Kwantyfikacja, ocena żywotności i strategie wizualizacji biofilmów Acinetobacter

Summary

Ten protokół opisuje przygotowanie inokulum, kwantyfikację biofilmu na płytkach mikromiareczkowych za pomocą barwnika fioletu krystalicznego, liczenie żywotnych w biofilmach oraz wizualizację biofilmów Acinetobacter.

Abstract

Acinetobacter powoduje infekcje szpitalne, a tworzenie się jego biofilmu może przyczynić się do przetrwania na suchych powierzchniach, takich jak szpitale. W związku z tym kwantyfikacja i wizualizacja biofilmu są ważnymi metodami oceny potencjału szczepów Acinetobacter do wywoływania zakażeń szpitalnych. Biofilmy tworzące się na powierzchni mikropłytki można określić ilościowo pod względem objętości i liczby komórek. Objętość biofilmu można określić ilościowo poprzez barwienie za pomocą fioletu krystalicznego, mycie, odbarwianie za pomocą etanolu, a następnie pomiar rozpuszczonego barwnika za pomocą czytnika mikropłytek. Aby określić ilościowo liczbę komórek osadzonych w biofilmach, biofilmy są zeskrobywane za pomocą skrobaków do komórek, zbierane w roztworze soli, energicznie mieszane w obecności szklanych kulek i rozprowadzane na agarze Acinetobacter. Następnie płytki inkubuje się w temperaturze 30 °C przez 24-42 godziny. Po inkubacji czerwone kolonie są liczone w celu oszacowania liczby komórek w biofilmach. Ta realna metoda liczenia może być również przydatna do liczenia komórek Acinetobacter w biofilmach mieszanych gatunków. Biofilmy Acinetobacter można wizualizować za pomocą barwników fluorescencyjnych. Dostępna na rynku mikropłytka przeznaczona do analizy mikroskopowej jest wykorzystywana do tworzenia biofilmów. Następnie biofilmy przyczepione do dolnej powierzchni są barwione barwnikami SYTO9 i jodku propydyny, przemywane, a następnie wizualizowane za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Introduction

Acinetobacter jest znany z wywoływania infekcji szpitalnych, a jego zakażenie u ludzi, szczególnie w placówkach służby zdrowia, jest coraz częściej zgłaszane¹. Jest szeroko rozpowszechniony w szpitalach, placówkach opieki zdrowotnej i środowiskach związanych z żywnością^2,3,4. Może przetrwać przez długi czas w środowiskach, w tym na powierzchniach szpitalnych, takich jak poręcze łóżek, stoliki nocne, powierzchnia wentylatorów i zlewozmywaki⁴. Takie utrzymywanie się na powierzchniach środowiskowych może być jednym z istotnych czynników przyczyniających się do zakażeń szpitalnych Acinetobacter⁴.

Biofilm jest formą życia mikrobiologicznego i jest mikrobiologiczną matrycą złożoną z żywych komórek mikrobiologicznych i zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych (EPS) z komórek⁵. Komórki mikrobiologiczne są osadzone w matrycy i często są wysoce odporne na stresy środowiskowe, takie jak ciepło, sole, suchość, antybiotyki, środki dezynfekujące i siły ścinające^6,7.

Acinetobacter może tworzyć biofilmy na powierzchniach, co sugeruje, że może przyczynić się do wydłużenia przeżywalności na powierzchniach środowiskowych, w tym na powierzchniach szpitalnych, oraz do zwiększenia odporności na leczenie antybiotykami8^,9. Ponadto tworzenie się biofilmu przez Acinetobacter może być silnie związane z wynikami klinicznymi u ludzi⁸. W związku z tym zdolność do formowania biofilmu szczepów Acinetobacter może być jednym ze wskaźników w przewidywaniu przeżycia w środowisku i zakażeń u ludzi^8,10.

Biofilmy przyczepione do powierzchni mogą być określone ilościowo i zobrazowane w celu oceny formowalności biofilmu. Aby określić ilościowo biofilmy przyczepione do powierzchni, biofilmy są zwykle barwione barwnikami barwiącymi biofilm, takimi jak fiolet krystaliczny, a barwniki są eluowane w roztworze i mierzone pod kątem gęstości optycznej¹¹. Wizualizacja biofilmów to kolejne dobre podejście do oceny odkształcalności biofilmu¹¹. Metoda wizualizacji konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM) wykorzystująca specyficzność przy użyciu barwników fluorescencyjnych może być bardziej przydatna do scharakteryzowania morfologii biofilmu w porównaniu z innymi technikami, takimi jak SEM^12,13.

Zdolne do życia komórki w biofilmach można policzyć w celu oszacowania liczby żywotnych komórek w biofilmach¹¹. Żywe komórki osadzone w biofilmach są odłączane, rozcieńczane, rozprowadzane na płytkach agarowych, inkubowane i liczone. Ponieważ większa liczba komórek prawdopodobnie spełni dawkę zakaźną, może dostarczyć bardziej szczegółowych informacji na temat biofilmów, takich jak potencjały infekcji związane z liczbą komórek^13,14.

Ten artykuł przedstawia krok po kroku protokoły do (1) ilościowego oznaczania biofilmów przyczepionych powierzchniowo, (2) liczenia żywotnych komórek w biofilmach oraz (3) wizualizacji biofilmów za pomocą CLSM Acinetobacter. Przedstawione protokoły opisują metody oceny formowalności biofilmu izolatów Acinetobacter oraz charakteryzują ich biofilmy.

Protocol

1. Przygotowanie inokulum bakteryjnego

1. Wyjąć fiolkę z glicerolem przechowywaną w temperaturze -80 °C.
2. Usunąć szczep bakteryjny (2-10 μl) z fiolki za pomocą sterylnej końcówki pipety.
   UWAGA: W tym protokole stosuje się szczepy Acinetobacter, A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) i A. ursingii (24-1).
3. Zaszczepić bakteriami dostępną w handlu płytkę z agarem z krwią (tryptyczny agar sojowy uzupełniony 5% krwią owczą, patrz Tabela Materiałów) bakteriami.
   UWAGA: Można również użyć innych pożywek, takich jak agar odżywczy lub agar MacConkey.
4. Smuguj powierzchnię agaru za pomocą sterylnej pętli z przerywanym płomieniem, aby ją rozrzedzić.
5. Umieścić płytkę agarową do góry nogami w inkubatorze i inkubować w temperaturze 30 °C przez noc przez 20-24 godziny.
6. Pobrać pojedynczą kolonię kultury bakteryjnej za pomocą sterylnej igły i zaszczepić 5 ml sterylnego bulionu do infuzji serca mózgu (BHI, patrz tabela materiałów) kulturą.
7. Zaszczepiony bulion inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C przez noc przez 20-24 godziny przy około 150 obr./min.
8. Przenieść 1 ml kultury przez noc do sterylnej probówki mikrowirówkowej i odwirować nocną kulturę w temperaturze 6 000 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
9. Usunąć supernatant za pomocą pipety.
10. Za pomocą wiru ponownie zawiesić osad w 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
11. Odwirować przy 6 000 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.
12. Zawiesić osad w sterylnym, dziesięciokrotnie rozcieńczonym BHI za pomocą wiru do gęstości optycznej około 0,1 przy 600 nm.
    UWAGA: Gęstość optyczna około 0,1 odpowiada około 10⁷ jtk/ml.

2. Kwantyfikacja biofilmu za pomocą fioletu krystalicznego

1. Dodać 200 μl inokulum do każdej studzienki sterylnej polistyrenowej płytki 96-dołkowej (patrz Tabela Materiałów) i dodać 200 μl wody dejonizowanej do każdej z najbardziej zewnętrznych studzienek, aby zapobiec wysychaniu studzienek wewnętrznych¹⁵.
2. Dodać 200 μl dziesięciokrotnie rozcieńczonego BHI do każdego dołka tej samej płytki jako kontrolę ujemną.
3. Inkubować płytkę w temperaturze 25 °C przez 24 godziny.
4. Usunąć supernatant za pomocą pipety.
   UWAGA: Pipeta wielokanałowa jest często wygodniejsza w przypadku wielu próbek.
5. Ostrożnie dodać 300 μl PBS do każdego dołka i usunąć supernatant za pomocą pipety.
   UWAGA: Pipeta wielokanałowa jest często wygodniejsza w przypadku wielu próbek.
6. Powtórz krok 2.5 jeszcze dwa razy.
7. Dodać 200 μl roztworu fioletu krystalicznego (1%) (patrz tabela materiałów) do każdego dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
8. Powtórz kroki 2.4-2.6.
9. Dodać 200 μl absolutnego etanolu do każdego dołka i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Dokładnie wymieszać, pipetując kilka razy w górę i w dół.
10. Przenieść 100 μl elucji z każdej studzienki na nową 96-dołkową płytkę.
11. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 595 nm za pomocą czytnika mikropłytek (patrz tabela materiałów).
12. Gdy absorbancja przekracza 2,0, należy odpowiednio rozcieńczyć próbkę do poziomu poniżej 2,0 w absolutnym etanolu i zmierzyć ją jak w kroku 2.11. Następnie należy obliczyć absorbancję próbki (wartość końcową), mnożąc wartość obserwowaną przez współczynnik rozcieńczenia.
13. Obliczyć rzeczywistą absorbancję próbek, odejmując średnią wartość kontroli ujemnej od wartości każdego dołka z badanych próbek na tej samej płytce studzienki.

3. Liczba żywotności biofilmu

1. Dodaj 1 ml inokulum (krok 1) do każdego dołka sterylnej polistyrenowej płytki 12-dołkowej¹⁵. Inkubować płytkę w temperaturze 25 °C przez 24 godziny. Usunąć supernatant za pomocą pipety.
2. Ostrożnie dodać 1,5 ml sterylnego PBS do każdej studzienki i usunąć supernatant za pomocą pipety. Dodaj 1 ml sterylnego PBS do każdej studzienki.
3. Zeskrob dolną i ścienną powierzchnię studni za pomocą zamontowanych skrobaków do komórek.
4. Zawiesinę pobranych komórek przenieść do sterylnej plastikowej probówki (^10-1) zawierającej 9 ml soli fizjologicznej (0,85% NaCl) i 10-20 szklanych kulek (patrz Tabela materiałów).
   UWAGA: Aby zebrać wszelkie resztki biofilmu pozostawione na dnie studni, można je ponownie zawiesić i przenieść za pomocą pipety przy użyciu soli fizjologicznej z probówki ^10-1.
5. Obracaj rurkę ^10-1 przez 60 s z maksymalną prędkością.
6. Wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenie, przenosząc 1 ml do następnej sterylnej probówki (^10-2) zawierającej 9 ml soli fizjologicznej (0,85% NaCl) do ^10-7.
7. Rozprowadzić 100 μl z każdego rozcieńczenia na agarze Acinetobacter (patrz tabela materiałów) i inkubować płytki agarowe w temperaturze 30 °C przez 24-42 godziny.
8. Policz ręcznie liczbę typowych czerwonych kolonii na każdej płytce w zakresie od 10 do 250.
9. Oblicz liczbę żywotnych komórek w biofilmie każdej studzienki, korzystając z poniższego równania:
   Komórki żywotne = liczba kolonii × Współczynniki rozcieńczenia × 10

4. Wizualizacja biofilmu za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM)

1. Dodać 200 μl inokulum do każdego dołka sterylnej 96-dołkowej płytki przeznaczonej do analizy mikroskopowej.
2. Inkubować płytkę w temperaturze 25 °C przez 24 godziny.
3. Usunąć supernatant za pomocą pipety.
4. Ostrożnie dodaj 300 μl wysterylizowanej wodą dejonizowaną z filtrem do każdej studzienki i usuń supernatant za pomocą pipety.
5. Powtórz krok 4.4.
6. Przygotować mieszaninę SYTO 9 i jodku propidyny (patrz tabela materiałów) rozcieńczoną w sterylizowanej filtrem wodzie dejonizowanej do końcowego stężenia odpowiednio 10 μM i 60 μM.
7. Dodać mieszaninę do każdego dołka o pojemności 200 μl i inkubować płytkę przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
8. Powtórz kroki 4.3-4.4
9. Wizualizacja biofilmów przyczepionych do dolnej powierzchni za pomocą CLSM o długości fali wzbudzenia 488 nm i 561 nm oraz zakresie długości fali emisji odpowiednio 499-535 nm i 568-712 nm.

Results

Zgodnie z protokołem, biofilmy izolatów Acinetobacter, pierwotnie wyizolowanych z powierzchni kuchennych, zostały utworzone na 96-dołkowej płytce polistyrenowej, zabarwione fioletem krystalicznym, a barwniki zostały rozpuszczone w etanolu i zmierzone pod kątem masy biofilmu (Rysunek 1). Liczba biofilmów znacznie różniła się w zależności od szczepów, wahając się od OD 0,04 do 1,69 (Ryc. 1). Opierając się na kryteriach ustalonych przez Stepanovića i wsp.^16<...

Discussion

Korzystając z opisanego protokołu, zmierzono, zwizualizowano tworzenie się biofilmu izolatów Acinetobacter o różnym stopniu i oszacowano żywotne komórki w biofilmach (ryc. 1, ryc. 2 i ryc. 3).

W protokole tym zastosowano dwie różne temperatury: 30 °C do wzrostu i 25 °C do tworzenia biofilmu Acinetobacter. Zastosowano 30 °C, ponieważ w wielu badaniach stosowano więcej niż 30 °C dla optyma...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-dołkowa płytka do hodowli komórkowych	SPL	30096	Polistyren 96-dołkowa płytka
BHI (Brain Heart Infusion) bulion	Merck KGaA	1.10493.0500
Płytka bazowa agaru z krwią	KisanBio	MB-B1005-P50	Pożywka wzrostowa dla Acinetobacter
CHROMagar Acinetobacter	CHROMagar	AC092	Selektywna płytka do Acinetobacter
Crystal violet rozwiązanie	Sigma-Aldrich	V5265
Filmtracer LIVE/DEAD Zestaw do żywotności biofilmu	Invitrogen	L10316	SYTO9 i jodek propidyny
Czytnik mikropłytek	Tecan	Infinite M200 PRO NanoQuant	Pomiar biofilmu
Koraliki szklane	RBC	RBC RG001	Koraliki szklane
μ-Płytka 96 Well	ibidi	89621	Mikropłytka przeznaczona do CLSM