Kwantyfikacja, ocena żywotności i strategie wizualizacji biofilmów Acinetobacter

Summary

Ten protokół opisuje przygotowanie inokulum, kwantyfikację biofilmu na płytkach mikromiareczkowych za pomocą barwnika fioletu krystalicznego, liczenie żywotnych w biofilmach oraz wizualizację biofilmów Acinetobacter.

Abstract

Acinetobacter powoduje infekcje szpitalne, a tworzenie się jego biofilmu może przyczynić się do przetrwania na suchych powierzchniach, takich jak szpitale. W związku z tym kwantyfikacja i wizualizacja biofilmu są ważnymi metodami oceny potencjału szczepów Acinetobacter do wywoływania zakażeń szpitalnych. Biofilmy tworzące się na powierzchni mikropłytki można określić ilościowo pod względem objętości i liczby komórek. Objętość biofilmu można określić ilościowo poprzez barwienie za pomocą fioletu krystalicznego, mycie, odbarwianie za pomocą etanolu, a następnie pomiar rozpuszczonego barwnika za pomocą czytnika mikropłytek. Aby określić ilościowo liczbę komórek osadzonych w biofilmach, biofilmy są zeskrobywane za pomocą skrobaków do komórek, zbierane w roztworze soli, energicznie mieszane w obecności szklanych kulek i rozprowadzane na agarze Acinetobacter. Następnie płytki inkubuje się w temperaturze 30 °C przez 24-42 godziny. Po inkubacji czerwone kolonie są liczone w celu oszacowania liczby komórek w biofilmach. Ta realna metoda liczenia może być również przydatna do liczenia komórek Acinetobacter w biofilmach mieszanych gatunków. Biofilmy Acinetobacter można wizualizować za pomocą barwników fluorescencyjnych. Dostępna na rynku mikropłytka przeznaczona do analizy mikroskopowej jest wykorzystywana do tworzenia biofilmów. Następnie biofilmy przyczepione do dolnej powierzchni są barwione barwnikami SYTO9 i jodku propydyny, przemywane, a następnie wizualizowane za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Introduction

Acinetobacter jest znany z wywoływania infekcji szpitalnych, a jego zakażenie u ludzi, szczególnie w placówkach służby zdrowia, jest coraz częściej zgłaszane¹. Jest szeroko rozpowszechniony w szpitalach, placówkach opieki zdrowotnej i środowiskach związanych z żywnością^2,3,4. Może przetrwać przez długi czas w środowiskach, w tym na powierzchniach szpitalnych, takich jak poręcze łóżek, stoliki nocne, powierzchnia wentylatorów i zlewozmywaki⁴. Takie utrzymywanie się na powierzchniach środowiskowych może być jednym z istot....

Protocol

1. Przygotowanie inokulum bakteryjnego

1. Wyjąć fiolkę z glicerolem przechowywaną w temperaturze -80 °C.
2. Usunąć szczep bakteryjny (2-10 μl) z fiolki za pomocą sterylnej końcówki pipety.
   UWAGA: W tym protokole stosuje się szczepy Acinetobacter, A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) i A. ursingii (24-1).
3. Zaszczepić bakteriami dostępną w handlu płytkę z agarem z krwią (tryptyczny agar sojowy uzupełniony 5% krwią owczą, patrz Tabela Materiałów) bakteriami.
   UWAGA: M....

Results

Zgodnie z protokołem, biofilmy izolatów Acinetobacter, pierwotnie wyizolowanych z powierzchni kuchennych, zostały utworzone na 96-dołkowej płytce polistyrenowej, zabarwione fioletem krystalicznym, a barwniki zostały rozpuszczone w etanolu i zmierzone pod kątem masy biofilmu (Rysunek 1). Liczba biofilmów znacznie różniła się w zależności od szczepów, wahając się od OD 0,04 do 1,69 (Ryc. 1). Opierając się na kryteriach ustalonych przez Stepanovića i wsp.^16<.......

Discussion

Korzystając z opisanego protokołu, zmierzono, zwizualizowano tworzenie się biofilmu izolatów Acinetobacter o różnym stopniu i oszacowano żywotne komórki w biofilmach (ryc. 1, ryc. 2 i ryc. 3).

W protokole tym zastosowano dwie różne temperatury: 30 °C do wzrostu i 25 °C do tworzenia biofilmu Acinetobacter. Zastosowano 30 °C, ponieważ w wielu badaniach stosowano więcej niż 30 °C dla optyma.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-dołkowa płytka do hodowli komórkowych	SPL	30096	Polistyren 96-dołkowa płytka
BHI (Brain Heart Infusion) bulion	Merck KGaA	1.10493.0500
Płytka bazowa agaru z krwią	KisanBio	MB-B1005-P50	Pożywka wzrostowa dla Acinetobacter
CHROMagar Acinetobacter	CHROMagar	AC092	Selektywna płytka do Acinetobacter
Crystal violet rozwiązanie	Sigma-Aldrich	V5265
Filmtracer LIVE/DEAD Zestaw do żywotności biofilmu	Invitrogen	L10316	SYTO9 i jodek propidyny
Czytnik mikropłytek	Tecan	Infinite M200 PRO NanoQuant	Pomiar biofilmu
Koraliki szklane	RBC	RBC RG001	Koraliki szklane
μ-Płytka 96 Well	ibidi	89621	Mikropłytka przeznaczona do CLSM