśli korzystna jest możliwość przejścia testu między qPCR a ddPCR, zaleca się najpierw optymalizację warunków testu za pomocą qPCR i zidentyfikowanie warunków dla wybranego zestawu, które skutkują wydajnością amplifikacji 90%-110% przy R² ≥ 0,98. Jednak ddPCR jako metoda końcowa jest zwykle mniej czuła niż qPCR ze względu na różnice w wydajności amplifikacji. Jako minimum zaleca się przeprowadzenie termicznego gradientu temperatury na etapie wyżarzania/wydłużania w celu pokrycia temperatur powyżej i poniżej oczekiwanych temperatur wyżarzania oraz oceny separacji amplitudy deszczu i fluorescencji między ujemnymi i dodatnimi klastrami kropel w funkcji temperatury. Jeśli pozwala na to przestrzeń robocza, zaleca się posiadanie indywidualnych dedykowanych stanowisk roboczych do przygotowania miksu głównego, dodawania szablonów i wzmacniania. Tam, gdzie to możliwe, powinny one być fizycznie segregowane przez jednokierunkowy przepływ pracy z wbudowanymi kontrolami inżynieryjnymi, takimi jak kontrolowany dostęp i różnica ciśnień powietrza, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego i wyników fałszywie dodatnich. Jeśli nie jest to możliwe, należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.

W tym protokole są dwa kroki, które mogą wydawać się niezwykłe dla tych, którzy są bardziej przyzwyczajeni do opracowywania testów qPCR. Pierwszym z nich jest włączenie enzymu restrykcyjnego do głównej mieszanki PCR. Podczas amplifikacji ddPCR każda kropla jest poddawana termocyklowi do punktu końcowego. W prawidłowo zoptymalizowanym teście daje to dwie populacje kropel, z których jedna wykazuje niezmiennie wysoki poziom sygnałów fluorescencyjnych - sygnałów dodatnich - a druga konsekwentnie wyświetla niski poziom sygnału fluorescencyjnego - negatywów. Jeśli dojdzie do interferencji PCR, może to spowodować desynchronizację inicjacji amplifikacji PCR, co spowoduje, że kropla nie osiągnie plateau amplifikacji, a tym samym niespójne fluorescencyjne punkty końcowe. W takim przypadku kropelki zostaną rozprowadzone między negatywami i pozytywami, co spowoduje zjawisko zwane deszczem ddPCR. Może to prowadzić do niedokładnej kwantyfikacji celu oraz niespójnych i subiektywnie stosowanych progów. Zalecamy ustawienie progu nieco powyżej sygnału NTC, co powinno zminimalizować wpływ deszczu w końcowej kwantyfikacji, ponieważ wszystkie kropelki są nadal uważane za dodatnie, nawet jeśli nie są w pełni cyklicznie przekazywane do punktu końcowego. AAV mają bardzo złożoną strukturę drugorzędową, która, w zależności od celu amplifikacji, może ograniczać dostęp do starterów i sond, powodując zakłócenia PCR, a tym samym deszcz. Włączenie enzymu restrykcyjnego do mieszanki wzorcowej rozszczepia tę drugorzędową strukturę, aby zwiększyć dostęp starterów i sond, zmniejszając opady deszczu, co może w ten sposób poprawić dokładność testu. Skutki włączenia enzymu restrykcyjnego do reakcji ddPCR zostały opisane wcześniej^25,32. Można użyć dowolnego enzymu restrykcyjnego, o ile potwierdzono, że nie przecina się w docelowym obszarze amplifikacji. Nie są wymagane żadne etapy wstępnego trawienia ani alternatywne kompozycje buforowe.

Drugim nietypowym etapem jest przygotowanie próbki łez zawierającej AAV. W tym protokole wykorzystano stosunek łez 1:10 (lub większy), a następnie próbkę podgrzano. Zazwyczaj, gdy łzy są zbierane za pomocą rurki kapilarnej, która jest szeroko stosowaną metodą pobierania, średnio można zebrać około 10,0 μl³³. Rozcieńczenie pomaga rozwiązać problem ograniczonej objętości próbki i zapewnić wystarczającą ilość materiału do powtórnego testowania odwiertu. Chociaż zmniejsza to teoretyczną granicę wykrywalności, solidna czułość ddPCR powinna nadal skutkować wykryciem wszystkich, z wyjątkiem bardzo małej liczby cząstek wektorowych. Takie podejście dodatkowo tworzy studnię "zapasową" na wypadek, gdyby jeden z nich nieoczekiwanie uległ awarii. W takim przypadku lub w przypadku niewystarczającej objętości próbki do uruchomienia dwóch odwiertów, błąd Poissona może być wykorzystany do oceny precyzji. Ponadto w przypadkach, gdy stężenie jest poniżej granicy wykrywalności, stwarza to możliwość połączenia danych z odwiertu w celu określenia stężenia. Konieczne jest uwolnienie wektorów AAV od kapsydów wirusa w celu wykrycia ddPCR. Niektóre metody oznaczania ilościowego AAV obejmowały etap trawienia proteinazy K w celu usunięcia kapsydu^wirusa 34,35,36. Wszystkie naturalnie występujące serotypy AAV mają temperaturę topnienia równą lub niższą niż około 90 °C, przy czym większość z nich spada poniżej 80 °C; W związku z tym wydaje się, że jest to zbędne włączenie³⁷. Samo ogrzewanie wydaje się być wystarczające do uwolnienia DNA wektora.

Ponadto ddPCR jest na ogół mniej podatny na inhibitory PCR, które mogą być obecne w próbce, co może mieć wpływ na test qPCR. Jeśli uwzględniony jest konkretny etap izolacji DNA, wymagałoby to również specyficznej walidacji, której unika się w tym protokole. Próbki rozcieńcza się przed podgrzaniem ze względu na kinetykę dyfuzji genomów wektorów w cieczy. Podczas procesu ogrzewania i późniejszego chłodzenia dodatnie i ujemne nici zmysłowe jednoniciowego genomu DNA mogą wyżarzać się razem, tworząc dwuniciowy produkt pośredni, jeśli stężenia są wystarczająco wysokie. Rozcieńczenie przed ogrzewaniem zmniejsza stężenia i sprawia, że jest matematycznie mało prawdopodobne, aby wytworzyła się wystarczająca ilość dwuniciowych produktów pośrednich, aby mieć niekorzystny wpływ na dokładność oznaczania ilościowego. Należy zauważyć, że syntetyczne fragmenty DNA lub zlinearyzowane plazmidy stosowane do kontroli jakości nie mogą być poddawane temu etapowi podgrzewania. Ponieważ są one dwuniciowe, ogrzewanie spowodowałoby konwersję na półprodukty jednoniciowe. Oczekuje się, że po niezależnym podziale tych jednoniciowych QC na kropelki, spowoduje to dwukrotny wzrost stężenia QC w stosunku do stężenia nominalnego. Alternatywnie, jeśli QC mają być podgrzewane w celu standaryzacji metody, musi to być uwzględnione przy rekonstytucji i przypisaniu stężenia nominalnego.

Wreszcie, jeśli chodzi o przygotowanie próbki, wiele protokołów zaleca również włączenie etapu leczenia DNazą w celu usunięcia niekapsułkowanego DNA wektora. Etap ten ma kluczowe znaczenie w przypadkach, gdy nie jest pożądane ilościowe oznaczanie wolnego DNA związanego z preparatem wektora (np. podczas oznaczania ilościowego w celu dawkowania). Jednak w kontekście badań nad biodystrybucją i biolinieniem zazwyczaj chce się wiedzieć, dokąd przemieścił się jakikolwiek wektor DNA, niezależnie od tego, czy jest on zamknięty, czy nie. Dlatego sugeruje się, aby zazwyczaj nie wykonywać etapu leczenia DNazy podczas takich badań. Jeżeli zostanie stwierdzone, że konieczne jest uwzględnienie etapu DNazy, etap ten powinien poprzedzać rozcieńczanie i ogrzewanie.

W artykule przedstawiono dane reprezentatywne dla podejścia do oceny zakresu dynamiki, czułości, dokładności i precyzji metody w kontekście walidacji zgodnej z dobrą praktyką laboratoryjną. Obecny brak wytycznych w tym zakresie sprawia, że laboratoria walidacyjne muszą samodzielnie określić kryteria oznaczania docelowego, zgodnie z obecnym myśleniem branży. Różne grupy postawiły zarówno wyższe, jak i niższe kryteria docelowe niż zastosowane w tym badaniu 19,20,21,22,23,24,25. Docelowe kryteria testu, do czasu ich bardziej rygorystycznego określenia, powinny być wybierane przed walidacją w oparciu o zamierzone zastosowania kliniczne metody. W zależności od dalszych decyzji, które należy podjąć na podstawie danych, może być wymagany wyższy poziom dokładności i precyzji. I odwrotnie, prosty wynik pozytywny i negatywny może być wystarczający.

W ramach podejścia skupiono się również na zaleceniach dotyczących oceny swoistości i efektu matrycy. Pula łez pobranych od osób nieleczonych nie dała pozytywnego wyniku w tym teście, podczas gdy cel można było wykryć, gdy wektor został wstrzyknięty do łez w wysokim i niskim stężeniu w zalecanych wskaźnikach odzyskiwania. Idealnie byłoby, gdyby matryca zawierająca wektor endogenny (np. pobrana po leczeniu wektorem wirusowym) była również uwzględniona w tych ocenach. Jest jednak mało prawdopodobne, aby takie próbki były dostępne do wykorzystania w walidacji. Aby zwiększyć wiarygodność walidacji, można ocenić wiele pul łez lub łez pobranych od różnych osób w celu określenia, czy występuje efekt matrycy specyficzny dla pacjenta. Na koniec zaleca się ocenę stabilności. W przepływach pracy, w których ekstrakcja DNA odbywa się poza matrycą biologiczną, może być konieczna ocena stabilności zarówno próbki, jak i wyekstrahowanego DNA. W tym procesie pracy próbka jest testowana bezpośrednio w teście bez konieczności ekstrakcji DNA. W związku z tym, biorąc pod uwagę ocenę stabilności dla tej metody, należy ocenić stabilność próbek łez. Zazwyczaj zaleca się ocenę stabilności na stole, w lodówce, zamrażanie/rozmrażanie i długoterminową stabilność. Nie zostały one przeprowadzone w ramach tego badania, ale opracowane tutaj metody mogą być wykorzystane w tej ocenie, po manipulacjach próbkami wejściowymi.

Ogólnie rzecz biorąc, wykazano, że metoda ta jest solidnym, powtarzalnym i walidowalnym testem do wykrywania wektorów opartych na AAV w próbkach łez. Może służyć jako platforma do dostosowania do określonych wektorów w celu wsparcia badań klinicznych i stanowi podstawę do walidacji testu zgodnego z dobrą praktyką laboratoryjną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
AAV-eGFP Vector	Charles River Laboratories	RS-AAV2-FL	Lot AAV2-0720-FL, używany jako wektor dowodu zasady
AutoDG Droplet Digital PCR system	Bio-Rad	QX200	Alternatywny system ddPCR może być stosowany zgodnie z wymaganiami producenta s protokół.
AutoDG Olej do sond	Bio-Rad	1864110	Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR.
Kontrola bufora ddPCR dla sond	Bio-Rad	1863052	Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR i chemią PCR.
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	1863004	Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR.
Uszczelki z folii przebijającej ddPCR	Bio-Rad	1814040	Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR.
ddPCR Płytki 96-dołkowe, półlistkowe	Bio-Rad	12001925	Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR.
ddPCR Supermix do sond (bez dUTP)	Bio-Rad	1863023, 1863024 lub 1863025	Użyj mieszanki głównej kompatybilnej ze starterami/sondami i systemem ddPCR.
DG32 AutoDG Cartidges	Bio-Rad	1864108	Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR.
Czytnik kropelkowy	Bio-Rad	QX200	Alternatywny system ddPCR może być stosowany zgodnie z zaleceniami producenta s protokół.
GeneAmp PCR	Buffer Applied Biosystems	N8080129	Nie dotyczy
Dwuskładnikowy	system wodny bez nukleaz	AM9906	N/A
PCR Plate Sealer	Bio-Rad	PX1	Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR.
Końcówki do pipet do AutoDG	Bio-Rad	1864120	Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR.
Pluronic F-68 Niejonowy środek powierzchniowo czynny	Gibco	24040	N/A
Sondy podkładowe i hydrolizy	Różne	różne	Konstrukcja oparta na sekwencji docelowej przy użyciu ogólnych podejść do projektowania startera / sondy. Wybierz fluorofory i wygaszacze kompatybilne z systemem ddPCR.
Enzym restrykcyjny	Różne	Różni	się w zależności od docelowej sekwencji amplifikacji. Użyj enzymu restrykcyjnego, który nie tnie w amplifikowanej sekwencji
Ścięte DNA nasienia łososia	ThermoFisher	AM9680	N/A
Syntetyczny fragment genu DNA lub zlinearyzowany plazmid	Różne	Różne	Projektuj syntetyczny fragment DNA zawierający docelowy region amplifikacji do użycia jako kontrola jakości
Bufor TE	Teknova	T0224	Upewnij się, że przygotowane lub zakupione są wolne od nukleaz. 10 mM Tris-HCl, 1,0 mM EDTA, pH = 8,0
Dotykowy termocykler	Bio-Rad	C1000	Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR.