Mysi kręg lędźwiowy Jednoosiowe badanie ściskania z osadzeniem powierzchni ładunkowej

Podsumowanie

W tym protokole opisane są dwa podejścia, które ułatwiają jednoosiowe testowanie kompresji kręgów lędźwiowych myszy. W pierwszej kolejności opisano konwersję giętarki trzypunktowej na maszynę do prób ściskania. Po drugie, metoda osadzania w celu przygotowania powierzchni ładunkowej, która wykorzystuje cement kostny, jest dostosowana do kręgów lędźwiowych myszy.

Streszczenie

Wzrasta świadomość, że kość korowa i gąbczasta różnią się pod względem regulacji i reagowania na terapie farmaceutyczne, terapie hormonalne i inne metody leczenia utraty masy kostnej związanej z wiekiem. Zginanie trzypunktowe jest powszechną metodą stosowaną do oceny wpływu leczenia na obszar środkowej części trzonu kości długich, który jest bogaty w kość korową. Jednoosiowe testy kompresji kręgów myszy, choć zdolne do oceny kości bogatych w kość gąbczastą, są rzadziej wykonywane ze względu na wyzwania techniczne. Jeszcze rzadziej wykonuje się połączenie trzypunktowych testów zginania i ściskania w celu określenia, w jaki sposób leczenie może wpływać na obszar środkowej kości długiej i centrum kręgu w podobny lub różny sposób. W tym miejscu opisujemy dwie procedury, dzięki którym próba kompresji kręgów lędźwiowych myszy jest mniej trudna do wykonania równolegle z zginaniem trzypunktowym: po pierwsze, procedura przekształcania trzypunktowej maszyny do gięcia w maszynę do prób ściskania, a po drugie, metoda osadzania w celu przygotowania powierzchni obciążenia kręgów lędźwiowych myszy.

Wprowadzenie

Zmiany kostne związane z wiekiem są powszechnie uznawane za problematyczne ze względu na zwiększone ryzyko złamań kości związanych z tymi zmianami. Złamania kości u ludzi mogą prowadzić do przewlekłego bólu, ograniczonej mobilności, długotrwałej niepełnosprawności, zwiększonego ryzyka śmierci i obciążeń ekonomicznych¹. Typowe terapie badane w celu złagodzenia objawów zmian kostnych związanych z wiekiem obejmują suplementy diety, terapie hormonalne i leki^{2,3,4,5,6,7,8,9}. Wstępne badania nad takimi terapiami u ludzi są zwykle wykonywane przy użyciu małych modeli zwierzęcych (np. szczurów laboratoryjnych i myszy), które posiadają dwa główne typy kości znalezione w ludzkim szkielecie¹⁰. Kości długie wyrostka robaczkowego, takie jak kość ramienna, kość udowa i piszczelowa, są bogate w kość korową (tj. zwartą), podczas gdy kręgi są bogate w kość gąbczastą (tj. kość tkaną, gąbczastą lub beleczkową)⁴. Coraz częściej wiadomo, że mechanizmy regulacji kości i szlaki sygnałowe różnią się między kością korową (np. kość długa środkowa trzonu) a kością gąbczastą (np. centrum kręgu)². Z tego powodu terapie mogą mieć zróżnicowane efekty, które są specyficzne dla kości lub nawet dla danego miejsca w obrębie tej samej klasy bone2^,3,4.

Przyłożenie siły do obiektu (np. kości) powoduje przyspieszenie, deformację lub jedno i drugie, w zależności od warunków brzegowych obiektu. Kiedy kość jest związana, przeciwna siła o równej wielkości opiera się przyspieszeniu kości i dochodzi do deformacji. Gdy kość ulega deformacji, generowany jest opór wewnętrzny zwany naprężeniem, którego istnieją dwa podstawowe typy: siła normalna, w postaci rozciągania lub ściskania, oraz siła ścinająca¹⁰. Często generowana jest kombinacja podstawowych typów naprężeń, w zależności od przyłożonego układu siły¹⁰. Siłą materiału jest jego zdolność do wytrzymywania naprężeń bez awarii. Gdy na materiał przykładane są coraz większe siły, w końcu ulega on trwałemu odkształceniu, w którym to momencie mówi się, że przeszedł ze stanu sprężystego (tj. powróci do swojego pierwotnego kształtu, jeśli siła zostanie usunięta) do stanu plastycznego (tj. nie powróci do swojego pierwotnego kształtu, jeśli siła zostanie usunięta)¹¹. Punkt, w którym następuje przejście ze stanu sprężystego do stanu plastycznego, nazywany jest punktem plastyczności. Ponieważ po przekroczeniu granicy plastyczności na materiał wywierane są jeszcze większe siły, coraz częściej ulega on mikropęknięciom (tj. uszkodzeniom), aż do całkowitego pęknięcia; W tym momencie mówi się, że materiał nie powiódł się^11,12. Złamanie kości oznacza awarię zarówno na poziomie strukturalnym, jak i tkankowym¹⁰. Na przykład złamanie kości kręgowej ma miejsce, ponieważ nie tylko wiele beleczek zawodzi na poziomie strukturalnym, ale także dochodzi do uszkodzenia elementów macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak kryształy kolagenu i hydroksyapatytu w pojedynczej beleczce na poziomie tkanki.

Zdarzenia mechaniczne prowadzące do uszkodzenia materiału mogą być mierzone za pomocą różnych metod testowania. Zginanie trzypunktowe jest powszechną metodą badania właściwości mechanicznych kości długich ze szkieletu wyrostka robaczkowego. Ta metoda jest prosta i powtarzalna, co czyni ją preferowaną metodą badań biomechanicznych dla wielu badaczy¹³. Opuszczając belkę poprzeczną na środkowy trzon długiej kości spoczywającej na dwóch dolnych belkach nośnych, metoda ta w szczególności testuje właściwości mechaniczne obszaru środkowego trzonu, który jest gęsto zorganizowaną kością korową. Na podstawie krzywych obciążenia-przemieszczenia można określić między innymi wpływ siły rozciągającej na elastyczność, wytrzymałość, siłę do uszkodzenia oraz przejście od zachowania sprężystego do plastycznego materiałów kostnych.

W drugim typie kości, określanym jako beleczkowa, gąbczasta, tkana lub gąbczasta, elementy kostne są formowane w szereg prętów i belek zwanych beleczkami, nadając im "gąbczasty" wygląd. Główne trzony kręgów (tj. centra) są bogate w kość gąbczastą i często są miejscami związanych z wiekiem złamań kości uciskowych u ludzi¹⁴. Kręgi lędźwiowe (tj. dolna część pleców) są największymi kręgami, przenoszą większość ciężaru ciała i są najczęstszym miejscem złamań kręgów^15,16. Właściwości mechaniczne trzonów kręgów można najlepiej ocenić bezpośrednio za pomocą jednoosiowych metod testowania ściskania, ponieważ kompresja osiowa jest normalnym obciążeniem siły wywieranym na kolumny kręgowe in vivo¹⁷. Kompresja trzonów kręgów in vivo występuje w wyniku skurczów mięśni i więzadeł, siły grawitacji i sił reakcji gruntu¹⁸.

Testy kompresji ex vivo kręgów małych zwierząt mogą być trudne ze względu na ich mały rozmiar, nieregularny kształt i kruchość. Kształt trzonów kręgów można oszacować jako równoległobok z łagodnym nachyleniem brzusznym i lekką wklęsłością czaszki¹⁷. Taki kształt stanowi wyzwanie dla przeprowadzenia jednoosiowego testu ściskania ex vivo, ponieważ bez odpowiedniego przygotowania powierzchni ładunkowej siły ściskające zostaną przyłożone tylko do części powierzchni ładunkowej, co spowoduje "kontakt lokalny"^17,19. Może to spowodować niespójne wyniki i przedwczesne niepowodzenie¹⁹. Nie ma to miejsca in vivo, ponieważ powierzchnia ładunkowa jest otoczona krążkami międzykręgowymi w stawach kręgowych, co umożliwia rozłożenie obciążenia na całej płycie końcowej czaszki. Kompleks międzykręgowo-czaszkowo-czaszkowo-płytkowy odgrywa ważną rolę w wywieraniu siły w całym trzonie kręgu i biomechanice złamania trzonu kręgu^14,20. Chociaż testy kompresji nie są nowością w dziedzinie biologii, istnieją ograniczenia w obecnych metodach mechanicznego testowania kości. Ograniczenia te obejmują brak modeli predykcyjnych i symulacji dla mechaniki kości, unikalną geometryczną architekturę przestrzenną, a nawet nieodłączne zmienności biologiczne oparte na próbkach²¹. Co ważniejsze, wyzwaniem dla tej dziedziny jest brak standaryzacji między metodami i ogólny brak metod raportowanych w literaturze²².

W literaturze opisano dwie metody przygotowania kręgów lędźwiowych gryzoni do jednoosiowego testu kompresji: metoda cięcia i metoda osadzania^{17,19,23,24,25,26}. Metoda cięcia wymaga, aby wyrostki kręgowe, płytka końcowa czaszki i płytka końcowa ogonowa zostały wycięte z trzonu kręgu. Pendleton et al.¹⁹ wcześniej opisali szczegółową metodę użycia tej metody na kręgach lędźwiowych myszy. Metoda ta wiąże się z wyzwaniami związanymi z uzyskaniem idealnie równoległych cięć zarówno na płytkach końcowych ogonowych, jak i czaszkowych, przy jednoczesnym uniknięciu uszkodzenia próbki. Ma również ograniczenie polegające na tym, że płytka końcowa czaszki jest usuwana. Płytka końcowa czaszki zawiera gęstą powłokę kości korowej i odgrywa ważną rolę w rozkładzie obciążeń z krążków międzykręgowych in vivo i bierze udział w uszkodzeniu kości w przypadku złamań in vivo^17,20,27. Natomiast metoda osadzania polega na usunięciu wyrostków kręgowych przy jednoczesnym zachowaniu nienaruszonej płytki końcowej czaszki trzonu kręgu. Powierzchnia ładunkowa jest następnie ustawiana w przybliżeniu poziomo poprzez umieszczenie niewielkiej ilości cementu kostnego na czaszkowym końcu trzonu kręgu. Metoda ta ma tę zaletę, że pokonuje wyzwania techniczne związane z metodą cięcia i może lepiej naśladować mechanizm przykładania obciążenia i uszkodzenia kości in vivo ze względu na zachowanie płytki końcowej czaszki. Podejście to zostało wcześniej udokumentowane w badaniach obejmujących jednoosiowe testy kompresji na kościach szczurów. Jednak, o ile nam wiadomo, nie zostało to wcześniej udokumentowane w kontekście mniejszych kręgów lędźwiowych myszy^17,25,26. Metoda, o której mowa, została wcześniej szczegółowo opisana przez Chachra et al.²⁵ i pierwotnie wykorzystywała próbkę kości przechowywaną pomiędzy dwiema płytkami, z których każda miała cylindryczną wnękę, która została następnie wypełniona polimetakrylanem metylu (PMMA). Ta sama grupa badawcza udoskonaliła później metodę, w której jeden koniec jest delikatnie szlifowany (ogonowy), a drugi koniec ma małą plamkę cementu kostnego (czaszka)²⁶. Ta metoda jest ulepszeniem w stosunku do poprzedniej metody, ponieważ minimalizuje materiał między płytami i jest przedmiotem tego artykułu. Pomimo wyzwań związanych z jednoosiową próbą kompresji kręgów, jest to metoda, która może dostarczyć cennych informacji na temat wpływu proponowanej terapii na kość, zwłaszcza w połączeniu z trzypunktowym zginaniem.

Tutaj przedstawiono użycie konwertowalnego trzypunktowego urządzenia do testowania zginania/ściskania, które pozwala na łatwe testowanie zarówno kości długich, jak i trzonów kręgów za pomocą jednej maszyny. Ponadto przedstawiono zastosowanie metody osadzania w celu uzyskania jednoosiowego badania kompresji kręgów lędźwiowych myszy. Niniejsze badanie zostało przeprowadzone w ramach większego badania, którego celem było zbadanie wpływu suplementacji konopi w diecie na właściwości kości szkieletowej u młodych, rosnących samic myszy C57BL/6^5,6. Tester zginania trzypunktowego został pierwotnie skonstruowany przez wykładowców i studentów z Wydziału Inżynierii Uniwersytetu Stanowego Kolorado-Pueblo i używany przez naszą grupę badawczą w testach zginania trzypunktowego na kościach długich [kość udowa i piszczelowa szczura⁷ oraz kość ramienna, kość udowa i piszczelowa myszy^5,6,8,9]. Jednak jego modyfikacja i zastosowanie do stosowania w testach ucisku trzonu kręgów u myszy nie zostały zbadane. Konstrukcja i budowa giętarki trzypunktowej zostały już wcześniej opisane⁷. Raport ten skupi się na metodach stosowanych do modyfikacji maszyny do testów ściskania i korygowania przemieszczenia systemu. Po drugie, opisano metodę osadzania w celu przygotowania powierzchni obciążenia trzonu kręgu myszy, wraz z metodami badania jednoosiowego ściskania i analizą danych dotyczących obciążenia i przemieszczenia.

Protokół

Wszystkie eksperymenty i protokoły zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych od National Institutes of Health i otrzymały zgodę od Międzynarodowego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Kolorado-Pueblo (Numer protokołu: 000-000A-021). Szczegółowe procedury dotyczące opieki nad zwierzętami zostały wcześniej opisane^5,6. Myszy uzyskano w wieku trzech tygodni w ramach szerszego badania mającego na celu zbadanie wpływu diety uzupełnionej nasionami konopi na młode, rosnące samice myszy C57BL/6 (patrz tabela materiałów). W wieku od 5 do 29 tygodni myszy były hodowane na jednej z trzech diet: kontrolnej (0% nasion konopnych), 50 g/kg (5%) nasion konopi lub 150 g/kg (15%) nasion konopi, z ośmioma myszami w grupie^5,6. Przez cały czas trwania badania myszy miały dostęp ad libitum do odpowiedniej diety i wody, były trzymane w parach w klatkach z poliwęglanu i utrzymywane w cyklu 12 godzin światła: 12 godzin ciemności (z włączonym światłem od 06:00 do 18:00). Waga i zdrowie myszy były oceniane co tydzień, a wszystkie myszy pomyślnie ukończyły badanie bez wystąpienia żadnych niekorzystnych warunków zdrowotnych. W wieku dwudziestu dziewięciu tygodni myszy zostały głęboko znieczulone za pomocą izofluranu i poddane eutanazji poprzez zwichnięcie szyjki macicy^5,6. Wykonano nacięcie w linii środkowej na powierzchni brzusznej od mostka do ogona, a z tusz usunięto wszystkie narządy wewnątrzpiersiowe, otrzewnowe i zaotrzewnowe. Wypatroszone tusze konserwowano w 0,9% roztworze chlorku sodu w temperaturze -70 °C do czasu wycięcia kości w celu przeprowadzenia badania kręgów, które nastąpiło około rok później.

1. Konwersja giętarki trzypunktowej na maszynę do prób ściskania

1. Odkręć belkę poprzeczną przymocowaną do czujnika obciążenia w giętarce trzypunktowej⁷ (patrz Tabela materiałów) (Rysunek 1A,B).
2. Przykręć samonastawną górną płytę dociskową do czujnika obciążenia (patrz tabela materiałów) z gwintem identycznym jak belka poprzeczna (Rysunek 1C).
3. Wywierć dwa poziome otwory w każdym z dolnych wsporników, do których dolna płyta zostanie później przymocowana (Rysunek 1D).
4. Wbij gwinty w dwie strony dolnej płyty ze stali nierdzewnej, aby wyrównać z wywierconymi otworami w dolnych wspornikach (Rysunek 1E).
5. Przymocuj dolną płytę dociskową do dwóch dolnych wsporników za pomocą gwintowanych sześciokątnych i dokręć, aż będzie bezpieczna (Rysunek 1F).
   UWAGA: sześciokątne muszą mieć gwinty pasujące do gwintowanych otworów na dolnych wspornikach i górnych/dolnych płytach. Zastosowanie samonastawnej górnej płyty dociskowej może pomóc w uzyskaniu równomiernego kontaktu między górną płytą a powierzchnią ładunkową, ale nie jest wystarczające, biorąc pod uwagę wklęsłość czaszkowego końca trzonów kręgów. Wymagane jest dalsze przygotowanie przy użyciu metody przygotowania powierzchni ładunkowej. Podczas konstruowania maszyny do próbowania ściskania kości małych zwierząt, które są mniejsze i słabsze niż wiele materiałów przemysłowych/inżynieryjnych, należy wziąć pod uwagę nośność czujnika obciążenia i rozmiar ramy ładunkowej. Dodatkowo maszyny powinny być regularnie czyszczone i smarowane, aby zapewnić dokładne wyniki i płynną pracę.

2. Korekta przemieszczenia maszyny do próbowania ściskania

1. Gdy między górną płytą a dolną płytą nie ma badanego materiału, opuść górną płytę na dolną płytę, aż do uzyskania lekkiego kontaktu (siła napięcia wstępnego ~0,3-0,5 N).
2. Włącz maszynę ze stałą prędkością opuszczania (~1 mm/min), aby rozpocząć test kompresji. Zbierz pomiary obciążenia (N) i przemieszczenia (mm) za pomocą oprogramowania do cyfrowego gromadzenia danych (patrz tabela materiałów) w celu gromadzenia danych z badań mechanicznych.
   UWAGA: Ponieważ żaden materiał nie znajduje się między górną a dolną płytą, całe zaobserwowane przemieszczenie będzie spowodowane przemieszczeniem samej maszyny (_maszyny Δx) (rama, ogniwo obciążnikowe, płyty dociskowe, złącza itp.).
3. Kontynuuj opuszczanie górnej płyty na dolną płytę ze stałą (tj. monotoniczną) prędkością, aż zostaną osiągnięte siły wyższe niż te, które zostaną uzyskane ze wszystkich próbek kości.
4. Powtórz kroki od 2.1 do 2.3, w sumie trzy razy.
5. Wykreśl dane dotyczące przemieszczenia systemu (_maszyna Δx, mm) w funkcji przyłożonego obciążenia (siła, N).
6. Dopasuj linię regresji o najlepszym dopasowaniu do danych (Rysunek 2A-D).
7. W arkuszu kalkulacyjnym z danymi z testu ucisku kości użyj równania dostarczonego przez analizę regresji, aby określić wielkość przemieszczenia maszyny (_maszyna Δx) wpływającego na zarejestrowane przemieszczenie (_{Δx całkowite zarejestrowane}) dla punktu danych testu kompresji kręgów lędźwiowych na myszy.
   UWAGA: Na przykład rozważmy punkt danych, w którym przyłożona jest siła 18 N i zarejestrowano przemieszczenie 2,730 mm (_{zarejestrowano łącznie} Δx). Zgodnie z przykładowym równaniem regresji wielomianowej trzeciego rzędu (Rysunek 2D) [Maszyna Δx = (4 × 10-7 x przyłożone obciążenie³) - (8 × ^10-5 x przyłożone obciążenie²) + (0,0044 x przyłożone obciążenie)], 0,056 mm zarejestrowanego przemieszczenia wynika z przemieszczenia maszyny (_maszyna Δx).
   Δx_{całkowita zapisana =} Δx_maszyna + Δx_próbka
8. Korygowanie zarejestrowanego przemieszczenia dla punktu danych.
   UWAGA: Rozważmy na przykład powyższy przykład. Jeśli zarejestrowane jest przemieszczenie 2,730 mm (_{zarejestrowane} całkowite Δx), a przemieszczenie maszyny _(maszyna Δx) stanowi 0,056 mm całości, to przemieszczenie, jakiemu poddano badany wzór (tj. _{kość) (próbka} Δx) wynosi 2,664 mm. Zatem 2,664 mm to rzeczywiste przemieszczenie, jakiemu uległ kręg (_próbka Δx) i jest to wartość, którą należy wykorzystać do analizy krzywej obciążenia-przemieszczenia.
   _{Δx próbka} = Δx_{całkowita zarejestrowana próbka - Δx maszyna}
9. Powtórz kroki 2.7-2.8 dla każdego punktu danych zebranego dla każdej pojedynczej próbki (kości).
   UWAGA: Ten krok jest ważny, ponieważ podczas próby ściskania obserwowane przemieszczenie nie wynika tylko z przemieszczenia próbki, ale zamiast tego obserwowane przemieszczenie jest kombinacją przemieszczenia maszyny (_maszyna Δx) (np. ściskanie/przemieszczenie ramy, ogniwa obciążnikowego, płyt dociskowych, sprzęgieł itp.) i próbki (_próbka Δx). Tak więc w przypadku próbek, które podlegają stosunkowo niewielkim przemieszczeniom, takich jak próbki małego zwierzęcia (np. myszy), przemieszczenie systemu (_maszyna Δx) może powodować duże błędy. Opisane tutaj procedury korygujące przemieszczenie systemu zostały wcześniej opisane przez Kalidindi i Abusafieh²⁸, którzy szczegółowo opisują również dwie inne metody oprócz opisanej tutaj. Zauważono, że niektórzy badacze używają więcej niż jednej metody do określania przemieszczenia systemu¹⁷. Każda maszyna może wyświetlać unikalne wzorce i stopnie przemieszczenia systemu po przyłożeniu do niej obciążeń. Z tego powodu współczynnik korekcji przemieszczenia systemu musi być określony dla każdej maszyny i nie będzie taki sam dla dowolnych dwóch maszyn. W przeciwieństwie do próby ściskania kości kręgowej, podczas pomiaru przemieszczenia systemu nie zaobserwuje się dużego zmniejszenia siły, ponieważ między górną a dolną płytą nie znajduje się żaden materiał.

3. Wycięcie piątego kręgu lędźwiowego (L5) z tuszy myszy

1. Rozmrażaj zamrożoną tuszę myszy w temperaturze pokojowej, dbając o nawodnienie tkanek miękkich i kości, regularnie stosując roztwór izotoniczny 0,9% NaCl.
2. Wykonaj małe (<0,5 cm) nacięcie w skórze na grzbietowej linii środkowej w pobliżu podstawy ogona, a następnie przedłuż nacięcie na każdą tylną kończynę i delikatnie pociągnij, aby usunąć futro od podstawy ogona do głowy zwierzęcia.
3. Odetnij mięśnie ściany brzucha, aż kręgosłup będzie dobrze widoczny.
4. Pod mikroskopem preparacyjnym wyobraź sobie dwa stawy krzyżowo-biodrowe i czaszkowy koniec kości krzyżowej.
5. Za pomocą żyletki lub skalpela wykonaj drobne cięcie, aby oddzielić ostatni kręg lędźwiowy (L6) od czaszkowego końca kości krzyżowej.
6. Ponownie, przecinając przestrzeń międzykręgową, usuń L6 i L5 z kręgosłupa, odkładając L5 do analizy (Rysunek 3).
7. Zbadaj kręg pod mikroskopem preparacyjnym i usuń wszystkie tkanki miękkie z kości, w tym krążek międzykręgowy, używając głównie gazików i, jeśli to konieczne, delikatnie kleszczami.
   UWAGA: W niniejszym badaniu L5 został wybrany jako kręg będący przedmiotem zainteresowania, ale inne kręgi lędźwiowe mogą być wybrane do testów kompresyjnych.

4. Przygotowanie powierzchni nośnej kręgu L5 do jednoosiowego testu ściskania przy użyciu metody zatapiania cementu kostnego PMMA

1. Za pomocą tarczy diamentowej do cięcia (patrz Tabela materiałów) przymocowanej do narzędzia obrotowego, wykonaj nacięcie na każdej szypułce, aby usunąć wyrostek poprzeczny i kolczysty (Rysunek 4). Pozostawione w centrum, wyrostki kręgowe mogą powodować lokalne kontakty z górnymi/dolnymi płytami dociskowymi przy samych procesach, w przeciwieństwie do rozkładu obciążenia w całym środku.
2. Delikatnie przeszlifuj ogonowy koniec kręgu drobnym papierem ściernym o ziarnistości 120 (patrz Tabela materiałów), aby usunąć wszystkie krążki międzykręgowe, tkanki miękkie i nierówności.
3. Oznacz szlifowany koniec ogona trwałym markerem, aby ułatwić późniejszą identyfikację.
4. Wymieszaj cement kostny PMMA zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
5. Gdy cement kostny PMMA jest nadal półmiękki, umieść minimalną ilość na czaszkowym (nieoznaczonym) końcu kręgu skierowanym do góry, upewniając się, że cała powierzchnia jest pokryta, podczas gdy kręg znajduje się w kąpieli solankowej, aby próbka kości była nawilżona i chłodna.
6. Gdy PMMA jest nadal półmiękki, umieść kręg na dolnej płycie ogonowej (zaznaczoną) stroną skierowaną w dół (Rysunek 5).
7. Włącz maszynę, aby włączyć koła zębate napędowe i powoli opuść górną płytę dociskową na kompleks kręg + cement kostny PMMA, aż dojdzie do kontaktu z cementem kostnym i zostanie przyłożona minimalna siła (<0,5 N) w celu równomiernego rozprowadzenia PMMA na powierzchni kości. Górna płyta dociskowa w neutralnej pozycji może być oszacowana jako pozioma, a podczas naciskania na półmiękki PMMA spowoduje, że PMMA wypełni wklęsłość na czaszkowym końcu kręgu i utworzy płaską poziomą powierzchnię pod górną płytą.
8. Z górną płytą delikatnie dociskającą cement kostny PMMA, pozwól próbce siedzieć w spokoju, aż cement kostny PMMA całkowicie stwardnieje (~ 10 minut zgodnie z instrukcjami producenta dla cementu kostnego PMMA używanego w niniejszym badaniu). W tym okresie należy przechowywać próbkę w kąpieli solankowej lub często spryskiwać ją solą fizjologiczną, aby utrzymać próbkę nawodnioną i chłodną.
9. Gdy cement kostny PMMA całkowicie stwardnieje, można rozpocząć testy ściskania. Zbierz dane dotyczące obciążenia (tj. siły) (N) i przemieszczenia (tj. ugięcia) (mm) z czujników do arkusza kalkulacyjnego w czasie rzeczywistym za pomocą cyfrowego oprogramowania przeznaczonego do zbierania danych z badań mechanicznych (patrz Tabela materiałów).
10. Po zebraniu danych wyjściowych przez 5 s, przyłożonych przy minimalnej sile napięcia wstępnego <0,5 N, należy rozpocząć opuszczanie górnej płyty dociskowej na próbkę z pojedynczą (tj. monotoniczną), z góry określoną prędkością opuszczania, aby rozpocząć próbę ściskania (~1 mm/min).
11. Przerwij zbieranie danych, gdy zaobserwujesz duże zmniejszenie obciążenia (N), co wskazuje na awarię materiału.
    UWAGA: Instrukcje producenta określają przybliżony czas utwardzania cementu kostnego PMMA. Czas utwardzania cementu kostnego PMMA może się różnić w zależności od rodzaju użytego cementu kostnego PMMA. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby określić czas oczekiwania na utwardzenie PMMA. Jednak jako wskaźnik, że cement kostny PMMA całkowicie stwardniał, dodatkowa próbka cementu kostnego PMMA może być zmieszana w tym samym czasie, co próbka, która zostanie umieszczona na kręgu, ale odłożona na bok i sprawdzona, czy jest nadal miękka lub całkowicie stwardniała. Jeśli jest całkowicie stwardniały, może to oznaczać, że PMMA na kości jest również całkowicie stwardniały bez naruszania kompleksu kość + PMMA. Próbka kości musi pozostać dobrze nawodniona i chłodna przez cały okres twardnienia PMMA i badań. Już kilka minut ekspozycji na suche powietrze może spowodować zmiany właściwości biomechanicznych. Niektórzy badacze używają maszyn do testowania kompresji wyposażonych w kąpiel solankową¹⁹. Maszyna do prób ściskania nie była wyposażona w kąpiel solną w niniejszym badaniu. Zamiast tego przez cały okres utwardzania PMMA i okres testowania regularnie stosowano delikatną mgiełkę soli fizjologicznej.

5. Analiza krzywych obciążenia-przemieszczenia dla testów jednoosiowego ściskania kręgów L5

1. Skopiuj i wklej dane obciążenia (N) i skorygowanego przemieszczenia (mm) z arkusza kalkulacyjnego do oprogramowania do tworzenia wykresów technicznych i analizy danych (patrz tabela materiałów).
2. Wygeneruj wykres z obciążeniem (N) na osi y i skorygowanym przemieszczeniem próbki (_próbka Δx, mm) na osi x (Rysunek 6). Zrób to w oprogramowaniu, klikając najpierw Windows, Nowa tabela, a następnie Zrób to, aby utworzyć tabelę. Skopiuj skorygowane dane o przemieszczeniu (mm) i obciążeniu (N) z arkusza kalkulacyjnego danych pierwotnych do nowej tabeli.
3. Następnie wygeneruj przebieg reprezentujący surowe dane, klikając Dane, a następnie kliknij XY Pair to Waveform i wybierz skorygowane dane przemieszczenia dla X-Wave i załaduj dane dla Y-Wave. Upewnij się, że w polu "Liczba punktów" znajduje się prawidłowa liczba punktów danych, nazwij przebieg, a następnie kliknij Utwórz przebieg. Po utworzeniu przebiegu wygeneruj wykres, klikając Windows, a następnie Nowy wykres i umieść przebieg na osi Y i "obliczony" na osi X.
4. Użyj narzędzia kursora, aby zaznaczyć punkty/obszary zainteresowania na wykresie do analizy. Kilka punktów/obszarów zainteresowania do obliczenia typowych właściwości mechanicznych całej kości jest wymienionych w krokach 5.4-5.8 (Rysunek 6) i obejmują pracę do uszkodzenia (N x mm), maksymalne obciążenie (N), sztywność (N / mm), obciążenie plastyczności (N) i przemieszczenie po plastyczności (mm).
5. W celu obliczenia stosunku pracy do uszkodzenia (N x mm) należy umieścić kursor (A) na początku badania i kursor (B) w punkcie bezpośrednio poprzedzającym uszkodzenie materiału (tj. przy maksymalnym obciążeniu osiągniętym podczas badania, zanim zaobserwowano duży spadek obciążenia).
   UWAGA: W ten sposób kursory A-B obejmą w nawiasie cały test od momentu, gdy materiał zaczyna wytrzymywać siły i ulegać przemieszczeniu do punktu, w którym materiał ulega uszkodzeniu. Stosunek pracy do niepowodzenia (N x mm) można mierzyć jako całkowity obszar pod krzywą (tj. obszar pod krzywą między kursorami A i B).
6. Obliczyć maksymalne obciążenie (N) jako najwyższą wartość obciążenia zaobserwowanego podczas badania (tj. obciążenie przy kursorze B).
7. Oblicz sztywność (N/mm) materiału jako nachylenie liniowego obszaru sprężystego (tj. nachylenie między kursorami C i D).
8. Obciążenie plastyczności (N) to obciążenie, przy którym krzywa obciążenia-przemieszczenia odchyla się od liniowości i wchodzi w obszar plastyczny, doznając w ten sposób trwałego odkształcenia (tj. obciążenia w punkcie D). Oblicz to, mierząc obciążenie przy kursorze D.
9. Przemieszczenie po plastyczności (mm) jest wskaźnikiem plastyczności materiału. Zmierz to jako przemieszczenie między granicą plastyczności a punktem uszkodzenia materiału (tj. przemieszczenie między kursorami D i B).
   UWAGA: Parametry wymienione powyżej to tylko niektóre z powszechnie podawanych właściwości mechanicznych całej kości. Nie jest to pełna lista wszystkich właściwości mechanicznych całej kości, które można uzyskać na podstawie krzywej obciążenia-przemieszczenia. Inne parametry właściwości mechanicznych całej kości obejmują między innymi przemieszczenie całkowite (mm), pochłoniętą energię sprężystą (N x mm), przemieszczenie sprężyste (mm), pochłoniętą energię plastyczną (N x mm) i przemieszczenie plastyczne (mm), aby wymienić tylko kilka. Ponadto nie wymieniono właściwości mechanicznych kości na poziomie tkankowym; Wymagają one przekształceń danych przy użyciu określonych pomiarów anatomicznych, takich jak średnica kości. Przykładowy kod do wykonania pomiarów z krzywej obciążenia-przemieszczenia w oprogramowaniu został wymieniony w pliku uzupełniającym 1.

Wyniki

Dzięki temu protokołowi krok po kroku, który wykorzystuje osadzanie powierzchni ładunkowej L5 i konwertowalną trzypunktową giętarkę/maszynę do testowania kompresji, możliwe jest przeprowadzenie testów kompresji na kręgu lędźwiowym myszy w celu porównań między grupami. Metodą osadzania przygotowano łącznie dwadzieścia cztery mysie kręgi L5. Trzy z próbek zostały jednak uszkodzone podczas usuwania wyrostków kręgowych za pomocą diamentowego koła tnącego na narzędziu obrotowym i dlatego nie zostały przebadane. Biorąc to pod uwagę, wymienione właściwości mechaniczne udało się uzyskać z dwudziestu jeden z dwudziestu czterech próbek przy użyciu metody zatapiania. Próbki były sprawdzane wizualnie po każdym teście, a nasadka z PMMA nie uległa uszkodzeniu w żadnym z testów. Jak wspomniano, myszy użyte w niniejszym badaniu były częścią większego badania mającego na celu określenie wpływu dietetycznych nasion konopi na kości młodych i rosnących samic myszy C57BL / 6. Statystyki opisowe pięciu powszechnie zgłaszanych właściwości mechanicznych całej kości przedstawiono w tabeli 1. Krzywe obciążenia i przemieszczenia dla wszystkich dwudziestu jeden próbek są podane w Rysunek 7.

Rysunek 1: Konwersja giętarki trzypunktowej na maszynę do prób ściskania. (A) Maszyna w pełni wyposażona do pracy jako giętarka trzypunktowa z czujnikiem przemieszczenia i czujnikiem obciążenia (białe strzałki). (B) Maszyna po zdjęciu belki poprzecznej. (C) Maszyna po umieszczeniu samonastawnej płyty górnej w miejscu, w którym wcześniej umieszczono belkę poprzeczną. (D) Dolne belki nośne z wywierconymi w nich otworami. (E) Dolna płyta ze stali nierdzewnej z czterema gwintowanymi otworami wbitymi w nią, oraz śrubą częściowo wkręconą w jeden z otworów. Pozostałe dwa otwory niewidoczne na zdjęciu znajdują się po przeciwnej stronie. (F) Dolne belki nośne z dolną płytą przymocowaną do nich za pomocą czterech sześciokątnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przykładowy wykres przemieszczenia systemu (_maszyna Δx) w porównaniu z obciążeniem wyposażony w regresję liniową (A), logarytmiczną (B), wielomianową drugiego rzędu (C) i wielomianową trzeciego rzędu (D). W tym przykładzie wielomian trzeciego rzędu zapewnia najlepsze dopasowanie na wartość R², a jego regresja jest używana jako współczynnik korekcji przemieszczenia systemu. Obrazy reprezentują przykładowe dane demonstrujące dopasowanie regresji i będą musiały zostać uzyskane przez badaczy dla poszczególnych maszyn. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Kręgosłup lędźwiowy myszy. Kręgosłup lędźwiowy myszy pod mikroskopem preparacyjnym przed usunięciem L6 (A) i po usunięciu L6, pozostawiając przyczepiony L5 (B). L5 zostanie następnie usunięty i przygotowany do próby kompresji. Białe pasma to krążki międzykręgowe, które zostały wypreparowane i usunięte. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Anatomia kręgu L5. Reprezentatywny kręg L5 myszy w widoku czaszkowym, ogonowym, grzbietowym i brzusznym pod mikroskopem preparacyjnym. Ważne wymiary trzonu kręgu obejmują wysokość, szerokość grzbietowo-brzuszną i szerokość boczną, jak pokazano kolorowymi liniami. Czarne przerywane linie pokazują mniej więcej miejsce, w którym należy wykonać nacięcia w celu usunięcia wyrostków kręgowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Okres twardnienia cementu kostnego PMMA. Przykładowy kręg L5 z cementem kostnym PMMA (zielony) umieszczonym na płycie końcowej czaszki i górną płytą opuszczoną na cement kostny PMMA + kompleks kostny. Gdy cement kostny PMMA całkowicie stwardnieje, rozpocznie się próba ściskania. Górna płyta dociskowa będzie dalej obniżana, dopóki nie zostanie zaobserwowane uszkodzenie materiału. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Test kompresji kości kręgowej myszy krzywa obciążenia-przemieszczenia i analiza danych. Kursor A oznacza początek testu kompresji. Kursor B oznacza punkt uszkodzenia materiału. Kursor C oznacza początek liniowego obszaru sprężystego, podczas gdy kursor D oznacza koniec (tj. granicę plastyczności). Obszar zacieniony w kolorze jasnoszarym to liniowy obszar sprężysty, w którym materiał powróci do swojego pierwotnego kształtu, jeśli obciążenie zostanie usunięte. Obszar zacieniony na ciemnoszaro to obszar plastyczny, w którym materiał uległ trwałemu odkształceniu i nie powróci do swojego pierwotnego kształtu, jeśli ładunek zostanie usunięty. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Krzywe obciążenia-przemieszczenia dla wszystkich dwudziestu jeden próbek kości. Wzory różniły się między kośćmi. Ogólnie rzecz biorąc, największa zmienność występowała w przemieszczeniu po plonowaniu, przy czym niektóre (n = 5) kości miały stosunkowo małe przemieszczenie po plonowaniu, a inne (n = 16) miały stosunkowo duże przemieszczenie po plonowaniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

grupa	Stosunek pracy do niepowodzenia (N*mm)	Maksymalne obciążenie (N)	Sztywność (N/mm)	Obciążenie plastyczności (N)	Przemieszczenie po plonowaniu (mm)
CON (n = 7)	13.43 ± 2.44 A,B	37,93 ± 3,28	od 109,14 ± 11,86	22.68 ± 2.04	0,34 ± 0,06
5HS (n = 8)	12,12 ± 1,23 A	33,62 ± 2,43	od 99,70 ± 16,62	20,88 ± 2,69	0,38 ± 0,08
15HS (n = 6)	19.55 ± 2.13 B	od 41,82 ± 1,85	134,58 ± 19,73	28.07 ± 3.20	0,51 ± 0,07
Grupy połączone (n = 21)	14,68 ± 1,27	37,40 ± 1,63	121,82 ± 9,43	23.54 ± 1.60	0,40 ± 0,04

Tabela 1: Reprezentatywne wartości dla powszechnie zgłaszanych właściwości mechanicznych całej kości uzyskane przy użyciu metody osadzania przygotowania powierzchni obciążeniowej. Wartości uzyskano przy użyciu wszystkich protokołów wyszczególnionych w niniejszym badaniu. Zatem wartości reprezentują te, które można uzyskać za pomocą opisanych tutaj metod. Grupy ±reprezentują samice myszy C57BL/6 karmione dietą wzbogaconą o całe nasiona konopi w stężeniach 0% (CON), 50 g/kg (5%) (5HS) lub 150 g/kg (15%) (15HS) w wieku 5-29 tygodni. Dla jednego z parametrów (praca do niepowodzenia) wydaje się, że dieta wpłynęła na wartości dla jednoczynnikowej ANOVA (p < 0,05). Wartości o tym samym indeksie górnym literowym nie różnią się znacząco (p > 0,05), podczas gdy wartości z różnymi indeksami górnymi liter różnią się znacząco (p < 0,05), zgodnie z analizą post hoc Tukeya-Kramera.

Plik uzupełniający 1: Przykładowy kod do uzyskania właściwości mechanicznych całej kości. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Celem niniejszej pracy było opisanie budowy kabrioletu do gięcia trzypunktowego/maszyny do prób ściskania, a także zastosowanie metody zatapiania cementu kostnego PMMA do przygotowania próbek kręgów lędźwiowych myszy przed jednoosiową próbą ściskania. Uzyskano i przedstawiono statystyki opisowe dla próbek kości, które będą przydatne do porównania w przyszłych badaniach. W niniejszym badaniu przeanalizowano niektóre z najczęściej zgłaszanych właściwości mechanicznych całej kości. Warto jednak zauważyć, że istnieje kilka dodatkowych właściwości mechanicznych na poziomie całych kości i tkanek, które nie zostały tutaj zbadane.

Nie jest jasne, jak właściwości mechaniczne uzyskane z próbek przygotowanych metodą zatapiania wypadają w porównaniu z tymi przygotowanymi metodą cięcia kręgów lędźwiowych myszy. Schumancher¹⁷ wcześniej ocenił właściwości mechaniczne kręgów szczurów przygotowanych przy użyciu dwóch różnych metod i stwierdził, że kręgi przygotowane metodą osadzania miały znacznie niższą sztywność, większe przemieszczenie plastyczności i wyższą wydajność odkształcenia niż próbki przygotowane metodą cięcia. Potrzebna jest dalsza charakterystyka, aby zrozumieć, w jaki sposób porównują się właściwości mechaniczne kręgów myszy lub innych modeli zwierzęcych mierzone przy użyciu dwóch różnych metod przygotowania powierzchni obciążenia. Oczekuje się, że niektóre parametry różnią się między kręgami przygotowanymi różnymi metodami, biorąc pod uwagę, że metoda osadzania dodaje materiał do próbki, ale zachowuje płytkę końcową, która jest ważną strukturą w złamaniach kręgów in vivo^17,27. Dodanie cementu kostnego do końca czaszki zwiększa wysokość próbki, podczas gdy cięcie płyt końcowych usuwa wysokość, zmieniając proporcje, a tym samym zmieniając właściwości mechaniczne, takie jak sztywność. Co więcej, chociaż PMMA jest sztywniejsza niż kość gąbczasta kręgów, możliwe jest, że PMMA ulega przemieszczeniu, a zakres tego przemieszczenia wymaga dalszej charakterystyki. Ponadto nie jest jasne, w jaki sposób wyniki uzyskane za pomocą metody osadzania lub metody cięcia wypadają w porównaniu z przewidywaniami parametrów kości przy użyciu analizy elementów skończonych dla kręgów myszy lub jak wyniki różnią się w różnych warunkach (np. prędkość obniżania, różne poziomy kręgów, skład PMMA). Niemniej jednak, ponieważ wszystkie próbki są przygotowywane w podobny sposób, metoda ta jest odpowiednia i pozwala na łatwe i opłacalne dokonywanie porównań między grupami poddanymi działaniu substancji w jednym badaniu, w którym próbki są przygotowywane i badane w podobnych warunkach.

Jeśli chodzi o przygotowanie próbki przed testem ściskania, ważne jest, aby przygotować próbki w powtarzalny sposób. Jednym z możliwych ograniczeń metody opisanej w niniejszym badaniu jest użycie narzędzia obrotowego do usuwania wyrostków kręgowych. Inna metoda usuwania wyrostków kręgowych kręgów lędźwiowych myszy została opisana przez Pendletona i ^wsp.19, co może pozwolić na bardziej spójne przygotowanie próbki. Ponadto zastosowanie cementu kostnego PMMA może powodować niespójności. Dlatego ważne jest, aby cement kostny był stosowany konsekwentnie pod względem objętości, rozmieszczenia i czasu twardnienia. Jednak metoda zatapiania może zapewnić prostszy sposób na uzyskanie spójnego przygotowania próbki w porównaniu z metodą cięcia, ponieważ uzyskanie idealnie równych, równoległych cięć konsekwentnie między wszystkimi próbkami może być trudne ze względu na ich mały rozmiar i kruchość. Potrzebne będą przyszłe badania, aby ocenić precyzję wyników uzyskanych z próbek przygotowanych przy użyciu zatapiania vs. metoda cięcia.

Jak wspomniano, konieczna jest dalsza charakterystyka i badanie metody osadzania w celu przygotowania próbki kręgów lędźwiowych myszy przed jednoosiowym testem ściskania. Niemniej jednak niniejsze badanie pokazuje, że taka metoda może być zastosowana, zawiera szczegółowy opis proponowanej metody oraz oferuje opisowe statystyki parametrów zmierzonych z próbek przygotowanych przy użyciu tej metody. Protokół ten jest cenny dla tej dziedziny ze względu na obecny brak dostępnej metodologii. Co więcej, metoda ta może lepiej naśladować mechanizm, dzięki któremu dochodzi do złamań kręgów in vivo w porównaniu z innymi metodami^17,27. Zaletą metody jest również pokonanie trudności technicznych związanych z innymi obecnie opisywanymi metodami, dzięki czemu jednoosiowe testy kompresji są bardziej wykonalne w badaniach nad kośćmi. Jest to szczególnie istotne, ponieważ leki, diety lub inne interwencje mogą wpływać na kości bogate w korę mózgową (np. kość długa w środku trzonu) i kości bogate w beleczki (^np. trzony kręgów) w różny sposób, jednak zginanie trzypunktowe jest dominującą metodą oceny właściwości mechanicznych kości. Połączenie trzypunktowego zginania i jednoosiowej próby ściskania może stać się jeszcze łatwiejsze do osiągnięcia dzięki zastosowaniu konwertowalnej trzypunktowej maszyny do próbowania zginania/ściskania. W związku z tym w niniejszym badaniu zaproponowano dwa możliwe sposoby ułatwienia naukowcom oceny zarówno kości bogatej w korę, jak i bogatej w beleczkową kość w tym samym badaniu, potencjalnie prowadząc do lepszego zrozumienia, w jaki sposób dane leczenie wpływa na różne typy kości między grupami eksperymentalnymi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Papier ścierny o ziarnistości 120	N/A	N/A	Do usuwania tkanek miękkich i nierówności ogonowej płytki
24-bitowy interfejs ogniwa obciążnikowego	LoadStar Sensors, Freemont, Kalifornia, USA	DQ-1000	Do podłączenia czujników obciążenia i przemieszczenia do osobistego koputeru
Base Mouse Diet	Dyets, Inc, Bethlehem, PA, USA	AIN-93G	Diet myszy były karmione bez dodatku nasion konopi
Diamentowa tarcza tnąca z narzędziem obrotowym	Dremel US, Mt. Prospect, Illinois, USA	F0130200AK	Do usuwania wyrostków kręgowych Czujnik
przemieszczenia	Mitutoyo, Aurora, Illinois, USA	ID-S112EX Czujnik	przemieszczenia o rozdzielczości 0,001 mm i dokładności 0,00305 mm
Zewnętrzne źródło prądu o zmiennym napięciu	Extech Instruments, Nashua, New Hampshire, USA	382213	Aby zapewnić moc do testowania kompresji maszyna
Samica C57BL/6 Myszy	Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts, USA	027 (Kod szczepu)	Model myszy wykorzystany w niniejszym badaniu
Hempseed	Natera, Pitt Meadows, Kanada	670834012199	Nasiona konopi dodane do oprogramowania Base Mouse
Diet Igor Pro (wersja 8.04)	Wave Metrics, Portland, Oregon, USA	Nie dotyczy	Oprogramowanie używane do analizy
krzywej obciążenia i przemieszczeniaiLoad Mini Force	Sensor LoadStar Sensors, Freemont, Kalifornia, USA	MFM-010-050-S	Czujnik obciążenia (siły) z dokładnością 1,0%
Izotoniczny (0,9%) roztwór soli	Nie		Aby utrzymać nawodnienie kości
Leica EZ4 W Miscoscope	Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy	NC1601884	Do preparacji kości i usuwania wyrostka kręgowego
Oprogramowanie	Microsoft ExcelMicrosoft Corporation, Redmond, Waszyngton, USA Nie	dotyczy	Do przesyłania danych z oprogramowania SensorVue
PALACOS R Bone Cement	Hareus Medical, Wehreim, Niemcy	00-1112-140-01	Cement kostny PMMA do zatapiania powierzchni ładunkowej
Komputer osobisty	Nie		rejestrowania danych (patrz 24-bitowy interfejs ogniwa obciążnikowego, oprogramowanie SensorVue, oprogramowanie Microsoft Excel) i analizy (patrz Oprogramowanie Igor Pro)
Oprogramowanie SensorVue	Czujniki LoadStar, Freemont, Kalifornia, USA	Nie dotyczy	Oprogramowanie używane do zbierania danych w czasie rzeczywistym podczas testów kompresji
Zestaw do preparowania małych zwierząt	Nie		Nie dotyczy Nożyczki preparacyjne, kleszcze, skalpel, ostrza, szpilki, gaziki
Para górnych płyt dociskowych ze stali nierdzewnej (samoprzystających) i dolnych			Skonstruowane przez Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering
Giętarka trzypunktowa	N/A	N/A	skonstruowana przez Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering. Patrz Sarper et al. (2014) aby uzyskać więcej informacji na temat budowy