Artykuł metodologiczny

Walidowalny cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej do wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w badaniach bioliowania łez

3.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65495

⸱

14 lipca 2023

 ,  ,  , 
1Cell and Gene Therapy, KCAS Bioanalytical and Biomarker Services

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i walidacji dobrych praktyk laboratoryjnych w zakresie zgodnego wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w ludzkich łzach za pomocą kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy w celu wsparcia klinicznego rozwoju wektorów terapii genowej.

Streszczenie

Wykorzystanie wektorów wirusowych w leczeniu chorób genetycznych znacznie wzrosło w ostatnich latach, z ponad 2,000 zarejestrowanych do tej pory badań. Wektory wirusowe związane z adenowirusem (AAV) odniosły szczególny sukces w leczeniu chorób związanych z oczami, czego przykładem jest zatwierdzenie leku voretigene neparvovec-rzyl. Aby wprowadzić nowe terapie na rynek, agencje regulacyjne zazwyczaj wymagają kwalifikowanych lub zwalidowanych badań nad biowydzielaniem w celu oceny uwalniania wektora do środowiska. Jednak Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków nie wydała żadnych oficjalnych wytycznych dotyczących opracowywania testów molekularnych wspierających takie badania nad zrzucaniem, pozostawiając twórcom najlepsze praktyki dla siebie. Celem tego protokołu jest przedstawienie walidowanego protokołu wykrywania wektorów AAV w ludzkich łzach za pomocą kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (ddPCR) w celu wsparcia klinicznych badań nad biowydzielaniem. W niniejszym artykule omówiono obecne podejścia przemysłu do walidacji testów molekularnych i wykazano, że metoda wykracza poza kryteria akceptacji testów docelowych proponowane obecnie w białych księgach. Na koniec omówiono etapy krytyczne w wykonaniu dowolnego testu ddPCR, niezależnie od zastosowania.

Wprowadzenie

Definicje terapii genowej różnią się, ale zazwyczaj wywołują celową i często oczekiwaną trwałą zmianę określonej sekwencji DNA genomu komórkowego w celu modyfikacji lub manipulacji ekspresji genu lub zmiany właściwości biologicznych żywej komórki w celach klinicznych1,2. Wektory wirusowe są coraz częściej wykorzystywane jako nośniki terapii genowej ze względu na ich skuteczność transdukcji, a jeden raport sugeruje, że ponad 70% obecnych badań klinicznych terapii genowej wykorzystuje wektory wirusowe3. Zainteresowanie wektorami wirusowymi w terapii genowej stale rośnie. Kwartalny raport danych za 4 kwartał 2022 r. na temat krajobrazu terapii genów, komórek i RNA opracowany przez American Society of Gene and Cell Therapy poinformował, że w 2022 r. linia terapii genów, komórek i RNA od przedklinicznej do wstępnej rejestracji wzrosła o 7%, zwiększając całkowitą liczbę opracowywanych terapii do 3 726, z czego 2 053 (55%) stanowiły terapie genowe4. Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (USA FDA) zatwierdziła obecnie 27 terapii komórkowych i genowych do użytku klinicznego u ludzi, z których pięć wykorzystuje wektory wirusowe5.

Wirusy związane z adenowirusami (AAV) zyskały szczególne zainteresowanie jako nośniki terapii genowej. Niedawna metaanaliza wykazała, że w ciągu ostatnich dwóch dekad przeprowadzono około 136 badań klinicznych badających zastosowanie AAV: 6. Ponadto trzy z pięciu zatwierdzonych przez amerykańską FDA terapii genowych są oparte na AAV. Wynika to z ich wysoce edytowalnego charakteru, szerokiego zakresu żywicieli, który można dostroić w oparciu o użycie specyficznych naturalnie występujących lub sztucznie zaprojektowanych wektorów, niskiej patogenności i toksyczności u ludzi oraz ogólnie niskiej immunogenności7,8. AAV są również z powodzeniem stosowane w leczeniu chorób oczu w zatwierdzonych warunkach klinicznych. Voretigene neparvovec-rzyl jest terapią opartą na AAV2, która została zatwierdzona przez amerykańską FDA w 2017 r. i przez Europejską Agencję Leków (EMA) w 2018 r. do leczenia biallelicznej dystrofii siatkówki związanej z mutacją RPE659.

Wraz z rosnącym zainteresowaniem rozwojem terapii opartych na AAV pojawia się potrzeba wytycznych regulacyjnych dotyczących testów. Dokładne wykrywanie i oznaczanie ilościowe każdego wektora wirusowego jest integralną częścią faz odkrywania, produkcji i testów przedklinicznych/klinicznych w ramach opracowywania produktu. Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) zaczęła wydawać wytyczne dotyczące terapii genowych, w tym dotyczące chemii, produkcji i kontroli nowych leków eksperymentalnych w terapii genowej u ludzi10, długoterminowa obserwacja po podaniu terapii genowej11, testy retrowirusowe z kompetencjami replikacyjnymi12, oraz zalecenia dotyczące wektorów mikrobiologicznych stosowanych w terapiach genowych13. EMA wydała również szereg wytycznych dotyczących rozwoju produktów terapii genowej, które generalnie są zgodne z zaleceniami FDA, chociaż istnieją pewne różnice14. Należy zauważyć, że chociaż niniejsze wytyczne nie ustanawiają prawnie egzekwowalnych obowiązków, z wyjątkiem przypadków, w których odniesione są do konkretnych przepisów, zapewniają one jasność co do obecnego sposobu myślenia agencji regulacyjnych na ten temat i ich oczekiwań dotyczących testów wymaganych do składania wniosków o dopuszczenie do obrotu i zatwierdzanie przez organy regulacyjne.

FDA wyraźnie zaleca przeprowadzenie badań w celu oceny dystrybucji, trwałości i usuwania wektora z miejsca podania do docelowych tkanek oka i nieocznego, płynów wewnątrzgałkowych i krwi15. Przyjmują one formę badań nad biodystrybucją i wydalaniem. Badania biodystrybucji oceniają narażenie, badając, w jaki sposób produkt rozprzestrzenia się po organizmie pacjenta od miejsca podania. Wydalanie w szczególności ocenia uwalnianie produktu od pacjenta do środowiska i zwiększa możliwość przeniesienia wektora na osoby nieleczone16. FDA wydaje zalecenia dotyczące projektowania badań biodystrybucji i wydalania w odniesieniu do częstotliwości pobierania próbek, czasu trwania pobierania próbek, rodzajów pobieranych próbek i warunków przechowywania.

Dodatkowo, FDA zaleca stosowanie ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR, lub real-time PCR) do ilościowego wykrywania genomów wektorowych ze względu na łatwość wykonania, format o wysokiej przepustowości, szybki czas realizacji i czułość testu. Istnieje jednak względny brak zaleceń dotyczących projektowania i oceny wydajności metod molekularnych w porównaniu z tymi, które istnieją dla małych i dużych cząsteczek. Wiele wytycznych dotyczących takich badań jest trudnych do zastosowania w odniesieniu do metod molekularnych ze względu na unikalną i złożoną konstrukcję zarówno produktów, jak i samych testów, co rodzi pytania co do adekwatności dostępnych platform dla zalecanych ocen i odpowiednich metod walidacji testów. Do tej pory FDA nie wymagała formalnej walidacji testów opartych na PCR, chociaż EMA nałożyła ten wymóg17. W związku z tą pustką różne grupy i warsztaty wydały białe księgi i zalecenia, których producenci i organizacje badawcze starają się przestrzegać18,19,20,21,22,23,24,25. Większość z tych zaleceń została napisana specjalnie z myślą o testach qPCR, z sugestiami lub zmianami dotyczącymi pojawiających się platform, takich jak cyfrowy PCR kropelkowy (ddPCR), uwzględnionymi tylko wtedy, gdy zostaną uznane za istotne. Nowsze zalecenia koncentrowały się na rozważaniach dotyczących testów ddPCR, ale w dużej mierze koncentrowały się na ich zastosowaniach do kwantyfikacji genomu wektorowego w warunkach produkcyjnych, a nie w złożonych matrycach biologicznych napotkanych w badaniach nad biowydzielaniem.

W zależności od zastosowania klinicznego i celów, ddPCR może być preferowany zamiast qPCR w badaniach nad biodystrybucją i wydalaniem ze względu na zwiększoną czułość ddPCR i jego zdolność do radzenia sobie z zakłóceniami matrycy w porównaniu do qPCR. Ponadto, dzięki podziałowi próbek na około 20 000 kropel, dokładne określenie ilościowe liczby kopii można osiągnąć bez użycia standardowej krzywej przy użyciu statystyki Poissona, co upraszcza opracowywanie i walidację metody. Celem tego protokołu jest opisanie znormalizowanego podejścia do opracowania i walidacji metody opartej na ddPCR do wykrywania wektorów AAV we łzach pobranych z powierzchni oka w celu wsparcia klinicznych badań biowydzielania.

Protokół

1. Przygotowanie syntetycznego fragmentu DNA

  1. Zaprojektuj i zamów syntetyczny fragment DNA zawierający docelowy region amplifikacji do wykorzystania w celu kontroli jakości.
    1. Upewnij się, że sekwencja obejmuje cały amplikon od startera forward do startera reverse docelowego genu, z przedłużeniem od czterech do sześciu par zasad na końcach 5' każdej sekwencji wiązania startera.
    2. Unikaj homopolimerów adeniny i tyminy dłuższych niż 12 par zasad lub guaniny i cytozyny dłuższych niż osiem par zasad, ponieważ długie homopolimery mogą zakłócać syntezę fragmentu genu.
      UWAGA: Jeśli amplikony zawierają takie sekwencje, można wprowadzić substytucje zasad, pod warunkiem zachowania miejsc przyłączania dla starterów i sond.
    3. Alternatywnie przygotuj zlinearyzowany plazmid zawierający amplikon, stosując typowe strategie klonowania.
  2. Wirowarkuj probówkę zawierającą syntetyczny fragment DNA w mikrocentry fudze przez ~10 s, aby upewnić się, że materiał zebrał się na dnie probówki.
  3. Resuspenduj syntetyczny fragment DNA w buforze tris-EDTA (TE) do stężenia 1,0 × 1010 kopii/µL lub do stężenia odpowiedniego dla zakresu docelowego testu.
  4. Krótko wymieszaj na wirówce typu vortex, a następnie inkubuj w temperaturze 50 °C przez 20 ± 5 min. Schłodź na lodzie.
  5. Przygotuj wiele, najlepiej jednorazowych alikwotów i przechowuj w temperaturze od -70 do -90 °C do momentu użycia.
    UWAGA: Syntetyczne fragmenty DNA przygotowane w ten sposób są zazwyczaj stabilne przez co najmniej 24 miesiące od daty resuspensji.
  6. W razie potrzeby określ dokładne stężenie przygotowanego roztworu syntetycznego DNA przed użyciem go w celu kontroli jakości lub oszacuj stężenie nominalne na podstawie zastosowanej resuspensji.

2. Przygotowanie starterów i sondy

  1. Zaprojektować i zamówić primery oraz sondę hydrolityczną skierowaną na pożądany region amplifikacji, stosując typowe strategie projektowania26,27.
    1. Wykorzystać fluorescencyjny barwnik reporterowy na końcu 5' (np. FAM) oraz wygaszacz na końcu 3' (np. Iowa Black dark quencher) kompatybilne z systemem ddPCR.
      UWAGA: Istnieje wiele pakietów oprogramowania do projektowania testów PCR, z których można korzystać. Na przykład narzędzie Primer-BLAST opracowane przez National Center for Biotechnology Information28 jest powszechnie stosowane ze względu na rozbudowane opcje projektowania testów oraz łatwość bioinformatycznej oceny specyficzności w celu zidentyfikowania możliwych efektów poza celowym regionem. Należy zauważyć, że przygotowanie primerów i sond może różnić się od opisanych tutaj kroków w zależności od formy, w jakiej są one dostarczane.
  2. Odwirować probówki zawierające primer prawy, primer lewy oraz sondę w mikrocentry fudze przez ~10 s, aby osadzić materiał na dnie probówki.
  3. Resuspendować primery do stężenia 20 µM przy użyciu buforu TE. Krótko wymieszać w wortexie.
  4. Resuspendować sondę do stężenia 10 µM przy użyciu buforu TE. Krótko wymieszać w wortexie.
  5. Przygotować wiele, najlepiej jednorazowych aliquotów i przechowywać w temperaturze minimum -20 °C do momentu użycia.
    ​UWAGA: Primery i sondy przygotowane w ten sposób są zazwyczaj stabilne przez co najmniej 24 miesiące od daty resuspensji.

3. Przygotowanie buforu do rozcieńczania próbek

  1. Rozmrozić bufor do PCR oraz pocięte DNA z plemni łososia w temperaturze pokojowej. Dokładnie wymieszać za pomocą wortexa.
  2. Przygotować bufor do rozcieńczania próbek zgodnie z Tabelą 1.
  3. Dokładnie wymieszać za pomocą wortexa. Po przygotowaniu przechowywać w temperaturze 2-8 °C przez maksymalnie 1 miesiąc.

Tabela 1: Przygotowanie buforu do rozcieńczania próbek. Aby pobrać tę tabelę, kliknij tutaj.

4. Przygotowanie mieszaniny master mix

  1. Rozmrozić w temperaturze pokojowej ddPCR master mix dla sond, startery forward, startery reverse oraz sondy i pozostawić do ogrzania przez co najmniej 10 min po rozmrożeniu przed użyciem. Przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu użycia.
    UWAGA: Odczynniki te muszą zostać całkowicie doprowadzone do temperatury pokojowej, aby zapewnić efektywne tworzenie kropel. Nie przechowywać odczynników na lodzie podczas przygotowania.
    1. Dokładnie wymieszać w wirówce typu vortex i krótko odwirować w miniwirówce przed użyciem.
      UWAGA: Enzymy restrykcyjne są zazwyczaj dostarczane w glicerolu i powinny być wyjmowane z przechowywania bezpośrednio przed użyciem. Mieszać delikatnie. Nie używać wirówki typu vortex.
  2. Przygotować PCR master mix dla każdego celu amplifikacji. Sugerowany skład PCR master mix znajduje się w Tabeli 2; w razie potrzeby zmodyfikować stężenia starterów i sond.
    1. Dokładnie wymieszać w wirówce typu vortex i krótko odwirować przed dodaniem enzymu restrykcyjnego. Dodać enzym restrykcyjny i wymieszać poprzez odwracanie probówki.
      UWAGA: Na tym etapie wymagane jest 22 µL reakcji PCR, aby uzyskać końcową objętość 40 µL reakcji PCR po utworzeniu kropel (składającej się z 15 µL PCR master mix, 5,0 µL matrycy i 20 µL oleju do generowania kropel).
  3. Dodać 16,5 µL master mix do każdego dołka zgodnie z mapą płyty. Przykład mapy płyty dla serii walidacji dokładności i precyzji znajduje się na Rysunku 1.
    1. Upewnić się, że płyta zawiera trzy niezależne przygotowania serii kontroli jakości (QC), trzy niezależnie przetestowane alikwoty endogennych łez (testowane bez dodatku, z dodatkiem wysokiego i niskiego poziomu), a także trzy niezależne kontrole bez matrycy (NTC).
    2. Zróżnicować rozmieszczenie tych dołków na płycie, gdzie Zestaw 1 jest ładowany w kolejności malejących stężeń, Zestaw 2 w kolejności rosnących stężeń, a Zestaw 3 w kolejności losowej, aby ocenić, czy występują efekty specyficzne dla lokalizacji na płycie.
    3. Rozmieścić próbki tak, aby wypełnić jak najwięcej miejsca w kolumnie, a niewykorzystane dołki w kolumnie wypełnić buforem kontrolnym. W pozostałych dołkach można, jeśli potrzeba, umieścić wiele partii kontroli endogennych (np. więcej pul łez lub łez pobranych od poszczególnych osób).
    4. Uszczelnić płytę przezroczystą folią adhezyjną. Przechowywać płytę w temperaturze pokojowej podczas przygotowania matrycy. Alternatywnie można przechowywać płytę do 4 h w temperaturze 2-8 °C, ale należy ją doprowadzić do temperatury pokojowej przez co najmniej 10 min przed dodaniem matrycy.

Tabela 2: Przykład przygotowania mieszaniny master mix do PCR. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Schemat układu mikropłytki do analizy próbek; obejmuje alikwoty, dodatki, kontrole i bufory.
Rysunek 1: Przykładowa mapa płytki dla serii pomiarowej w celu walidacji dokładności i precyzji. Skróty: ULQC = górna granica kontroli jakości; HQC = wysoka kontrola jakości; MQC = średnia kontrola jakości; LQC = niska kontrola jakości; LLQC = dolna granica kontroli jakości; NTC = kontrola bez matrycy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

5. Przygotowanie próbek kontroli jakości (QC)

  1. Odmrozić syntetyczne fragmenty DNA lub zlinearyzowane plazmidy w temperaturze pokojowej i pozostawić do ogrzania przez co najmniej 10 min po rozmrożeniu przed użyciem. Doprowadzić matryce do temperatury pokojowej, aby zapewnić efektywne tworzenie kropelek.
    1. Przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu użycia. Dokładnie wymieszać w wirówce typu vortex i krótko odwirować w miniwirówce przed użyciem.
  2. Przygotować rozcieńczenia kontroli jakości (QC), wykorzystując bufor do rozcieńczania próbek jako rozcieńczalnik. Przykład zalecanych stężeń do przygotowania w celu walidacji dokładności i precyzji przedstawiono w Tabeli 3.
    ​UWAGA: Po pomyślnym zakończeniu serii badań dokładności i precyzji, na każdej płytce należy wykonać analizę jedynie dla wysokiej kontroli jakości (HQC), średniej kontroli jakości (MQC) oraz niskiej kontroli jakości (LQC). W seriach badań dokładności i precyzji do oceny dokładności i precyzji wewnątrzanalizy włącza się co najmniej trzy niezależne rozcieńczenia QC. Po zakończeniu badań dokładności i precyzji wystarczy uwzględnić tylko jedną serię rozcieńczeń.
  3. Po przygotowaniu przechowywać rozcieńczenia w temperaturze pokojowej do momentu naniesienia na płytkę.
  4. W razie potrzeby przechowywać rozcieńczenia w lodzie lub w temperaturze 2-8 °C. Przed kolejnym użyciem pozwolić rozcieńczeniom ogrzać się do temperatury pokojowej przez co najmniej 10 min. Kontrole QC należy utylizować na koniec dnia.

Tabela 3: Przykład przygotowania kontroli jakości (QC) z użyciem syntetycznych fragmentów dwuniciowego DNA. Skróty: ULQC = górna granica kontroli jakości; HQC = wysoka kontrola jakości; MQC = średnia kontrola jakości; LQC = niska kontrola jakości; LLQC = dolna granica kontroli jakości; NTC = kontrola bez matrycy. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

6. Przygotowanie próbek

  1. Odmrozić w temperaturze pokojowej próbki łez pobrane podczas badania klinicznego, a następnie pozostawić do ogrzania przez co najmniej 10 min po rozmrożeniu przed użyciem.
    1. Przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu użycia. Przed użyciem dokładnie wymieszać w vortexie i krótko odwirować w mikrocentryfudze.
  2. Rozcieńczyć próbki łez w stosunku 1:10 (lub większym), używając buforu do rozcieńczania próbek jako rozcieńczalnika, w probówkach PCR 0,2 mL lub paskach PCR 8-dołkowych. Zamknąć szczelnie probówki.
    UWAGA: W zależności od oczekiwanego stężenia celu w łzach, może być konieczne dalsze rozcieńczenie próbek lub przetestowanie wielu rozcieńczeń każdej próbki.
  3. Podgrzać próbki w termocyklerze w temperaturze 95 °C przez 10 min, a następnie utrzymać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 5 min w celu schłodzenia. Zastosować szybkość zmiany temperatury 3 °C/s.
    UWAGA: Próbki mogą pozostać w termocyklerze w temperaturze 4 °C do momentu użycia w tym samym dniu lub mogą zostać zamrożone w temperaturze od -70 do -90 °C w celu dłuższego przechowywania. Krok ten służy denaturacji kapsydu wektora, co uwalnia genom. Ponieważ syntetyczne fragmenty DNA do kontroli jakości lub zlinearyzowane plazmidy są dwuniciowe, nie powinny być poddawane temu etapowi podgrzewania.
  4. Po schłodzeniu doprowadzić próbki do temperatury pokojowej (lub w przypadku mrożenia, rozmrozić w temperaturze pokojowej) i pozostawić do ogrzania przez co najmniej 10 min.
    ​UWAGA: Próbki muszą zostać w pełni doprowadzone do temperatury pokojowej, aby zapewnić efektywne tworzenie kropelek.

7. Dodanie matrycy

  1. Wyjmij płytkę ddPCR zawierającą master mix. Każdą próbkę lub probówkę z rozcieńczeniem QC dokładnie wymieszać w wirówce typu vortex, a następnie krótko odwirować, aby zebrać materiał na dnie.
  2. Usuń folię adhezyjną i dodaj 5,5 µL próbek lub kontroli QC do odpowiednich dołków płytki 96-dołkowej, zgodnie z mapą płytki.
    UWAGA: Wyjaśnienie wymaganych objętości znajduje się w punkcie 4.2.1
  3. Do dołków NTC dodaj 5,5 µL buforu do rozcieńczania próbek.
  4. Generowanie kropli wymaga, aby wszystkie dołki w kolumnie zawierały reakcję lub kontrolę buforową. Jeśli którekolwiek dołki w kolumnie nie zawierają reakcji z próbką, rozcieńcz bufor kontrolny 2x ddPCR w stosunku 1:2, używając wody wolnej od nukleaz. Do wszystkich pustych dołków w kolumnie dodaj 22 µL buforu kontrolnego 1x ddPCR.
    UWAGA: Jeśli cała kolumna nie jest wykorzystywana, nie ma potrzeby dodawania buforu kontrolnego do tych dołków.
  5. Na płytkę nałóż perforowaną folię uszczelniającą. Umieść płytkę w zgrzewarce i zgrzewaj przez 5 s w temperaturze 180 °C.
    1. Alternatywnie, uszczelnij płytkę zgodnie z zaleceniami producenta systemu ddPCR.
  6. Mieszaj płytkę w wirówce typu vortex z maksymalną prędkością przez co najmniej 30 s (korzystając z ustawienia mieszania ciągłego; nie używaj trybu dotykowego), a następnie krótko odwirowuj w wirówce do płytek.
    UWAGA: Dokładne i całkowite wymieszanie zawartości płytki na tym etapie jest kluczowe dla prawidłowego podziału reakcji PCR na krople. Upewnij się, że w dołkach nie ma widocznych pęcherzyków powietrza. W razie potrzeby płytkę można przechowywać w temperaturze 2-8 °C przed generowaniem kropli przez maksymalnie 4 h. W takim przypadku przed generowaniem kropli należy pozostawić płytkę w temperaturze pokojowej przez minimum 10 min.

8. Zautomatyzowane generowanie kropel, cykli termicznych i odczyt kropel

  1. Wygeneruj kropelki w zautomatyzowanym generatorze kropelek w następujący sposób.
    1. Na ekranie dotykowym zaznacz kolumny na mapie płytki zawierające próbki. Pokład instrumentu zaświeci się, wskazując, które materiały eksploatacyjne (kartridże DG32, końcówki, pojemnik na odpady, olej do generowania kropelek) są wymagane. Żółte światła wskazują konieczność dodania materiału eksploatacyjnego, natomiast zielone światła oznaczają, że dostępne są wystarczające ilości materiałów.
    2. Załaduj generator kropelek od tyłu do przodu.
    3. W przypadku sond hydrolizy upewnij się, że zainstalowano olej do generowania kropelek dla sond i pozostało wystarczająco dużo oleju dla danej liczby studzienek. Jeśli stosowane są alternatywne odczynniki do PCR, upewnij się, że zainstalowano kompatybilny olej do generowania kropelek.
    4. Umieść blok chłodzący w uchwycie na płytkę do kropelek. Upewnij się, że blok jest całkowicie niebieski i nie widać różowego koloru. Umieść nową płytkę ddPCR z 96 studzienkami w bloku chłodzącym.
    5. Umieść przygotowaną płytkę PCR w uchwycie na płytkę z próbkami. Zamknij pokrywę urządzenia. Naciśnij start, aby rozpocząć generowanie kropelek.
  2. Po uformowaniu kropelek łącznie 40 µL na każdą reakcję zostanie automatycznie przeniesione do nowej płytki PCR.
  3. W ciągu 30 min po zakończeniu generowania kropelek wyjmij płytkę zawierającą kropelki z bloku chłodzącego. Postępuj ostrożnie, ponieważ kropelki są na tym etapie najbardziej delikatne.
  4. Na płytce umieść perforowalną folię uszczelniającą. Umieść płytkę w zgrzewarce do płytek i zgrzewaj przez 5 s w temperaturze 180 °C.
    1. Alternatywnie, uszczelnij płytkę zgodnie z zaleceniami producenta systemu ddPCR.
  5. Umieść płytkę w kompatybilnym termocyklerze. Wprowadź warunki cykli (patrz Tabela 4).
  6. Po zakończeniu cykli termicznych przechowuj płytkę w termocyklerze w temperaturze 2-8 °C lub odczytaj ją niezwłocznie.
    UWAGA: Przechowywanie płytki przez 12 h w temperaturze 4-12 °C może poprawić liczbę kropelek, ale nie jest to wymagane. Odpowiednią liczbę kropelek powinno się uzyskać bez tego etapu.
  7. Załaduj płytkę do czytnika kropelek, upewniając się, że w czytniku pozostało wystarczająco dużo oleju, a w pojemniku na odpady jest wystarczająco dużo miejsca. Odczytaj kropelki. Wykonaj odczyt kropelek w ciągu 24 h od rozpoczęcia cykli termicznych.

Tabela 4: Typowe warunki cyklicznego przetwarzania termicznego. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

9. Analiza danych

UWAGA: Do prawidłowego obliczenia stężenia przy użyciu statystyki Poissona niezbędne jest uzyskanie minimum 10 000 kropel na studnię. Nie należy przeprowadzać analizy w studniach zawierających mniej niż 10 000 kropel.

  1. Wymagane jest ustalenie progu (threshold), aby zdefiniować kropelki jako pozytywne lub negatywne. Oprogramowanie analityczne ddPCR automatycznie stosuje próg, który może różnić się pomiędzy poszczególnymi studzienkami. Jednakże, w celu uzyskania bardziej spójnych, dokładnych i precyzyjnych wyników, należy ręcznie ustawić próg dla wszystkich studzienek na płytce, nieco powyżej intensywności fluorescencji studzienek NTC.
    UWAGA: Prawidłowe rozmieszczenie progu może wymagać optymalizacji w zależności od stopnia rozdzielenia kropelek pozytywnych i negatywnych oraz ilości występującego tzw. deszczu kropelek (droplet rain) (patrz Rysunek 2). W tym przykładzie wykres amplitudy kropel pokazuje przykładowe studzienki dla każdego poziomu QC oraz NTC. Fioletowa linia wskazuje próg 1 000, ustawiony nieco powyżej populacji kropelek negatywnych.
  2. Modelowanie statystyczne Poissona wymaga co najmniej trzech kropelek pozytywnych, aby obliczyć stężenie z 95% pewnością. Wszystkie studzienki zawierające zero, jedną lub dwie kropelki pozytywne należy uznać za negatywne i przypisać im stężenie zero27.
  3. Oblicz wstecznie liczbę kopii w każdej próbce łez.
    1. Stężenie w kopii/µL jest podane w raporcie z danych. Wartość tę należy wykorzystać do określenia stężenia w kopii/µL oryginalnej próbki (tj. próbki łez).
    2. Aby obliczyć rozcieńczenie reakcji ddPCR, należy podzielić początkową objętość reakcji PCR przed formowaniem kropelek przez objętość dodanej matrycy. Przy zastosowaniu objętości przedstawionych w tej metodzie, daje to wartość 4.
      Wzór na rozcieńczenie reakcji ddPCR, objętość reakcji PCR podzielona przez objętość matrycy, schemat równania.
    3. Wyznacz czynnik rozcieńczenia seryjnego z oryginalnej próbki (krok 6.2).
    4. Aby wyznaczyć liczbę kopii/µL w próbce, należy pomnożyć liczbę kopii/µL przez rozcieńczenie reakcji ddPCR, a następnie przez czynnik rozcieńczenia seryjnego. Na przykład: stężenie w kopii/µL wygenerowane w raporcie danych wynosiło 966; na 22 µL reakcji dodano 5,5 µL matrycy. Zastosowano rozcieńczenie seryjne próbki 1:50 000.
      Równanie do obliczania stężenia DNA; pokazuje kopie/µL × czynnik rozcieńczenia ddPCR × czynnik rozcieńczenia seryjnego.
      Równanie PCR pokazujące obliczanie liczby kopii DNA na mikrolitr; naukowa metoda kwantyfikacji.
    5. Jeśli badano wiele rozcieńczeń tej samej próbki, należy przeanalizować wszystkie poprawne rozcieńczenia mieszczące się w zakresie i obliczyć średnią.
  4. Dla każdego QC oblicz oczekiwaną liczbę kopii/µL reakcji PCR, dzieląc stężenie danego rozcieńczenia QC (w kopii/µL) przez objętość reakcji ddPCR (20 µL). Pozwala to na bezpośrednie porównanie tej wartości nominalnej z wartością kopii/µL podaną w raporcie danych bez dalszych obliczeń.
    UWAGA: To podejście zostało również zastosowane do analizy wzbogaconych próbek łez wykorzystanych w reprezentatywnych wynikach.
  5. Wyznacz wartość średnią, odchylenie standardowe, współczynnik zmienności (%CV) oraz procentowy błąd względny względem stężenia nominalnego (%RE) dla wartości próbki lub QC, korzystając z powtórnych studzienek (uwzględniając wiele rozcieńczeń, jeśli dotyczy).
    1. W celu oceny precyzji międzystudzienkowej, wyznacz tę wartość dla każdego z duplikatów studzienek, jeśli zostały one uwzględnione.
    2. W celu oceny dokładności i precyzji wewnątrzanalizy (intra-assay), wyznacz tę wartość dla każdej serii rozcieńczeń lub alikwoty wykorzystanej w obrębie serii.
    3. W celu oceny dokładności i precyzji międzyanalizami (inter-assay), wyznacz tę wartość, korzystając ze średnich wewnątrzanalizy dla każdej z uwzględnionych serii.

Wykres kropelkowej cyfrowej PCR, analiza amplitudy danych dla kwantyfikacji DNA w różnych kontrolach.
Rysunek 2: Przykład ustawiania progu. Skróty: ULQC = górna granica kontroli jakości; HQC = wysoka kontrola jakości; MQC = średnia kontrola jakości; LQC = niska kontrola jakości; LLQC = dolna granica kontroli jakości; NTC = kontrola bez matrycy. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

10. Kryteria akceptacji analizy

  1. Wykorzystaj poniższe specyfikacje w odniesieniu do danych obliczonych dla każdej serii, aby określić, czy seria jest dopuszczalna. Jeśli warunki te nie zostaną spełnione, unieważnij i powtórz serie.
    UWAGA: Kryteria te zostały określone na podstawie konsensusu z opublikowanych białych ksiąg dotyczących walidacji testów opartych na metodzie PCR18,19,20,21,22,23,24,25. Może być konieczne odpowiednie zmodyfikowanie kryteriów docelowych w zależności od zastosowania klinicznego.
  2. Kontrola bez matrycy (NTC)
    1. Upewnij się, że każda studzienka NTC zawiera co najmniej 10 000 kropli.
    2. Upewnij się, że każda studzienka NTC zawiera mniej niż 3 pozytywne krople.
  3. Kontrole jakości (QC) i zakres testu
    1. Upewnij się, że każda studzienka QC zawiera co najmniej 10 000 kropli.
    2. Upewnij się, że precyzja powtórnych studzienek dla danej koncentracji QC wynosi ≤25,0% CV, z wyjątkiem górnej i dolnej granicy oznaczalności, gdzie dopuszczalne jest ≤30,0%. Oceń to niezależnie dla każdego zestawu QC i poziomu koncentracji.
    3. Upewnij się, że błąd względny obliczonej wstecz koncentracji dla każdego średniego poziomu QC mieści się w zakresie ±25,0% RE od koncentracji nominalnej (kopii/reakcja PCR), z wyjątkiem górnej i dolnej granicy oznaczalności, gdzie dopuszczalne jest ±30,0% RE. Oceń to niezależnie dla każdego zestawu QC i poziomu koncentracji.
    4. Upewnij się, że co najmniej 2/3 próbek QC (np. cztery z sześciu wyników) oraz 50% próbek QC na każdym poziomie (niskim, średnim, wysokim) spełniają te wytyczne.
  4. Próbki
    1. Upewnij się, że studzienki z próbkami przeznaczonymi do analizy zawierają co najmniej 10 000 kropli.
    2. Upewnij się, że precyzja powtórnych studzienek dla rozcieńczenia próbki przeznaczonej do analizy wynosi ≤25,0% CV.
    3. Upewnij się, że co najmniej jedno uwzględnione rozcieńczenie danej próbki mieści się w zdefiniowanym zakresie oznaczalności testu, określonym powyżej na podstawie QC górnej i dolnej granicy.
    4. Jeśli wszystkie uwzględnione rozcieńczenia dają wyniki powyżej zdefiniowanej górnej granicy oznaczalności i jeśli pozostała wystarczająca objętość próbki, powtórz test, stosując wyższe rozcieńczenie próbki.
    5. Jeśli wszystkie uwzględnione rozcieńczenia dają wynik poniżej dolnej granicy oznaczalności i jeśli pozostała wystarczająca objętość próbki, powtórz test, stosując niższe rozcieńczenie próbki.
      UWAGA: Próbki zawierające więcej niż trzy pozytywne krople, ale o koncentracji poniżej dolnej granicy oznaczalności, mogą być opisane jako wykrywalne, lecz nieoznaczalne.

Wyniki

Dla celów demonstracyjnych opracowano test przeznaczony do wykrywania dostępnego na rynku, wzmocnionego wektora AAV2 z ekspresją zielonego białka fluorescencyjnego (eGFP), z syntetycznym dwuniciowym fragmentem DNA zawierającym eGFP jako kontrolę jakości. Obecnie toczy się debata na temat tego, czy sam wektor, czy syntetyczny fragment DNA lub zlinearyzowany plazmid jest najbardziej odpowiedni do użycia jako kontrola jakości. Ogólnie rzecz biorąc, syntetyczny fragment DNA lub zlinearyzowany plazmid może być użyty, jeśli w procesie opracowywania metody zostanie wykazana równoważność z wektorem (dane nie pokazane). Startery i sondy zostały zaprojektowane i zoptymalizowane pod kątem wykrywania transgenu eGFP. Patrz Tabela Uzupełniająca S1, aby zapoznać się z sekwencjami wykorzystanymi w tej pracy. Stężenie zapasu fragmentów QC określono empirycznie za pomocą ddPCR. Wszystkie testy przeprowadzono przy użyciu stężeń i warunków PCR podanych jako przykłady w sekcji protokołu.

Dla testów qPCR zaleca się ocenę liniowości, czułości, zakresu dynamiki, dokładności i precyzji krzywej wzorcowej. Ponieważ ddPCR nie opiera się na krzywej standardowej do oznaczania docelowego oznaczania ilościowego, zalecenia te muszą zostać zmodyfikowane. Zamiast tego wykorzystano QC składające się z syntetycznych dwuniciowych fragmentów DNA rozcieńczonych do różnych stężeń w celu objęcia oczekiwanego wymiernego zakresu reakcji ddPCR w oparciu o modelowanie statystyczne Poissona29,30,31,32 w celu zdefiniowania zakresu dynamiki i czułości oraz oceny dokładności i precyzji. Wybór stężeń QC opierał się przede wszystkim na oczekiwanym stosunku dodatnich do całkowitych kropel w studzience przy danym stężeniu. Matematycznie ddPCR jest teoretycznie najdokładniejszy, gdy około 80% partycji dodatnio się wzmacnia. Gdy stosunek dodatni do całkowitego stosunku kropel wzrasta powyżej 0,8, dokładność zmniejsza się z powodu nasycenia przegród, przy czym kwantyfikacja nie jest możliwa, gdy 100% kropel jest dodatnich. Z drugiej strony, teoretycznie, można wykryć i określić ilościowo zaledwie jedną dodatnią kroplę, chociaż dokładność jest gorsza, a test jest podatny na fałszywe alarmy na niskim poziomie. Zazwyczaj co najmniej trzy krople muszą być dodatnie, aby wynik został obliczony z 95% pewnością, co jest progiem do obliczenia stężenia, którego tutaj użyliśmy.

Przygotowano serię pięciu różnych stężeń QC, z obliczoną docelową liczbą kopii/objętościami reakcji μL PCR, które mają dać dodatnie proporcje kropel do całkowitej obejmujące mierzalny zakres ddPCR, jak pokazano w Tabeli 5. Wykorzystano je do oceny dokładności i precyzji testu. W tej ocenie górna i dolna granica oznaczalności nie zostały przesunięte do teoretycznego maksimum możliwego w ddPCR. Dokładna kwantyfikacja może być możliwa przy wyższych i niższych poziomach niż wykazane tutaj. Zakres ten powinien być rozwijany zgodnie z dalszymi zastosowaniami tej metody.

Łącznie trzy niezależnie przygotowane serie rozcieńczeń tych QC zostały przygotowane w buforze do rozcieńczania próbki dla każdej partii, aby ocenić dokładność i precyzję testu wewnątrztestowego. Uwzględniono zduplikowane studzienki każdego rozcieńczenia QC. Aby zasymulować rzeczywisty protokół walidacji, wielu analityków przeprowadziło łącznie sześć partii dokładności i precyzji w ciągu kilku dni. Wyniki z tych sześciu partii przeanalizowano w celu określenia dokładności i precyzji metody w teście wewnętrznym i międzytestowym oraz w celu zdefiniowania zakresu dynamicznego testu.

Wydajność testu wewnętrznego została oceniona dla każdej partii na każdym poziomie kontroli jakości. Spodziewaliśmy się, że wszystkie studnie QC i NTC będą miały co najmniej 10 000 kropel. Wymóg ten został spełniony w 216 z 216 badanych studzienek we wszystkich sześciu partiach, przy średniej liczbie kropli wynoszącej 19 748 kropli / studzienkę (Tabela 6). Następnie oczekiwano, że %CV między studzienkami każdego zestawu zduplikowanych studzienek każdej kontroli jakości wyniesie ≤25,0%, z wyjątkiem górnej i dolnej granicy kontroli jakości, gdzie oczekiwano ≤30,0%. Zostało to spełnione w zestawach 90 z 90 dołków testowanych we wszystkich sześciu partiach dla kontroli jakości, ze średnim %CV między studzienkami wynoszącymi 3,9% na wszystkich poziomach kontroli jakości (tabela 7). Wszystkie QC dały średni dodatni stosunek kropli do całkowitej w oczekiwanych zakresach opisanych powyżej (Tabela 6).

W każdej partii, średnia z testu i odchylenie standardowe zostały obliczone dla każdego z niezależnie przygotowanych punktów serii rozcieńczeń, a następnie użyto ich do obliczenia średniej z testu dla każdego stężenia w każdym teście. Wykorzystano to do oceny dokładności i precyzji testu (tabela 8). Precyzja odnosi się do zmienności danych pochodzących z powtórzeń tej samej jednorodnej próbki w normalnych warunkach oznaczania i jest oceniana poprzez obliczenie %CV wielokrotności uwzględnionych podwielokrotności. Spodziewaliśmy się, że trzy podwielokrotności testowane w każdej partii dadzą %CV w teście wewnętrznym ≤25,0%, z wyjątkiem górnej i dolnej granicy kontroli jakości, gdzie oczekiwano ≤30,0%. Zostało to spełnione dla wszystkich pięciu poziomów kontroli jakości w każdej z 60 partii (30 z 30 wszystkich wyników). Ogólnie rzecz biorąc, można było osiągnąć większą precyzję wewnątrz testu niż kryteria docelowe, ze średnią %CV wewnątrz testu wynoszącą 7,7% na wszystkich poziomach kontroli jakości. Dokładność odnosi się do bliskości zgodności między wartością wyznaczoną doświadczalnie a wartością nominalną. Ocenia się to, obliczając procentowy błąd względny (%RE lub %Bias) między obliczonymi stężeniami każdego QC a ich teoretycznie oczekiwanymi stężeniami nominalnymi. Oczekiwano, że średnia z trzech podwielokrotności wyniesie ±25,0% RE stężenia nominalnego, z wyjątkiem górnej i dolnej granicy QC, gdzie oczekiwano ±30,0%. Zostało to spełnione dla wszystkich pięciu poziomów kontroli jakości w każdej z 60 partii (30 z 30 wszystkich wyników). Ogólnie rzecz biorąc, można było osiągnąć większą dokładność testu niż nasz cel, ze średnią bezwzględną %RE wewnątrz testu wynoszącą 4,2% na wszystkich poziomach kontroli jakości. We wszystkich parametrach NTC (łącznie 30) nie wykryto żadnych dodatnich kropel.

Dokładność i precyzja między testami zostały również obliczone przy użyciu średniej z każdego poziomu QC w każdej partii. Oczekiwano, że precyzja między testami wyniesie ≤25,0% CV, z wyjątkiem górnej i dolnej granicy kontroli jakości, gdzie oczekiwano ≤30,0%. Podobnie, w przypadku dokładności między testami, oczekiwano ±25,0% RE, z wyjątkiem górnej i dolnej granicy kontroli jakości, gdzie oczekiwano ±30,0%. Zaobserwowano znacznie większą dokładność i precyzję między testami niż te cele (Tabela 9), z precyzją między testami w zakresie od 4,0% do 8,5% i bezwzględną dokładnością między testami w zakresie od 1,0% do 3,2%. Podsumowując, wyniki te pokazują, że metoda ta może osiągnąć wystarczającą dokładność i precyzję w testach wewnątrz i między nimi, co mieści się w obecnych celach branżowych. Na podstawie tych wyników można określić zakres dynamiczny tego testu wynoszący 2,500-2,5 kopii na μl reakcji PCR, przy ogólnej czułości testu wynoszącej 2,5 kopii na μl reakcji PCR. Jak wspomniano wcześniej, możliwe jest zweryfikowanie szerszych zakresów dynamiki.

Następnie, konieczne było oszacowanie dokładności i precyzji testu w matrycy docelowej - w tym przypadku rozdarcia. Zazwyczaj testy są walidowane przed rozpoczęciem badań klinicznych, co oznacza, że jest mało prawdopodobne, aby łzy pobrane od pacjentów leczonych wektorem były dostępne do celów walidacji. Można to sztucznie stworzyć, wtłaczając docelowy wektor AAV do łez pobranych od ochotniczych dawców w celu wytworzenia QC z kolcami matrycy. Zebrane ludzkie łzy zostały pobrane przez stronę trzecią (BioIVT). Dla udowodnienia zasadności wykorzystano wektor AAV2 z ekspresją eGFP pozyskany ze źródła komercyjnego. Stężenie stada wektorów AAV2 określono empirycznie za pomocą ddPCR, bez użycia etapu izolacji DNA, jak opisano w niniejszym protokole. W każdym przebiegu AAV2 był niezależnie wzbogacany do trzech podwielokrotności łez na wysokim (oczekiwanym 1,41 x 103 kopii/μl reakcji PCR) i niskim (28,2 kopii/μl reakcji PCR) poziomie. Niewzbogacone podwielokrotności włączono jako kontrolę, aby wykazać specyficzność metody.

Wydajność testu wewnętrznego została oceniona dla każdej partii na każdym poziomie spajka. Spodziewano się, że wszystkie próbki łez będą miały co najmniej 10 000 kropel. Zostało to spełnione w 108 ze 108 studzienek testowanych we wszystkich sześciu partiach, przy średniej całkowitej liczbie kropli wynoszącej 20 208 kropli / studzienkę (Tabela 10). Następnie oczekiwano, że %CV między studzienkami każdego zestawu zduplikowanych studzienek każdej kontroli jakości wyniesie ≤25,0% dla wysokich i niskich poziomów skoków. Zostało to spełnione w 36 z 36 zestawów studzienek testowanych we wszystkich sześciu partiach dla kontroli jakości, ze średnim %CV między studzienkami wynoszącymi 3,2% (tabela 11).

W każdej partii, średnia z testu i odchylenie standardowe zostały obliczone dla każdego z niezależnie przygotowanych kolców łez, a następnie użyto ich do obliczenia średniej z testu dla każdego stężenia w każdym teście. Wykorzystano to do oceny dokładności i precyzji testu w matrycy (tabela 12). Spodziewaliśmy się, że %CV w teście wewnętrznym wyniesie ≤25,0%, a poziomy skoków będą wysokie i niskie. Zostało to spełnione w sześciu z sześciu partii dla każdego poziomu. Ogólnie rzecz biorąc, można było osiągnąć większą precyzję wewnątrz testu w matrycy niż wartość docelowa, przy średnim %CV wewnątrz testu wynoszącym 3,7% na wysokim poziomie i 12,2% na niskim poziomie (ogólnie 8,0%). Oczekiwano również, że %RE w teście wewnętrznym wyniesie ±25,0% przy obu poziomach skoków. Zostało to spełnione w sześciu z sześciu partii dla każdego poziomu. Podobnie, ogólnie stwierdzono, że można osiągnąć większą dokładność w matrycy testu niż wartość docelowa, przy średnim bezwzględnym %RE w teście wewnętrznym wynoszącym 8,1% na niskim poziomie i 11,3% na wysokim poziomie (ogólnie 9,7%). W przypadku kontroli bez wzbogacania nie wykryto sygnału eGFP w żadnej z podwielokrotności (Tabela 12), co świadczy o swoistości metody w ludzkiej macierzy łzowej.

Dokładność i precyzja między testami w matrycy łez została również obliczona przy użyciu średniej z testu każdego poziomu skoku w każdej partii. Oczekiwano, że precyzja między testami wyniesie ≤25,0% CV, a dla dokładności między testami spodziewaliśmy się ±25,0% RE. Zaobserwowano znacznie większą dokładność i precyzję między testami niż te cele (tabela 13), z precyzją między testami 5,5% na wysokim poziomie i 7,1% na niskim poziomie oraz z absolutną dokładnością między testami 11,3% na wysokim poziomie i 8,1% na niskim poziomie. Łącznie wyniki te pokazują dokładność, precyzję i specyficzność metody w matrycy łezowej.

Tabela 5: Kontrole jakości używane do określenia zakresu dynamicznego testu. Skróty: ULQC = upper limit quality control; HQC = wysoka kontrola jakości; MQC = średnia kontrola jakości; LQC = niska kontrola jakości; LLQC = dolna granica kontroli jakości; NTC = brak kontroli szablonu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 6: Całkowita liczba kropel i dodatnie do całkowitego stosunku kropelek w kontroli jakości syntetycznego dwuniciowego DNA i NTC. Skróty: ULQC = upper limit quality control; HQC = wysoka kontrola jakości; MQC = średnia kontrola jakości; LQC = niska kontrola jakości; LLQC = dolna granica kontroli jakości; NTC = brak kontroli szablonu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 7: Statystyki międzydołkowe kontroli jakości (kopiowanie celów/μL reakcji PCR). Skróty: ULQC = upper limit quality control; HQC = wysoka kontrola jakości; MQC = średnia kontrola jakości; LQC = niska kontrola jakości; LLQC = dolna granica kontroli jakości; NTC = brak kontroli szablonu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 8: Dokładność i precyzja testów jakości (copy targets/μL PCR reaction). Skróty: ULQC = upper limit quality control; HQC = wysoka kontrola jakości; MQC = średnia kontrola jakości; LQC = niska kontrola jakości; LLQC = dolna granica kontroli jakości; NTC = brak kontroli szablonu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 9: Dokładność i precyzja między testami QC (copy targets/μL reakcji PCR). Skróty: ULQC = upper limit quality control; HQC = wysoka kontrola jakości; MQC = średnia kontrola jakości; LQC = niska kontrola jakości; LLQC = dolna granica kontroli jakości; NTC = brak kontroli szablonu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 10: Całkowita liczba kropel w próbkach łez. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 11: Statystyki międzydołkowe próbki łez (cele kopiowania/μL reakcji PCR). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 12: Dokładność i precyzja próbek do łez (cele kopiowania/μL reakcji PCR). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 13: Dokładność i precyzja między testami próbek łez (cele kopiowania/μL reakcji PCR). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca S1: Sekwencje starterów, sond i kontroli jakości syntetycznego dwuniciowego DNA wykorzystane w tym badaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Istnieje kilka etapów protokołu ddPCR, które mają kluczowe znaczenie dla prawidłowego wykonania testu. Pierwszym krytycznym krokiem jest zaprojektowanie i optymalizacja podkładów i sondy. Ogólnie rzecz biorąc, zaleca się stosowanie chemii opartej na sondzie hydrolizy zamiast chemii opartej na barwniku (np. SYBR Green) w warunkach przedklinicznych lub klinicznych ze względu na ich lepszą specyficzność. Ponadto wybór celu wzmocnienia ma kluczowe znaczenie. Zazwyczaj celem jest transgen będący przedmiotem zainteresowania wektora. Jednak we wcześniejszych stadiach przedklinicznych lub w wektorach, w których może nie być możliwe odróżnienie transgenu wektora od genomowego DNA, właściwe może być zastosowanie standardowych celów wektorowych. Na przykład, można celować w odwrócony region powtórzeń końcowych, promotor, ogon poli-A lub połączenia międzysegmentowe między tymi składnikami wektorowymi. Wybór celu będzie się różnić w zależności od projektu wektorowego. Tradycyjne strategie i oprogramowanie do projektowania starterów i sond qPCR są zazwyczaj odpowiednie dla ddPCR. Parametry projektowe, które mają zapewnić stałą temperaturę wyżarzania (na przykład 60°C), powinny być tak dobrane, aby zmniejszyć wymaganą optymalizację. Zaleca się również zaprojektowanie, zamówienie i ocenę co najmniej trzech różnych zestawów dla każdego celu. Następnie należy wybrać zestaw, który wykazuje największą swoistość (brak amplifikacji w studzience kontroli ujemnej lub w matrycy pokrewnego docelowego DNA) i czułość (tj. granicę wykrywalności)20.

Jeśli korzystna jest możliwość przejścia testu między qPCR a ddPCR, zaleca się najpierw optymalizację warunków testu za pomocą qPCR i zidentyfikowanie warunków dla wybranego zestawu, które skutkują wydajnością amplifikacji 90%-110% przy R2 ≥ 0,98. Jednak ddPCR jako metoda końcowa jest zwykle mniej czuła niż qPCR ze względu na różnice w wydajności amplifikacji. Jako minimum zaleca się przeprowadzenie termicznego gradientu temperatury na etapie wyżarzania/wydłużania w celu pokrycia temperatur powyżej i poniżej oczekiwanych temperatur wyżarzania oraz oceny separacji amplitudy deszczu i fluorescencji między ujemnymi i dodatnimi klastrami kropel w funkcji temperatury. Jeśli pozwala na to przestrzeń robocza, zaleca się posiadanie indywidualnych dedykowanych stanowisk roboczych do przygotowania miksu głównego, dodawania szablonów i wzmacniania. Tam, gdzie to możliwe, powinny one być fizycznie segregowane przez jednokierunkowy przepływ pracy z wbudowanymi kontrolami inżynieryjnymi, takimi jak kontrolowany dostęp i różnica ciśnień powietrza, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego i wyników fałszywie dodatnich. Jeśli nie jest to możliwe, należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.

W tym protokole są dwa kroki, które mogą wydawać się niezwykłe dla tych, którzy są bardziej przyzwyczajeni do opracowywania testów qPCR. Pierwszym z nich jest włączenie enzymu restrykcyjnego do głównej mieszanki PCR. Podczas amplifikacji ddPCR każda kropla jest poddawana termocyklowi do punktu końcowego. W prawidłowo zoptymalizowanym teście daje to dwie populacje kropel, z których jedna wykazuje niezmiennie wysoki poziom sygnałów fluorescencyjnych - sygnałów dodatnich - a druga konsekwentnie wyświetla niski poziom sygnału fluorescencyjnego - negatywów. Jeśli dojdzie do interferencji PCR, może to spowodować desynchronizację inicjacji amplifikacji PCR, co spowoduje, że kropla nie osiągnie plateau amplifikacji, a tym samym niespójne fluorescencyjne punkty końcowe. W takim przypadku kropelki zostaną rozprowadzone między negatywami i pozytywami, co spowoduje zjawisko zwane deszczem ddPCR. Może to prowadzić do niedokładnej kwantyfikacji celu oraz niespójnych i subiektywnie stosowanych progów. Zalecamy ustawienie progu nieco powyżej sygnału NTC, co powinno zminimalizować wpływ deszczu w końcowej kwantyfikacji, ponieważ wszystkie kropelki są nadal uważane za dodatnie, nawet jeśli nie są w pełni cyklicznie przekazywane do punktu końcowego. AAV mają bardzo złożoną strukturę drugorzędową, która, w zależności od celu amplifikacji, może ograniczać dostęp do starterów i sond, powodując zakłócenia PCR, a tym samym deszcz. Włączenie enzymu restrykcyjnego do mieszanki wzorcowej rozszczepia tę drugorzędową strukturę, aby zwiększyć dostęp starterów i sond, zmniejszając opady deszczu, co może w ten sposób poprawić dokładność testu. Skutki włączenia enzymu restrykcyjnego do reakcji ddPCR zostały opisane wcześniej25,32. Można użyć dowolnego enzymu restrykcyjnego, o ile potwierdzono, że nie przecina się w docelowym obszarze amplifikacji. Nie są wymagane żadne etapy wstępnego trawienia ani alternatywne kompozycje buforowe.

Drugim nietypowym etapem jest przygotowanie próbki łez zawierającej AAV. W tym protokole wykorzystano stosunek łez 1:10 (lub większy), a następnie próbkę podgrzano. Zazwyczaj, gdy łzy są zbierane za pomocą rurki kapilarnej, która jest szeroko stosowaną metodą pobierania, średnio można zebrać około 10,0 μl33. Rozcieńczenie pomaga rozwiązać problem ograniczonej objętości próbki i zapewnić wystarczającą ilość materiału do powtórnego testowania odwiertu. Chociaż zmniejsza to teoretyczną granicę wykrywalności, solidna czułość ddPCR powinna nadal skutkować wykryciem wszystkich, z wyjątkiem bardzo małej liczby cząstek wektorowych. Takie podejście dodatkowo tworzy studnię "zapasową" na wypadek, gdyby jeden z nich nieoczekiwanie uległ awarii. W takim przypadku lub w przypadku niewystarczającej objętości próbki do uruchomienia dwóch odwiertów, błąd Poissona może być wykorzystany do oceny precyzji. Ponadto w przypadkach, gdy stężenie jest poniżej granicy wykrywalności, stwarza to możliwość połączenia danych z odwiertu w celu określenia stężenia. Konieczne jest uwolnienie wektorów AAV od kapsydów wirusa w celu wykrycia ddPCR. Niektóre metody oznaczania ilościowego AAV obejmowały etap trawienia proteinazy K w celu usunięcia kapsyduwirusa 34,35,36. Wszystkie naturalnie występujące serotypy AAV mają temperaturę topnienia równą lub niższą niż około 90 °C, przy czym większość z nich spada poniżej 80 °C; W związku z tym wydaje się, że jest to zbędne włączenie37. Samo ogrzewanie wydaje się być wystarczające do uwolnienia DNA wektora.

Ponadto ddPCR jest na ogół mniej podatny na inhibitory PCR, które mogą być obecne w próbce, co może mieć wpływ na test qPCR. Jeśli uwzględniony jest konkretny etap izolacji DNA, wymagałoby to również specyficznej walidacji, której unika się w tym protokole. Próbki rozcieńcza się przed podgrzaniem ze względu na kinetykę dyfuzji genomów wektorów w cieczy. Podczas procesu ogrzewania i późniejszego chłodzenia dodatnie i ujemne nici zmysłowe jednoniciowego genomu DNA mogą wyżarzać się razem, tworząc dwuniciowy produkt pośredni, jeśli stężenia są wystarczająco wysokie. Rozcieńczenie przed ogrzewaniem zmniejsza stężenia i sprawia, że jest matematycznie mało prawdopodobne, aby wytworzyła się wystarczająca ilość dwuniciowych produktów pośrednich, aby mieć niekorzystny wpływ na dokładność oznaczania ilościowego. Należy zauważyć, że syntetyczne fragmenty DNA lub zlinearyzowane plazmidy stosowane do kontroli jakości nie mogą być poddawane temu etapowi podgrzewania. Ponieważ są one dwuniciowe, ogrzewanie spowodowałoby konwersję na półprodukty jednoniciowe. Oczekuje się, że po niezależnym podziale tych jednoniciowych QC na kropelki, spowoduje to dwukrotny wzrost stężenia QC w stosunku do stężenia nominalnego. Alternatywnie, jeśli QC mają być podgrzewane w celu standaryzacji metody, musi to być uwzględnione przy rekonstytucji i przypisaniu stężenia nominalnego.

Wreszcie, jeśli chodzi o przygotowanie próbki, wiele protokołów zaleca również włączenie etapu leczenia DNazą w celu usunięcia niekapsułkowanego DNA wektora. Etap ten ma kluczowe znaczenie w przypadkach, gdy nie jest pożądane ilościowe oznaczanie wolnego DNA związanego z preparatem wektora (np. podczas oznaczania ilościowego w celu dawkowania). Jednak w kontekście badań nad biodystrybucją i biolinieniem zazwyczaj chce się wiedzieć, dokąd przemieścił się jakikolwiek wektor DNA, niezależnie od tego, czy jest on zamknięty, czy nie. Dlatego sugeruje się, aby zazwyczaj nie wykonywać etapu leczenia DNazy podczas takich badań. Jeżeli zostanie stwierdzone, że konieczne jest uwzględnienie etapu DNazy, etap ten powinien poprzedzać rozcieńczanie i ogrzewanie.

W artykule przedstawiono dane reprezentatywne dla podejścia do oceny zakresu dynamiki, czułości, dokładności i precyzji metody w kontekście walidacji zgodnej z dobrą praktyką laboratoryjną. Obecny brak wytycznych w tym zakresie sprawia, że laboratoria walidacyjne muszą samodzielnie określić kryteria oznaczania docelowego, zgodnie z obecnym myśleniem branży. Różne grupy postawiły zarówno wyższe, jak i niższe kryteria docelowe niż zastosowane w tym badaniu 19,20,21,22,23,24,25. Docelowe kryteria testu, do czasu ich bardziej rygorystycznego określenia, powinny być wybierane przed walidacją w oparciu o zamierzone zastosowania kliniczne metody. W zależności od dalszych decyzji, które należy podjąć na podstawie danych, może być wymagany wyższy poziom dokładności i precyzji. I odwrotnie, prosty wynik pozytywny i negatywny może być wystarczający.

W ramach podejścia skupiono się również na zaleceniach dotyczących oceny swoistości i efektu matrycy. Pula łez pobranych od osób nieleczonych nie dała pozytywnego wyniku w tym teście, podczas gdy cel można było wykryć, gdy wektor został wstrzyknięty do łez w wysokim i niskim stężeniu w zalecanych wskaźnikach odzyskiwania. Idealnie byłoby, gdyby matryca zawierająca wektor endogenny (np. pobrana po leczeniu wektorem wirusowym) była również uwzględniona w tych ocenach. Jest jednak mało prawdopodobne, aby takie próbki były dostępne do wykorzystania w walidacji. Aby zwiększyć wiarygodność walidacji, można ocenić wiele pul łez lub łez pobranych od różnych osób w celu określenia, czy występuje efekt matrycy specyficzny dla pacjenta. Na koniec zaleca się ocenę stabilności. W przepływach pracy, w których ekstrakcja DNA odbywa się poza matrycą biologiczną, może być konieczna ocena stabilności zarówno próbki, jak i wyekstrahowanego DNA. W tym procesie pracy próbka jest testowana bezpośrednio w teście bez konieczności ekstrakcji DNA. W związku z tym, biorąc pod uwagę ocenę stabilności dla tej metody, należy ocenić stabilność próbek łez. Zazwyczaj zaleca się ocenę stabilności na stole, w lodówce, zamrażanie/rozmrażanie i długoterminową stabilność. Nie zostały one przeprowadzone w ramach tego badania, ale opracowane tutaj metody mogą być wykorzystane w tej ocenie, po manipulacjach próbkami wejściowymi.

Ogólnie rzecz biorąc, wykazano, że metoda ta jest solidnym, powtarzalnym i walidowalnym testem do wykrywania wektorów opartych na AAV w próbkach łez. Może służyć jako platforma do dostosowania do określonych wektorów w celu wsparcia badań klinicznych i stanowi podstawę do walidacji testu zgodnego z dobrą praktyką laboratoryjną.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy są pracownikami KCAS Bioanalytical and Biomarker Services, organizacji zajmującej się badaniami na zlecenie, świadczącej kompleksowe usługi rozwojowe zgodne z Dobrymi Praktykami Laboratoryjnymi/Dobrymi Praktykami Klinicznymi, od wsparcia wczesnego odkrywania po rejestrację produktu, w tym wspieranie testów opartych na AAV, zgodnie z opisem w niniejszym protokole. KCAS sfinansował ten projekt i publikację tego protokołu. Chociaż nie ma aktualnych wytycznych FDA dotyczących projektowania i walidacji eksperymentów przedstawionych w tym artykule, eksperci i liderzy opinii opracowujący takie badania w KCAS przyjęli to podejście jako podejście podstawowe. Dodatkowe kryteria i parametry są omawiane indywidualnie dla każdego projektu i mogą być uwzględniane w zależności od zamierzonego zastosowania.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Nickowi Russellowi i Brandonowi McKethanowi z Bio-Rad za ich pomocne dyskusje podczas rozwoju tej metody.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AAV-eGFP VectorCharles River LaboratoriesRS-AAV2-FLLot AAV2-0720-FL, używany jako wektor dowodu zasady
AutoDG Droplet Digital PCR systemBio-RadQX200Alternatywny system ddPCR może być stosowany zgodnie z wymaganiami producenta s protokół.
AutoDG Olej do sondBio-Rad1864110Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR.
Kontrola bufora ddPCR dla sondBio-Rad1863052Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR i chemią PCR.
ddPCR Droplet Reader OilBio-Rad1863004Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR.
Uszczelki z folii przebijającej ddPCRBio-Rad1814040Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR.
ddPCR Płytki 96-dołkowe, półlistkoweBio-Rad12001925Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR.
ddPCR Supermix do sond (bez dUTP)Bio-Rad1863023, 1863024 lub 1863025Użyj mieszanki głównej kompatybilnej ze starterami/sondami i systemem ddPCR.
DG32 AutoDG CartidgesBio-Rad1864108Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR.
Czytnik kropelkowyBio-RadQX200Alternatywny system ddPCR może być stosowany zgodnie z zaleceniami producenta s protokół.
GeneAmp PCRBuffer Applied BiosystemsN8080129Nie dotyczy
Dwuskładnikowysystem wodny bez nukleazAM9906N/A
PCR Plate SealerBio-RadPX1Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR.
Końcówki do pipet do AutoDGBio-Rad1864120Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR.
Pluronic F-68 Niejonowy środek powierzchniowo czynnyGibco24040N/A
Sondy podkładowe i hydrolizyRóżneróżneKonstrukcja oparta na sekwencji docelowej przy użyciu ogólnych podejść do projektowania startera / sondy. Wybierz fluorofory i wygaszacze kompatybilne z systemem ddPCR.
Enzym restrykcyjnyRóżneRóżnisię w zależności od docelowej sekwencji amplifikacji. Użyj enzymu restrykcyjnego, który nie tnie w amplifikowanej sekwencji
Ścięte DNA nasienia łososiaThermoFisherAM9680N/A
Syntetyczny fragment genu DNA lub zlinearyzowany plazmidRóżneRóżneProjektuj syntetyczny fragment DNA zawierający docelowy region amplifikacji do użycia jako kontrola jakości
Bufor TETeknovaT0224Upewnij się, że przygotowane lub zakupione są wolne od nukleaz. 10 mM Tris-HCl, 1,0 mM EDTA, pH = 8,0
Dotykowy termocyklerBio-RadC1000Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR.

Bibliografia

  1. Sherkow, J. S., Zettler, P. J., Greeley, H. T. Is it 'gene therapy. Journal of Law and the Biosciences. 5 (3), 786-793 (2018).
  2. Ginn, S. L., Amaya, A. K., Alexander, I. E., Edelstein, M., Abedi, M. R. Gene therapy clinical trials worldwide to 2017: an update. The Journal of Gene Medicine. 20 (5), 3015(2018).
  3. Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. Viral vector systems for gene therapy: a comprehensive literature review of progress and biosafety challenges. Applied Biosafety. 25 (1), 7-18 (2020).
  4. Gene, Cell, & RNA therapy landscape, Q4 2022 quarterly data report. American Society for Gene & Cell Therapy. , Available from: https://asgct.org/global/documents/asgct_citeline-q4-2022-report_final.aspx (2022).
  5. Approved Cellular and Gene Therapy Products. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products (2022).
  6. Au, H. K. E., Isalan, M., Meilcarek, M. Gene therapy advances: a meta-analysis of AAV usage in clinical settings. Frontiers in Medicine. 8, 809118(2022).
  7. Lundstrom, K. Viral vectors in gene therapy. Diseases. 6 (2), 42(2018).
  8. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31, 317-334 (2017).
  9. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomized, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
  10. Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drugs (INDs). United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/chemistry-manufacturing-and-control-cmc-information-human-gene-therapy-investigationsal-new-drug (2020).
  11. Long term follow-up after administration of human gene therapy products. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/long-term-follow-after-adminstration-human-gene-therapy-products (2020).
  12. Testing of retroviral vector-based human gene therapy products for replication competent retrovirus during product manufacture and patient follow-up. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/testing-retroviral-vector-based-human-gene-therapy-products-replication-competent-retrovirus-during (2020).
  13. Recommendations for microbial vectors used in gene therapy. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/recommendations-microbial-vectors-used-gene-therapy (2016).
  14. Multidisciplinary: gene therapy. European Medicines Agency. , Available from: https://www.europa.eu/en/human-regulatory-development/scientific-guidelines/multidisciplinary/multidisciplinary-gene-therapy (2023).
  15. Human gene therapy for retinal disorders. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/human-gene-therapy-retinal-disorders (2020).
  16. Design and analysis of shedding studies for virus or bacterial-based gene therapy and oncolytic products. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/design-and-analysis-shedding-studies-virus-or-bacteria-based-gene-therapy-and-oncolytic-products (2015).
  17. Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products. European Medicines Agency. , Available from: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-quality-non-clinical-clinical-aspects-gene-therapy-medicinal-products_en.pdf (2018).
  18. Kaur, S. white paper on recent issues in bioanalysis: mass spec of proteins, extracellular vesicles, CRISPR, chiral assays, oligos; nanomedicines bioanalysis; ICH M10 section 7.1; non-liquid & rare matrices; regulatory inputs (part 1A - recommendations on endogenous compounds, small molecules, complex methods, regulated mass spec of large molecules, small molecule, PoC & part 1B - regulatory agencies' inputs on bioanalysis, biomarkers, immunogenicity, gene & cell therapy and vaccine). Bioanalysis. 14 (9), 505-580 (2022).
  19. Hays, A., Islam, R., Matys, K., Williams, D. Best practices in qPCR and qPCR validation in regulated bio analytical laboratories. The AAPS Journal. 24 (2), 36(2022).
  20. Ma, H., Bell, K. N., Loker, R. N. qPCR and qRT-PCR analysis: Regulatory points to consider when conducting biodistribution and vector shedding studies. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 17 (20), 152-168 (2020).
  21. Wissel, M. Recommendations on qPCR/ddPCR assay validation by GCC. Bioanalysis. 14 (12), 853-863 (2022).
  22. Expectations for biodistribution (BD) assessments for gene therapy (GT) products. International Pharmaceutical Regulators Programme. , Available from: https://admin.iprp.global/sites/default/files/2018-09/IPRP_GTWG_ReflectionPaper_BD_Final_2018_0713.pdf (2018).
  23. Pinheiro, L., Emslie, K. R. Basic concepts and validation of digital PCR measurements. Methods in Molecular Biology. 1768, 11-24 (2018).
  24. Tzonev, S. Fundamentals of counting statistics in digital PCR: I measured two target copies-what does it mean. Methods in Molecular Biology. 1768, 25-43 (2018).
  25. Prantner, A., Marr, D. Genome concentration, characterization, and integrity analysis of recombinant adeno-associated viral vectors using droplet digital PCR. PLoS One. 18, 0280242(2023).
  26. Primer-BLAST. National Library of Medicine, National Center for Biotechnology Information. , Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/tools/primer-blast/ (2023).
  27. Koressaar, T., Remm, M. Enhancements and modifications of primer design program Primer 3. Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).
  28. Ye, J. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134(2012).
  29. Droplet Digital PCR Application Guide. Bio-Rad. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/we/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf (2023).
  30. Qian, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: A technology review. Sensors. 18 (4), 1271(2018).
  31. Basu, A. Digital assays part I: portioning statistics and digital PCR. SLAS Technology. 22 (4), 369-386 (2017).
  32. Sanmiguel, J., Gao, G., Vandeberghe, L. H. Quantitative and digital droplet-based AAV genome titration. Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).
  33. Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: from sampling to preanalytical processing. Scientific Reports. 11, 10064(2021).
  34. Martinez-Fernandez de la Camara, C., McClements, M. E., MacLaren, R. E. Accurate quantification of AAV vector genomes by quantitative PCR. Genes. 12 (4), 601(2021).
  35. Ai, J., Ibraheim, R., Tai, P. W. L., Gao, G. A scalable and accurate method for quantifying vector genomes of recombinant adeno-associated viruses in crude lysate. Human Gene TherapyMethods. 28 (3), 139-147 (2017).
  36. Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Frontiers in Microbiology. 10, 1570(2019).
  37. Bennett, A., et al. Thermal stability as a determinant of AAV serotype identity. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 6, 171-182 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Cyfrowy PCR kropelkowypróbki łezwalidacja testu molekularnegodetekcja wektorów wirusowychkliniczne wydalanie biologiczneinhibicja PCRprecyzja testudokładność testu
Walidowalny cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej do wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w badaniach bioliowania łez
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.