Oparta na uczeniu maszynowym metoda charakterystyki i kwantyfikacji złogów lipidowych LipidUNet przy użyciu nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z iPSC

Summary

Choroby zwyrodnieniowe oczu, które wpływają na warstwę nabłonka barwnikowego siatkówki, mają pochodzenie monogenowe i poligenowe. Opracowano kilka modeli chorób i aplikację LipidUNet w celu badania mechanizmów choroby, a także potencjalnych interwencji terapeutycznych.

Abstract

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) to monowarstwa sześciokątnych komórek znajdujących się w tylnej części oka. Zapewnia odżywienie i wsparcie dla fotoreceptorów i naczyń włosowatych naczyniówki, przeprowadza fagocytozę zewnętrznych segmentów fotoreceptorów (POS) i wydziela cytokiny w sposób spolaryzowany w celu utrzymania homeostazy siatkówki zewnętrznej. Dysfunkcyjny RPE, spowodowany mutacjami, starzeniem się i czynnikami środowiskowymi, powoduje zwyrodnienie innych warstw siatkówki i powoduje utratę wzroku. Charakterystyczną cechą fenotypową degenerującego się RPE są wewnątrz- i subkomórkowe złogi bogate w lipidy. Złogi te są powszechnym fenotypem w różnych chorobach zwyrodnieniowych siatkówki. Aby odtworzyć fenotyp złogów lipidowych monogenowych zwyrodnień siatkówki in vitro, z fibroblastów pacjentów wygenerowano indukowane pluripotencjalne RPE pochodzące z komórek macierzystych (iRPE). Linie komórkowe wygenerowane od pacjentów z chorobą Stargardta i zwyrodnieniem siatkówki o późnym początku (L-ORD) były karmione POS przez 7 dni w celu odtworzenia fizjologicznej funkcji RPE, która spowodowała patologię wywołaną fagocytozą POS w tych chorobach. Aby wygenerować model zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD), choroby poligenowej związanej z alternatywną aktywacją dopełniacza, w ramach projektu iRPE podano anafilatoksyny alternatywnego dopełniacza. Wewnątrz- i subkomórkowe złogi lipidowe scharakteryzowano za pomocą czerwieni nilowej, boru-dipyrrometenu (BODIPY) i apolipoproteiny E (APOE). Aby określić ilościowo gęstość złogów lipidowych, opracowano oprogramowanie oparte na uczeniu maszynowym, LipidUNet. Oprogramowanie zostało przeszkolone na obrazach projekcyjnych iRPE o maksymalnej intensywności na powierzchniach hodowlanych. W przyszłości zostanie przeszkolony w zakresie analizy obrazów trójwymiarowych (3D) i ilościowego określania objętości kropelek lipidów. Oprogramowanie LipidUNet będzie cennym źródłem informacji na temat leków, które zmniejszają akumulację lipidów w modelach chorób.

Introduction

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) to monowarstwa komórek znajdujących się w tylnej części oka, przylegająca do fotoreceptorów siatkówki. RPE odgrywa istotną rolę w utrzymaniu prawidłowego widzenia, zapewniając wsparcie metaboliczne i strukturalne fotoreceptorom. Zdrowe komórki RPE charakteryzują się wyraźną sześciokątną morfologią. Są one połączone ścisłymi połączeniami, które pozwalają RPE działać jako bariera między naczyniówką włosowatą znajdującą się po jej podstawowej stronie a fotoreceptorami znajdującymi się wierzchołkowo. Aby utrzymać ekosystem siatkówki, RPE transportuje kluczowe metabolity, np. glukozę, do fotoreceptorów w sposób, który minimalizuje zużycie glukozy w klasie RPE¹. Ze względu na to ograniczenie, RPE zależy od innych metabolitów, aby utrzymać swoje potrzeby metaboliczne, w tym kwasów tłuszczowych, które RPE przekształca w ketony poprzez β-oksydację². Biorąc pod uwagę skłonność RPE do wykorzystywania kwasów tłuszczowych, które prawdopodobnie są odzyskiwane z trawienia zewnętrznego segmentu fotoreceptora (POS), jako źródła energii, szkodliwe zmiany w szlakach przetwarzania lipidów w RPE często prowadzą lub są związane zarówno z monogenowymi, jak i poligenowymi chorobami zwyrodnieniowymi siatkówki³.

Zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD), poligeniczna choroba zwyrodnieniowa oczu, która powoduje zwyrodnienie RPE, zostało również powiązane z nieprawidłową autofagią i metabolizmem lipidów w monowarstwie RPE. Niezdolność dysfunkcyjnej monowarstwy RPE do przetwarzania POS i wykonywania innych krytycznych funkcji prowadzi do powstawania złogów zewnątrzkomórkowych (sub-RPE) zwanych podstawowymi złogami liniowymi (BLinD) zlokalizowanych między RPE a błoną Brucha - cecha charakterystyczna patologii AMD. Głównymi składnikami BLinD są lipoproteiny, z których najliczniejszą jest apolipoproteina E (APOE)⁴. Nagromadzenie cienkich warstw BLinD może prowadzić do miękkich druz, co jest rozpoznawane jako objaw kliniczny AMD^5,6.

Kilka grup wykazało, że modele chorób in vitro pochodzących z komórek macierzystych, które powodują dysfunkcję RPE, charakteryzują się akumulacją lipidów sub-RPE^7,8,9. Hallam i in. (2017) wygenerowali indukowane pluripotencjalne RPE pochodzące z komórek macierzystych (iRPE) od pacjentów z wysokim ryzykiem AMD z powodu polimorfizmu genu CFH. iRPE wykazywał akumulację druz, zgodnie z oznaczeniem APOE, a RPE wysokiego ryzyka gromadził większe depozyty niż iRPE generowane od pacjentów niskiego ryzyka¹⁰.

Aby stworzyć model in vitro, który podsumowuje cechy komórkowe AMD, takie jak kropelki lipidów i odkładanie druz, linie iRPE wygenerowane z próbek krwi pacjenta zostały ustalone przy użyciu wcześniej opublikowanego protokołu ukierunkowanego na rozwój¹¹. iRPE poddano działaniu ludzkiej surowicy kompetentnej dopełniacza (CC-HS), roztworowi zawierającemu anafilatoksyny, które naśladują jedną z możliwych przyczyn AMD: zwiększoną sygnalizację alternatywnego dopełniacza⁸. Wynikowe komórkowe i subkomórkowe odkładanie się złogów lipidowych mierzono przy użyciu powszechnie stosowanych markerów lipidowych i lipoproteinowych, APOE, czerwieni Nilowej i BODIPY. Za pomocą tych markerów wykazano, że aktywowana sygnalizacja dopełniacza za pośrednictwem CC-HS nasilała akumulację lipidów w komórkach iRPE⁸.

Aby opracować model choroby zwyrodnieniowej monogenowej siatkówki, linie iRPE zostały opracowane od pacjentów z chorobą Stargardta, chorobą spowodowaną mutacjami genu ABCA4 w RPE. Wcześniej wykazano, że gdy ABCA4 jest znokautowany, lipofuscyna A2E, osad wewnątrzkomórkowy, o którym wiadomo, że zawiera wysoki poziom fosfolipidów i zależnych od światła produktów peroksydacji lipidów, gromadzi się wewnątrz klasy RPE¹². Linie do wybijania ABCA4 zostały opracowane równolegle z liniami pacjentów i obie zostały poddane podawaniu w punktach sprzedaży. Stargardt iRPE wykazał patologię wywołaną fagocytozą POS, wykazując zwiększoną akumulację lipidów określoną ilościowo przez barwienie BODIPY. RPE pochodzące z ABCA4 KO iPSC poddano obróbce CC-HS; kwantyfikacja sygnału BODIPY wykazała również defekt w obchodzeniu się z lipidami w modelu choroby Stargardta⁹.

Biorąc pod uwagę rozpowszechnienie tych chorób i potrzebę skutecznych terapii, wraz z odpowiednimi modelami chorób opisanymi powyżej, istnieje potrzeba ustanowienia solidnych metod ilościowego określania skuteczności potencjalnych terapii. Aby określić ilościowo depozyty lipidów w sposób obiektywny, zautomatyzowany i ustandaryzowany, stworzono oprogramowanie oparte na uczeniu maszynowym, LipidUNet, dzięki czemu w połączeniu z narzędziami do analizy masek można szybko i skutecznie zidentyfikować osadzanie się lipidów przy użyciu popularnych markerów czerwieni nilowej, BODIPY i APOE. Statystyki sumaryczne uzyskane za pomocą tego potoku analiz mogą być następnie analizowane i wyświetlane graficznie, co pozwala na łatwe porównanie warunków leczenia. Schemat protokołu jest pokazany w Rysunek 1.

Rysunek 1: Schemat protokołu: Komórki RPE są hodowane na 96-dołkowej płytce i poddawane działaniu aktywnej ludzkiej surowicy lub oczyszczonych zewnętrznych segmentów bydlęcych w celu modelowania różnych typów zwyrodnień siatkówki in vitro. Komórki RPE są utrwalane i barwione pod kątem złogów lipoprotein czerwienią nilową, BODIPY i APOE. Mikroskop konfokalny służy do pozyskiwania stosów Z znakowanych fluorescencyjnie cząstek lipidowych, które są następnie przetwarzane na projekcje 2D o maksymalnej intensywności. Algorytm uczenia maszynowego został przeszkolony w celu rozpoznawania i prawidłowej segmentacji cząstek lipoprotein. Generowane są tabele podsumowujące zawierające liczbę cząstek i różne metryki kształtu, które można wykorzystać do późniejszego wykreślania i analizy statystycznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protocol

Wszystkie kroki protokołu są zgodne z wytycznymi określonymi przez komisję etyki badań na ludziach NIH. Badania nad komórkami macierzystymi i pobieranie próbek od pacjentów zostały zatwierdzone przez Combined NeuroScience Institutional Review Board (CNS IRB) w ramach Biura Ochrony Badań nad Ludźmi (OHRP), NIH, zgodnie z wytycznymi 45 CFR 46 rządu USA. Próbki od pacjentów pobrano przy użyciu formularza zgody zatwierdzonego przez CNS IRB zgodnie z kryteriami określonymi w Deklaracji Helsińskiej pod numerem protokołu NCT01432847 (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01432847?cond=NCT01432847&draw=2&rank=1).

1. Generacja iRPE

1. Wygeneruj iRPE z iPSC pochodzącego z krwi pacjenta zgodnie z opublikowanym protokołem Sharma i wsp., 2022¹¹ (Rysunek 2 i Rysunek 3).

Rysunek 2: Schemat różnicowania i dojrzewania iRPE. Aby wygenerować iRPE, zastosowano ustalony protokół różnicowania, a komórkom pozostawiono do dojrzewania przez 5 tygodni. Uzyskana hodowla komórkowa działa jak model in vitro, którym można manipulować za pomocą różnych metod leczenia, aby naśladować dysfunkcję RPE w chorobach takich jak AMD i choroba Stargardta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy udanego i nieudanego różnicowania i dojrzewania RPE. Dwa obrazy TJP1 RPE w jasnym polu przy 10-krotnym powiększeniu zostały pokazane w 42 dniu protokołu iRPE. (A) Pomyślne różnicowanie i dojrzewanie wykaże zlewające się RPE z pigmentacją i morfologią wielokątów. (B) Nieudane różnicowanie i dojrzewanie pokaże skupiska umierających komórek, jak pokazano tutaj. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Przygotowanie podłoża do konserwacji RPE (RPE-MM)

1. Rozmrozić suplement N2 w temperaturze 4 °C przez noc. Rozmrozić wszystkie inne odczynniki w temperaturze pokojowej (RT).
2. W sterylnych warunkach dodać odczynniki wymienione w tabeli 1 przy podanych współczynnikach rozcieńczenia, zgodnie z protokołem ustalonym przez Sharma i in., 2022¹¹.
3. Dobrze wymieszaj media i przefiltruj je za pomocą jednostki filtrującej 0,22 μm.
   UWAGA: Podłoże nadaje się do użycia w ciągu 2 tygodni, jeśli jest przechowywane w temperaturze 4 °C.

3. Siew płytek 96-dołkowych

1. Rozmrażać porcję witronektyny w temperaturze pokojowej przez 3-5 minut lub do momentu, gdy lód całkowicie się rozpuści.
2. Rozcieńczyć witronektynę 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem Dulbecco (DPBS), aby uzyskać pożądany roztwór roboczy, stosując rozcieńczenie 1:200 (witronektyna: DPBS). W przypadku płytki 96-dołkowej pokryj każdą studzienkę 200 μl roztworu roboczego.
3. Połączyć rozmrożony inhibitor ROCK (dichlorowodorek Y-27632) z RPE-MM w rozcieńczeniu 1:1000, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM. Jest to materiał galwaniczny do ogniw RPE.
4. Rozmrozić fiolkę iRPE za pomocą automatycznego systemu rozmrażania komórek i przenieść zawiesinę komórek iRPE do probówki o pojemności 50 ml.
5. Rozcieńczyć zawiesinę komórek pożywką galwaniczną w rozcieńczeniu 1:10. Odwirować probówkę o sile 400 x g przez 5 minut.
6. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki galwanicznej.
7. Zmieszać 400 μl podłoża galwanicznego ze 100 μl roztworu komórek zawieszonych do liczenia komórek. Podwielokrotność tę należy wykorzystać do określenia stężenia żywych komórek w zawiesinie komórek za pomocą licznika żywotności komórek.
8. Rozcieńczyć zawiesinę komórek pożywką galwaniczną do końcowego stężenia 60 000 komórek/ml.
9. Całkowicie odessać roztwór powlekający witronektynę z płytki 96-dołkowej i dozować 200 μl zawiesiny komórkowej do każdej studzienki. Będzie około 12 000 komórek/studnię lub ~200 komórek/^mm2.
10. Inkubować wysiane płytki komórkowe przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Po 48 godzinach zmienić podłoże na RPE-MM bez dodatku inhibitora ROCK. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni w ciągu 5-tygodniowego okresu dojrzewania.

4. Modele chorób in vitro

1. Uzupełnienie leczenia kompetentną surowicą ludzką (CC-HS)
   1. Rozmrozić ludzką surowicę kompetentną w temperaturze 4°C przez noc.
   2. Przygotować CC-HS i uzupełnić niekompetentną pożywkę z surowicy ludzkiej (CI-HS).
      1. Aby przygotować 5% pożywkę CC-HS, należy zmieszać rozmrożoną surowicę ludzką kompetentną z RPE-MM w rozcieńczeniu 1:20. Przed użyciem przefiltrować roztwór przez filtr mediów o grubości 0,22 μm.
      2. Aby przygotować pożywkę z 5% niedopełniaczem niekompetentnej surowicy ludzkiej (CI-HS), najpierw podgrzej CC-HS w łaźni wodnej o temperaturze 57 °C przez 30 minut, a następnie wymieszaj z pożywką hodowlaną w rozcieńczeniu 1:20. Przed użyciem przefiltrować roztwór przez filtr mediów o grubości 0,22 μm.
   3. Surowicę należy poddać komórkom 200 μl pożywki 5% CC-HS lub 5% CI-HS przez łączny czas inkubacji 48 godzin, odświeżając pożywkę po 24 godzinach.
   4. Przemyć komórki 1x DPBS i utrwalić je 4% paraformaldehydem przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć ponownie 1x DPBS i przechowywać próbki w temperaturze 4 °C, zanurzone w 200 μl DPBS.
   5. OPCJONALNIE: W razie potrzeby poddaj lizie komórki z płytki, aby wykazały tylko odkładanie się lipidów sub-RPE.
      1. Aby zlizować komórki i pozostawić tylko złogi lipidów, usuń pożywkę i dodaj 200 μl dejonizowanej wody do każdej studzienki.
      2. Inkubować przez 10-15 minut, pipetować w górę i w dół, aż komórki zostaną usunięte. Umyj ponownie 200 μl wody dejonizowanej i natychmiast utrwal komórki 4% paraformaldehydem.
      3. Potwierdź skuteczność usuwania komórek za pomocą barwienia jądrowego za pomocą Hoechst. Dodać Hoechst w rozcieńczeniu 1:2000 do 1x roztworu DPBS zawierającego 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,5% Tween 20 i 0,5% Triton-X 100. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności. Następnie umyć 1x DPBS.
2. Leczenie zewnętrznego segmentu fotoreceptora (POS) na iRPE
   1. Przygotowanie POS
      1. Wyjmij rurkę z granulkami POS z przechowywania w temperaturze -80 °C i rozmrozić przez noc w temperaturze 4 °C w przykrytym pojemniku na lód.
      2. Przygotować bufor do płukania POS, mieszając 10 g sacharozy w 40 ml podwójnie dejonizowanego_H2O(ddH₂O).
      3. Podgrzej mieszaninę w temperaturze 40-50 °C, delikatnie mieszając przez 15 min. Do mieszaniny dodać 840 mg wodorowęglanu sodu i mieszać podgrzewając przez 10 min.
      4. Dostosuj całkowitą objętość buforu do płukania POS do 100 ml z ddH₂O i dostosuj pH roztworu do 8,3 za pomocą 1 N HCl lub 1 N NaOH, w zależności od potrzeb. Przefiltrować roztwór myjący za pomocą filtra 0,22 μm.
         UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać; bufor myjący POS może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez noc.
      5. Po rozmrożeniu zawiesić granulat w 15 ml buforu do mycia POS. Zachowaj ostrożność podczas zawieszania peletów, aby zapewnić integralność POS. Odwirować zawiesinę POS o sile 600 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut, a następnie odessać supernatant.
      6. Ponownie zawiesić granulat POS w 10 ml bufora do mycia POS.
      7. Usunąć 100 μl podwielokrotności POS + POS buforu do płukania (roztwór POS) i rozcieńczyć w 400 μl 1x DPBS. Rozprowadzić 50 μl rozcieńczonego roztworu POS na płytce z agarem z krwią i płytce agarozowej, aby sprawdzić, czy nie ma zanieczyszczeń bakteryjnych i grzybiczych. Przygotować kontrole pozytywne dla każdego z nich i inkubować wszystkie płytki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C.
      8. Wykonaj test qPCR, dodając 1 μl roztworu POS do studzienki detekcyjnej w celu zbadania na obecność mykoplazmy. Aby amplifikować fragmenty DNA, należy wykonać 40 cykli denaturacji (95°C, 15 s) oraz wyżarzania i wydłużania (60°C, 1 min). Startery do przodu i do tyłu do wykrywania mykoplazmy w próbce POS są następujące:
         Podkład do przodu: GGA TTA GAT ACC CTG GTA GTC CAC G
         Podkład odwrotny: CGT CAA TTC CTT TAA GTT TCA CTC TTG GC
      9. Zmierz stężenie POS za pomocą analizatora komórek i podwielokrotności w zależności od potrzeb. Dla jednej studzienki składającej się z 96-dołkowych płytek z komórkami RPE wystarczy 3 x 10⁶ POS. Pożądany stosunek to 10 ogniw POS/RPE. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze 80 °C do wykorzystania w przyszłości.
   2. Dodawanie POS do komórek
      1. Rozmrozić fiolki POS w kąpieli lodowej.
      2. Wymieszaj obliczoną ilość przygotowanego POS z RPE-MM i traktuj komórki POS raz dziennie przez 7 dni.
         UWAGA: Codziennie przygotowuj świeże rozwiązanie POS.
      3. Przemyć komórki 1x DPBS, a następnie utrwalić je 4% paraformaldehydem przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie przemyć DPBS i przechowywać próbki w temperaturze 4 °C, zanurzone w 200 μl DPBS.

5. Barwienie osadów sub-RPE

1. Protokół barwienia czerwienią Nilu
   1. Po utrwaleniu PFA umyć próbki 3 razy 1x DPBS.
      UWAGA: Jeśli protokół nie zostanie natychmiast użyty, można go tutaj wstrzymać, ale próbki muszą być przechowywane w 1x DPBS + 0,02% roztworze azydku sodu w temperaturze 4 °C.
   2. Aby przygotować roztwór podstawowy czerwieni nilowej, należy rozpuścić proszek czerwieni nilowej w acetonie o stężeniu 3 mg/ml. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej z okresowym mieszaniem. Przefiltrować roztwory filtrem 0,22 μm raz lub dwa razy, w zależności od poziomu osadu pozostałego w roztworze.
      UWAGA: Chronić roztwór podstawowy przed światłem.
   3. Aby przygotować roztwór roboczy, rozcieńczyć roztwór podstawowy w stosunku 1:500 w 1x DPBS. Dodać 200 μl roztworu roboczego do próbki przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce i chronić ją przed światłem.
   4. Przemyć 3 razy 1x PBS i przechowywać próbki w temperaturze 4 °C, zanurzone w 200 μl DPBS.
      UWAGA: W przypadku przeprowadzania eksperymentu na transwellach zamiast na płytce 96-dołkowej, próbki można zamontować na szkiełku z mediami montażowymi, przykryć szklanym szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnić przezroczystym lakierem do paznokci. Należy zachować ostrożność, aby zamontować próbkę z kuwetami skierowanymi do góry.
2. Protokół barwienia BODIPY
   1. W przypadku roztworu podstawowego rozpuścić BODIPY w bezwodnym dimetylosulfotlenku (DMSO), aby osiągnąć stężenie podstawowe 3,8 mM.
   2. W przypadku próbek utrwalonych PFA rozcieńczyć materiał BODIPY w stosunku 1:300 w 1x DPBS. Dodać 200 μl do komórek i inkubować przez noc na kołysku w temperaturze pokojowej.
   3. Przemyć 3 razy 1x DPBS i przechowywać próbki w temperaturze 4 °C, zanurzone w 200 μl DPBS.
      UWAGA: W przypadku przeprowadzania eksperymentu na transwellach zamiast na płytce 96-dołkowej, próbki można zamontować na szkiełku z mediami montażowymi, przykryć szklanym szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnić przezroczystym lakierem do paznokci. Należy zachować ostrożność, aby zamontować próbkę z kuwetami skierowanymi do góry.
3. Protokół barwienia immunologicznego APOE
   1. Połącz 1x DPBS z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA), 0,5% Tween 20 i 0,5% Triton-X 100, aby utworzyć roztwór buforowy.
   2. W przypadku próbek utrwalonych PFA należy zablokować i przepuścić próbkę w 200 μl roztworu buforowego przez 1 godzinę w temperaturze suchej masy.
   3. Dodać pierwszorzędowe przeciwciało APOE rozcieńczone w stosunku 1:100 do roztworu buforowego i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.
   4. Następnego dnia umyj próbki 3 razy 1x DPBS.
   5. Dodać przeciwciało drugorzędowe w rozcieńczeniu 1:1000 do roztworu buforowego i dodawać 200 μl roztworu do komórek przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   6. Przemyć 3 razy 1x DPBS i przechowywać próbki w temperaturze 4 °C, zanurzone w 200 μl DPBS.
      UWAGA: W przypadku przeprowadzania eksperymentu na transwellach zamiast na płytce 96-dołkowej, próbki można zamontować na szkiełku z nośnikiem montażowym (Fluoromount), przykryć szklanym szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnić przezroczystym lakierem do paznokci. Należy zachować ostrożność, aby zamontować próbkę z kuwetami skierowanymi do góry.

6. Automatyzacja i przetwarzanie obrazów

1. Automatyczne skanowanie obrazu
   UWAGA: W tym badaniu wykorzystano odwrócony konfokalny mikroskop skaningowy Zeiss LSM 800 oraz oprogramowanie ZEN 3.2 (edycja niebieska). Upewnij się, że 96-dołkowa płytka jest rozgrzana do RT przez co najmniej 60 minut przed obrazowaniem, aby uniknąć dryfu płaszczyzny ogniskowej podczas skanowania z powodu zmiany współczynnika załamania światła wraz ze zmianą temperatury.
   1. Za pomocą mikroskopu konfokalnego i obiektywu 40x utwórz profil skanowania z odpowiednimi kanałami fluorescencyjnymi dla zastosowanego markera lipidowego i wszelkich dodatkowych przeciwciał.
   2. Użyj pola wyboru Kafelki, aby skonfigurować automatyzację obrazów. Aby skalibrować płytkę 96-dołkową, upewnij się, że zostały wprowadzone i wybrane prawidłowe pomiary nośnika próbki. Następnie kliknij przycisk Kalibruj, aby skalibrować płytkę zgodnie z instrukcją, co wymaga użycia obiektywu 10x.
   3. Wybierz widok Ustawienia zaawansowane, aby wybrać odpowiednie studnie i dodać 3 różne punkty obrazowania w pobliżu środka studni za pomocą funkcji Pozycje. Można to zrobić ręcznie w podzakładce Pozycja lub losowo, korzystając z zakładki Ustawienia pozycji i wybierając opcję Ustawienia według przewoźnika. Powtórz dla wszystkich dołków o tym samym barwieniu.
   4. Aby uzyskać optymalne ustawianie ostrości i pozycjonowanie stosu Z podczas automatyzacji, przejdź do karty Strategia ostrości, aby wybrać opcję Użyj wartości Focus Surface/Z zdefiniowanych przez ustawienia kafelków. Metody alternatywne mogą wykorzystywać inne strategie koncentracji uwagi, ale zaleca się korzystanie z tego ustawienia w celu uzyskania najbardziej spójnych wyników.
   5. Na karcie Kafelki kliknij opcję Sprawdź pozycje i ręcznie ustaw środkową płaszczyznę Z dla każdej pozycji. Ustawienia w podkarcie Opcje uporządkowają pobieranie obrazów, więc sprawdź to przed rozpoczęciem obrazowania. Aby uzyskać obrazy w kolejności, w jakiej zostały zaznaczone pozycje, usuń zaznaczenie pól wyboru Regiony/Pozycje kafelków i Studnie nośne/kontener. Wybierz opcję Podziel sceny na osobne pliki, aby ułatwić przetwarzanie obrazu.
   6. Upewnij się, że karta Z-Stack jest ustawiona na Środek, zakres jest wprowadzany zgodnie z preferencjami użytkownika i wybrany jest przycisk Optymalny, aby ustawić interwał cięcia.
   7. Po zoptymalizowaniu zakładek Tryb pozyskiwania, Kanały, Strategia skupienia, Stos Z i Kafelki rozpocznij eksperyment.
2. Przetwarzanie obrazu
   1. Korzystając z metody przetwarzania wsadowego obrazu, utwórz maksymalne projekcje każdego stosu Z za pomocą metody rozszerzonej głębi ostrości.
   2. Korzystając z metody przetwarzania wsadowego, wyeksportuj maksymalną liczbę plików projekcji jako 16-bitowe obrazy TIFF. Ustaw kompresję na Brak i upewnij się, że zaznaczona jest opcja Oryginalne dane. Otrzymany obraz powinien być maksymalnym TIFF projekcji w skali szarości tylko dla kanału fluorescencji, na którym następuje ekspresja markera lipidowego.

7. Segmentacja i kwantyfikacja

UWAGA: Program LipidUNet został przeszkolony na 40-krotnych obrazach z 96-dołkowej płytki. Zdecydowanie zaleca się używanie zdjęć uzyskanych przy użyciu obiektywu 40x.

1. Zainstaluj oprogramowanie LipidUNet. LipidUNet można pobrać z następującego repozytorium GitHub: https://github.com/RPEGoogleMap/LipidUNet
2. Zidentyfikuj obrazy TIFF reprezentujące Nile Red, Bodipy lub APOE i przenieś je do folderu o nazwie imgs w katalogu o nazwie Nile_Red, Bodipy lub APOE, w zależności od używanej metody.
   UWAGA: Aby program LipidUNet mógł rozpoznać katalogi, należy użyć dokładnych konwencji nazewnictwa.
3. Otwórz oprogramowanie LipidUNet (Rysunek 4).
4. Na karcie Przewiduj oprogramowanie wybierz odpowiedni katalog (Nile_Red, Bodipy lub APOE), klikając wielokropek i przechodząc do nazwanego katalogu. Upewnij się, że program LipidUNet poprawnie zidentyfikował obrazy, sprawdzając wpis Klasa.
5. Wybierz próg prawdopodobieństwa dla algorytmu z zakresu od 0,01 do 0,99. Wyższa wartość wyeliminuje więcej wyników fałszywie dodatnich, ale może spowodować więcej wyników fałszywie ujemnych, a niższe wartości mogą wprowadzić więcej wyników fałszywie dodatnich, eliminując więcej wyników fałszywie ujemnych. Wartość 0,65 jest wartością domyślną i jest zalecana.
6. Kliknij przycisk Predict.
   UWAGA: Oprogramowanie automatycznie przeprowadzi iterację po wszystkich obrazach i utworzy nowy folder o nazwie predicted_masks w wybranym katalogu.
7. Użyj narzędzia do analizy masek, aby iterować po wygenerowanych maskach i podać ilościową liczbę progowych depozytów lipidowych z obrazów masek.
8. Analizuj wygenerowane dane zliczające, aby porównać warunki leczenia.

Rysunek 4: Interfejs użytkownika LipidUNet. Oprogramowanie LipidUNet ma różne sekcje do wyboru dla katalogu danych treningowych, w których obrazy złogów lipidowych zostały poprawnie zidentyfikowane; katalog wag modelu, który jest tworzony na podstawie danych treningowych; oraz katalog danych predykcyjnych, w którym użytkownik wprowadzi swoje obrazy w celu segmentacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Results

Ten protokół umożliwia identyfikację złogów lipidowych zabarwionych przez Nile Red, BODIPY i APOE. Opracowane oprogramowanie może automatycznie identyfikować i określać ilościowo złogi lipidów i działa najlepiej, gdy opisany protokół jest zoptymalizowany. Uwzględniono przykłady skutecznie zróżnicowanych RPE (Rysunek 3A) i słabo zróżnicowanych RPE (Rysunek 3B), ponieważ jakość modelu komórkowego ma ogromny wpływ na jakość prawidłowej segmentacji obrazu.

Dwa z trzech markerów opisanych w protokole, Nile Red i BODIPY, są zidentyfikowane jako małe okrągłe punkty, które są wyraźnie jasne na obrazach fluorescencyjnych (Rysunek 5 i Rysunek 6). "Pozytywnym" obrazem z protokołu byłaby odpowiednia identyfikacja tych odrębnych osadów (Rysunek 5A-D i Rysunek 5E-H). "Negatywny" wynik wykazałby nieprawidłową segmentację obrazu poprzez pomylenie fluorescencji tła z osadem, albo z powodu słabego barwienia ( Rysunek 6A-C i Rysunek 6D-F) lub z powodu wysokiej intensywności tła ( Rysunek 6G-I).

Złoża APOE mają różne rozmiary i kształty, wyglądając bardziej owal lub nieregularnie niż okrągłe złoża Nile Red i BODIPY. Osady te są również mniej punktowe, a intensywność sygnału może się różnić między osadami ze względu na różnice w przepuszczalności próbki. Prawidłowa identyfikacja pozwoli zidentyfikować każde złoże, w tym te, które są mniej nasycone (Rysunek 5I-L), podczas gdy nieprawidłowa segmentacja nie wychwyci tych osadów (Rysunek 6J-L). Dlatego ważne jest, aby zoptymalizować metody barwienia i obrazowania, aby uniknąć drastycznych zmian. Jednym ze sposobów, aby to zrobić, jest zwrócenie szczególnej uwagi na etapy przepuszczalności próbki podczas barwienia immunologicznego. Aby zoptymalizować sygnał fluorescencyjny, komórki mogą być poddawane lizie przed utrwaleniem i barwieniem immunologicznym dla APOE, co skutkuje równomiernym nasyceniem i lepszą segmentacją złogów APOE.

Pod warunkiem są również podzielone na segmenty obrazy komórek dojrzałych na platformie hodowlanej innej niż płytka 96-dołkowa. Oprogramowanie LipidUNet zostało uruchomione na obrazach komórek hodowanych na transwellu i podczas gdy złogi lipidów są progowe, to samo dzieje się z porami w błonie transwell (Rysunek 6M-O). Ze względu na podobieństwo kształtu i rozmiaru, oprogramowanie LipidUNet w swojej obecnej formie będzie masować zarówno złogi lipidów, jak i pory transwell.

Rysunek 5: Reprezentatywne wyniki. (A,E,I) 96-dołkowe RPE są barwione barwnikiem jądrowym Hoechst (niebieski) i albo czerwienią Nilu (magenta), BODIPY (zielony), albo APOE (pomarańczowy) i są projekcjami maksymalnej intensywności komina Z. (B,F,J) Obrazy wejściowe w skali szarości dla oprogramowania LipidUNet po przetworzeniu obrazu. (C,G,K) Maski generowane przez LipidUNet, gdzie wszystkie złoża są poprawnie identyfikowane. (D,H,L) Kontury każdej zamaskowanej cząstki są ponumerowane. Etykiety te pozwalają na powiązanie każdej cząstki na obrazie z wpisem w spreadheet z surowymi danymi. (A-D) pokazuje zabarwienie czerwienią nilową, a oprogramowanie jest w stanie dokładnie rozpoznać osady na tle pomimo słabszego sygnału. (E-H) pokazuje silny kontrast między sygnałem BODIPY a tłem, co jest idealne. LipidUNet poprawnie identyfikuje każde złoże na obrazie. (I-L) pokazuje silny sygnał APOE i reprezentuje zmienność nasycenia sygnału, która jest często obserwowana w przypadku tego zabarwienia. Niemniej jednak segmentacja obrazu jest w stanie zidentyfikować granice każdego złoża APOE. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Nieoptymalne wyniki. (A,D,G,J,M) 96-dobrze platerowane RPE są barwione barwieniem jądrowym Hoechst (niebieskim) i czerwienią Nilu (magenta), BODIPY (zielony) lub APOE (pomarańczowy) i są maksymalnymi projekcjami intensywności komina Z. (B,E,H,K,N) Obrazy wejściowe w skali szarości dla oprogramowania LipidUNet po przetworzeniu obrazu. (C,F,I,L,O) Nieprawidłowe maski wygenerowane przez LipidUNet. Czerwone kółka wskazują miejsca, w których oprogramowanie nieprawidłowo zidentyfikowało złog lipidowy. (A-C) Przetwarzanie czerwieni Nilu jest nieprawidłowe, ponieważ oprogramowanie zidentyfikowało barwienie tła jako osad. Może się to zdarzyć częściej, gdy na obrazie występuje wysokie tło, ale niewiele złogów lipidowych. Pokazano dwa przykłady barwienia BODIPY: obraz o niskiej jakości spowodowany (D-F) słabym barwieniem BODIPY i (G - I) silny sygnał BODIPY z wysokim tłem. W obu przypadkach oprogramowanie nie jest w stanie odróżnić małych, kolistych osadów lipidowych od okrągłego pierścienia tła otaczającego jądro. Chociaż barwienie i obrazowanie powinny być zoptymalizowane, aby uniknąć tych błędów, najnowsza wersja LipidUNet jest znacznie ulepszona dla tych obrazów. (J-L) Nieprawidłowa segmentacja APOE. Ponieważ złoża są bardziej zmienne pod względem wielkości i nasycenia sygnału, oprogramowanie ma trudności z rozpoznaniem niektórych osadów. (od poniedziałku do ocho) RPE wysiewany na transwell i barwiony czerwienią nilową. Wycinek stosu Z jest pokazany tutaj zarówno ze złożami lipidów czerwieni nilowej, jak i porami transwell. Oprogramowanie nie jest w stanie ich rozróżnić, o czym świadczy czerwone kółko zawierające pory transwella i zielona strzałka wskazująca na złoża czerwieni nilowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Porównanie narzędzi do maskowania. (A,B,C) 96-dołkowe RPE ze zmiennymi ilościami osadzania lipidów są identyfikowane jako czerwień nilowa (czerwona). Obrazy są maskowane przy użyciu trzech różnych popularnych metod maskowania, Find Maxima, Max Entropy i Renyi Entropy, i porównywane z maską generowaną przez LipidUNet. Oryginalnemu obrazowi towarzyszy ręczne zliczanie złogów lipidów, podczas gdy maski wyświetlają przewidywane liczby dla każdej metody segmentacji. Średni poziom błędu obliczono dla każdej metody segmentacji przy użyciu następującego wzoru: średnia[(|Przewidywana liczba - Liczenie ręczne|/Liczenie ręczne) x 100]. Maska wygenerowana przez LipidUNet dokładniej identyfikuje złogi lipidów na obrazach ze zmiennym osadzaniem w porównaniu z innymi metodami maskowania (średnie poziomy błędów: 23% LipidUnet, 1164% Find Maxima, 851% Max Entropia, 203% Renyi Entropy). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt. . pkt. pkt. szt.

składnik	Numer kota	Stan magazynowy	Końcowa konc.	Ml
MEM alfa	12571-063	nie		500
Suplement N2	Numer katalogowy: 17502-048	nie	1 proc	5
FBS inaktywowany termicznie	SH30071.03	nie	5 proc.	25
NMEM NEAA	Numer katalogowy: 11140-050	10 mM	0,01 mln	5
Pirogronian sodu	Numer katalogowy: 11360-070	100mM	1mM	5
Penicylina-streptomycyna	Rozdział 15140-122	10000u / ml	100U/ml	5
tauryna	Zobacz materiał T4571	50 mg/ml	250ug/ml	Rozdział 2.5
Hydrokortyzon	Zobacz materiał H6909	18,1 mg/l	20ug/L	0,553
Klasa T3	Zobacz materiał T5516	20ug/L	0,013ug/L	0,33
Objętość całkowita, ml				548 383

Tabela 1: Skład odczynnika RPE-MM. Wykaz odczynników i optymalnych stężeń dla RPE-MM.

Discussion

Protokół ten zapewnia metodę skutecznego znakowania, obrazowania i ilościowego oznaczania złogów lipidów w monogenowych i poligenicznych modelach chorób in vitro dla zwyrodnieniowych chorób oczu. Oprogramowanie oparte na sztucznej inteligencji, LipidUNet, można zastosować do trzech popularnych markerów lipidowych: APOE, czerwieni Nilowej i BODIPY, i zapewnia szybką, automatyczną metodę analizy, która pozwala na standardowe i bezstronne określanie ilościowe.

Głównym ograniczeniem LipidUNet jest fakt, że zestaw danych treningowych dla sztucznej inteligencji był ograniczony do obrazów komórek hodowanych na 96-dołkowej płytce w 40-krotnym powiększeniu. W wyniku zestawu obrazów treningowych, LipidUNet w swojej obecnej formie ogranicza się do analizy obrazów w powiększeniu 40x. Oprogramowanie może być używane do analizy 40-krotnych obrazów komórek hodowanych na innych powierzchniach hodowlanych poza płytką 96-dołkową, ale należy zachować ostrożność w celu zbadania wygenerowanych masek wyjściowych w celu sprawdzenia dokładnego progowania przez oprogramowanie. Potrzeba więcej zestawów obrazów (przy różnych powiększeniach), aby rozszerzyć zakres próbek/obrazów, które może analizować.

Protokół składa się z kilku krytycznych kroków. Na etapie markera lipidowego użytkownik powinien potwierdzić, że wybrany przez niego związek znakujący (BODIPY, APOE, czerwień nilowa) skutecznie oznaczył próbkę. Dojrzałe komórki RPE są często silnie pigmentowane, co może osłabiać sygnał fluorescencyjny barwienia immunologicznego przeciwciał. Gdy sygnał fluorescencyjny jest słaby lub gdy występuje zbyt duże zabarwienie tła, LipidUNet nie jest w stanie dokładnie rozróżnić kropelek lipidów. Z podobnego powodu należy stosować odpowiednio dobrane ustawienia akwizycji dla kroku automatycznego obrazowania protokołu. Jeśli uzyskane obrazy są niskiej jakości, LipidUNet będzie miał trudności z prawidłowym maskowaniem obrazów, a zatem kwantyfikacja będzie niedokładna (Rysunek 6A-L). Wreszcie, przetwarzanie końcowe obrazów jest ważnym krokiem, ponieważ LipidUNet ma określone wymagania dotyczące działania oprogramowania.

W porównaniu z przepływami pracy do analizy lipidów, które wykorzystują ręczne progowanie lub techniki, które obejmują automatyczne progowanie w oprogramowaniu takim jak Fidżi, LipidUNet oferuje bezstronną i wiarygodną segmentację obrazów ze zmiennym osadzaniem lipidów, co znajduje odzwierciedlenie w niewielkim poziomie błędów w identyfikacji cząstek lipidów (ryc. 7). Oprogramowanie pozwala na wprowadzanie przez użytkownika dodatkowych obrazów treningowych, co pozwala na analizę zestawów obrazów poza tymi, które wykorzystują obiektyw o 40-krotnym powiększeniu, a nawet tymi, które wykorzystują inny marker lipidowy, zgodnie z opisem w protokole. W przyszłości oprogramowanie zostanie przeszkolone w zakresie analizy obrazów 3D, tak aby możliwe było ilościowe określenie objętości złogów lipidowych. Choroby zwyrodnieniowe oczu, które wiążą się z odkładaniem się lipidów jako głównym czynnikiem przyczyniającym się do patologii, są powszechne i przewiduje się, że liczba przypadków wzrośnie wraz z powiększaniem się populacji osób starszych¹³. Dokładne modele chorób i skuteczne narzędzia analityczne, jak opisaliśmy w niniejszym protokole, pozwolą na opracowanie nowatorskich interwencji terapeutycznych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22 &mikro; m System filtrów Steriflip	EMD Millipore	SCGP00525
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-144
3,3',5-Triiodo-L-tyronina	Sigma	T5516
Albumina bydlęca, frakcja V	MP Biomedical	160069
Alexa Fluor 555 królik anty-kozi IgG (H+L)	Invitrogen	A21431	APOE przeciwciało drugorzędowe
APOE przeciwciało pierwszorzędowe	Millipore Sigma	AB947
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	Chronić przed światłem
Uzupełnij kompetentną ludzką surowicę	Millipore Sigma	S1-LITR
CTS N2 Suplement	Life Technologies	A13707-01
Hyklon płodu bydlęcego		SH30071.03
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01	Nośniki do montażu szkiełek
Szkiełka nakrywkowe #1 1/2 22 mm x 22 mm	Mikroskopia elektronowa Sciences	72204-01
Szkiełko mikroskopowe 25 mm x 75 mm - grubość 1,2 mm	Mikroskopia elektronowa Sciences	71870-01
Hydrokortyzon	Sigma	H0396
MEM	Alpha Life Technologies	12571-063
MEM endogenne aminokwasy	Life Technologies	11140
Red	Sigma	72485-100MG	Ochrona przed światłem
Paraformaldehyd 16% roztwór,	mikroskopia elektronowa	15710
Penicylina-Paciorkowiec	Technologies	15140-148
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami 10x	Gibco	70011-044
Zewnętrzne segmenty pręta (OS)	InVision Bioresources	98740
Wodorowęglan sodu	Sigma Aldrich	S5761
Pirogronian sodu	Life Technologies	11360-070
Sacharoza	Sigma Aldrich	S1888
SYBR Green Master Mix	Bio-Rad	1725274
Taurine	Sigma	T0625
Triton X-100	Sigma	9002-93-1
Tween 20 Ultrapure	Affymetrix	9005-64-5
Vitronectin	Life Technologies	A14701SA
Y-27632 dichlorowodorek	R& Systemy D	1254