Artykuł metodologiczny

Unikalne podejście do izolowania neutrofili szpiku kostnego szczurów o porównywalnej pojemności

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65506

⸱

26 kwietnia 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Surgery, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Sichuan Provincial Pancreatitis Centre, West China Hospital, Sichuan University, 3West China-Liverpool Biomedical Research Centre, West China Hospital, Sichuan University, 4Cardiovascular Surgery Research Laboratory, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie przedstawia dwie techniki izolowania licznych pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) ze szpiku kostnego szczura. Jedna metoda łączy komercyjny zestaw do izolacji neutrofili z wirowaniem w gradionym przepływie gęstości, podczas gdy druga wykorzystuje tylko wirowanie w gradiencie gęstości. Oba podejścia dają funkcjonalne NET przewyższające te z neutrofili krwi obwodowej.

Streszczenie

Głównym celem tych badań było opracowanie niezawodnego i skutecznego podejścia do izolowania neutrofilowych pułapek zewnątrzkomórkowych (NET) ze szpiku kostnego szczura. Wysiłek ten wynikał z ograniczeń związanych z tradycyjną metodą ekstrakcji NET z krwi obwodowej, głównie ze względu na niedobór dostępnych neutrofili do izolacji. Badanie ujawniło dwie odrębne metodologie pozyskiwania neutrofili szczurów ze szpiku kostnego: uproszczoną jednoetapową procedurę, która zapewniła zadowalający poziom oczyszczania, oraz bardziej czasochłonny dwuetapowy proces, który wykazał zwiększoną skuteczność oczyszczania. Co ważne, obie techniki pozwoliły uzyskać znaczną ilość żywotnych neutrofili, od 50 do 100 milionów na szczura. Skuteczność ta odzwierciedlała wyniki uzyskane podczas izolowania neutrofili zarówno ze źródeł ludzkich, jak i mysich. Co istotne, neutrofile pochodzące ze szpiku kostnego szczura wykazywały porównywalne zdolności do wydzielania NET w porównaniu z neutrofilami uzyskanymi z krwi obwodowej. Jednak metoda oparta na szpiku kostnym konsekwentnie wytwarzała znacznie większe ilości zarówno neutrofili, jak i NET. Podejście to wykazało potencjał uzyskania znacznie większych ilości tych składników komórkowych do dalszych zastosowań. Warto zauważyć, że te izolowane NET i neutrofile są obiecujące dla wielu zastosowań, obejmujących stany zapalne, infekcje i choroby autoimmunologiczne.

Wprowadzenie

Neutrofile stanowią krytyczny podzbiór leukocytów, które odgrywają kluczową rolę w wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Charakteryzują się wielopłatkowymi jądrami i granulkami zawierającymi różne proteazy i peptydy przeciwdrobnoustrojowe1. Neutrofile działają głównie poprzez degranulację, fagocytozę i tworzenie NET. Obserwacja NET została po raz pierwszy dokonana przez Takei i wsp. w 1996 roku podczas eksperymentu, w którym neutrofile były stymulowane octanem mirystynianu forbolu (PMA)2. Następnie, proces powstawania NET został ukuty przez Brinkmanna i in. jako "NETosis" przez Brinkmanna i in.3 w 2004 roku. Ich badania dodatkowo rzuciły światło na kluczową rolę NET w odpowiedziach przeciwdrobnoustrojowych za pośrednictwem neutrofili. NET to struktury przypominające sieć składające się z chromatyny, histonów i białek przeciwdrobnoustrojowych, które są uwalniane z aktywowanych neutrofili w odpowiedzi na bodźce zakaźne i zapalne. NET mogą unieruchamiać i zabijać atakujące patogeny, zatrzymując je i wystawiając na działanie wysokiego stężenia peptydów i proteaz przeciwdrobnoustrojowych1,3. Dodatkowo NET przyczyniają się do usuwania komórek apoptotycznych i uczestniczą w rozwiązywaniu stanu zapalnego. Ostatnie badania wskazują również, że nadmierne tworzenie NET lub upośledzona degradacja NET może prowadzić do uszkodzenia tkanek, zaburzeń autoimmunologicznych, trombogenezy i upośledzenia rewaskularyzacji4,5,6,7,8,9,10.

Patogenna rola NET w niekontrolowanym zwłóknieniu po zawale mięśnia sercowego i powstawaniu tętniaków komorowych została wykazana poprzez ekspansję zwłóknienia okołonaczyniowego4,11. Model zawału mięśnia sercowego i izolacja neutrofili ze szpiku kostnego u myszy są dobrze znane. Leukocyty wielojądrzaste (PMN), rodzaj białych krwinek obfitujących w ludzką krew, służą jako doskonałe źródło do izolowania ludzkich neutrofili. Ta metoda eliminuje konieczność pobierania szpiku kostnego, zwiększając w ten sposób bezpieczeństwo i wydajność.

NET również odgrywają rolę w migotaniu przedsionków związanym z przebudową serca. Jednak duże zwierzęta, takie jak psy i świnie, zostały wykorzystane do modelowania migotania przedsionków, ponieważ myszy nie mają przedsionka wystarczająco dużego, aby ustanowić cykl ponownego wejścia lub model AF, chyba że określone kanały jonowe lub szlaki sygnałowe zostaną powalone lub znokautowane12. Chociaż możliwe jest wywołanie migotania przedsionków u szczurów i wyizolowanie neutrofili z krwi obwodowej szczura, jak opisano wcześniej, naukowcy napotkali ograniczenie, dzięki któremu z krwi obwodowej można było wyizolować tylko 2 x 105-5 x 105 neutrofili (10 ml na szczura). Ekstrakcja wystarczającej ilości NET w każdym punkcie czasowym wymagała około 10-25 szczurów (w sumie 5 x 106 neutrofili), co skutkowało czasochłonnym, kosztownym i często mało wydajnym procesem13. W związku z tym Li He i współpracownicy prezentują strategię zorientowaną na szpik kostny, aby uzyskać odpowiednie NET od szczurów14. W swoim artykule przedstawili wyczerpujący opis izolowania neutrofili ze szpiku kostnego szczura i porównali możliwości wydzielania NET neutrofili obwodowych i szpiku kostnego szczurów. Dwie opisane metody służą różnym celom eksperymentalnym, a obie skutkują wystarczającą ilością neutrofili w szpiku kostnym szczurów przy jednoczesnym zmniejszeniu liczby wymaganych szczurów. Dwuetapowa metoda izolacji wykazała lepsze oczyszczanie neutrofili, podczas gdy metoda jednoetapowa okazała się efektywna czasowo przy akceptowalnych poziomach oczyszczania. Ponadto naukowcy porównali NETozę i tworzenie NET między neutrofilami szpiku kostnego szczura a ich obwodowymi odpowiednikami, stwierdzając taką samą siłę działania jak PMN. Odkrycia te znacząco przyczyniają się do badań nad migotaniem przedsionków związanych z neutrofilami i podkreślają znaczenie elastycznego wyboru różnych źródeł izolacji neutrofili u różnych zwierząt doświadczalnych o różnym rozmieszczeniu neutrofili

.

Protokół

Badanie zostało przeprowadzone na podstawie licencji projektu (nr 20211404A) udzielonej przez Komitet Etyki Zwierząt Szpitala Zachodniochińskiego, Uniwersytet Sichuan, zgodnie z wytycznymi Komisji Etyki Zwierząt Szpitala Zachodniochińskiego, Uniwersytetu Syczuańskiego w zakresie opieki i wykorzystywania zwierząt. Zgodnie z wytycznymi etycznymi, szczury wykorzystane w tym badaniu były utrzymywane w kontrolowanym środowisku z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności, temperaturą 22-24 °C i wilgotnością 50%-60%. Szczury miały dostęp do pożywienia i wody ad libitum. Zwierzętami wykorzystanymi w tym badaniu były 6-8 tygodniowe samce szczurów Sprague Dawley (SD), ważące około 250 g i wolne od specyficznych patogenów. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów).

1. Izolacja neutrofili szczurów

  1. Pobieranie szpiku kostnego
    1. Umieść szczura w odpowiednim pojemniku do znieczulenia (patrz Tabela materiałów). Podawać szczurowi 3% izofluranu do momentu, gdy zwierzę straci przytomność. Sprawdź, czy nie ma reakcji na uszczypnięcie palca u nogi lub ogona, aby upewnić się, że znieczulenie jest głębokie.
    2. Gdy szczur jest głęboko znieczulony, wykonaj zwichnięcie szyjki macicy, kładąc szczura na plecach i trzymając go za ogon jedną ręką, a drugą chwytając głowę. Zwichnij szyję szybko i stanowczo, przykładając nagłą i silną siłę do góry na ogon, jednocześnie ciągnąc głowę w dół, aż do przecięcia kręgosłupa szyjnego. Poczekaj na potwierdzenie śmierci, takie jak zaprzestanie oddychania i brak bicia serca, zanim przystąpisz do pobierania lub usuwania tkanek.
    3. Zanurz szczura w 75% etanolu i pozostaw na kilka minut, aby wysterylizować futro i skórę. Połóż szczura na plecach i odetnij kończyny dolne w biodrze, aby chronić głowę kości udowej. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć więzadło w stawie skokowym i złóż staw kolanowy do tyłu, aby odsłonić kość udową i piszczelową.
    4. Za pomocą kleszczy i nożyczek ostrożnie usuń wszelkie mięśnie, ścięgna i inne tkanki połączone z kośćmi. Opłucz kości zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS), aby usunąć wszelkie pozostałe resztki tkanek i krew. Powtórz jeszcze dwa razy, w sumie trzy prania. Oczyszczone kości należy umieścić w sterylnym pojemniku.
    5. Użyj strzykawki o pojemności 5 lub 10 ml z igłą, aby przebić szpik przez oba końce kości, aby poluzować macierz szpiku. Przepłukać szpik kostny 10-15 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) inną strzykawką, aż nie będzie można wypłukać widocznego szpiku kostnego.
    6. Odwirować komórki szpiku kostnego przy sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C. Dodać 5-10 ml buforu do lizy czerwonych krwinek (patrz Tabela Materiałów) w celu ponownego zawieszenia komórek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Dodać do mieszaniny 4-krotność objętości HBSS. Odwirować komórki przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, wyrzucić supernatant za pomocą pipety i użyć powstałego osadu do dalszego wykorzystania.
  2. Izolacja neutrofili ze szpiku kostnego
    1. W przypadku metody dwuetapowej wykonaj następujące dodatkowe kroki:
      1. Wyizolować komórki szpiku kostnego za pomocą komercyjnego zestawu do izolacji neutrofili szczurów, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
      2. Przygotować gradient gęstości, nakładając warstwy 2 ml 55% odczynnika perkolowego (patrz Tabela materiałów), 2 ml 65% odczynnika, 2 ml 70% odczynnika i 2 ml 80% odczynnika w nowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę o sile 800 x g przez 40 minut w temperaturze 20 °C, z przyspieszeniem ustawionym na 5 i opóźnieniem ustawionym na 0 lub 1.
      3. Zebrać warstwę gradientu 70%, w tym warstwy komórek na granicy między odczynnikiem gradientu 65% i 70%, za pomocą sterylnej pipety. Przenieść zawiesinę komórkową do nowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodaj 15 ml HBSS do probówki i delikatnie odwróć probówkę kilka razy, aby umyć komórki. Odwirować probówkę o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby granulować komórki.
    2. W przypadku metody jednoetapowej wykonaj następujące dodatkowe kroki:
      1. Poddaj komórki szpiku kostnego gradientom bez użycia zestawu do izolacji neutrofili szczura.
      2. Zebrać warstwę gradientu 70%, w tym warstwy komórek na granicy gradientu od 65% do 70%, za pomocą sterylnej pipety. Przenieść zawiesinę komórek do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i przemyć komórki HBSS. Odwirować probówkę o masie 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby osadzać komórki.
      3. Policz wyizolowane neutrofile za pomocą hemocytometru i oceń żywotność za pomocą barwienia błękitem trypanowym.
        UWAGA: Protokół może być modyfikowany w zależności od liczby szczurów i pożądanej liczby izolowanych neutrofili. Dopuszczalna ilość kości jest uzyskiwana od trzech szczurów, gdy metoda ta jest stosowana po raz pierwszy w nowych warunkach doświadczalnych. Wszystkie zabiegi powinny być wykonywane w sterylnych warunkach. Izolację neutrofili ze szpiku kostnego należy przeprowadzić tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować uszkodzenie komórek i utratę żywotności.

2. Pozyskiwanie szczurzych sieci NET

  1. Zawiesić 0,5 x 108-1 x 108 wyizolowanych neutrofili w 4 ml pożywki RPMI (uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną) na sterylnej 10-centymetrowej szalce Petriego.
  2. Dodać 500 nM PMA (patrz tabela materiałów) do zawiesiny neutrofili w celu wywołania NETozy. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. W celu kontroli ujemnej dodać DNazę I (10 U/ml) do zawiesiny neutrofili w celu degradacji wydzielanych NET.
  4. Aby zebrać NETs, wyjmij pożywkę i delikatnie umyj NET przymocowane do szalki Petriego za pomocą HBSS. Następnie użyj intensywnego płukania 4 ml świeżego podłoża dla każdej płytki, aby odłączyć siatki od płytki.
  5. Zbierać pożywkę płuczącą i często pipetować w celu całkowitego ponownego zawieszenia NET.
  6. Odwirować zawiesinę o stężeniu 300 × g przez 10 minut w temperaturze 20 °C w celu usunięcia wszelkich pływających komórek.
  7. Przenieść zawiesinę zawierającą NET do sterylnej probówki i przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszego wykorzystania w ciągu 2 tygodni.
    UWAGA: Siatki są wrażliwe na degradację, dlatego w celu uzyskania najlepszych rezultatów zaleca się stosowanie świeżo zebranego materiału.

3. Weryfikacja obecności sieci NET

  1. Utrwal komórki (od kroku 2.4) na szkiełkach nakrywkowych z 4% paraformaldehydem przez 15 minut i NET (od kroku 2.7) przez 30 minut do 1 godziny.
  2. Odwróć szkiełko nakrywkowe na kroplę PBS/PBST na stojaku na probówkę pokrytą folią parafinową i powtórz proces mycia trzy razy po 5 minut.
  3. Przepuszczalność komórek 0,5% Triton-X-100 przez 10 minut w temperaturze pokojowej i trzykrotne mycie w PBS/PBST przez 1 minutę każde. Zapieczętuj komórki 10% normalną surowicą osła (patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  4. Inkubować komórki z przeciwciałem przeciwko elastazie neutrofilowej u szczurów i przeciwciałem przeciwko szczurzej mieloperoksydazie (patrz tabela materiałów) przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie umyj szkiełko nakrywkowe w PBS/PBST trzy razy po 5 minut każde.
  5. Inkubować komórki z drugorzędowym przeciwciałem IgG przeciwko królikowi IgG (H + L) sprzężonym z A488, anty-mysim IgG (H + L) sprzężonym z A594 osłem i A594 sprzężonym z kozim, anty-mysim, IgG1 (patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności. Następnie umyj szkiełko nakrywkowe w PBS/PBST trzy razy po 5 minut każde.
  6. Jądra komórek barwiących i szkielety NET o stężeniu 10 mg/ml DAPI. Następnie umyj szkiełko nakrywkowe w PBS/PBST trzy razy po 5 minut każde.
  7. Umieść kroplę podłoża montażowego na szkiełku podstawowym i odwróć szkiełko nakrywkowe z komórkami. Pozostaw do wyschnięcia na 1 godzinę w celu analizy mikroskopowej za pomocą soczewek zanurzeniowych; w przeciwnym razie jest gotowy do inspekcji.
    UWAGA: Należy zachować dużą ostrożność podczas manipulowania sieciami, nawet po fiksacji, ponieważ są one niezwykle delikatne i mogą łatwo zostać zgubione podczas przygotowania.

4. Kwantyfikacja NET

  1. Przygotować bufor Tris-EDTA (TE) i roztwór roboczy PicoGreen (odczynnik do testu dsDNA) zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
  2. Przygotować wzorce, rozcieńczając podstawowe DNA do stężeń 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml i 1 μg/ml.
    UWAGA: Aby określić ilościowo stężenie NET, zastosowano zestaw do oznaczania dsDNA (patrz tabela materiałów), zgodnie z wytycznymi producenta. Bufor Tris-EDTA (TE) i odczynniki do oznaczania dsDNA przygotowano przy użyciu odpowiednio 19-krotnej objętości podwójnie destylowanej wody lub 199-krotnej objętości buforu TE. Następnie przygotowano roztwory wzorcowe (1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml i 1 μg/ml), a każde 50 μl próbki połączono z 450 μl buforu TE.
  3. Dodać 50 μl każdej próbki do 450 μl buforu TE.
  4. Dodać 100 μl wzorców lub próbek wraz z równą objętością roztworu roboczego odczynnika do oznaczania do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce, w tym wzorców i próbek.
  5. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 2-5 minut, unikając bezpośredniego światła.
  6. Odczytać próbki za pomocą czytnika mikropłytek fluorescencyjnych o widmie emisyjnym około 530 nm i widmie absorbancji około 480 nm.
  7. Obliczyć stężenie NET w każdej próbce, korzystając z krzywej wzorcowej wygenerowanej przez wzorce.

5. Analiza wydzielania NET za pomocą cytometrii komórkowej

  1. Dodać barwienie jądra (patrz tabela materiałów) do komórek inkubowanych na 96-dołkowej płytce, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 ng/ml i inkubować przez 30 minut.
  2. Dodać do komórek barwnik DNA bezkomórkowego (cfDNA, patrz tabela materiałów), aby osiągnąć końcowe stężenie 300 nM i inkubować przez 10 minut.
  3. Wymieszać barwniki fluorescencyjne przez delikatne pipetowanie. Nie wyrzucać supernatantu ani nie myć osadu.
  4. Załadować płytkę z próbką do przyrządu do cytometru.
  5. Ustaw parametry ostrości i czasu ekspozycji dla różnych kanałów: niebieski (np. 377/50 nm, em: 470/22 nm), zwykle z ekspozycją 30 000 ms, zielony (np. 483/32 nm, eM: 536/40 nm) zwykle z ekspozycją 5 000 ms.
  6. Rejestruj bardzo jednolite obrazy całej płyty w różnych kanałach.
  7. Przeanalizuj liczbę zabarwień jądra dla różnych grup. Jeśli są podobne, wydzielanie NET można określić na podstawie liczby barwień cfDNA.

Wyniki

Opisany w niniejszym dokumencie protokół przedstawia dwie odrębne metody, z których każda charakteryzuje się albo lepszym oczyszczaniem, albo usprawnionymi krokami. Obie metody pozwoliły uzyskać około 0,5 x 108-1 x 108 neutrofili na szczura. Analiza cytometryczna, z wykorzystaniem zestawu do wykrywania apoptozy annexin V-FITC/PI, wykazała żywotność komórek powyżej 90%, co jest porównywalne z wynikami dla myszy i ludzi (Rycina 1). Choć zanieczyszczenie limfocytami wydawało się nieuniknione podczas izolacji neutrofili z szpiku kostnego, metoda dwuetapowa wykazała wyższy poziom czystości wynoszący 90% w porównaniu do 50% osiągniętych w metodzie jednoetapowej (Rycina 2).

Podobne odpowiedzi w zakresie sekrecji NET były zauważalne pomiędzy neutrofilami obwodowymi a szpikiem kostnym, niezależnie od stymulacji PMA (Rysunek 3). Ponadto NET szczurze wykazały ograniczone możliwości sieciowania ze sobą (Rysunek 4). W celu dokładniejszego zbadania procesu NETozy u szczurów zastosowano PMA jako induktor. NET wykryto poprzez barwienie cfDNA, a pełne obrazy zarejestrowano za pomocą analizatora obrazowania komórkowego. Co istotne, neutrofile szczurze wykazywały wyższą skłonność do spontanicznej NETozy w porównaniu z neutrofilami mysimi i ludzkimi, nawet bez zewnętrznej stymulacji. Inkubacja z PMA doprowadziła do 10% wzrostu zawartości cfDNA po 4 h (Rysunek 5). Po wystawieniu na 500 nM PMA, szpik kostny każdego szczura dostarczył końcowe stężenie 8-12 µg/mL NET-DNA. Warto zauważyć, że zawartość wewnątrzkomórkowa w neutrofilach szczurzych nie została całkowicie wydalona podczas NETozy, co skutkowało obserwacją licznych komponentów wewnątrzkomórkowych. Ponadto NET szczurze wykazywały tendencję do tworzenia filmu przypominającego gazę ze względu na zwiększone właściwości adhezyjne, prezentując charakterystyczny wygląd przypominający chmurę.

Wykres kropkowy z cytometrii przepływowej, Annexin V-FITC vs PI, analiza apoptozy, rozkład w kwadrantach.
Rysunek 1: Ocena żywotności neutrofili po izolacji z szpiku kostnego. Optymalnym źródłem izolacji neutrofili szczura jest szpik kostny, co ułatwia późniejsze pozyskanie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych. Rysunek został opracowany na podstawie pracy He et al.14. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Barwienie komórek w badaniu histologicznym, obrazy mikroskopowe A-C, powiększenie 20 μm, porównanie gęstości komórkowej.
Rycina 2Oczyszczanie neutrofili z krwi obwodowej i szpiku kostnego poprzez Barwienie metodą Wright-Giemsa. (A) pochodzenie z krwi obwodowej. (B) Pochodzenie z szpiku kostnego poprzez metoda jednotapowa. (C) Pochodzenie z szpiku kostnego poprzez metoda dwuetapowa. Ekstrakcja szpiku kostnego jest preferowaną metodą izolacji neutrofili szczurzych i późniejszego pozyskiwania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili. Pasek skali = 20 µmPowiększenie = 400x. Rysunek opracowano na podstawie pracy He i wsp.14. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy poziomów dsDNA w neutrofilach obwodowych i szpiku kostnego; efekt aktywacji neutrofili.
Rysunek 3: Wydzielanie NET po inkubacji z PMA lub PMA + DNase I. Pobieranie szpiku kostnego stanowi preferowaną metodę izolacji neutrofili szczura oraz późniejszego gromadzenia zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilnych. Rysunek zaadaptowano z He et al.14. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; lokalizacja komórkowa; jądra (niebieskie), białka (zielone), obraz złożony.
Rycina 4: Analiza immunofluorescencyjna. Barwienie immunofluorescencyjne jądra (niebieski, A), MPO (zielony, B) oraz obraz złożony (C). NET: zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe; MPO: mieloperoksydaza. Ekstrakcja z szpiku kostnego jest preferowaną metodą izolacji neutrofili szczura i późniejszego gromadzenia zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych. Pasek skali = 50 µm. Powiększenie = 200x. Rycina opracowano na podstawie He et al.14. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Mikroskopia fluorescencyjna, barwienie DNA, SytoxGreen, Hoechst, diagram porównawczy traktowania PMA.
Rysunek 5: Kompleksowa analiza cfDNA za pomocą analizatora obrazowania komórek w różnych warunkach. Barwienie fluorescencyjne cfDNA (zielony) i jądra komórkowego (niebieski). Ekstrakcja z szpiku kostnego jest główną metodą izolacji neutrofili szczura i następującego po niej zbierania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili. Pasek skali = 500 µm. Rysunek zaadaptowany z He et al.14. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Izolacja neutrofili stanowi kluczowy krok w badaniu NETosis, gdzie wybór odpowiedniej metody izolacji ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych wyników. Ważnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest wystąpienie zanieczyszczenia limfocytów podczas izolacji. Sprostanie temu wyzwaniu jest szczególnie istotne w przypadku izolowania neutrofili szczurów od szpiku kostnego. Pomimo wyraźnego zakresu gęstości neutrofili (1,0814-1,0919, ze szczytem 1,0919) w porównaniu z limfocytami (1,0337-1,0765, ze szczytem 1,0526), zanieczyszczenie limfocytami pozostaje nieuniknione. Można to częściowo przypisać obfitości limfocytów w szpiku kostnym i zwiększonej gęstości niedojrzałych limfocytów15. Techniki takie jak separacja w gradionym gradinie gęstości, takie jak stosowanie Percollu i Ficollu, mogą pomóc w ograniczeniu zanieczyszczenia limfocytów, chociaż osiągnięcie całkowitej eliminacji limfocytów może być trudne. Specjalistyczny roztwór Percoll, skalibrowany do określonego gradientu gęstości, może być zastosowany w celu zminimalizowania zanieczyszczenia poprzez wykorzystanie różnicy gęstości między neutrofilami szczura a innymi komórkami szpiku kostnego. Dlatego badacze powinni rozsądnie ocenić potencjalny wpływ zanieczyszczenia limfocytami na wyniki eksperymentów i podjąć działania w celu złagodzenia jego wpływu.

Badanie to podkreśla znaczenie dostosowania metod izolacji do konkretnych wymagań eksperymentalnych. W metodzie opisanej wcześniej14 metoda jednoetapowa okazała się mniej wymagająca pod względem czasu i wysiłku. W związku z tym został zatwierdzony do nabycia NET ze względu na nieistotny wpływ zanieczyszczenia limfocytów na wydzielanie NET. Limfocyty te mogą być następnie eliminowane na końcowym etapie wirowania. I odwrotnie, w przypadku prób obejmujących izolację neutrofili i późniejszą ocenę NETozy i wydzielania NET, zalecono metodę dwuetapową14. Podejście to pozwoliło na precyzyjną kwantyfikację NET wytwarzanych przez neutrofile, przy jednoczesnym zminimalizowaniu wpływu potencjalnych czynników zakłócających wynikających z innych zanieczyszczeń komórkowych.

W protokole izolacji można wprowadzić modyfikacje w celu zwiększenia zarówno wydajności, jak i czystości. Na przykład zastosowanie zoptymalizowanego zestawu odczynników o gradiencie gęstości może dać więcej neutrofili. Delikatne metody pipetowania i mycia mogą również złagodzić utratę komórek i zwiększyć czystość. Działania związane z rozwiązywaniem problemów, takie jak monitorowanie pH i temperatury bufora, wraz z dostosowaniem parametrów wirowania, mogą skutecznie rozwiązać problemy napotkane podczas procesu izolacji. Związane z tym ograniczenie izolacji szpiku kostnego polega na prawdopodobieństwie zanieczyszczenia niedojrzałych neutrofili i innych komórek szpiku kostnego, co wpływa zarówno na czystość, jak i wydajność. Opracowanie uproszczonego podejścia do wydalania limfocytów może zwiększyć ogólną skuteczność izolacji. Inne ograniczenie dotyczy konieczności składania ofiar zwierzęcych w celu izolacji szpiku kostnego, co może być nieodpowiednie dla badań podłużnych neutrofili u szczurów in vivo.

Izolacja neutrofili u ludzi opiera się głównie na krwi obwodowej. Konwencjonalne metody obejmują separację Ficoll-Paque, Percoll i immunomagnetyczną separację kulek 16,17,18. Metoda Ficoll segreguje populacje leukocytów na podstawie wyporu i opiera się na środku kontrastowym w celu różnicowania neutrofili. Oferuje prostotę i opłacalność, ale idzie na kompromis w zakresie czystości i wydajności oraz stanowi wyzwanie w eliminacji czerwonych krwinek. Z drugiej strony, Percoll wykorzystuje gradienty gęstości, uzyskując większą czystość i wydajność neutrofili kosztem specjalistycznego sprzętu oraz zwiększonych wydatków i czasu19. Separacja kulek immunomagnetycznych jest nowszą, bardziej specyficzną techniką wykorzystującą kulki magnetyczne sprzężone z przeciwciałami, które specyficznie wiążą się z neutrofilami przy minimalnym zanieczyszczeniu innymi leukocytami. Chociaż można go zautomatyzować, wymaga specjalistycznego sprzętu i wiąże się z wyższymi kosztami ze względu na wydatki na koraliki. Wybierając metodę izolacji neutrofili, naukowcy muszą rozważyć wydajność, czystość, koszt i złożoność. Obecnie najwygodniejszą metodą izolacji neutrofili u ludzi jest użycie PolymorphPrep20. Takie podejście pozwala uzyskać wysoce oczyszczone neutrofile w znacznych ilościach w krótkim czasie. Zasada działania PolymorphPrep opiera się na separacji komórek w zależności od gęstości.

U myszy izolowanie neutrofili od krwi obwodowej jest niewskazane ze względu na małą objętość krwi i wyzwanie związane z zapewnieniem wystarczającej ilości i czystości do dalszych eksperymentów. Pomimo tego, że szczury dostarczają wystarczającą ilość krwi (10 ml na szczura), ich cechy krwi obwodowej różnią się od cech ludzi i myszy. Szczury z natury wykazują niedobory w ekstrakcji neutrofili, przy czym monocyty są najliczniejszymi komórkami jądrzastymi13,14. W związku z tym izolacja krwi obwodowej dostarcza tylko 2 x 105-5 x 105 neutrofili od jednego szczura. Szpik kostny służy jako bardziej żywotne źródło neutrofili, oferując łatwo dostępne i obfite zaopatrzenie niezależnie od statusu infekcji zwierzęcia. Alternatywnie, indukowanie środowiska zapalnego w jamie brzusznej lub klatce piersiowej w celu zwiększenia infiltracji neutrofili w celu izolacji jest zawodne i skomplikowane. W związku z tym ekstrakcja szpiku kostnego jawi się jako praktyczna i niezawodna metoda izolacji neutrofili szczurów21.

NEToza obejmuje różnorodne procesy komórkowe obejmujące dekondensację DNA, autofagię i wydalanie macierzy wewnątrzkomórkowej1. U ludzi ekstruzja NET jest kompleksowa, pozostawiając resztki błony komórkowej. Co ciekawe, badania neutrofili na szczurach wykazują rozbieżne wzorce, ujawniając więcej zawartości wewnątrzkomórkowej po stymulacji. Pomimo stymulacji PMA, neutrofile szczurów wykazują niepełną ekstruzję NET, co jest zgodne z ich spontaniczną NETosis. Co ciekawe, szczurze sieci NET wykazują skłonność do zagregowanych form (aggNET), a nie rozległej struktury sieciowej, potencjalnie ze względu na zmniejszoną zdolność do sieciowania. Zjawisko to może znacząco wpłynąć na agregację neutrofili, wpływając na szerszą odpowiedź immunologiczną u szczurów. Przyszłe zastosowania izolacji szpiku kostnego mogą obejmować badanie odrębnych szlaków sygnałowych i komórek odpornościowych w NETosis. Ponadto metoda ta może ułatwić badanie NETozy w różnych modelach choroby, odkrywając rolę neutrofili w różnych patologiach. Ostatecznie, nowatorskie techniki izolowania i charakteryzowania NET dają nadzieję na rozwikłanie mechanizmów napędzających NETosis i jej funkcjonalnych implikacji w różnych modelach zwierzęcych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Finansowanie: Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 82004154, 81900311, 82100336 i 81970345).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
A488-sprzężony osł anty-IgG(H + L)Invitrogen, USAA32790
A594-sprzężony osł anty-mysi IgG(H + L)Invitrogen, USAA32744
A594-sprzężony kozioł anty-mysi IgG1 Invitrogen, Stany ZjednoczoneA21125
Przeciw szczurzej mieloperoksydazieAbcam, Angliaab134132
Elastaza neutrofilowa przeciw szczuromAbcam, Angliaab21595
Cytometr obrazowy CeligoNexelom, USA200-BFFL-5C
DNase ISigma, USA10104159001
płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco, Stany Zjednoczone10099141C
Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS)Gibco, Stany ZjednoczoneC14175500BT
HoechstThermofisher, USA33342
IzofluranRWD, ChinyR510-22-10
MowiolSigma, USA81381
Normalna surowica osłaSolarbio, ChinySL050
Paraformaldehydbiosharp, ChinyBL539A
Hyklon penicyliny-streptomycyny, USASV30010
PercollGE, Stany ZjednoczoneP8370-1L
12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA)Sigma, Stany Zjednoczone  P1585
Zestaw do oznaczania Picogreen dsDNAInvitrogen, USAP11496
Zestaw do izolacji neutrofili szczurówSolarbio, ChinyP9200
Bufor do lizy czerwonych krwinekSolarbio, ChinyR1010
Pożywka dla Roswell Park Memorial Institute (RPMI),USASH30809.01B
RWD Uniwersalna maszyna do znieczulania zwierzątRWD, ChinyR500
Szczury Sprague Dawley (SD)Dashuo, Chiny
SytoxGreenThermofisher, USABufor S7020
Tris-EDTA (TE)Solarbio, ChinyT1120
Triton-X-100Biofroxx, niemiecki1139ML100

Bibliografia

  1. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
  2. Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Li, T., et al. Neutrophil extracellular traps induce intestinal damage and thrombotic tendency in inflammatory bowel disease. Journal of Crohn's and Colitis. 14 (2), 240-253 (2020).
  5. Laridan, E., Martinod, K., De Meyer, S. F. Neutrophil extracellular traps in arterial and venous thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
  6. Dinallo, V., et al. Neutrophil Extracellular traps sustain inflammatory signals in ulcerative colitis. Journal of Crohn's and Colitis. 13 (6), 772-784 (2019).
  7. Dicker, A. J., et al. Neutrophil extracellular traps are associated with disease severity and microbiota diversity in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 117-127 (2018).
  8. Franck, G., et al. Roles of PAD4 and netosis in experimental atherosclerosis and arterial injury: Implications for superficial erosion. Atherosclerosis. 275, e11(2018).
  9. Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
  10. Marin-Esteban, V., et al. Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells. Infection and Immunity. 80 (5), 1891-1899 (2012).
  11. Kang, L., et al. Neutrophil extracellular traps released by neutrophils impair revascularization and vascular remodeling after stroke. Nature Communications. 11 (1), 2488(2020).
  12. Schüttler, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
  13. Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified human neutrophil extracellular traps (NETs) isolation and handling. Journal of Visualized Experiments. 98, e52687(2015).
  14. He, L., et al. Bone marrow is the preferred source for isolation of rat neutrophils and the subsequent acquisition of neutrophil extracellular traps. Annals of Translational Medicine. 10 (15), 823-823 (2022).
  15. Freeman, G. E., Dalton, C. A., Brooks, P. M. A Nycodenz gradient method for the purification of neutrophils from the peripheral blood of rats. Journal of Immunological Methods. 139 (2), 241-249 (1991).
  16. Zindl, C. L., et al. IL-22-producing neutrophils contribute to antimicrobial defense and restitution of colonic epithelial integrity during colitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12768-12773 (2013).
  17. Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
  18. Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).
  19. Lindena, J., Burkhardt, H. Separation and chemiluminescence properties of human, canine and rat polymorphonuclear cells. Journal of Immunological Methods. 115 (1), 141-147 (1988).
  20. Lauwers, M., et al. Optimization of the Transwell assay for the analysis of neutrophil chemotaxis using flow cytometry to refine the clinical investigation of immunodeficient patients. Clinical Immunology. 238, 108994(2022).
  21. Evrard, M., et al. Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions. Immunity. 48 (2), 364-379 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

izolacja neutrofilizewn trzkom rkowe pu apki neutrofilowetworzenie NETgradient g sto cineutrofile z krwi obwodowejywotno kom rekstymulacja PMAwolnokom rkowe DNAfluorescencyjny czytnik mikrop ytek

Powiązane artykuły