Wprowadzenie do przetwarzania, dopasowywania i interpretowania danych absorpcji stanów nieustalonych

Podsumowanie

Ten protokół jest wstępem dla początkujących do przetwarzania, dopasowywania i interpretacji widm absorpcji przejściowej. Protokół ten koncentruje się na przygotowaniu zestawów danych i dopasowaniu przy użyciu zarówno kinetyki pojedynczej długości fali, jak i globalnej analizy czasu życia. Omówiono wyzwania związane z danymi dotyczącymi absorpcji stanów nieustalonych i ich dopasowaniem.

Streszczenie

Spektroskopia absorpcji przejściowej (TA) to potężna metoda spektroskopowa o rozdzielczości czasowej, używana do śledzenia ewolucji procesów stanu wzbudzonego poprzez zmiany w widmie absorpcji systemu. Wczesne wdrożenia TA były ograniczone do specjalistycznych laboratoriów, ale ewolucja komercyjnych systemów "pod klucz" sprawiła, że technika ta stała się coraz bardziej dostępna dla grup badawczych na całym świecie. Nowoczesne systemy TA są w stanie generować duże zbiory danych o wysokiej rozdzielczości energetycznej i czasowej, które są bogate w informacje fotofizyczne. Jednak przetwarzanie, dopasowywanie i interpretacja widm TA może być wyzwaniem ze względu na dużą liczbę cech stanu wzbudzonego i artefaktów instrumentalnych. Podczas gromadzenia, przetwarzania i dopasowywania danych TA należy dokładnie rozważyć wiele czynników, aby zmniejszyć niepewność co do tego, który model lub zestaw parametrów dopasowania najlepiej opisuje dane. Celem przygotowania i dopasowania danych jest ograniczenie jak największej liczby tych czynników zewnętrznych przy jednoczesnym zachowaniu danych do analizy. W tej metodzie początkujący otrzymują protokół przetwarzania i przygotowania danych TA, a także krótkie wprowadzenie do wybranych procedur i modeli dopasowania, w szczególności dopasowania pojedynczej długości fali i globalnej analizy czasu życia. Przedstawiono komentarz do szeregu powszechnie spotykanych wyzwań związanych z przygotowaniem danych i metod ich rozwiązywania, a następnie omówiono wyzwania i ograniczenia związane z tymi prostymi metodami dopasowywania.

Wprowadzenie

Spektroskopia przejściowej absorpcji (TA) jest techniką spektroskopową z rozdzielczością czasową, która monitoruje ewolucję wzbudzonych fotoelektronicznie gatunków poprzez zależne od czasu zmiany w ich widmie absorpcyjnym po wzbudzeniu impulsem światła. Ponieważ TA jest techniką absorpcyjną, możliwe jest zidentyfikowanie sygnałów spektroskopowych pochodzących zarówno ze stanów przechodzących przejścia radiacyjne (tj. stanów, które zazwyczaj emitują foton), jak i przejścia nieradiacyjne (stanów zazwyczaj niefluoryzujących, które przechodzą konwersję wewnętrzną, przejście międzyukładowe lub uczestniczą w fotoreakcjach), a także śledzenie ich ewolucji^1,2. W zależności od specyfiki źródła wzbudzenia i metody detekcji, TA umożliwia dostęp do kinetyki w zakresie od femtosekund do ponad mikrosekund oraz od zakresu UV do dalekiej podczerwieni (IR), co czyni ją wszechstronnym narzędziem spektroskopowym. Komercjalizacja spektrometrów TA znacząco postąpiła w ciągu ostatnich kilku dekad, co sprawiło, że więcej laboratoriów i placówek badawczych zyskało dostęp do tej potężnej techniki².

Nowoczesne systemy TA są w stanie generować duże zestawy danych o wysokiej rozdzielczości energetycznej i czasowej. Zbiory danych te przyjmują zazwyczaj formę macierzy 2D wartości różnicy transmitancji lub absorbancji w funkcji długości fali i opóźnienia czasowego względem impulsu wzbudzenia. Zbiór danych ten można przedstawić w formie dwuwymiarowej mapy ciepła lub trójwymiarowej mapy topograficznej . Interpretacja tych danych stała się bardziej złożona, ponieważ badacze dążą do uwzględnienia całego zbioru danych podczas generowania dopasowań, które najlepiej opisują badany układ³.

Choć TA może obejmować szeroki zakres długości fal i skal czasowych, niniejszy protokół skupia się na jednej z jego najbardziej dostępnych form⁴: spektroskopii szerokopasmowej w obszarze UV-widzialnym z wykorzystaniem femtosekundowego lasera impulsowego. Schemat^5,6 takiego urządzenia przedstawiono na Ryc. 1. Eksperyment rozpoczyna się od pobrania impulsu z lasera i rozdzielenia go na dwie kopie. Jedna kopia impulsu, nazywana „pompą”, służy do wzbudzenia próbki. Do przekształcenia impulsu pompowego na pożądaną długość fali wzbudzenia zazwyczaj wykorzystuje się urządzenie takie jak optyczny wzmacniacz parametryczny (OPA)^5,7. Druga kopia impulsu, nazywana „sondą”, trafia na mechaniczną linię opóźniającą, która pozwala zmieniać opóźnienie czasowe między impulsami pompy i sondy poprzez zmianę dystansu, jaki pokonuje impuls. Jednofalowy impuls sondy jest następnie przekształcany w kontinuum białego światła za pomocą kryształu szafiru lub fluorku wapnia (CaF₂)⁸. Impuls białego światła przechodzi przez próbkę, a jego widmo jest mierzone za pomocą detektora szerokopasmowego, takiego jak kamera CCD (charge-coupled device). Poprzez pomiar zmian w widmie impulsu białego światła z pompą i bez niej, można zmierzyć zmiany w widmie absorpcji próbki indukowane przez pompę, ΔA(T). Zainteresowanych czytelników odsyłamy do tego przydatnego przeglądu⁹ w celu uzyskania szerszych informacji na temat procesu detekcji.

W każdej formie spektroskopii TA, ΔWidma A(t) oblicza się poprzez wyznaczenie różnicy między absorbancją stanu podstawowego, A_sondaor stanu wzbudzonego, A_{pompa i sonda}, przy określonym opóźnieniu czasowym t między dwoma impulsami^2,5,9,10.

    (1)

Należy zauważyć, że A_probe odpowiada widmu absorpcji próbki w stanie stacjonarnym i jest niezależne od czasu; rozdzielczość czasowa eksperymentu wynika z opóźnienia między impulsem pompowym a sondującym, zarejestrowanego w A_pump+probe(t). Symulacja tych danych przedstawiona jest na Rysunku 2A.

W przeciwieństwie do widm absorpcyjnych w stanie stacjonarnym, widma TA mogą wykazywać zarówno cechy dodatnie, jak i ujemne ze względu na różnicę wyliczaną w równaniu 1. Cechy dodatnie są wynikiem powstania nowych gatunków absorbujących wywołanych impulsem pompowym i mogą reprezentować wzbudzone stany chromoforów, stany tripletowe, przegrupowania geometryczne, efekty solwatacji lub fotoprodukty stanu wzbudzonego³. Ogólne wytyczne dotyczące identyfikacji tych cech i przypisywania ich do konkretnych gatunków chemicznych zostaną przedstawione w sekcji Dyskusja. Cechy ujemne mogą wynikać z wybielania stanu podstawowego (GSB) lub emisji stymulowanej (SE) (Rysunek 2B). GSB wynika z utraty populacji stanu podstawowego po absorpcji impulsu pompowego. Cząsteczki przeniesione do stanu wzbudzonego nie absorbują już w tym samym obszarze co w stanie podstawowym; w związku z tym absorbowana jest mniejsza część impulsu badawczego, a różnica w równaniu 1 w tym obszarze może być ujemna. GSB charakteryzuje się tym samym kształtem widma co absorpcja stanu podstawowego, lecz z przeciwnym znakiem. Sygnały SE wynikają z emisji z gatunków w stanie wzbudzonym stymulowanej przez impuls badawczy³. Emisja z tych gatunków powoduje, że do detektora dociera więcej światła, co jest równoważne z mniejszą absorpcją przy tych długościach fal. Sygnał SE będzie miał podobny kształt widmowy co widmo emisji spontanicznej danego gatunku, ale z ujemnym znakiem i innym ważeniem częstotliwości¹⁰.

Oprócz informacji o gatunkach w stanie wzbudzonym, widma TA mogą zawierać szereg artefaktów i cech obcych, które mogą zniekształcać podstawową dynamikę i utrudniać przypisanie pasm absorpcji¹¹. Nieprawidłowa obsługa tych artefaktów podczas przygotowania i analizy danych może prowadzić do zastosowania niewłaściwych modeli fotofizycznych i, w konsekwencji, do błędnych wniosków¹¹. Dlatego pierwsza część niniejszego protokołu koncentruje się na tym, jak prawidłowo przetwarzać zestawy danych TA po ich zebraniu. Celem tej sekcji jest dostarczenie badaczom rozpoczynającym pracę z TA zestawu wytycznych, które pomogą wypracować intuicję i zrozumienie potrzeby rygorystycznego przygotowania i przetwarzania danych.

Po przetworzeniu zestawu danych dostępnych jest wiele narzędzi i modeli do dopasowania i interpretacji widm o różnym stopniu złożoności i rygoru¹⁰. Celem drugiej części niniejszego protokołu jest przygotowanie czytelnika do zastosowania dopasowania jednofalowego oraz analizy globalnej do danych, a także udzielenie wskazówek, kiedy modele te są odpowiednie do opisu posiadanych danych. Obecnie łatwo dostępne jest komercyjne oprogramowanie do przygotowywania i przetwarzania danych TA, takie jak Surface Xplorer^12,13 firmy Ultrafast systems (bezpłatne do pobrania i użytkowania, patrz Tabela materiałów). Inne bezpłatne alternatywy zostały wydane przez badaczy akademickich, np. Glotaran¹⁴. Glotaran to bezpłatny program komputerowy opracowany do analizy globalnej i celowanej danych spektroskopii i mikroskopii z rozdzielczością czasową. Służy on jako graficzny interfejs użytkownika (GUI) dla pakietu R o nazwie TIMP¹⁴. Ponadto użytkownicy mogą wykorzystać języki programowania, takie jak Python, do napisania własnych kodów przeprowadzających analizę. Każde z tych oprogramowań do dopasowania i rozwiązań programistycznych posiada pozytywne cechy, które czynią je istotnymi wkładami w dziedzinę. Na potrzeby niniejszego opracowania w części wizualnej tej aktywności możemy przedstawić tylko jedno oprogramowanie. Pogłębiona dyskusja na temat każdego z programów do dopasowania wykracza poza zakres niniejszego artykułu.

Niniejszy artykuł przedstawia szczegółową procedurę (1) przetwarzania danych TA, (2) dopasowywania danych TA z wykorzystaniem kinetyki jednowavelengthowej i analizy globalnej oraz (3) wyodrębniania danych i dopasowywania ich do innych modeli. Do celów ćwiczeniowych dla czytelnika dołączono zestaw reprezentatywnych danych TA (Plik uzupełniający 1 oraz Plik uzupełniający 2). Dane stanowią pomiar próbki 1, 4-bis(5-fenylooksazol-2-yl)benzenu (POPOP) o stężeniu 165 µM w etanolu, wzbudzonej przy 330 nm i rejestrowanej w zakresie od −5 ps do 5,5 ns. Dodatkowo, w tych samych warunkach eksperymentalnych, w zakresie od −5 ps do 5 ps, zarejestrowano próbkę „ślepą” zawierającą wyłącznie etanol bez badanej substancji, która jest wykorzystywana podczas przygotowania danych do dopasowania (krok 1). Widma zbierano przy użyciu ultraszybkiego spektrometru absorpcji przejściowej. Próbka znajdowała się w kuwecie o drodze optycznej 2 mm i była poddawana ciągłemu mieszaniu. Opisana procedura przetwarzania i dopasowania opiera się na oprogramowaniu Surface Xplorer, które dopasowuje dane w formacie *.ufs i które w dalszej części będzie nazywane „programem do dopasowywania”. Dostępne są programy służące do konwersji zestawów danych z innych formatów na pliki *.ufs¹⁵. Chociaż szczegóły tego protokołu są specyficzne dla Surface Xplorer, następujące kroki można zastosować do dowolnego pakietu oprogramowania, komercyjnego lub autorskiego. Ponadto wyniki przetwarzania danych mogą zostać wyodrębnione i dopasowane przy użyciu tych innych pakietów oprogramowania. Plik z informacjami uzupełniającymi (Plik uzupełniający 3) zawiera dodatkowe wskazówki dotyczące dopasowywania.

Protokół

1. Przygotowanie danych do dopasowania

1. Wczytaj zestaw danych SAMPLE do oprogramowania Fitting. Dane zostaną wyświetlone tak, jak pokazano w Rycina uzupełniająca 1.
2. Gdy w oknie detekcji optycznej eksperymentu występuje rozproszone światło wzbudzenia, należy zastosować Odjęcie światła rozproszonego opcja (Rycina uzupełniająca 2). Jeśli w danych nie występuje rozproszone światło wzbudzenia, należy przejść do kroku 1.5.
   UWAGA: Światło rozproszone jest najczęściej obserwowane, gdy długość fali wzbudzenia mieści się w oknie optycznym. Światło rozproszone objawia się jako ostry ujemny sygnał (wybielenie) przy długości fali wzbudzenia (lub w pewnym rzędzie dyfrakcyjnym, bądź przy długości fali generowanej w OPA), który nie zmienia się w czasie.
3. Kliknij w Powierzchnia menu, a następnie kliknij w Odjęcie światła rozproszonego opcja (Rysunek uzupełniający 2). Pojawi się nowe okno.
4. W nowym oknie kliknij strzałka przyciski służące do ustawienia liczby uśrednianych widm tła (Rycina uzupełniająca 3) w celu przeprowadzenia korekcji tła. Wykorzystanie dziesięciu widm stanowi odpowiedni punkt wyjścia, a liczba ta może zostać zmieniona według uznania. Kliknij w Zaakceptuj aby przeprowadzić odejmowanie (przejdź do kroku 1.7).
   UWAGA: Widma tła są pobierane z pierwszych widm występujących w zbiorze danych, a następnie przesuwane w czasie, wykorzystując tyle widm tła, ile jest konieczne do uśrednienia sygnału tła; jednakże użycie zbyt wielu widm może doprowadzić do objęcia widm zawierających analizowany sygnał, dlatego nie należy ich nadużywać. W przypadku danych z długim oknem czasowym cecha rozproszenia może nie pojawić się na końcu okna czasowego danych. Może to wynikać z przekroczenia czasu integracji kamery przez okno czasowe lub z innych przyczyn, zależnie od konstrukcji eksperymentu TA. Aby to skorygować, można zastosować opcję ustawienia zakresu czasu, zgodnie z opisem w Plik uzupełniający 3.
5. W przypadku danych, w których w oknie optycznym nie występuje światło rozproszone, należy kliknąć w Powierzchnia menu, a następnie kliknij w Odejmij tło opcja
6. W oknie, które się pojawi, kliknij przycisk strzałka przyciski w prawym dolnym rogu służące do "Liczba widm" do uśrednienia (wybrać 10), a następnie kliknąć w Zaakceptuj.
   UWAGA: Widma tła w tej opcji działają tak samo, jak w "Odjęcie światła rozproszonego" opcja. Rozpoczęcie od dziesięciu widm zapewnia dobre uśrednienie. Można zastosować więcej widm, jednak należy uważać, aby nie było ich zbyt wiele, co pozwoli uniknąć włączenia widm zawierających sygnały będące przedmiotem zainteresowania. Instrukcja obsługi programu Surface Xplorer opisuje różnice w stosowanej korekcji dla "Odejmij światło rozproszone" kontraim bardziej zasadowy "Odjęcie tła" korekta. Ważne jest zastosowanie odpowiedniej korekty dla artefaktu¹⁶.
7. Dane w pobliżu krawędzi okna optycznego mogą charakteryzować się bardzo niskim stosunkiem sygnału do szumu, co wynika z kształtu widma sondy i/lub zbyt silnej absorpcji białego światła przez próbkę. Zakłócenia w tych obszarach utrudniają analizę. Należy usunąć te nieprzydatne fragmenty widma. Kliknij w długości fal końcowych w widoku widma (kafel w lewym dolnym rogu) wpisz nowe wartości (Rycina uzupełniająca 4), a następnie kliknij WprowadźWybierz zakres długości fali, który usunie zaszumione dane na krawędziach okna. Dla dostarczonych danych zakres ten wynosi 340–680 nm.
8. Zakończ dostrajanie okna widmowego do pożądanego zakresu długości fal. Kliknij w Powierzchnia menu, a następnie kliknij Plon (Rycina uzupełniająca 5). Pojawi się okno wyskakujące.
   1. Kliknij w Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Kliknij w Plik menu, a następnie kliknij Zapisz plik jakoNastępnie kliknij Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Zamknij ten zestaw danych.
      UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas przycinania, ponieważ funkcja ta przycina dane wzdłuż osi długości fali oraz osi opóźnienia czasowego, usuwając wszystkie pozostałe dane. Należy upewnić się, że okno opóźnienia czasowego obejmuje część danych, która ma zostać zachowana. Ponadto zdecydowanie zaleca się zapisywanie wszelkich przyciętych danych w nowym, odpowiednio opisanym pliku, aby zachować nienaruszoną powierzchnię danych surowych jako kopię zapasową.
9. W przypadku danych zebranych w skalach czasowych femtosekundowych (fs) lub pikosekundowych (ps) należy zastosować korekcję chirpu. Otwórz powierzchnię danych zawierającą wyłącznie rozpuszczalnik lub substrat (bez próbki), pobraną w tej samej konfiguracji eksperymentalnej co dane. Próbka ta jest nazywana "Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia." przebieg eksperymentu. Wykonaj ten sam zestaw kroków w ramach "Tekst źródłowy jest pusty. Proszę o dostarczenie treści do przetłumaczenia." dane (od kroku 1.2 do kroku 1.8), które zostały przeprowadzone na danych próbnych.
   UWAGA: Stanowczo zaleca się, aby taka "Tekst źródłowy nie został dostarczony. Proszę o przesłanie treści do tłumaczenia." eksperyment należy przeprowadzić w tych samych warunkach co w przypadku próbki, lecz przy krótszym oknie czasowym (na przykład od ok. −5 ps do 5 ps), aby zapewnić dużą liczbę punktów wokół czasu zero. To "Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia." pomiar powinien obejmować wyłącznie rozpuszczalnik lub substrat, w zależności od rodzaju próbki, i służy do wyznaczenia krzywizny chirpu. Przygotowanie "Tekst źródłowy nie został dostarczony. Proszę o przesłanie treści do tłumaczenia." do tego momentu należy zastosować taką samą korekcję tła i przycinanie, jak w przypadku danych próbnych. Jeśli a "Tekst źródłowy nie został dostarczony. Proszę o przesłanie treści do przetłumaczenia." jeżeli nie została przeprowadzona, korekcja chirp może zostać wykonana bezpośrednio na zbiorze danych.
10. Rozpocznij proces korekcji chirp. W kafelku mapy ciepła (lewy górny róg) kliknij na celownik krzyżowy i przeciągnij komponent linii pionowej do niebieskiego końca widma. Zacznij od zakresu długości fal niebieskich w pobliżu początku okna widmowego. Kliknij w Kinetyka menu, a następnie kliknij Odpowiedź na rozpuszczalnik dopasowany.
    UWAGA: Odpowiedź na rozpuszczalnik dopasowujący należy przeprowadzić wyłącznie na "Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia." próbka, która nie generuje żadnego sygnału po czasie zero. Próba zastosowania tej funkcji dopasowania do zbioru danych zawierającego dane dotyczące analizowanej cząsteczki lub materiału spowoduje, że program spróbuje dopasować dane zamiast IRF (funkcja odpowiedzi instrumentu). Dla "Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia." próbek jedynym obecnym sygnałem powinien być spójny artefakt wynikający z modulacji krzyżowej fazy. Modulacja krzyżowa fazy występuje tylko w miejscu nakładania się wiązki pompowanej i sondującej, a zatem dostarcza śladu krzywizny chirpu, który można dopasować za pomocą "Odpowiedź na dopasowanie rozpuszczalnika" opcja. W przypadku danych bez dołączonego pliku konieczne będzie ręczne wyznaczanie punktów "Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia." do wykorzystania w korekcji i zostały opisane bardziej szczegółowo w Plik uzupełniający 3.
11. Nowy "Dostosowanie odpowiedzi rozpuszczalnika" otwiera się okno. Kliknij w Dopasowanie przycisk (Rycina uzupełniająca 6). Dopasowanie wygeneruje krzywą dopasowaną do funkcji odpowiedzi instrumentu z wykorzystaniem pierwszej i drugiej pochodnej rozkładu Gaussa. Kliknij w Zapisz przycisk, a następnie kliknij w Proszę podać tekst do przetłumaczenia. aby zamknąć ekran.
    UWAGA: Czerwona linia dopasowania powinna dobrze odpowiadać punktom danych (niebieskie puste kwadraty) w całym zakresie czasu, a w szczególności w przypadku wyraźnej cechy widocznej w pobliżu czasu zero (0,1–2,0 ps). Dopasowanie będzie najskuteczniejsze, jeśli wystąpią dużą liczbę punktów wokół czasu zero, co można osiągnąć poprzez zastosowanie krótkiego okna opóźnienia czasowego dla "Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia." eksperymentu i zachowaniu dużej liczby punktów. Jeśli dopasowanie nie wydaje się dobrze odpowiadać punktom danych, należy sprawdzić "Dodaj rozkład Gaussa (R0)" obramuj i ponów dopasowanie. Opcja ta doda sumę funkcji Gaussa do pierwszej i drugiej pochodnej, co może pozwolić na lepsze dopasowanie kształtu charakterystyki IRF przy tej długości fali. Jeśli dopasowanie odpowiedzi rozpuszczalnika nadal nie obejmuje sygnału IRF, należy wybrać inną długość fali.
12. Przeprowadź ten proces (kroki 1.10–1.11) co najmniej pięciokrotnie, ponieważ do prawidłowej korekcji chirpingu wymaganych jest pięć punktów. Punkty powinny być, w miarę możliwości, rozmieszczone w całym oknie widmowym. W zależności od warunków eksperymentalnych niektóre rozpuszczalniki/podłoża mogą nie generować obserwowalnego sygnału w niektórych częściach okna widmowego. W razie potrzeby można dodać lub wykorzystać więcej punktów, aby uzyskać akceptowalne dopasowanie. Po zakończeniu zamknij "Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia." zbiór danych
    UWAGA: Każdy zapisany punkt jest zapisywany w pliku Excel w folderze roboczym jako nowy wiersz natychmiast po kliknięciu przez użytkownika w ZapiszJeśli zapisany zostanie niepożądany punkt, można go usunąć z pliku Excel poprzez usunięcie wiersza odpowiadającego temu punktowi.
13. Ponownie otwórz zestaw danych po przycięciu i odjęciu tła. Kliknij w Powierzchnia menu, a następnie kliknij w Korekcja chirpingu opcję. Spowoduje to wyświetlenie nowego ekranu z trzema oknami oraz menu w prawym dolnym rogu (Rycina uzupełniająca 7).
14. Dodaj utworzoną właśnie korekcję chirp. Kliknij w Dodaj z pliku opcja, wybierz plik Excel kończący się na "współczynniki dopasowania"i kliknij w Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Dopasowanie korekcji chirpu jest teraz wyświetlane w oknie w górnym lewym rogu jako czarna linia z markerami X (Rysunek uzupełniający 8).
    UWAGA: Korekcja chirp jest przedstawiona jako linia ciągła; znaczniki X wzdłuż linii to punkty wygenerowane w procesie dopasowania odpowiedzi rozpuszczalnika. Punkty można dodawać ręcznie, przesuwając celownik i klikając w DodajPunkty można również usuwać poprzez ich zaznaczenie i naciśnięcie UsuńKolejne punkty można edytować ręcznie, wpisując wartości na liście w prawym dolnym rogu. Na koniec, w razie potrzeby, aktualną korekcję można również zapisać w pliku do późniejszego wykorzystania za pomocą Zapisz do pliku przycisk
15. Kliknij w Korekcja chirp w podglądzie przycisk. Powoduje to tymczasowe zastosowanie korekcji chirp. Obserwuj korekcję w oknie w lewym górnym rogu, aby upewnić się, że dane zostały wyrównane czasowo i nie jest już widoczna żadna krzywizna.
    1. Jeśli korekcja chirp jest satysfakcjonująca, kliknij w Zastosuj & Wyjście przycisk. W przypadku braku satysfakcjonującego wyniku należy powtórzyć kroki 1.10–1.14, wybierając więcej (lub inne) długości fal dla dopasowania korekcji chirp, aż do uzyskania satysfakcjonującej korekcji.
       UWAGA: Zastosowanie korekcji chirp przesunie punkt czasu zero do linii wyprostowanej, tak jak jest ona widoczna w podglądzie. Może wystąpić pewne przesunięcie czasowe pomiędzy "Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia." or powierzchnia danych.
16. Kliknij w Plik menu, a następnie kliknij Zapisz plik jakoWpisz odpowiednią nazwę pliku, która wskaże, że zastosowano korekcję chirp. Następnie kliknij Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia..
17. Niektóre cechy rozproszenia w danych mogą nie zostać całkowicie usunięte podczas odejmowania tła. Cechy te wpływają na dopasowanie i prowadzą do błędnych wyników. Należy zlokalizować w danych wszystkie takie elementy, które powinny zostać usunięte. Cechy rozproszenia najłatwiej zidentyfikować w ujemnym obszarze czasu.
    1. W lewym górnym kafelku mapy ciepła kliknij i przeciągnij celownik do ujemnego obszaru czasu. Pozostając w ujemnym obszarze czasu, należy użyć celownika, aby określić długości fal, przy których rozpoczyna się i kończy cecha rozproszeniowa. Należy odnotować zakres długości fal cechy rozproszeniowej (dla dostarczonego zestawu danych zakres ten wynosi od 654 nm do 672 nm).
       UWAGA: Aby określić, czy dany sygnał powinien zostać usunięty, należy przesuwać poziomy celownik w górę i w dół wzdłuż osi czasu, aby zwizualizować zakres spektralny tego sygnału. Sygnały rozproszeniowe charakteryzują się zazwyczaj bardzo dużym poziomem szumu w kinetycznych przebiegach dla pojedynczej długości fali, zatem zakres spektralny sygnału można zweryfikować również za pomocą przebiegów kinetycznych.
18. Zaczynając od niższej (niebieskiej) długości fali (tj. 654 nm), kliknij w długość fali prawokrawędziowej na widmie (kafel w lewym dolnym rogu) i wpisz wartość zakresu dolnego (niebieskiego) piku.
19. Przytnij dane, klikając w Powierzchnia menu, a następnie kliknij w KadrowanieKliknij w Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. w menu rozwijanym. Zapisz przycięte dane pod unikalną nazwą pliku, aby wskazać, która to strona danych (zalecane jest określenie Blue lub Left). Zamknij plik.
20. Otwórz plik z zastosowaną korekcją chirp zapisaną w kroku 1.16. Przejdź do wyższego (czerwonego) zakresu długości fal danej cechy. Kliknij w lewy koniec długość fali w widmie (kafelek w lewym dolnym rogu), a następnie wpisz wartość górnej granicy cechy.
21. Przytnij dane, klikając w Powierzchnia menu, a następnie kliknij w KadrowanieKliknij w Proszę przesłać tekst źródłowy do tłumaczenia. w menu rozwijanym. Zapisz przycięte dane, nadając plikowi unikalną nazwę, która wskaże, którą stronę danych reprezentuje (zaleca się użycie określenia Lewa lub Prawa).
22. Połącz dwa pliki, klikając w Plik menu, a następnie kliknij w Łączenie wielu powierzchniW nowym oknie zaznacz obie strony danych (tzn. prawą i lewą lub niebieską i czerwoną). Użyj ctrl + kliknięcie aby wybrać każdy plik. Należy upewnić się, że oba pliki zostały zaznaczone w "Nazwa pliku:" pole, a następnie kliknij w Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. w prawym dolnym rogu. Po zakończeniu działania paska postępu dane zostaną połączone.
    UWAGA: W ten sposób można połączyć dowolną liczbę plików. Dane mogą być łączone wzdłuż wielu cięć zarówno w osi czasu, jak i w osi długości fali.
23. Kliknij w Plik menu, a następnie kliknij Zapisz plik jako oraz wybierz unikalną nazwę pliku, która wskaże, że jest on połączony (zaleca się użycie określenia Combined lub Composite). Następnie kliknij Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. aby zapisać plik.
    UWAGA: Zob. sekcję 3 w celu uzyskania informacji o tym, jak zapisywać dane z okna danych surowych do późniejszego wyświetlania i wykreślania. Dane na mapie ciepła (górna (lewy kafel) powinno wyglądać jak w Rycina 3 i jest teraz gotowe do dopasowania. Wizualizacja reprezentatywnych widm, przedstawiona w Rysunek 3jest opisany w kroku 3.1.2.

2. Wykonywanie dopasowania

1. Wczytaj odpowiednio przygotowaną powierzchnię danych.
2. Zdecyduj, który dopasowania zostanie wykonane, i przejdź do odpowiedniej sekcji.
   UWAGA: Niniejszy protokół przedstawia dwie opcje dopasowania danych: krok 2.3 dotyczy dopasowania kinetycznego dla pojedynczej długości fali, a krok 2.4 dotyczy dopasowania w ramach analizy globalnej.
3. Dopasowanie dla pojedynczej długości fali
   1. Aby skonfigurować pojedyncze dopasowanie kinetyczne, przesuń kursor (w górnym lub dolnym lewym kafelku) do pożądanej długości fali. Kliknij menu Kinetics, a następnie kliknij Fit Kinetic. Dla dostarczonego zestawu danych zacznij od 632 nm.
   2. W nowo otwartym oknie (Supplementary Figure 9) zwróć uwagę, że główne parametry dopasowania i wartości startowe są ustawione w górnej lewej części okna, pod logo programu, w polu obok tego obszaru pod tekstem „current fit @ wavelength”.
   3. Klikaj przyciski strzałek, aby dostosować liczbę czasów życia (tj. liczbę zaników wykładniczych użytych do dopasowania danych) w polu „Finite lifetimes”. Dla dostarczonego zestawu danych wybierz 2 czasy życia. Jako punkt wyjścia typowe jest od 1 do 3 czasów życia.
   4. Jeśli sygnał danych wykracza poza zebrany przedział czasowy, należy uwzględnić komponent o czasie życia „nieskończonym”. Aby to zrobić, zaznacz pole wyboru Use infinite lifetime. Jeśli dane w pełni zanikają do linii bazowej, nie zaznaczaj tego pola. Dla dostarczonego zestawu danych nie zaznaczaj tego pola.
      UWAGA: „Nieskończony czas życia” pozwala na pozostanie przesunięcia sygnału (tj. program nie wymusi powrotu dopasowania do linii bazowej). Użycie komponentu nieskończonego jest wymagane, gdy sygnał przy danej długości fali nie zanika do linii bazowej w czasie trwania eksperymentu.
   5. Wprowadź wartości szacunkowe dla czasów życia i powiązanych z nimi amplitud, czasu odpowiedzi instrumentu oraz czasu zero, aby wspomóc proces dopasowania (Supplementary Figure 10). Kliknij pożądany parametr. Kliknij w oknie wartości, wpisz wartość szacunkową, a następnie kliknij przycisk initial guess, aby ustawić wartość. Dla dostarczonego zestawu danych odpowiednimi wartościami szacunkowymi są: 0 = 0 ps, IRF = 0.25 ps, A1 = 0.6, t1 = 100 ps, A2 = 0.08, t2 = 1100 ps.
      UWAGA: „0” to szacunek czasu zero, „IRF” to czas odpowiedzi instrumentu, „A” odnosi się do amplitudy danej funkcji wykładniczej (patrz Równanie 3), a „t” to czas życia/stała czasowa. Podanie dobrych wartości szacunkowych pomaga programowi uzyskać rozsądne dopasowanie. Wybierz wartości „A” mieszczące się w zakresie wartości A w zestawie danych. Wybierz wartości „t” w przedziałach czasowych, w których w przebiegu kinetycznym obserwuje się znaczną zmianę. Najlepszym sposobem na zrozumienie, jak wartości szacunkowe wpływają na dopasowanie, jest wypróbowanie kilku zestawów wartości i obserwacja uzyskanych wyników. Jeśli jeden lub więcej z tych parametrów jest znanych, parametr ten można ustawić i „unieruchomić” (fixed), tak aby nie zmieniał się podczas dopasowania (Supplementary Figure 11).
   6. Po wprowadzeniu wszystkich parametrów szacunkowych kliknij przycisk Fit. Reprezentatywne dopasowanie pokazano na Rysunku 4.
      UWAGA: Zastosowanie dopasowania spowoduje pojawienie się na wykresie danych linii dopasowania oraz wykresu rezyduów, który może służyć do oceny jakości dopasowania. Parametry dopasowania, takie jak czasy życia i powiązane z nimi amplitudy, czas zero oraz czas odpowiedzi instrumentu, zostaną również wpisane w górnym lewym polu. Użyj kilku różnych parametrów dopasowania, aby określić liczbę czasów życia oraz włączenie/wykluczenie „nieskończonego” komponentu czasowego, które zapewnią najlepsze dopasowanie do danych.
   7. Zapisz dopasowanie, klikając przycisk Save (Supplementary Figure 9).
      UWAGA: Patrz sekcja 3 w celu uzyskania informacji o sposobie zapisywania danych z okna danych surowych do późniejszego wyświetlania i tworzenia wykresów.
4. Dopasowanie w analizie globalnej
   1. Kliknij menu Surface, a następnie wybierz opcję Principal Components via SVD. Pojawi się nowe okno (Supplementary Figure 12).
      UWAGA: Okno w prawym górnym rogu wyświetla główne przebiegi kinetyczne, a okno w lewym dolnym rogu wyświetla widma główne. Kafel w lewym górnym rogu wyświetla wykres powierzchni rezyduów utworzonej przez różnicę między powierzchnią oryginalną a powierzchnią stworzoną przez wybrane główne komponenty.
   2. Klikaj przyciski strzałek, aby ustawić „Number of Principal Components” (Supplementary Figure 12). Dla dostarczonego zestawu danych wybierz 15.
      UWAGA: Przy decydowaniu o liczbie głównych komponentów jedną z metod jest zwiększanie tej liczby do momentu, aż zarówno widma główne, jak i główne przebiegi kinetyczne zaczną przypominać szum. Inny sposób określenia liczby głównych komponentów polega na analizie wartości współczynników wagowych, które pojawiają się po lewej stronie legendy w prawym górnym kafelku. Dodawaj główne komponenty, dopóki wartość ta nie osiągnie 0.01. Zazwyczaj zaleca się dodanie kilku kolejnych dla pewności. Może to skutkować wyborem nawet 15 lub więcej głównych komponentów.
   3. Kliknij przycisk Save. Zapisane główne komponenty są wymagane do przejścia do następnego kroku.
      UWAGA: Każdy główny komponent jest reprezentacją o zredukowanej złożoności oryginalnej powierzchni danych. Użycie głównych komponentów spowoduje uproszczenie powierzchni w porównaniu do analizowanych danych surowych. Uwzględnienie większości głównych cech powierzchni danych jest bardzo ważne dla uzyskania dokładnego dopasowania, dlatego kluczowe jest użycie wystarczającej liczby głównych komponentów, aby uchwycić te cechy. Użycie większej liczby głównych komponentów nie pogorszy dopasowania. Dlatego w razie wątpliwości co do liczby głównych komponentów, należy wybrać ich więcej niż mniej. Pamiętaj, że użycie zbyt wielu komponentów może spowolnić działanie oprogramowania do dopasowania.
   4. Po zapisaniu głównych komponentów program powróci do ekranu głównego i można będzie podjąć próbę dopasowania globalnego. Kliknij menu Surface, a następnie opcję Global Fit. Otworzy się nowe okno (Supplementary Figure 13).
      UWAGA: Główne przebiegi kinetyczne są wyświetlane w prawym górnym kafelku. Kafel w lewym górnym rogu wyświetli powierzchnię   dopasowania w porównaniu z powierzchnią surową. Kafel w lewym dolnym rogu wyświetli widma różnicowe powiązane z zanikiem (DADS) wygenerowane przez dopasowanie. Wreszcie, w prawym dolnym kafelku można ustawić parametry dopasowania, w tym liczbę funkcji wykładniczych oraz to, czy użyć funkcji nieskończonej.
   5. Użyj przycisków strzałek obok „number of exp.”, aby ustawić liczbę funkcji wykładniczych do uwzględnienia w dopasowaniu. Jeśli sygnał danych wykracza poza zebrany przedział czasowy, należy uwzględnić komponent o czasie życia „nieskończonym”. Aby to zrobić, zaznacz pole wyboru Use offset (Ainf). Dla dostarczonego zestawu danych wybierz 2 i nie zaznaczaj pola. Jeśli dane w pełni zanikają do linii bazowej, nie zaznaczaj tego pola.
      UWAGA: Parametry dopasowania można unieruchomić przed wykonaniem dopasowania, klikając kolumnę etykiet w prawym dolnym polu pod współczynnikami dopasowania globalnego. Etykieta zmieni kolor na czerwony i pojawi się przy niej wskaźnik (fixed). Każda wartość wpisana w polu po prawej stronie zostanie użyta dla tego parametru zamiast być swobodnie zmieniana podczas dopasowania. Należy zachować ostrożność przy unieruchamianiu wartości, ponieważ może to wprowadzić błąd do wyników dopasowania.
   6. Kliknij przycisk Fit. Postęp dopasowania będzie wyświetlany za pomocą małego paska ładowania w centrum ekranu. Po zakończeniu procesu okna zostaną wypełnione danymi z dopasowania (Rysunek 5 i Supplementary Figure 14). Wizualnie sprawdź wyniki dopasowania.
      UWAGA: Informacje zarówno z głównego dopasowania kinetycznego, jak i z DADS są wykorzystywane do określenia, czy dopasowanie warto zapisać, czy jest zbyt słabe. Zazwyczaj, jeśli dopasowanie przebiegów głównych dobrze zgadza się z danymi i w wykresie nie ma lub jest bardzo mało cech, dopasowanie można zaakceptować. Łatwo jest sprawdzić wiele dopasowań, zmieniając liczbę czasów życia i/lub zaznaczając/odznaczając przycisk „Use offset (Ainf)”. Należy zaakceptować najlepsze dopasowanie uzyskane po sprawdzeniu wielu wariantów parametrów.
   7. Kliknij przycisk Save. Spowoduje to zapisanie obecnie wyświetlanego dopasowania wraz z danymi w pliku Excel.
      UWAGA: Plik Excel jest zapisywany w tej samej lokalizacji co zestaw danych. Jeśli zostaną wykonane dodatkowe dopasowania i będą one zapisywane, nadpiszą one każdą poprzednią wersję. W związku z tym, przed wygenerowaniem i zapisaniem nowego dopasowania, nadaj każdemu staremu dopasowaniu unikalną nazwę. Parametry zapisane z dopasowania obejmują jedynie czas zero, IRF, czasy życia i towarzyszące im widma DADS. Plik ten nie zawiera informacji o wykresie   ani o dopasowaniu do głównych przebiegów kinetycznych. Zapisywanie głównych przebiegów kinetycznych opisano w kroku 3.3. Patrz krok 3.0 w celu uzyskania informacji o sposobie zapisywania danych z okna danych surowych do późniejszego wyświetlania i tworzenia wykresów.

3. Eksport danych surowych i dopasowań z oprogramowania do dopasowywania w celu wykreślenia wykresów

UWAGA: Surowe dane lub dopasowania uzyskane z dopasowania pojedynczej długości fali lub analizy globalnej mogą zostać wyeksportowane do plików csv, które można otworzyć w wielu innych programach.

1. Ekstrakcja surowych danych do wykresów
   1. Aby wyeksportować mapę ciepła zbioru danych, kliknij w Plik menu, a następnie kliknij Eksportuj do pliku CSV (Rycina uzupełniająca 15). Otworzy to okno, kliknij w Proszę dostarczyć tekst źródłowy do tłumaczenia. Aby zapisać plik CSV w tym samym katalogu co plik danych, otwórz go pod tą samą nazwą co plik danych.
      UWAGA: Alternatywnie surowe dane można wyeksportować, klikając prawym przyciskiem myszy w oknie mapy ciepła i wybierając Eksportuj dane do schowkaPozwoli to na tymczasowe zapisanie danych w celu ich późniejszego wklejenia do wybranego przez użytkownika dokumentu programowego. Wklej dane do pliku Excel, a następnie je zapisz.
   2. W oknie można wyświetlić wiele widm w celu ich porównania lub w celu przygotowania rysunku. Przeciągnij poziomy kursor (na mapie ciepła, w lewym górnym rogu) do wybranego punktu czasowego. Naciśnij Ctrl + S należy wybrać widmo i zapisać je w oknie widmowym (lewy dolny róg). Należy dodać tyle punktów czasowych, ile jest koniecznych aby przedstawić progresję danych (5–10 widm), jak pokazano w Rysunek 3.
      UWAGA: Liczba widm wybranych do reprezentacji danych oraz ich rozmieszczenie czasowe mogą w dużym stopniu zależeć od konkretnej próbki i warunków eksperymentalnych. Powyższa rekomendacja stanowi ogólną wytyczną, jednak to specyfika eksperymentu powinna determinować, które części zbioru danych należy uwydatnić.
   3. Wyeksportuj jako dane, klikając prawym przyciskiem myszy w oknie zawierającym widma. Kliknij w Eksportuj dane do schowka opcja. Dane są zapisywane tymczasowo. Wklej te dane do wybranego dokumentu w oprogramowaniu (np. Excel) i zapisz.
   4. W oknie kinetyki można wyświetlić wiele krzywych kinetycznych w ten sam sposób, co w oknie widm. Przeciągnij pionowy kursor (na mapie ciepła, w lewym górnym rogu) do pożądanej długości fali. Naciśnij Ctrl + X aby wybrać przebieg czasowy i zapisać go w oknie kinetyki (prawy górny róg). Należy dodać dowolną liczbę punktów czasowych. Spowoduje to tymczasowe zapisanie bieżącego przebiegu kinetycznego w oknie.
   5. Wyeksportuj jako dane, klikając prawym przyciskiem myszy w oknie zawierającym ślady kinetyczne. Kliknij w Eksportuj dane do schowka opcja. Dane są zapisywane tymczasowo. Wklej te dane do odpowiedniego dokumentu w oprogramowaniu (np. Excel) i zapisz.
2. Ekstrakcja danych z dopasowania dla pojedynczej długości fali w celu ich prezentacji
   1. Kliknij w Kinetyka menu, a następnie kliknij w Dopasowanie kinetyczne aby otworzyć okno zawierające dopasowane dane.
   2. Kliknij prawym przyciskiem myszy na dopasowanie okno (tj. centralny kafel w oknie pojedynczego dopasowania). Kliknij w Eksportuj dane do schowkaPozwoli to na tymczasowe zapisanie danych w celu ich wklejenia do innego programu komputerowego.
      UWAGA: Wykres residuów znajdujący się poniżej danych dopasowania nie może zostać wyeksportowany i będzie musiał zostać odtworzony na podstawie danych dopasowania. Eksport dopasowania obejmuje zarówno dane surowe, jak i linię dopasowania, które mogą następnie posłużyć do odtworzenia residuów. Residuum tworzy się poprzez odjęcie wartości dopasowania od danych w każdym punkcie czasowym, a następnie sporządzając wykres podobny do tego, który przedstawiono w "Kinetyka dopasowania" okno
   3. Wklej te dane do odpowiedniego dokumentu w programie (np. Excel) i zapisz.
      UWAGA: Eksport do schowka obejmie jedynie surowe dane oraz dane linii dopasowania dla każdej wykładniczej użytej w dopasowaniu. Parametry dopasowania, takie jak czasy życia, amplitudy i podobne wartości nie zostaną uwzględnione i będą musiały zostać wyeksportowane poprzez skopiowanie wartości z oprogramowania do dopasowywania danych.
3. Ekstrakcja danych z globalnej analizy czasu życia do celów prezentacji i analizy
   1. Kliknij w Powierzchnia menu, a następnie kliknij w Dopasowanie globalne opcja otwarcia okna zawierającego dopasowane dane.
   2. Precyzję wartości zarówno dla gęstości optycznej, jak i osi opóźnienia czasu/długości fali, należy odpowiednio dostosować dla głównych składowych (prawy górny kafel) i DADS (lewy dolny kafel). Najedź kursorem myszy na okno głównych składowych, aż w prawym dolnym rogu pojawi się pole ustawień.
   3. Szybko kliknij w x.xx przycisk, najechanie myszą "Precyzja," i kliknij w 6 z menu, aby ustawić liczbę miejsc po przecinku.
   4. Najedź kursorem myszy na okno głównych komponentów, aż w prawym dolnym rogu pojawi się pole ustawień. Szybko kliknij w y.yy przycisk, najechanie myszą "Precyzja" i kliknij w 6 z menu w celu ustawienia liczby miejsc po przecinku.
   5. Kliknij prawym przyciskiem myszy na Główne krzywe kinetyczne okno. Kliknij w Eksportuj dane do schowkaPozwoli to na tymczasowe zapisanie danych w celu ich wklejenia do innego programu komputerowego.
   6. Wklej te dane do wybranego dokumentu w oprogramowaniu (np. Excel) i zapisz.
      UWAGA: Dane zostaną zapisane w postaci serii kolumn zawierających kolejno opóźnienia czasowe (Time Delays), główne ślady kinetyczne (Principal Kinetic Traces), a następnie linię dopasowania. Dla każdego komponentu głównego wybranego podczas przygotowania do analizy globalnej zostanie utworzony jeden taki zestaw. Widma DADS zostały już zapisane w ramach procedury dopasowania w kroku 2.4.7.

Wyniki

Przygotowanie i analiza próbki 1,4-bis[2-(5-fenylooksazolyl)]benzenu (POPOP) w etanolu zostały przeprowadzone zgodnie z powyższą procedurą. Pomiary wykonano przy użyciu ultraszybkiego spektrometru absorpcji przejściowej, zgodnie z opisem w Rysunek 1z roztworami ciekłymi w kuwetach o szerokości 2 mm, przy użyciu regulowanego uchwytu na kuwety oraz mieszadła magnetycznego w celu zapewnienia mieszania. Próbki mierzono w warunkach otoczenia, bez dodatkowej kontroli temperatury lub atmosfery. Okno optyczne od 340 nm do 680 nm uzyskano przy użyciu kryształu fluorku wapnia. Zebrano dwieście pięćdziesiąt (250) punktów czasowych w zakresie od −5 ps do ~5500 ps, a uśrednienie trzech skanów pozwoliło na wygenerowanie końcowego zbioru danych, Rycina 3Dane POPOP zostały przygotowane zgodnie z opisem w protokole. Przykład suboptymalnej korekcji chirp widoczny jest w Rycina uzupełniająca 16Przeprowadzono dopasowanie kinetyczne dla jednej długości fali dla POPOP, wybierając 632 nm jako długość fali docelową. Ponadto przeprowadzono analizę globalną dla POPOP zgodnie z opisem w protokole.

Kinetyczne dopasowanie jednofalowe dla POPOP przy 632 nm pozwoliło na wyznaczenie dwóch czasów życia. Czasom tym pozwolono na zmienność i nie wprowadzano dalszych korekt. Otrzymane parametry końcowe były następujące: t0 = −0.1176 ps, IRF = 0.436 ps, A1 = 0.0956, t1 = 1.614 ps, A2 = 0.0646, t2 = 522.2 ps (Rycina 4). Wyniki te są zgodne z przeprowadzoną następnie analizą globalną oraz zgłaszanymi wartościami czasu życia emisji dla POPOP (τ = 1.35 ns)¹⁷. Przykład dopasowania jednofalowego z zbyt małą liczbą komponentów czasu życia przedstawiono i omówiono na Rycini Uzupełniającej 16.

Globalna analiza dopasowania dla POPOP została przeprowadzona po wybraniu 15 głównych komponentów (PCs) podczas wykonywania SVD. Po dopasowaniu wybrano dwa czasy życia, nie ustalono żadnych parametrów na stałe. Końcowe parametry uzyskane z dopasowania były następujące: t0 = −0.1586 ps, tp (IRF) = 0.4408 ps, t1 = 1459 ps, t2 = 267.5 ps. Widma różnicowe związane z zanikiem przedstawiono na Rysunku 5. Wyniki były zgodne z wynikami pojedynczego dopasowania kinetycznego przy 632 nm oraz wartościami czasu życia dla POPOP¹⁷. Dwa przykłady suboptymalnej analizy globalnej przedstawiono i omówiono na Rysunku uzupełniającym 16.

Rysunek 1: Schematyczna reprezentacja femtosekundowego szerokopasmowego instrumentu do absorpcji przejściowej opisanego w niniejszym protokole. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Symulacja danych TAS i wkłady w sygnał TAS. (A) Krzywe Gaussa symulujące widmo absorpcji stanu podstawowego (niebieska linia przerywana) oraz widmo stanu wzbudzonego (czerwona linia przerywana, przesunięte w stronę czerwieni względem widma stanu podstawowego). Widmo różnicowe tych dwóch widm (fioletowa linia ciągła) stanowi widmo różnicowe obserwowane w TA. Różnice między widmami stanu podstawowego i wzbudzonego zostały wyolbrzymione w celach ilustracyjnych. (B) Reprezentatywne widmo różnicowe TA dla POPOP w czasie 1,04 ps po wzbudzeniu przy 330 nm. Linie przerywane przedstawiają absorbancję stanu podstawowego oraz emisję stanu stacjonarnego POPOP. Zaznaczone obszary pokazują typowe cechy TA: wybielenie stanu podstawowego (GSB), emisję stymulowaną (SE) oraz absorbancję stanu wzbudzonego (ESA) zaobserwowane w tych danych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 3: Dane przygotowane do POPOP będące wynikiem zastosowania kroku 1 – Przygotowanie danych. Dane przedstawiono w formie skorygowanej mapy ciepła oraz reprezentatywnych widm. Wyniki te obrazują, jak powinny wyglądać dane po zastosowaniu korekt, gdy zestaw danych jest gotowy do dopasowania modelu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 4: Wyniki dopasowania dla pojedynczej długości fali dla POPOP przy 632 nm po zastosowaniu kroku 2.3 – Dopasowanie dla pojedynczej długości fali. Na rycinie przedstawiono (sekcja górna) uzyskane czasy życia w formie tabeli, (sekcja środkowa) dane (niebieskie kropki) oraz dopasowanie do danych (czerwona linia dopasowania) oraz (sekcja dolna) wykres rezyduów. Należy zauważyć, że w sekcji „current fit” amplitudy (A) są przedstawione jako wartości ΔA z danych, które reprezentują wkład tego konkretnego komponentu czasu życia w t0. Jednakże, gdy bieżące dopasowanie zostanie zapisane i pojawi się w tabeli „Fit Coefficients”, domyślnym ustawieniem jest wyświetlanie amplitud znormalizowanych. Ustawienie to można zmienić, odznaczając pole obok etykiety „Normalized” w sekcji „Fit Coefficients”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 5: Wyniki dopasowania analizy globalnej POPOP uzyskane po dopasowaniu w kroku 2.4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 6: Przykład stymulowanego rozpraszania Ramanowskiego zaobserwowanego w eksperymentalnych danych TA. W tym zestawie danych (nie w danych POPOP pokazanych w samouczku) próbka była wzbudzana przy 550 nm (oznaczone linią przerywaną). Rozpraszanie Ramanowskie jest widoczne wokół czasu zero i zazwyczaj pojawia się zarówno po niebieskiej stronie (rozpraszanie Ramanowskie anty-Stokesa), jak i po czerwonej stronie (rozpraszanie Ramanowskie Stokesa) w stosunku do długości fali wzbudzenia pompy. Stymulowane rozpraszanie Ramanowskie jest krótkotrwałe, zazwyczaj trwa tylko około ~200 fs, ponieważ występuje w wyniku oddziaływania wiązki sondującej z próbką w tym samym czasie co wiązka pompująca, co stymuluje proces Ramanowski. Zjawiska tego nie można jednak uniknąć i należy je usunąć poprzez przycinanie danych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina uzupełniająca 1: Menu główne po wstępnym załadowaniu danych. Zazwyczaj w tym oprogramowaniu do dopasowywania w dolnym prawym rogu okna pojawiają się pola opcji po najechaniu na nie kursorem myszy. Pola te umożliwiają zmianę interakcji kursora z oknem, np. przesuwanie zaznaczeń, powiększanie lub panoramowanie wybranych okien. Dostępne są również opcje regulacji precyzji skal osi x i y dla okna, a także zmiana trybu wyświetlania z liniowego na logarytmiczny. Osie można również blokować lub odblokowywać. W stanie zablokowanym oś pozostaje na określonym poziomie powiększenia lub w zadanym zakresie wartości; po odblokowaniu zakres zostanie zmieniony tak, aby objął cały zestaw danych. Inne opcje pozwalają na dostosowanie wyświetlania liczb oraz kolorowania siatek, jeśli są obecne. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 2: Menu powierzchniowe służące do odejmowania światła rozproszonego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 3: Ekran odejmowania światła rozproszonego – ustawianie widm do uśredniania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 4: Ustawianie zakresu przycinania. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 5: Zbiór danych wyciętych. Wycięte dane zostaną trwale usunięte. Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Rysunek uzupełniający 6: Dopasowane okno odpowiedzi rozpuszczalnika oraz przykład dopasowania odpowiedzi rozpuszczalnika (linia czerwona) do danych (niebieskie kropki). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 7: Okno korekcji chirp z danymi próbki „blank”. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 8: Korekcja chirp przedstawiona wraz ze zbiorem danych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 9: Okno pojedynczego dopasowania kinetycznego. Dodatkowo suwak u góry umożliwia użytkownikowi wybór długości fali, dla której ma zostać wykonane dopasowanie. Wybór odpowiedniej długości fali wymaga znajomości spektroskopii układu, aby zidentyfikować, przy których wartościach zachodzą interesujące procesy. Przykładami są produkty przeniesienia ładunku, tworzenie stanów tripletowych lub powstawanie fotoproduktów, których cechy spektralne są skorelowane z określonymi długościami fal. Te konkretne długości fal mogą być dopasowane w celu wyznaczenia czasów życia tych konkretnych zdarzeń. Ponadto zestaw wybranych długości fal może zostać wykorzystany do walidacji wybranego globalnego modelu dopasowania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 10: Ustawianie parametrów pojedynczego dopasowania kinetycznego (Single Kinetic Fit). Poszczególne parametry dopasowania można zablokować lub zmienić ręcznie, jeśli jest to konieczne, aby precyzyjnie dostroić dopasowanie i zminimalizować odchylenie standardowe reszt. Uwaga: Parametry można łatwo dostosować, klikając wartość w polu, a następnie korzystając z suwaka lub wpisując wartość ręcznie. Wyświetlane dopasowanie będzie aktualizowane w czasie rzeczywistym wraz ze zmianą wartości. Po uzyskaniu akceptowalnego dopasowania można je wyeksportować, klikając prawym przyciskiem myszy na ekranie dopasowania, co umożliwia eksport danych do schowka w celu wklejenia do wybranego programu lub zapisanie jako obraz do szybkiego podglądu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 11: Ograniczanie i ustalanie wartości parametrów Single Kinetic Fit jest możliwe, jeśli jeden lub więcej parametrów jest dobrze znanych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 12: Okno dekompozycji wartości osobliwych z głównymi składowymi, pokazujące, jak będą wyglądać ślad oraz składowe po dodaniu odpowiedniej liczby głównych składowych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 13: Okno Global Fit przed wygenerowaniem dopasowania analizy globalnej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 14: Okno Global Fit prezentujące wyniki dopasowania analizy globalnej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 15: Menu Plik służące do zapisywania i eksportowania plików. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 16: Przykłady nieoptymalnej korekcji chirp i dopasowania. (A) przedstawia słabe dopasowanie pojedynczej kinetyki. Rodzaj ustrukturyzowanych residuów pokazany na panelu A zazwyczaj wskazuje, że do dopasowania danych wymagany jest dodatkowy czas życia. Zauważmy, że residua spadają poniżej zera w krótszych czasach i unoszą się powyżej linii zero w dłuższych czasach życia. (B) przedstawia poprawną korekcję chirp z wykorzystaniem przycisku podglądu, w której cechy są wyprostowane i w danych nie występuje zakrzywienie. (C) przedstawia nieprawidłową korekcję chirp, w której w niebieskiej części widma występuje wyraźne zakrzywienie, co wskazuje, że funkcja chirp nadmiernie koryguje ten obszar. (D) pokazuje słabe dopasowanie globalnej analizy czasu życia, w którym nadmierne dopasowanie (overfitting, w tym zbyt wiele parametrów) doprowadziło do powstania „symetrycznych” DADS (które wyglądają jak odbicia lustrzane względem osi x) w podobnych zakresach czasu życia, co w zasadzie znosi ich wzajemny wpływ. Gdy zaobserwowane zostaną takie cechy, dopasowania nie należy używać. (E) pokazuje słabe dopasowanie globalne, w którym zbyt wiele parametrów doprowadziło do uzyskania bardzo krótkiego czasu życia z bardzo dużą amplitudą. Problem przedstawiony w (E) może pojawić się również wtedy, gdy artefakty wokół czasu zero nie są prawidłowo korygowane, a proces dopasowania skupia się na minimalizacji residuów poprzez nadmierne podkreślanie bardzo krótkiego czasu życia (takiego, który nie ma sensu fizycznego). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 17: Przykład danych TAS z rozproszeniem Ramana. Rozproszenie występuje w okolicach czasu zero i pokrywa się z długością fali wzbudzenia pompy. Rozproszenie składa się z serii ostrych pików z bardzo intensywnym pikiem dodatnim po niebieskiej stronie wzbudzenia pompy oraz pikiem ujemnym po czerwonej stronie wzbudzenia pompy. Tego zjawiska nie da się w rozsądny sposób uniknąć, dlatego należy usunąć je z danych, aby nie zakłócało wyników dopasowania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Plik zawierający zestaw danych do tego samouczka (POPOP data_POPOP-inEtOH.ufs). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Plik zawierający pusty zestaw danych do tego samouczka (POPOP data_BLANK.ufs). Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Pliki z informacjami pomocniczymi zawierające dodatkowe uwagi dotyczące dopasowania odpowiedzi rozpuszczalnika, korekty rozproszenia oraz odejmowania tła powierzchniowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Ogólne uwagi dotyczące przygotowania danych
Dopasowanie danych TA może na pierwszy rzut oka wydawać się stosunkowo proste i można by oczekiwać, że dla danego zestawu danych zostanie uzyskana jedna, jednoznaczna i poprawna „odpowiedź”. Jednakże, jak podkreślono w protokole, istnieje wiele czynników podczas akwizycji, przygotowania i analizy danych, które należy starannie rozważyć, a które mogą prowadzić do niepewności co do tego, który model lub zestaw parametrów dopasowania najlepiej opisuje dane. Celem przygotowania i dopasowania danych jest maksymalne zredukowanie tych zbędnych czynników przy jednoczesnym zachowaniu danych do analizy. Zadanie to może wydawać się przytłaczające dla osoby początkującej, ponieważ jest wiele kwestii do rozważenia. Aby zbudować intuicję dotyczącą procesu dopasowania, osobom początkującym zaleca się wielokrotne przygotowanie tych samych danych od zera w nieco inny sposób, aby sprawdzić, jak drastycznie kroki przygotowania danych wpływają na najlepsze dopasowanie. Dodatkowo, dwóch różnych badaczy może przygotować i dopasować te same dane, a następnie porównać wyniki. Proces ten może być czasochłonny podczas pierwszych kilku prób, jednak pozwoli on osobie początkującej wypracować intuicję dotyczącą spójnego przygotowania danych dla przyszłych próbek. Jak każda umiejętność, przygotowanie i dopasowanie danych wymaga czasu na wypracowanie, dlatego osobom początkującym zaleca się cierpliwość i dyscyplinę podczas eksperymentowania i nauki tego procesu. Zestaw danych użyty w niniejszym badaniu został udostępniony, aby dać osobie początkującej możliwość dopasowania danych równolegle z samouczkiem oraz bezpośredniego porównania wyników z tymi przedstawionymi w samouczku.

Dane mogą zawierać cechy tła, które występują przy wszystkich opóźnieniach czasowych (Rycina uzupełniająca 2 oraz Rycina uzupełniająca 3) , takie jak rozpraszanie wiązki pompowania oraz emisja spontaniczna próbki. Niepożądane cechy te muszą zostać usunięte, aby wyizolować sygnał absorpcji przejściowej dla badanego związku¹¹. Usuwanie takich cech odbywa się poprzez wybór, uśrednienie i odjęcie wkładu z kilku widm różnicowych dla czasu ujemnego. Podczas wyboru widm tła należy upewnić się, że do usunięcia nie zostaną dołączone żadne cechy, które mogą być częścią badanego procesu. W danych TA  mogą być również obserwowane cechy tła pochodzące z rozpuszczalnika, takie jak absorpcja zanieczyszczeń lub samego rozpuszczalnika. W przypadku gdy rozpuszczalnik generuje sygnał, od zbioru danych próbki należy odjąć zbiór danych „ślepą próbę” zawierający tylko rozpuszczalnik, zmierzony w dokładnie tych samych warunkach doświadczalnych co próbka. Szczegóły dotyczące tej procedury znajdują się w Pliku uzupełniającym 3.

The korekcja chirp jest kolejnym czynnikiem, który należy starannie rozważyć. Chirp występuje, gdy impuls sondujący w drodze do próbki ulega rozszerzeniu z powodu niedoskonałości luster sterujących lub przechodząc przez optykę dyspersyjną, taką jak soczewki lub filtry. W efekcie fotony o niższej energii w impulsie sondującym (tj. czerwona strona widma sondy) docierają do próbki przed fotonami o wyższej energii (tj. niebieska strona widma sondy). Prowadzi to do "moment zero" rozmycia widm TA w skali kilku femtosekund lub pikosekund¹⁸, co przejawia się jako wyraźna krzywa w surowym zbiorze danych, rozpoczynająca się w zakresie długości fal niebieskich, a następnie wypłaszczająca się w miarę zbliżania się do zakresu czerwonego (Rysunek uzupełniający 7). Chirp jest najbardziej zauważalny w krótszych skalach czasowych, takich jak te dostępne w ultraszybkiej TA. To zależny od długości fali czas zero można skorygować zgodnie z opisem w protokole, jednak zastosowanie tego procesu może być trudne i subiektywne. Posiadanie "Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia." próbka lub pomiar odpowiedzi Kerra rozpuszczalnika mogą zminimalizować subiektywny charakter ręcznego wyboru punktów do korekcji chirpingu, niezbędnej do wygenerowania dopasowania wielomianowego stosowanego do dostrojenia i korekcji chirpingu. Celem korekcji chirpingu jest usunięcie wyraźnego "krzywa" czasu zero. Uzyskanie najlepiej skorygowanych danych może wymagać wielokrotnych prób dopasowania chirpu. Dane można dopasowywać wielokrotnie, stosując różne korekcje chirpu, aby zrozumieć wpływ tej korekcji na wartości krótkich czasów życia TA.

Artefakty pojawiające się w "czasie zero"
W danych TA w pobliżu "czasu zero" można zaobserwować kilka artefaktów, w tym rozpraszanie Rayleigha, stymulowane rozpraszanie Ramanowskie oraz modulację krzyżową fazy. Rozpraszanie Rayleigha wiązki pompowanej jest rozpraszaniem sprężystym, które zachodzi bez zmiany energii. Cecha ta pojawi się przy tej samej długości fali co impuls pompowy. Stymulowane rozpraszanie Ramanowskie może towarzyszyć sygnałowi rozpraszania pompowego¹⁹. Rozpraszanie Ramanowskie, będące wynikiem niesprężystego rozpraszania fotonu pompy, generuje piki o energii zarówno wyższej (anty-Stokes), jak i niższej (Stokes) niż energia padającego impulsu pompowego. W danych TA stymulowane rozpraszanie Ramanowskie jest obserwowane z powodu jednoczesnego naświetlania próbki wiązką pompową i sondującą. Gdy wiązka sondująca oddziałuje z próbką w tym samym czasie co wiązka pompową, stymuluje ona proces Ramanowski. W związku z tym stymulowane rozpraszanie Ramanowskie występuje wokół czasu zero i skutkuje dodatkowymi pikami w widmach w ciągu pierwszych kilkuset femtosekund (Rysunek 6, widoczne w ciemnoniebieskim widmie w zaznaczonej sekcji oraz Rysunek uzupełniający 17). Modulacja krzyżowa fazy wynika z modulacji współczynnika załamania światła rozpuszczalnika w wyniku oddziaływania z intensywnym polem elektrycznym impulsu.

Stymulowane rozpraszanie Ramanowskie można odróżnić od modulacji fazy krzyżowej, ponieważ piki Ramanowskie pojawiają się przy konkretnych częstotliwościach odpowiadających modom wibracyjnym rozpuszczalnika. Ponieważ jest to proces Ramanowski, można zaobserwować linie Stokesa i anty-Stokesa po obu stronach wzbudzenia. Rozpuszczalniki chlorowane, takie jak dichlorometan, wykazują bardzo wyraźne pasma Ramanowskie ze względu na dużą polaryzowalność chloru. Sygnatury spektralne modulacji fazy krzyżowej są unikalne dla danego rozpuszczalnika, ale nie są tak łatwo przewidywalne jak cechy rozpraszania Ramanowskiego.

W zależności od kinetyki mierzonej próbki, rozpraszanie Rayleigha, rozpraszanie Ramanowskie oraz modulacja fazowa mogą nakładać się na wczesne sygnały w danych TA, co może utrudniać ich usunięcie. W zasadzie cechy te można zaobserwować w pomiarze czystego rozpuszczalnika i odjąć je od danych, programy do analizy danych mogą posiadać funkcje dopasowania umożliwiające uwzględnienie tych zjawisk, jednak w praktyce może to być trudne. Gdy odjęcie tych artefaktów bez naruszenia danych próbki okazuje się zbyt trudne, lepszym rozwiązaniem może być wycięcie zniekształconych widm wokół czasu zero w celu wyeliminowania artefaktów. Będzie to miało niefortunny skutek uboczny w postaci usunięcia pierwszych około 300 fs danych, ale sprawi, że późniejsze dopasowanie będzie bardziej wiarygodne. W trakcie analizy wielu zestawów danych tych samych i różnych próbek, początkujący użytkownik nabierze intuicji w osiąganiu równowagi między odejmowaniem tła a wycinaniem danych z początkowych 100-200 fs.

Ogólne przycinanie może być konieczne dla fragmentów widm zawierających niski stosunek sygnału do szumu. Niestabilność wiązki sondującej w niektórych obszarach, niska intensywność światła sondującego, zbyt wysokie stężenia próbek (blokujące w ten sposób znaczną część padającej wiązki sondującej), niska intensywność pompy oraz przekrój czynny absorpcji próbki to typowe przyczyny niskiego stosunku sygnału do szumu, które mogą utrudniać dopasowanie danych. W takich przypadkach przycinanie zbioru danych po obu stronach okna optycznego w celu osiągnięcia pożądanego poziomu stosunku sygnału do szumu może wspomóc proces dopasowania.

Zbiór danych jest gotowy do analizy, gdy zostanie on odpowiednio przycięty w celu usunięcia wadliwych fragmentów, skorygowany pod kątem chirp i gdy widma tła zostaną uśrednione i odjęte. Ta procedura powinna doprowadzić do uzyskania danych zawierających jedynie te części, które są najbardziej istotne dla analizowanej fotofizyki i fotochemii. Należy przyznać, że proces ten wiąże się z pewnym stopniem subiektywizmu. Celem przygotowania danych jest znalezienie równowagi między usuwaniem artefaktów w taki sposób, aby nie zakłócały one dopasowania modelu, a jednocześnie nie usuwaniem zbyt dużej ilości informacji, co mogłoby naruszyć integralność zbioru danych i utrudnić jego interpretację. Znalezienie tej równowagi wymaga czasu i doświadczenia w celu wypracowania intuicji pozwalającej odróżnić artefakt od rzeczywistych danych. Dopasowywanie (i ponowne dopasowywanie) tego samego zestawu danych w różne dni lub przeprowadzenie analizy tych samych danych przez dwóch różnych badaczy może być sposobem na zminimalizowanie błędu ludzkiego oraz subiektywizmu w przygotowaniu i analizie danych.

Ogólne uwagi dotyczące dopasowania i interpretacji
Po przetworzeniu surowych widm TA muszą one zostać zinterpretowane i zamodelowane, aby wyodrębnić informacje o gatunkach i dynamice występującej w badanym układzie. Proces ten można opisać jako procedurę trójetapową, która obejmuje wstępną interpretację spektralną, modelowanie/dopasowanie ilościowe oraz przypisanie interpretacji spektralnej do modelu/dopasowania.

Wstępna interpretacja widm: Celem etapu interpretacji widm jest przypisanie cech występujących w widmach TA do stanów elektronowych osiąganych w trakcie ewolucji fotofizycznej lub fotochemicznej układu. W pierwszej kolejności należy zidentyfikować poszczególne stany. W niniejszej pracy stany odnoszą się do unikalnych stanów elektronowych będących częścią ewolucji fotofizycznej lub fotochemicznej układu. Stan, reprezentowany na przykład przez jedną konkretną krzywą energii potencjalnej (PEC), posiada zestaw charakterystycznych pików reprezentujących jego widmo absorpcyjne. Zmianę zachodzącą w obrębie jednego stanu nazywa się procesem. Proces fotofizyczny może objawiać się w widmach TA jako przesunięcie piku lub zmiana szerokości widma. Kluczowym aspektem procesu jest to, że populacja stanu pozostaje niezmieniona (tj. proces zachodzi w obrębie danej PEC); zmienia się jedynie rozkład energii wewnątrz stanu. Zmiana populacji stanu będzie określana jako przejście. Podczas przejścia układ ewoluuje do innej PEC (tj. stanu elektronowego). Przejścia mogą obejmować konwersję wewnętrzną (IC), przejście międzyukładowe (ISC), przeniesienie ładunku, przeniesienie energii, powstawanie nowych produktów lub powrót do stanu podstawowego. Wytyczne dotyczące przypisywania stanów, procesów i przejść zostały omówione w następnych akapitach.

Przypisywanie stanów
Pierwszym krokiem w tym procesie jest przypisanie cech spektralnych do konkretnych gatunków chemicznych lub stanów. Stan S₁ w TA powinien wykazywać czas życia zgodny z czasem życia fluorescencji wyznaczonym za pomocą spektroskopii emisyjnej z rozdzielczością czasową. Stan tripletowy można zweryfikować, jeśli jego czas życia ulega wygaszeniu przez tlen. W przypadku podejrzenia obecności anionu lub kationu rodnikowego w ewolucji fotofizycznej, można przeprowadzić spektroelektrochemię lub chemiczne utlenianie/redukcję w celu wygenerowania gatunków rodnikowych, a następnie uzyskać widmo absorpcyjne tego gatunku i porównać je z kształtem pasma TA. W celu potwierdzenia obecności wolnych rodników można przeprowadzić spektroskopię elektronowego rezonansu spinowego (ESR). Doskonały wykład instruktażowy organizowany przez ACS Division of Inorganic Chemistry przedstawia przegląd TA oraz rozważań dotyczących przypisywania cech spektralnych²⁰. Po przypisaniu pasm do poszczególnych gatunków, kolejnym krokiem w interpretacji widm TA jest jakościowy opis procesów dynamicznych zachodzących w układzie. Krok ten jest kluczowy, ponieważ pozwala badaczowi określić, jakie modele będą odpowiednie do opisu ich układu, i dostarcza punktu odniesienia do porównania parametrów dopasowania.

Zmiany w obrębie stanu
Chłodzenie wibracyjne, reorganizacja geometryczna lub solwatacja to niezwykle szybkie procesy (od sub-ps do dziesiątek ps), które można obserwować za pomocą TA. Chłodzenie wibracyjne objawia się jako szybki przesunięcie widma TA w stronę krótkofalową (blue shift) w skali czasu kilku pikosekund^21,22,23. Reorganizacja geometryczna może zachodzić w skali czasu dziesiątek ps. Dynamika solwatacji w konwencjonalnych cieczach dipolarnych objawia się jako przesunięcie widma w stronę długofalową (redshift) i jego zwężenie w ciągu kilku pikosekund, jednak rozpuszczalniki o wysokiej lepkości, takie jak glicerol, glikol polietylenowy (PEG), ciecze jonowe i głębokie rozpuszczalniki eutektyczne, mogą wykazywać dynamikę solwatacji trwającą wiele nanosekund^24,25,26.

Zmiany w populacji stanów
Reakcje charakteryzują się zmianą intensywności pasma, gdzie spadek intensywności wiąże się ze spadkiem stężenia odpowiedniego gatunku chemicznego, a i odwrotnie w przypadku wzrostu. W niektórych przypadkach w widmach widoczne są zarówno substraty, jak i produkty, podczas gdy w innych stany produktów są zbyt krótkotrwałe lub wykazują zbyt duże przesunięcie w stronę czerwieni, aby można było je zaobserwować. Często przejścia między stanami można zaobserwować dzięki obecności punktu izosbestycznego w widmach.

Modelowanie ilościowe/Dopasowanie danychA Następnie należy dopasować model do danych, aby wyekstrahować informacje ilościowe na temat dynamiki układu. Jak opisano wcześniej we wstępie, istnieje szeroki wachlarz dostępnych modeli. Niniejszy protokół skupia się na dwóch najczęstszych metodach: dopasowaniu jednofalowym oraz analizie globalnej. Metoda jednofalowa polega na dopasowaniu poszczególnych przebiegów dla danej długości fali ze spektra do określonej formy funkcyjnej, zazwyczaj sumy funkcji wykładniczych:

    (2)

gdzie ΔA(t) to sygnał TA przy wybranej długości fali, n to liczba komponentów wykładniczych, a a_i to amplituda komponentu wykładniczego, i, z stałą czasową τ_i. Można dodawać kolejne komponenty, aż dopasowanie odtworzy dane eksperymentalne. Celem każdego procesu dopasowania jest zamodelowanie danych przy użyciu takiej liczby czasów życia, aby dobrze odtworzyć dane, ale nie doprowadzić do ich nadmiernego dopasowania (overfitting) poprzez uwzględnienie zbyt wielu komponentów. Dlatego, aby pomóc określić, kiedy dane są dopasowane w granicach niepewności eksperymentalnych, stosuje się ważone parametry dobroci dopasowania, takie jak ⁵.

Po satysfakcjonującym dopasowaniu zaniku, parametry modelu mogą zostać wykorzystane do charakterystyki dynamiki układu. Następnie można wyodrębnić i zinterpretować wynikowe stałe czasowe. Niestety, duża liczba nakładających się cech w widmach TA oznacza, że pojedyncza długość fali w widmie może zawierać dynamikę odpowiadającą różnym gatunkom, których sygnatury spektralne się pokrywają, co oznacza, że stałe czasowe wyodrębnione z dopasowania dla pojedynczej długości fali mogą reprezentować kompozycję wielu zbieżnych procesów. Ponadto wszelkie zmiany w kształcie i położeniu pasma będą również wpływać na amplitudy i stałe czasowe wyodrębnione z dopasowania jednofalowego. Problemy te można w niektórych przypadkach obejść za pomocą metody dopasowania zwanej „analizą kształtu pasma”, w której określa się lub przyjmuje postać funkcyjną pasm TA dla każdego absorbującego gatunku w układzie. Kształty te są następnie ważone amplitudami zależnymi od czasu i sumowane w celu odtworzenia obserwowanego widma. Procedura ta jest powszechnie stosowana w analizie widm fluorescencji rozdzielonej w czasie, jednak bardziej skomplikowane kształty i nakładające się komponenty pasm TA sprawiają, że metoda ta jest możliwa do zastosowania tylko w kilku prostych przypadkach, co szczegółowo opisano w innym opracowaniu¹⁰.

Kolejną wadą dopasowania dla pojedynczej długości fali jest to, że nie wykorzystuje ono w sposób naturalny szerokiego zakresu widmowego oferowanego przez nowoczesne eksperymenty TA. W zasadzie można by metodycznie dopasowywać każdą pojedynczą długość fali widma, jednak taka analiza jest uciążliwa, czasochłonna i kosztowna obliczeniowo. Aby sprostać temu wyzwaniu, można zastosować metodę zwaną „analizą globalną”, która pozwala na jednoczesne dopasowanie całego zestawu widm TA do zbioru wspólnych parametrów dynamicznych⁴. Analiza globalna oraz ściśle z nią powiązana metoda zwana analizą docelową (target analysis) są skutecznymi i szeroko stosowanymi metodami, lecz posiadają one również swój własny zestaw wad i ograniczeń. Jak przy każdym modelu, kluczowe jest zrozumienie założeń wykorzystanych do jego stworzenia, a także wynikających z nich ograniczeń.

W analizie globalnej widma TA są reprezentowane przez macierz m na n, gdzie m oznacza liczbę długości fal zmierzonych w każdym widmie, a n oznacza liczbę zebranych punktów czasowych. Zakłada się następnie, że macierz tę można rozłożyć na produkt dwóch innych macierzy:

    (3)

gdzie C(t) jest macierzą n przez k, a S(λ) jest macierzą m przez k. Wartość k reprezentuje liczbę odrębnych komponentów spektralnych wykorzystanych do odtworzenia widm. Każdy z tych komponentów reprezentuje gatunek absorbujący o unikalnej sygnaturze spektralnej i dynamice. Macierz S(λ) reprezentuje widma TA k komponentów, a C(t) ich stężenia zależne od czasu. W najprostszej i najczęściej stosowanej implementacji analizy globalnej zakłada się, że każdy komponent charakteryzuje się kinetyką jednowykładniczą (i = 1 w równaniu 2, przy czym każdemu komponentowi przypisana jest własna stała czasowa). Podsumowując, pełne widmo TA można przedstawić jako sumę k komponentów widmowych, z których każdy posiada własne charakterystyczne widmo absorpcyjne i jednowykładniczy spadek.

Podczas dopasowywania widm TA użytkownik określa liczbę potrzebnych komponentów (tj. wartość k) oraz szacuje stałą czasową związaną z jednoexponentialnym zanikiem tych gatunków. Program do dopasowywania generuje następnie C_zgadnij(t) i rozwiązuje równanie 3 dla S_dopasowanie(t). Następnie S_dopasowanie(λ) oraz C_zgadnij(t) są mnożone zgodnie z równaniem 3 w celu utworzenia dopasowanych widm, ΔA(λ,t)_dopasowanieWreszcie reszty, ΔA(λ,t)_exp − A(λ,t)_dopasowanie, są zminimalizowano i optymalne S_dopasowanie(λ) oraz wyznaczonych stałych czasowych. Stosunkowa prostota analizy globalnej, polegająca na reprezentowaniu całego zestawu widm za pomocą kilku stałych czasowych i ustalonych komponentów spektralnych, czyni ją atrakcyjną (i skuteczną) metodą rozplątywania skomplikowanych kształtów pasm i dynamiki spotykanych w spektroskopii TA. Należy jednak zachować ostrożność, aby upewnić się, że analiza globalna jest odpowiednim modelem dla badanego układu.

Kluczowym założeniem w analizie globalnej, przedstawionym w równaniu 3, jest całkowita rozdzielność części długości fali i czasu w dynamice, właściwość ta nazywana jest „bilinearnością”. Założenie to wymaga, aby kształty pasm składowych były niezależne od czasu (tzn. mają stały kształt widmowy, który nie zmienia się ani nie przesuwa w czasie). Jedynym elementem, który zmienia się w trakcie eksperymentu, są względne populacje każdego składnika, reprezentowane przez C(t). W długich skalach czasowych, rzędu ~1 ns, założenie to zazwyczaj jest spełnione i analizę globalną można stosować bez większych obaw. Z drugiej strony, procesy w stanie wzbudzonym, takie jak chłodzenie wibracyjne i dynamika solwatacji, dominujące w ultraszybkich skalach czasowych dostępnych dla femtosekundowej spektroskopii TA, prowadzą do zależnych od czasu zmian w sygnaturze widmowej danego gatunku i do naruszenia bilinearności. Nie oznacza to, że analiza globalna nie może odtworzyć zbioru danych; w rzeczywistości zawsze może ona dostarczyć satysfakcjonującego dopasowania pod warunkiem zastosowania wystarczającej liczby składowych. Problem polega wówczas na interpretacji widm składowych i przypisaniu stałych czasowych do konkretnych procesów w stanie wzbudzonym, ponieważ składowe mogą już nie odpowiadać odrębnym gatunkom absorbującym. Dlatego należy zachować szczególną ostrożność podczas stosowania analizy globalnej w sytuacjach, gdy nie można założyć bilinearności.

Przypisanie interpretacji widmowej do modelu/dopasowania: Po uzyskaniu dopasowania interpretacja widmowa musi zostać odwzorowana na czasy życia uzyskane w procesie dopasowania. Czasy życia z dopasowania są przypisywane zarówno procesom, jak i reakcjom zidentyfikowanym podczas wstępnej interpretacji widm. Jednakże wstępna ocena widm oraz liczba dopasowanych czasów życia uzyskana przez model mogą nie być bezpośrednio ze sobą zgodne. W tej (częstej!) sytuacji osoba wykonująca dopasowanie musi wrócić do wstępnej interpretacji i ocenić ją ponownie. Być może podczas wstępnej oceny przeoczono chłodzenie wibracyjne lub inny proces , który został zidentyfikowany w procesie modelowania i dopasowania. Albo być może dwa różne zestawy parametrów dopasowania mogłyby dobrze odwzorować dane, a wstępna interpretacja może pomóc w wyborze odpowiedniego zestawu parametrów. W tym końcowym kroku osoba wykonująca dopasowanie musi przełączać się między interpretacją a dopasowaniem, aby znaleźć opis prowadzący do prawdopodobnego przypisania fotofizycznego gatunków i dynamiki układu. W celu uzupełnienia dopasowań uzyskanych za pomocą analizy globalnej oraz oprogramowania do dopasowania przedstawionego w tym artykule, można również wypróbować inne programy do dopasowania, które zawierają sekwencyjne modele dopasowania, takie jak analiza docelowa (target analysis)⁴.

Podsumowując, niniejszy protokół omawia przygotowanie i dopasowanie danych absorpcji przejściowej. Jego celem jest wskazanie wyzwań związanych z tym procesem oraz omówienie sposobów ich praktycznego unikania lub łagodzenia. Dopasowywanie danych TA, podobnie jak dopasowywanie większości danych spotykanych w dziedzinach technicznych, może być złożone i niekiedy subiektywne. Dlatego też krytyczne jest uświadomienie sobie procesu i ograniczeń danych, sposobu ich przygotowania oraz narzędzi matematycznych wykorzystywanych do modelowania i nadawania znaczenia tym danym. Naukowcy muszą podchodzić do danych i modelowania w sposób krytyczny.

Można podjąć próbę ograniczenia subiektywizmu dopasowań. Na przykład dane można przygotować i dopasować, zaczynając od różnych punktów startowych oraz w różne dni, aby upewnić się, że uzyskano takie samo dopasowanie. Można porównać dane zebrane w różne dni przy różnym przygotowaniu próbek. Różni badacze mogą dopasowywać te same dane i porównywać swoje wyniki. Z czasem badacze mogą wyrobić sobie intuicję dotyczącą uzyskiwanych danych (w oparciu o specyfikę swojej aparatury doświadczalnej i parametry eksperymentalne), co pozwoli im z większą pewnością przeprowadzać dopasowania.

Istnieje wiele do nauki w zakresie dopasowywania danych TA oraz szczegółów modeli omówionych w tym artykule. Z entuzjazmem poleca się kilka doskonałych artykułów przeglądowych, które zgłębiają tę tematykę^4,10,27. Niniejszy protokół ma być wstępem dla początkujących do procesu analizy i dopasowywania, który pobudzi zainteresowanie głębszym zrozumieniem tego procesu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
EtOH 200% Proof	Decon Laboratories Inc	CAS 64-17-5	Rozpuszczalnik używany do przygotowania
próbki Spektrometr absorpcji przejściowej Helios	Ultraszybkie systemy	https://ultrafast.systems/products/spectrometers-accessories/helios/	Spektrometr absorpcji przejściowej
POPOP  1,4-bis[2-(5-fenyloksazolyl)]benzen	Tokio Przemysł chemiczny	CAS 1806-34-4 Próbka	używana do przykładów
Ultraszybkie systemy	Surface Xplorer	https://ultrafast.systems/products/spectrometers-accessories/surface-xplorer/	Program dopasowania