Wprowadzenie do przetwarzania, dopasowywania i interpretowania danych absorpcji stanów nieustalonych

Summary

Ten protokół jest wstępem dla początkujących do przetwarzania, dopasowywania i interpretacji widm absorpcji przejściowej. Protokół ten koncentruje się na przygotowaniu zestawów danych i dopasowaniu przy użyciu zarówno kinetyki pojedynczej długości fali, jak i globalnej analizy czasu życia. Omówiono wyzwania związane z danymi dotyczącymi absorpcji stanów nieustalonych i ich dopasowaniem.

Abstract

Spektroskopia absorpcji przejściowej (TA) to potężna metoda spektroskopowa o rozdzielczości czasowej, używana do śledzenia ewolucji procesów stanu wzbudzonego poprzez zmiany w widmie absorpcji systemu. Wczesne wdrożenia TA były ograniczone do specjalistycznych laboratoriów, ale ewolucja komercyjnych systemów "pod klucz" sprawiła, że technika ta stała się coraz bardziej dostępna dla grup badawczych na całym świecie. Nowoczesne systemy TA są w stanie generować duże zbiory danych o wysokiej rozdzielczości energetycznej i czasowej, które są bogate w informacje fotofizyczne. Jednak przetwarzanie, dopasowywanie i interpretacja widm TA może być wyzwaniem ze względu na dużą liczbę cech stanu wzbudzonego i artefaktów instrumentalnych. Podczas gromadzenia, przetwarzania i dopasowywania danych TA należy dokładnie rozważyć wiele czynników, aby zmniejszyć niepewność co do tego, który model lub zestaw parametrów dopasowania najlepiej opisuje dane. Celem przygotowania i dopasowania danych jest ograniczenie jak największej liczby tych czynników zewnętrznych przy jednoczesnym zachowaniu danych do analizy. W tej metodzie początkujący otrzymują protokół przetwarzania i przygotowania danych TA, a także krótkie wprowadzenie do wybranych procedur i modeli dopasowania, w szczególności dopasowania pojedynczej długości fali i globalnej analizy czasu życia. Przedstawiono komentarz do szeregu powszechnie spotykanych wyzwań związanych z przygotowaniem danych i metod ich rozwiązywania, a następnie omówiono wyzwania i ograniczenia związane z tymi prostymi metodami dopasowywania.

Introduction

Spektroskopia absorpcji przejściowej (TA) to technika spektroskopowa z rozdzielczością czasową, która monitoruje ewolucję gatunków wzbudzonych w czasie poprzez zależne od czasu zmiany ich widma absorpcyjnego po wzbudzeniu impulsem światła. Ponieważ TA jest techniką absorpcyjną, można zidentyfikować sygnały spektroskopowe, które powstają ze stanów, które przechodzą zarówno przejścia radiacyjne (tj. stany, które zwykle emitują foton), jak i przejścia nieradiacyjne (stany, które są zazwyczaj niefluorescencyjne i przechodzą wewnętrzną konwersję, skrzyżowanie międzysystemowe lub uczestniczą w fotoreakcjach) i śledzić ich ewolucję^1,2. W zależności od specyfiki źródła wzbudzenia i metody detekcji, TA umożliwia dostęp do kinetyki od femtosekund do ponad mikrosekund oraz od UV do dalekiej podczerwieni, co czyni go wszechstronnym narzędziem spektroskopowym. Komercjalizacja spektrometrów TA znacznie się rozwinęła w ciągu ostatnich kilku dekad, co doprowadziło do tego, że coraz więcej laboratoriów i obiektów ma dostęp do tej potężnej techniki².

Nowoczesne systemy TA są zdolne do tworzenia dużych zbiorów danych o wysokiej rozdzielczości energetycznej i czasowej. Zestawy danych zazwyczaj mają postać matrycy 2D wartości różnicy transmitancji lub absorbancji w funkcji długości fali i opóźnienia czasowego w stosunku do impulsu wzbudzenia. Ten zestaw danych można wyświetlić jako dwuwymiarową mapę cieplną lub trójwymiarową mapę topograficzną. Interpretacja tych danych stała się bardziej złożona, ponieważ badacze starają się uwzględnić cały zestaw danych podczas generowania dopasowań, które najlepiej opisują ich interesujący system³.

Chociaż TA może obejmować szeroki zakres długości fal i skal czasowych, ten protokół skupia się na jednej z jego najbardziej dostępnych form⁴: szerokopasmowa spektroskopia w obszarze widzialnym UV sterowana przez femtosekundowy laser impulsowy. Schematic^5,6 takiego instrumentu znajduje się w Rysunek 1. Eksperyment rozpoczyna się od pobrania impulsu z lasera i podzielenia go na dwie kopie. Jedna kopia impulsu, zwana "pompą", służy do wzbudzenia próbki. Urządzenie, takie jak optyczny wzmacniacz parametryczny (OPA), jest zwykle używane do przekształcania impulsu pompy na żądaną długość fali wzbudzenia^5,7. Druga kopia impulsu, zwana "sondą", wchodzi w mechaniczny etap opóźnienia, który może zmieniać opóźnienie czasowe między impulsami pompy i sondy poprzez zmianę odległości, jaką pokonuje impuls. Impuls sondy o pojedynczej długości fali jest następnie przekształcany w kontinuum światła białego za pomocą kryształu szafiru lub fluorku wapnia (CaF₂) ⁸. Impuls światła białego jest przepuszczany przez próbkę, a jego widmo jest mierzone za pomocą detektora szerokopasmowego, takiego jak kamera z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem (CCD). Mierząc zmiany w widmie impulsu światła białego z pompą i bez niej, można zmierzyć zmiany w widmie absorpcji próbki wywołane przez pompę, ΔA(T). Zainteresowani czytelnicy są kierowani do tej przydatnej recenzji ⁹, aby uzyskać więcej informacji na temat procesu wykrywania.

We wszystkich formach spektroskopii TA, widma ΔA(t) są obliczane poprzez uwzględnienie różnicy między absorpcją w stanie podstawowym,_sondą A, a absorpcją w stanie wzbudzonym,_pompa+sonda, przy danym opóźnieniu czasowym, t, między dwoma impulsami^2,5^,9,10.

(1)

Zauważ, że_sonda jest równoważna widmu absorpcyjnemu próbki w stanie ustalonym i jest niezależna od czasu; rozdzielczość czasowa eksperymentu wynika z opóźnienia między pompą a sondą uchwyconą w_{pompie+sondzie}(t). Symulacja tych danych jest pokazana w Rysunek 2A.

W przeciwieństwie do widm absorpcyjnych w stanie ustalonym, widma TA mogą mieć zarówno cechy dodatnie, jak i ujemne ze względu na różnicę podaną w równaniu 1. Cechy dodatnie są wynikiem nowych form absorbujących wytworzonych przez impuls pompy i mogą reprezentować wzbudzone stany chromoforowe, stany trypletowe, przegrupowania geometryczne, efekty solwatacji lub fotoprodukty w stanie wzbudzonym³. W dyskusji zostaną przedstawione ogólne wytyczne dotyczące identyfikacji tych cech i przypisywania ich do związków chemicznych. Negatywne cechy mogą wynikać zarówno z wybielacza w stanie przyziemnym (GSB), jak i emisji wymuszonej (SE) (Rysunek 2B). GSB jest spowodowany utratą populacji w stanie podstawowym w wyniku absorpcji impulsu pompy. Cząsteczki awansowane do stanu wzbudzonego nie absorbują się już w tym samym regionie, co ich stan podstawowy; w związku z tym mniejsza część impulsu sondy jest pochłaniana, a różnica w równaniu 1 może być ujemna w tym obszarze. GSB charakteryzuje się takim samym kształtem widmowym jak absorpcja w stanie podstawowym, ale z przeciwnym znakiem. Sygnały SE wynikają z emisji z gatunku w stanie wzbudzonym stymulowanym przez impuls sondy³. Emisja z tych gatunków powoduje, że do detektora dociera więcej światła, co jest równoznaczne z mniejszą absorpcją na tych długościach fal. Sygnał SE będzie miał podobny kształt widmowy jak widmo emisji spontanicznej gatunku, ale ze znakiem ujemnym i inną wagą częstotliwości¹⁰.

Oprócz informacji o gatunkach w stanie wzbudzonym, widma TA mogą zawierać szereg artefaktów i obcych cech, które mogą zniekształcić podstawową dynamikę i zaciemnić przypisanie pasm absorpcji¹¹. Niewłaściwe traktowanie tych artefaktów w procesie przygotowania i analizy danych może prowadzić do zastosowania niewłaściwych modeli fotofizycznych do danych, a w konsekwencji do mylących wniosków¹¹. W związku z tym pierwsza część tego protokołu koncentruje się na tym, jak prawidłowo przetwarzać zestawy danych TA po ich zebraniu. Celem tej sekcji jest dostarczenie badaczom nowym w TA zestawu wskazówek, które pomogą rozwinąć intuicję i uznanie dla rygorystycznego przygotowania i przetwarzania ich danych.

Po przetworzeniu zestawu danych, dostępne są mnóstwo narzędzi i modeli do dopasowywania i interpretowania widm o różnych poziomach złożoności i rygoru¹⁰. Celem drugiej sekcji tego protokołu jest przygotowanie czytelnika do zastosowania dopasowania pojedynczej długości fali i analizy globalnej do danych oraz dostarczenie wskazówek co do tego, kiedy te modele są odpowiednie do opisania ich danych. Komercyjne oprogramowanie jest teraz łatwo dostępne do przygotowywania i przetwarzania danych TA, takie jak Surface Xplorer^12,13 od Ultrafast systems (do pobrania i używania bezpłatnie, patrz Tabela materiałów). Inne darmowe alternatywy zostały wydane przez badaczy akademickich, takich jak Glotaran¹⁴. Glotaran to darmowy program opracowany do globalnej i docelowej analizy danych ze spektroskopii i mikroskopii czasowo-rozdzielczej. Służy jako graficzny interfejs użytkownika (GUI) dla pakietu R TIMP¹⁴. Dodatkowo użytkownicy mogą używać języków programowania, takich jak Python, do pisania własnych kodów, które przeprowadzają analizę. Każde z tych dopasowanych rozwiązań programowych i programistycznych ma pozytywne cechy, które sprawiają, że wnoszą one ważny wkład. Na potrzeby niniejszego opracowania możemy zaprezentować tylko jedno oprogramowanie do wizualnego komponentu tego działania. Dogłębne omówienie każdego oprogramowania do montażu wykracza poza zakres tego artykułu.

Ten artykuł zawiera procedurę krok po kroku dla (1) przetwarzania danych TA, (2) dopasowywania danych TA za pomocą kinetyki pojedynczej długości fali i analizy globalnej, oraz (3) wyodrębniania danych i dopasowywania ich do innych modeli. Dołączony jest zestaw reprezentatywnych danych TA, które czytelnik może wykorzystać jako ćwiczenie (plik uzupełniający 1 i plik uzupełniający 2). Dane są pomiarem próbki 1,4-bis(5-fenyloksazolo-2-ylo)benzenu (POPOP) o wielkości 165 μM w etanolu wzbudzonym przy 330 nm i pobranej w zakresie od -5 ps do 5,5 ns. Dodatkowo, w tych samych warunkach doświadczalnych w zakresie od -5 ps do 5 ps, pobrano "ślepą" próbkę zawierającą tylko etanol i nie pobrano żadnej próbki, która jest wykorzystywana do przygotowania danych do dopasowania (krok 1). Widma zebrano za pomocą ultraszybkiego spektrometru absorpcji stanów nieustalonych. Próbkę umieszczono w kuwecie o długości 2 mm i poddano ciągłemu mieszaniu. Opisana procedura przetwarzania i dopasowywania opiera się na oprogramowaniu Surface Xplorer, które dopasowuje dane w formacie *.ufs i które w tym przypadku nazywa się "programem dopasowywania". Dostępne są programy do konwersji zbiorów danych w innych formatach do plików *.ufs¹⁵. Chociaż szczegóły tego protokołu są specyficzne dla Surface Xplorer, poniższe kroki można uogólnić na dowolny pakiet oprogramowania, komercyjny lub domowy. Dodatkowo, wyniki przetwarzania danych mogą być wyodrębniane i dopasowywane za pomocą tych innych pakietów oprogramowania. Plik z informacjami uzupełniającymi (plik uzupełniający 3) zawiera dodatkowe porady dotyczące montażu.

Protocol

1. Przygotowanie danych do dopasowania

1. Załaduj zestaw danych SAMPLE do oprogramowania Fitting. Dane zostaną wyświetlone tak, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 1.
2. Gdy rozproszone światło wzbudzenia jest obecne w oknie detekcji optycznej eksperymentu, użyj opcji Odejmij światło rozproszone (Rysunek uzupełniający 2). Jeśli w danych nie ma rozproszonego światła wzbudzenia, przejdź do kroku 1.5.
   UWAGA: Światło rozproszone jest najczęściej obserwowane, gdy długość fali wzbudzenia mieści się w oknie optycznym. Światło rozproszone pojawia się jako ostra cecha ujemna (wybielacz) na długości fali wzbudzenia (lub w pewnym porządku dyfrakcyjnym lub długości fali wytwarzanej w OPA), która nie zmienia się w czasie.
3. Kliknij menu Powierzchnia, a następnie kliknij opcję Odejmij światło rozproszone (Rysunek uzupełniający 2). Pojawi się nowe okno.
4. W nowym oknie kliknij przyciski strzałek, aby ustawić liczbę widm tła na średnią (Rysunek uzupełniający 3) w celu przeprowadzenia korekcji tła. Korzystanie z dziesięciu widm stanowi dobry punkt wyjścia, a liczbę można dostosować zgodnie z potrzebami. Kliknij Akceptuj, aby wykonać odejmowanie (przejdź do kroku 1.7).
   UWAGA: Widma tła są rysowane z pierwszych widm obecnych w zbiorze danych, a następnie przesuwają się czasowo do przodu, wykorzystując tyle widm tła, ile jest potrzebne do uśrednienia sygnału tła; Jednak użycie zbyt wielu spowoduje rozpoczęcie korzystania z widm, które zawierają interesujący nas sygnał, więc nie używaj zbyt wielu. W przypadku danych z długim przedziałem czasowym funkcja rozpraszania może nie pojawić się na końcu okna czasowego danych. Może się tak zdarzyć, jeśli okno czasowe przekroczy czas integracji kamery lub z innych powodów, w zależności od tego, jak skonstruowany jest eksperyment TA. Aby temu zaradzić, można użyć opcji Ustaw zakres czasu, jak opisano w pliku uzupełniającym 3.
5. W przypadku danych, w których w oknie optycznym nie ma rozproszonego światła, kliknij menu Powierzchnia, a następnie kliknij opcję Odejmij tło.
6. W wyświetlonym oknie kliknij przyciski strzałek w prawym dolnym rogu, aby "Liczba widm" uśrednić (wybierz 10), a następnie kliknij Akceptuj.
   UWAGA: Widma tła w tej opcji działają tak samo, jak w opcji "Odejmij rozproszone światło". Rozpoczęcie od dziesięciu widm zapewnia dobre uśrednienie. Można użyć więcej widm, ale należy uważać, aby nie używać zbyt wielu, aby uniknąć uwzględnienia widm zawierających interesujące sygnały. Instrukcja obsługi urządzenia Surface Xplorer opisuje różnice w korekcji zastosowanej dla opcji "Odejmij rozproszone światło" w porównaniu z korekcją. bardziej podstawowa korekcja "Odejmij tło". Ważne jest, aby zastosować odpowiednią poprawkę dla artifact¹⁶.
7. Dane w pobliżu krawędzi okna optycznego mogą mieć bardzo niski stosunek sygnału do szumu, wynikający z kształtu widma sondy i/lub próbki pochłaniającej zbyt dużo światła białego. Zaszumione dane w tych regionach utrudniają analizę. Usuń te nieprzydatne części spektrum. Kliknij końcowe długości fal w widmie (lewy dolny kafelek), wpisz nowe wartości (rysunek uzupełniający 4) i kliknij enter. Wybierz zakres długości fali, który usuwa zaszumione dane na krawędziach okna. Dla podanych danych zakres wynosi 340-680 nm.
8. Sfinalizuj dostosowanie okna widmowego do żądanego zakresu długości fal. Kliknij menu Powierzchnia, a następnie kliknij Przytnij (Rysunek uzupełniający 5). Pojawi się wyskakujące okienko.
   1. Kliknij OK. Kliknij menu Plik, a następnie kliknij Zapisz plik jako. Następnie kliknij OK. Zamknij ten zestaw danych.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas przycinania, ponieważ funkcja przytnie dane zarówno wzdłuż osi długości fali, jak i opóźnienia czasowego, usuwając wszystkie inne dane. Upewnij się, że okno opóźnienia czasowego zawiera część danych, która ma zostać zachowana. Ponadto zdecydowanie zaleca się zapisanie wszelkich przyciętych danych jako nowego, odpowiednio oznaczonego pliku, tak aby pozostawić nienaruszoną powierzchnię surowych danych jako kopię zapasową.
9. W przypadku danych zebranych na skalach czasowych fs lub ps należy zastosować korekcję ćwierkania. Otwórz powierzchnię danych, na której znajduje się tylko rozpuszczalnik lub substrat (bez próbki) pobrany w tym samym zestawie doświadczalnym co dane. Ten przykład jest nazywany "pustym" przebiegiem eksperymentu. Wykonaj ten sam zestaw kroków na "pustych" danych (od kroku 1.2 do kroku 1.8), które zostały wykonane na przykładowych danych.
   UWAGA: Zdecydowanie zaleca się, aby taki "ślepy" eksperyment był przeprowadzany w tych samych warunkach, co próbka, ale z krótszym oknem czasowym (na przykład ~ −5 ps do 5 ps), aby zapewnić dużą liczbę punktów w okolicach czasu zero. Ta "ślepa" próba powinna składać się wyłącznie z rozpuszczalnika lub substratu, w zależności od rodzaju próbki, i służy do ustalenia krzywizny ćwierkania. Przygotowanie "ślepej próby" do tego momentu powinno przebiegać zgodnie z tą samą korektą tła i kadrowaniem, co dane próbki. Jeśli "puste" nie zostało uruchomione, korekcję ćwierkania można wykonać bezpośrednio na zestawie danych.
10. Rozpocznij proces korekcji ćwierkania. Na kafelku mapy cieplnej (w lewym górnym rogu) kliknij celownik i przeciągnij składową linii pionowej na niebieski koniec spektrum. Rozpocznij w niebieskim zakresie długości fali w pobliżu początku okna spektralnego. Kliknij menu Kinetyka, a następnie kliknij Dopasuj odpowiedź rozpuszczalnika.
    UWAGA: Reakcja dopasowania rozpuszczalnika powinna być wykonywana tylko na "ślepej" próbce, która nie generuje żadnego sygnału po upływie czasu zerowego. Próba zastosowania tej funkcji dopasowania do zestawu danych zawierającego dane dotyczące cząsteczki lub materiału będącego przedmiotem zainteresowania spowoduje, że program spróbuje dopasować dane zamiast IRF (funkcja odpowiedzi instrumentu). W przypadku "ślepych" próbek jedynym obecnym sygnałem powinien być spójny artefakt powstały w wyniku modulacji międzyfazowej. Modulacja międzyfazowa występuje tylko tam, gdzie wiązki pompy i sondy nakładają się na siebie, a zatem zapewnia ślad krzywizny ćwierkania, który można dopasować za pomocą opcji "Dopasuj odpowiedź rozpuszczalnika". W przypadku danych bez dołączonego "pustego pola" do wykorzystania do korekty wymagane będzie ręczne umieszczanie punktów, które są opisane bardziej szczegółowo w pliku uzupełniającym 3.
11. Otworzy się nowe okno "Dopasuj odpowiedź rozpuszczalnika". Kliknij przycisk Dopasuj (Rysunek uzupełniający 6). Dopasowanie wygeneruje dopasowanie do funkcji odpowiedzi instrumentu przy użyciu pierwszej i drugiej pochodnej Gaussa. Kliknij przycisk Zapisz, a następnie kliknij x, aby zamknąć ekran.
    UWAGA: Czerwona dopasowana linia powinna dobrze pasować do punktów danych (niebieskie puste kwadraty) w całym zakresie czasu, a przede wszystkim do dużego obiektu widocznego w pobliżu czasu zerowego (0,1-2,0 ps). Dopasowanie będzie miało największy sukces, jeśli w okolicach czasu zerowego będzie duża liczba punktów, co można osiągnąć, wykorzystując krótkie okno opóźnienia czasowego dla "pustego" eksperymentu i zachowując dużą liczbę punktów. Jeśli dopasowanie nie wydaje się dobrze pasować do punktów danych, zaznacz pole "Dodaj gaussa (R0)" i spróbuj ponownie dopasować. Ta opcja doda sumę gaussa do pierwszej i drugiej pochodnej i może lepiej dopasować kształt cechy IRF na tej długości fali. Jeśli złączka reagująca na rozpuszczalnik nadal nie jest w stanie przechwycić sygnału IRF, wybierz inną długość fali.
12. Wykonaj ten proces (kroki 1.10-1.11) co najmniej pięć razy, ponieważ do prawidłowej korekty ćwierkania wymagane będzie pięć punktów. Jeśli to możliwe, punkty powinny być rozmieszczone w całym oknie spektralnym. Niektóre rozpuszczalniki/substraty mogą nie generować obserwowalnego sygnału w częściach okna spektralnego, w zależności od warunków eksperymentalnych. W razie potrzeby można dodać/użyć więcej punktów, aby uzyskać akceptowalne dopasowanie. Po zakończeniu zamknij "pusty" zestaw danych.
    UWAGA: Każdy zapisany punkt jest zapisywany w pliku Excel w folderze roboczym jako nowy wiersz, gdy tylko użytkownik kliknie przycisk Zapisz. Jeśli niepożądany punkt zostanie zapisany, można go usunąć z pliku Excel, usuwając wiersz niepożądanego punktu.
13. Ponownie otwórz przycięty i odjęty zestaw danych w tle. Kliknij menu Powierzchnia, a następnie kliknij opcję Korekcja ćwierkania. Spowoduje to wyświetlenie nowego ekranu z trzema oknami i menu w prawym dolnym rogu (rysunek uzupełniający 7).
14. Dodaj korekcję ćwierkania, która została właśnie utworzona. Kliknij opcję Dodaj z pliku, wybierz plik Excel, który kończy się na "współczynniki dopasowania" i kliknij OK. Dopasowanie korekcji ćwierkania jest teraz wyświetlane w lewym górnym oknie jako linia ze znacznikami X (rysunek uzupełniający 8).
    UWAGA: Korekcja ćwierkania jest wyświetlana jako linia ciągła; znaczniki X wzdłuż linii są punktami wygenerowanymi w procesie dopasowania reakcji rozpuszczalnika. Punkty można dodawać ręcznie, dostosowując krzyżyk i klikając Dodaj. Punkty można również usunąć, podświetlając je i naciskając przycisk Usuń. Dalsze punkty można edytować ręcznie, wpisując wartości na liście w prawym dolnym rogu. Na koniec, w razie potrzeby, bieżącą korektę można również zapisać jako plik do późniejszego ponownego wykorzystania za pomocą przycisku Zapisz do pliku.
15. Kliknij przycisk Podgląd korekcji ćwierkania. Spowoduje to tymczasowe zastosowanie korekcji ćwierkania. Obserwuj poprawkę w lewym górnym oknie, aby upewnić się, że dane zostały tymczasowo spłaszczone i nie można już zaobserwować krzywizny.
    1. Jeśli jesteś zadowolony z korekcji ćwierkania, kliknij przycisk Zastosuj i wyjdź. Jeśli nie jest zadowalający, powtórz kroki 1.10-1.14, wybierając więcej (lub różne) długości fal do dopasowania korekcji ćwierkania, aż do uzyskania zadowalającej korekcji.
       UWAGA: Zastosowanie korekcji ćwierkania spowoduje dostosowanie czasu zerowego do wyprostowanej linii, tak jak pojawia się ona w podglądzie. Może występować pewna niewspółosiowość czasowa między "pustym" a powierzchnią danych.
16. Kliknij menu Plik, a następnie kliknij Zapisz plik jako. Wpisz odpowiednią nazwę pliku, aby wskazać, że została zastosowana korekcja ćwierkania. Następnie kliknij OK.
17. Niektóre cechy rozpraszania w danych mogą nie zostać całkowicie usunięte podczas wykonywania odejmowania tła. Cechy te wpływają na dopasowanie i dają błędne wyniki dopasowania. Zlokalizuj wszystkie takie funkcje w danych, które powinny zostać usunięte. Cechę rozpraszania można najłatwiej zidentyfikować w ujemnym obszarze czasu.
    1. Na kafelku mapy cieplnej w lewym górnym rogu kliknij i przeciągnij celownik do ujemnego regionu czasu. Pozostając w ujemnym obszarze czasu, użyj celownika, aby określić długości fal, na których zaczyna się i kończy funkcja rozpraszania. Zwróć uwagę na zakres długości fal cechy rozpraszania (dla podanego zestawu danych zakres cech wynosi od 654 nm do 672 nm).
       UWAGA: Podczas określania, czy obiekt powinien zostać usunięty, przeciągnij poziomy krzyżyk w górę i w dół przez osie czasu, aby wyświetlić zakres widmowy obiektu. Cechy rozpraszania zazwyczaj mają bardzo hałaśliwe ślady kinetyczne na jednej długości fali, więc zakres widmowy obiektu można również zweryfikować za pomocą śladów kinetycznych.
18. Zaczynając od dolnej (niebieskiej) długości fali (tj. 654 nm), kliknij prawą długość fali na widmie (lewy dolny kafelek) i wpisz wartość dolnego (niebieskiego) zakresu cechy.
19. Przytnij dane, klikając menu Powierzchnia, a następnie kliknij Przytnij. Kliknij OK w menu podręcznym. Zapisz przycięte dane z unikatową nazwą pliku, aby wskazać, która strona danych to jest (zalecana jest niebieska lub lewa). Zamknij plik.
20. Otwórz plik z zastosowaną korekcją ćwierkania zapisaną w kroku 1.16. Kontynuuj do wyższego (czerwonego) zakresu długości fali obiektu. Kliknij lewy koniec długości fali w widmie (lewy dolny kafelek) i wpisz wartość większego zasięgu obiektu.
21. Przytnij dane, klikając menu Powierzchnia, a następnie kliknij Przytnij. Kliknij OK w menu podręcznym. Zapisz przycięte dane z unikatową nazwą pliku, aby wskazać, która strona danych to jest (zalecana jest czerwona lub prawa).
22. Połącz te dwa pliki, klikając menu Plik, a następnie kliknij opcję Połącz wiele powierzchni. W nowym oknie wybierz obie strony danych (tj. Prawa i Lewa lub Niebieska i Czerwona). Użyj ctrl + kliknięcie, aby zaznaczyć każdy plik. Sprawdź, czy oba pliki są zaznaczone w polu "Nazwa pliku:", a następnie kliknij OK w prawym dolnym rogu. Gdy pasek postępu zakończy się, dane zostaną połączone.
    UWAGA: W ten sposób można połączyć dowolną liczbę plików. Dane mogą być łączone ze sobą w wielu cięciach zarówno na osi czasu, jak i długości fali.
23. Kliknij menu Plik, a następnie kliknij Zapisz plik jako i wybierz unikalną nazwę pliku, aby wskazać, że jest on połączony (zalecany Połączony lub Kompozytowy). Następnie kliknij OK, aby zapisać plik.
    UWAGA: Patrz sekcja 3, aby uzyskać informacje na temat zapisywania danych z okna danych pierwotnych w celu późniejszego wyświetlenia i wydrukowania. Dane na mapie cieplnej (lewy górny kafelek) powinny wyglądać jak w Rysunek 3 i są teraz gotowe do dopasowania. Wizualizacja reprezentatywnych widm, jak pokazano na rysunku Rysunek 3, jest opisana w kroku 3.1.2.

2. Wykonywanie napadu

1. Załaduj odpowiednio przygotowaną powierzchnię danych.
2. Zdecyduj, które dopasowanie zostanie wykonane i przejdź do odpowiedniej sekcji.
   UWAGA: W tym protokole przedstawiono dwie opcje dopasowania danych: krok 2.3 przedstawia dopasowanie ścieżki kinetycznej o pojedynczej długości fali, a krok 2.4 przedstawia dopasowanie analizy globalnej.
3. Dopasowanie o pojedynczej długości fali
   1. Aby ustawić pojedyncze dopasowanie kinetyczne, przesuń kursor (w lewym górnym lub dolnym kafelku) na żądaną długość fali. Kliknij menu Kinetyka, a następnie kliknij Dopasuj Kinetykę. W przypadku podanego zestawu danych zacznij od 632 nm.
   2. W nowym oknie, które zostanie otwarte (Rysunek uzupełniający 9), zwróć uwagę, że główne parametry dopasowania i wartości początkowe są ustawione w lewym górnym rogu okna pod logo programu w polu obok tego obszaru pod tekstem "bieżące dopasowanie @ długość fali".
   3. Kliknij przyciski strzałek, aby dostosować liczbę czasów istnienia (tj. liczbę rozkładów wykładniczych używanych do dopasowania danych) w polu "Skończone czasy istnienia". Dla podanego zestawu danych wybierz 2 okresy istnienia. Jedno do 3 wcieleń są typowe jako punkt wyjścia.
   4. Jeśli sygnał danych wykracza poza zebrane okno czasowe, należy dołączyć "nieskończoną" składową czasu życia. Aby to zrobić, kliknij pole wyboru Użyj nieskończonego okresu istnienia. Jeśli dane całkowicie zanikną w stosunku do punktu odniesienia, nie zaznaczaj tego pola. W przypadku podanego zestawu danych nie zaznaczaj pola wyboru.
      UWAGA: "Nieskończony czas życia" pozwala na zachowanie przesunięcia sygnału (tj. program nie wymusi zaniku pasowania z powrotem do linii bazowej). Użycie składowej nieskończonej jest wymagane, gdy sygnał o tej długości fali nie zanika do linii podstawowej w zakresie czasowym eksperymentu.
   5. Wprowadź wartości szacunkowe dla czasów życia i związanych z nimi amplitud, czasu reakcji przyrządu i czasu zerowego, aby ułatwić proces dopasowania (rysunek uzupełniający 10). Kliknij żądany parametr. Kliknij w oknie wartości, wpisz wartość odgadnięcia, a następnie kliknij przycisk początkowego odgadnięcia, aby ustawić wartość. Dla podanego zestawu danych odpowiednie wartości przypuszczenia to: 0 = 0 ps, IRF = 0,25 ps, A1 = 0,6, t1 = 100 ps, A2 = 0,08, t2 = 1100 ps.
      UWAGA: "0" to oszacowanie czasu zero, "IRF" to czas reakcji instrumentu, "A" odnosi się do amplitudy danego wykładnika (patrz równanie 3), a "t" to stała czasu życia/czasu. Podanie dobrych wartości przypuszczenia pomaga programowi uzyskać rozsądne dopasowanie. Wybierz wartości "A", które znajdują się w zakresie A w zestawie danych. Wybierz wartości "t" w zakresach czasu, w których obserwuje się znaczącą zmianę w śladzie kinetycznym. Najlepszym sposobem na uzyskanie intuicji na temat tego, jak wartości domysłu wpływają na dopasowanie, jest wypróbowanie kilku zestawów wartości przypuszczenia i obserwowanie dopasowań, które tworzą. Jeśli jeden lub więcej z tych parametrów jest znanych, parametr ten można ustawić i "ustalić" tak, aby nie zmieniał się wraz z pasowaniem (rysunek uzupełniający 11).
   6. Po wprowadzeniu wszystkich parametrów odgadnięcia kliknij przycisk Dopasuj. Reprezentatywne dopasowanie jest pokazane w Rysunek 4.
      UWAGA: Zastosowanie dopasowania spowoduje wypełnienie wykresu danych linią dopasowania i wykresem resztkowym, których można użyć do oceny jakości dopasowania. Parametry dopasowania, takie jak okresy życia i związane z nimi amplitudy, czas zerowy i czas reakcji przyrządu, są również wypełnione w lewym górnym polu. Użyj kilku różnych parametrów dopasowania, aby określić liczbę okresów istnienia oraz włączanie/wykluczanie "nieskończonego" składnika czasu, który zapewnia najlepsze dopasowanie do danych.
   7. Zapisz dopasowanie, klikając przycisk Zapisz (Rysunek uzupełniający 9).
      UWAGA: Patrz sekcja 3, aby uzyskać informacje na temat zapisywania danych z okna danych pierwotnych w celu późniejszego wyświetlenia i wydrukowania.
4. Dopasowanie analizy globalnej
   1. Kliknij menu Powierzchnia, a następnie kliknij opcję Główne komponenty za pomocą SVD. Pojawi się nowe okno (Rysunek uzupełniający 12).
      UWAGA: W prawym górnym oknie wyświetlane są główne ślady kinetyczne, a w lewym dolnym wyświetlane są widma główne. Lewy górny kafelek wyświetla wykres powierzchni resztkowej utworzonej przez różnicę między powierzchnią oryginalną a powierzchnią utworzoną przez wybrane składniki główne.
   2. Kliknij przyciski strzałek, aby ustawić "liczbę głównych komponentów" (rysunek uzupełniający 12). Dla podanego zestawu danych wybierz pozycję 15.
      UWAGA: Decydując o liczbie głównych składników do wyboru, jednym ze sposobów jest ciągłe zwiększanie ich liczby, aż zarówno główne widma, jak i główne ścieżki kinetyczne będą przypominać wzór szumu. Innym sposobem określenia, ile głównych składników należy wybrać, jest przyjrzenie się wartościom współczynnika wagi, które pojawiają się po lewej stronie legendy w prawym górnym kafelku. Kontynuuj dodawanie głównych składników, aż ta wartość osiągnie 0,01. Ogólnie rzecz biorąc, na wszelki wypadek zaleca się dodanie kilku dodatkowych elementów. Może to spowodować, że zostanie wybranych nawet 15 lub więcej głównych komponentów.
   3. Kliknij przycisk Zapisz. Zapisane główne składniki są wymagane, aby przejść do następnego kroku.
      UWAGA: Każdy główny składnik jest reprezentacją oryginalnej powierzchni danych o zmniejszonej złożoności. Użycie głównych komponentów spowoduje uproszczenie powierzchni w porównaniu z analizowanymi danymi pierwotnymi. Uwzględnienie większości głównych cech powierzchni danych jest bardzo ważne dla uzyskania dokładnego dopasowania, dlatego kluczowe jest użycie wystarczającej liczby głównych składników do uchwycenia tych funkcji. Użycie większej liczby głównych komponentów nie wpłynie negatywnie na dopasowanie. Dlatego, jeśli masz jakiekolwiek wątpliwości co do tego, ile głównych składników wybrać, użyj więcej głównych składników, a nie mniej. Pamiętaj, że użycie zbyt wielu może spowolnić oprogramowanie do dopasowywania.
   4. Po zapisaniu głównych komponentów program powróci do ekranu głównego i można teraz podjąć próbę dopasowania globalnego. Kliknij menu Powierzchnia, a następnie kliknij opcję Dopasowanie globalne. Otworzy się nowe okno (Rysunek uzupełniający 13).
      UWAGA: Główne ślady kinetyczne są wyświetlane w prawym górnym kafelku. Lewy górny kafelek wyświetli powierzchnię powierzchni dopasowania powierzchni w porównaniu z powierzchnią surową. Lewy dolny kafelek wyświetli widma różnicowe związane z zanikiem (DADS) wygenerowane przez dopasowanie. Na końcu prawego dolnego kafelka można ustawić parametry dopasowania, w tym liczbę funkcji wykładniczych do użycia i to, czy użyć funkcji nieskończonej.
   5. Użyj przycisków strzałek obok "liczby exp.", aby ustawić liczbę funkcji wykładniczych, które mają być uwzględnione w dopasowaniu. Jeśli sygnał danych wykracza poza zebrane okno czasowe, należy dołączyć "nieskończoną" składową czasu życia. Aby to zrobić, kliknij pole wyboru Użyj przesunięcia (Ainf). Dla podanego zestawu danych wybierz pozycję 2 i nie klikaj tego pola. Jeśli dane całkowicie zanikną do linii bazowej, nie zaznaczaj tego pola.
      UWAGA: Parametry dopasowania można ustalić przed wykonaniem dopasowania, klikając kolumnę etykiety w prawym dolnym polu w obszarze globalnych współczynników dopasowania. Etykieta zmieni kolor na czerwony i zmieni się na (stały) wskaźnik na etykiecie. Każda wartość wpisana w polu po prawej stronie będzie używana dla tego parametru, a nie dowolnie zmieniana dla dopasowania. Należy zachować ostrożność podczas ustalania wartości dopasowania, ponieważ może to zniekształcić wyniki dopasowania.
   6. Kliknij przycisk Dopasuj. Postęp dopasowania będzie wyświetlany za pomocą małego paska ładowania na środku ekranu. Po zakończeniu postępu dopasowania okna zostaną wypełnione danymi z dopasowania (Rysunek 5 i Rysunek uzupełniający 14). Sprawdź wzrokowo wyniki dopasowania.
      UWAGA: Informacje zarówno z głównego dopasowania kinetycznego, jak i DADS są wykorzystywane do określenia, czy dopasowanie jest warte zaoczenia, czy też jest zbyt słabe. Ogólnie rzecz biorąc, jeśli dopasowanie głównych ścieżek dobrze pasuje do danych, a w wykresie, dopasowanie może zostać zaakceptowane. Łatwo jest sprawdzić wiele pasowań, zmieniając liczbę okresów istnienia i/lub zaznaczając/odznaczając przycisk "Użyj przesunięcia (Ainf)". Należy zaakceptować najlepsze dopasowanie uzyskane po sprawdzeniu wielu wariantów parametrów dopasowania.
   7. Kliknij przycisk Zapisz. Spowoduje to zapisanie aktualnie wyświetlanego dopasowania wraz z danymi w pliku Excel.
      UWAGA: Plik Excel jest zapisywany w tej samej lokalizacji pliku co zestaw danych. Jeśli zostaną wykonane dodatkowe pasowania i trzeba je zapisać, zastąpią one wszystkie poprzednie wersje. W związku z tym przed wygenerowaniem i zapisaniem nowego dopasowania nadaj każdemu staremu dopasowaniu unikalną nazwę. Parametry zapisane z dopasowania obejmują tylko czas zerowy, IRF, czasy życia i towarzyszące im DADS. Ten plik nie zawiera żadnych informacji o wykresie wykresu ani dopasowania do głównych śladów kinetycznych. Zapisywanie głównych śladów kinetyki przedstawiono w kroku 3.3. Zobacz krok 3.0, aby uzyskać informacje na temat zapisywania danych z okna danych pierwotnych w celu późniejszego wyświetlenia i wykreślenia.

3. Wyodrębnianie surowych danych i pasowań z oprogramowania do dopasowywania do kreślenia

UWAGA: Surowe dane lub dopasowania uzyskane z dopasowania pojedynczej długości fali lub analizy globalnej mogą być eksportowane do plików csv, które można otworzyć w wielu innych programach.

1. Wyodrębnianie nieprzetworzonych danych do kreślenia
   1. Aby wyeksportować mapę cieplną zestawu danych, kliknij menu Plik, a następnie kliknij opcję Eksportuj do pliku CSV (Rysunek uzupełniający 15). Spowoduje to otwarcie okna, kliknij OK, aby zapisać plik csv w tym samym katalogu, co plik danych otwarty o tej samej nazwie co plik danych.
      UWAGA: Alternatywnie surowe dane można wyeksportować, klikając prawym przyciskiem myszy okno mapy cieplnej i klikając Eksportuj dane do schowka. Spowoduje to tymczasowe zapisanie danych, aby można je było wkleić do wybranego przez użytkownika dokumentu oprogramowania. Wklej dane do pliku Excel, a następnie zapisz dane.
   2. W oknie można wyświetlić wiele widm w celu porównania lub w celu wykonania rysunku. Przeciągnij kursor poziomy (na mapie skupień, w lewym górnym rogu) do żądanego punktu czasowego. Naciśnij Ctrl + S, aby wybrać widmo i zapisać je w oknie widma (w lewym dolnym rogu). Dodaj tyle punktów czasowych, ile potrzeba, aby pokazać postęp danych (widma 5-10), jak widać na Rysunek 3.
      UWAGA: Liczba widm wybranych do przedstawienia danych i czasowy układ tych widm mogą w dużym stopniu zależeć od konkretnej próbki i warunków eksperymentalnych. Powyższe zalecenie jest ogólną wskazówką, ale specyfika eksperymentu powinna decydować o tym, które części zestawu danych mają być podkreślane.
   3. Eksportuj jako dane, klikając prawym przyciskiem myszy okno zawierające widma. Kliknij opcję Eksportuj dane do schowka. Dane są tymczasowo zapisywane. Wklej te dane do żądanego dokumentu oprogramowania (np. Excel) i Zapisz.
   4. Wiele śladów kinetycznych może być wyświetlanych w oknie kinetyki w taki sam sposób, jak w oknie widm. Przeciągnij pionowy kursor (na mapie cieplnej, w lewym górnym rogu) do żądanej długości fali. Naciśnij Ctrl + X, aby wybrać ślad czasu i zapisać go w oknie kinetyki (w prawym górnym rogu). Dodaj tyle punktów czasowych, ile chcesz. Spowoduje to tymczasowe zapisanie bieżącego śladu kinetycznego w oknie.
   5. Eksportuj jako dane, klikając prawym przyciskiem myszy okno zawierające ślady kinetyczne. Kliknij opcję Eksportuj dane do schowka. Dane są tymczasowo zapisywane. Wklej te dane do żądanego dokumentu oprogramowania (np. Excel) i Zapisz.
2. Wyodrębnianie danych z dopasowania pojedynczej długości fali do wyświetlania
   1. Kliknij menu Kinetics, a następnie kliknij Fit Kinetic, aby otworzyć okno zawierające dopasowane dane.
   2. Kliknij prawym przyciskiem myszy okno dopasowania (tj. centralny kafelek w oknie pojedynczego dopasowania). Kliknij Eksportuj dane do schowka. Spowoduje to tymczasowe zapisanie go, aby można go było wkleić do innego oprogramowania.
      UWAGA: Wykresu reszty poniżej danych dopasowania nie można wyeksportować i zamiast tego należy go ponownie utworzyć na podstawie danych pasowania. Pasowanie eksportuje zarówno nieprzetworzone dane, jak i linię dopasowania, które można następnie wykorzystać do odtworzenia reszty. Reszta jest tworzona przez odjęcie wartości dopasowania od danych w każdym punkcie czasowym i utworzenie wykresu podobnego do tego, który jest pokazany w oknie "Kinetyka dopasowania".
   3. Wklej te dane do żądanego dokumentu oprogramowania (np. Excel) i zapisz.
      UWAGA: Eksport do schowka będzie zawierał tylko dane surowe i dane linii dopasowania dla każdego wykładnika użytego w dopasowaniu. Parametry pasowania, takie jak czas życia, amplitudy i tym podobne, nie zostaną uwzględnione i będą musiały zostać wyeksportowane poprzez skopiowanie wartości z oprogramowania do dopasowania.
3. Ekstrakcja danych z globalnej analizy cyklu życia w celu wyświetlenia i analizy
   1. Kliknij menu Powierzchnia, a następnie kliknij opcję Globalne dopasowanie, aby otworzyć okno zawierające dopasowane dane.
   2. Precyzja wartości zarówno osi gęstości optycznej, jak i opóźnienia czasowego/długości fali będzie musiała zostać dostosowana odpowiednio dla głównych składowych (prawy górny kafelek) i DADS (lewy dolny kafelek). Umieść kursor myszy na oknie składnika głównego, aż w prawym dolnym rogu pojawi się pole ustawień.
   3. Szybko kliknij przycisk x.xx, najedź myszką na "Precyzja" i kliknij 6 w menu, aby ustawić liczbę miejsc dziesiętnych do uwzględnienia.
   4. Umieść kursor myszy na oknie składnika głównego, aż w prawym dolnym rogu pojawi się pole ustawień. Szybko kliknij przycisk y.yy, najedź myszką na "Precyzja" i kliknij 6 w menu, aby ustawić liczbę miejsc dziesiętnych do uwzględnienia.
   5. Kliknij prawym przyciskiem myszy okno Principal Kinetic Traces. Kliknij Eksportuj dane do schowka. Spowoduje to tymczasowe zapisanie go, aby można go było wkleić do innego oprogramowania.
   6. Wklej te dane do żądanego dokumentu oprogramowania (np. Excel) i zapisz.
      UWAGA: Dane zostaną zapisane jako seria kolumn zawierających najpierw opóźnienia czasowe, następnie główne ślady kinetyczne, a następnie linię dopasowania. Dla każdego głównego komponentu wybranego podczas przygotowywania do analizy globalnej dostępny będzie jeden zestaw. Widma DADS zostały już zapisane w ramach procedury dopasowania w kroku 2.4.7.

Results

Przygotowanie i analiza próbki 1,4-Bis[2-(5-fenyloksazolyl)]benzenu, POPOP w etanolu została przeprowadzona zgodnie z procedurą opisaną powyżej. Pomiary przeprowadzono przy użyciu ultraszybkiego spektrometru absorpcji stanów nieustalonych, zgodnie z opisem w Rysunek 1, z roztworami płynów w kuwetach 2 mm przy użyciu regulowanego uchwytu kuwety i mieszadła magnetycznego w celu zapewnienia mieszania. Próbki mierzono w warunkach otoczenia bez dodatkowych kontroli temperatury lub atmosfery. Okno optyczne od 340 nm do 680 nm zostało wygenerowane przy użyciu kryształu fluorku wapnia. Zebrano dwieście pięćdziesiąt (250) punktów czasowych w zakresie od -5 ps do ~5500 ps, a następnie uśredniono trzy skany w celu wygenerowania końcowego zestawu danych, Rysunek 3. Dane POPOP zostały przygotowane zgodnie z opisem w protokole. Przykład nieoptymalnej korekcji ćwierkania pokazano na rysunku uzupełniającym 16. Dopasowanie kinetyczne pojedynczej długości fali przeprowadzono na POPOP, wybierając 632 nm jako długość fali będącą przedmiotem zainteresowania. Dodatkowo przeprowadzono globalną analizę POPOP zgodnie z opisem w protokole.

Kinetyczne dopasowanie POPOP o pojedynczej długości fali przy 632 nm dało dwa cykle życia. Czasy te mogły się zmieniać i nie wprowadzano żadnych dalszych zmian. Otrzymane parametry końcowe były następujące: t0 = −0,1176 ps, IRF = 0,436 ps, A1 = 0,0956, t1 = 1,614 ps, A2 = 0,0646, t2 = 522,2 ps (Rysunek 4). Wyniki te są zgodne z przeprowadzoną później analizą globalną i podanymi wartościami czasu trwania emisji dla POPOP (τ = 1,35 ns)¹⁷. Przykład dopasowania pojedynczej długości fali ze zbyt małą liczbą elementów żywotności pokazano i omówiono na rysunku uzupełniającym 16.

Analiza globalna dopasowania do POPOP została przeprowadzona po wybraniu 15 głównych komponentów (PC) podczas wykonywania SVD. Po dopasowaniu wybrano dwa okresy życia, nie ustalono żadnych parametrów. Końcowe parametry uzyskane z dopasowania były następujące: t0 = −0,1586 ps, tp (IRF) = 0,4408 ps, t1 = 1459 ps, t2 = 267,5 ps. Widma różnicowe związane z rozpadem są wyświetlane w Rysunek 5. Wyniki były zgodne z wynikami pojedynczego dopasowania kinetycznego przy długości fali 632 nm i wartościami żywotności dla POPOP¹⁷. Dwa przykłady nieoptymalnej analizy globalnej przedstawiono i omówiono na rysunku uzupełniającym 16.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie femtosekundowego instrumentu do absorpcji transjentów szerokopasmowych opisanego w tym protokole. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Symulacja danych TAS i ich wkład w sygnał TAS. (A) Krzywe Gaussa symulujące widmo absorpcji stanu podstawowego (niebieska linia przerywana) i widmo stanu wzbudzonego (czerwona przerywana linia, przesunięta ku czerwieni w stosunku do widma stanu podstawowego). Widma różnicowe tych dwóch widm (fioletowa, ciągła linia) to widmo różnicowe widziane w TA. Różnice między widmami stanu podstawowego i wzbudzonego zostały wyolbrzymione w celach ilustracyjnych. (B) Reprezentatywne widmo różnicowe TA POPOP przy 1,04 ps po wzbudzeniu przy 330 nm. Linie przerywane pokazują absorbancję w stanie przyziemnym i emisję POPOP w stanie ustalonym. Podświetlone obszary pokazują wspólne cechy TA, bielenie w stanie podstawowym (GSB), emisję wymuszoną (SE) i absorbancję w stanie wzbudzonym (ESA) obserwowane w tych danych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przygotowane dane dla POPOP, które wynikają z zastosowania kroku 1 - Przygotowanie danych. Dane są przedstawione jako skorygowana mapa cieplna i widma reprezentatywne. Wyniki te pokazują, jak powinny wyglądać dane po zastosowaniu poprawek i przygotowaniu do zastosowania dopasowania do zestawu danych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wyniki dopasowania pojedynczej długości fali POPOP przy 632 nm po zastosowaniu kroku 2.3 - Dopasowanie pojedynczej długości fali. Rysunek przedstawia (górna sekcja) okresy istnienia uzyskane w formacie tabeli, (środkowa sekcja) dane (niebieskie kropki) i dopasowanie do danych (czerwona linia dopasowania) oraz (dolna sekcja) wykres reszt. Należy zauważyć, że w sekcji "bieżące dopasowanie" amplitudy (A) są pokazane jako wartości ΔA z danych, które reprezentują udział tego konkretnego składnika żywotności przy t0. Jednak gdy bieżące dopasowanie zostanie zapisane i pojawi się w tabeli "Współczynniki dopasowania", domyślnym ustawieniem jest pokazanie znormalizowanych amplitud. To ustawienie można zmienić, odznaczając pole obok etykiety "Współczynniki dopasowania" "Znormalizowane". Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Wyniki globalnej analizy dopasowania POPOP uzyskane po dopasowaniu kroku 2.4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Przykład stymulowanego rozpraszania Ramana zaobserwowanego w eksperymentalnych danych TA. W tym zestawie danych (a nie w danych POPOP pokazanych w samouczku) próbka została wzbudzona przy długości fali 550 nm (oznaczonej linią przerywaną). Rozpraszanie Ramana jest widoczne w okolicach czasu zerowego i zazwyczaj pojawia się zarówno w kolorze niebieskim (rozpraszanie Ramana anty-Stokesa), jak i czerwonym (rozpraszanie Ramana Stokesa) długości fali wzbudzenia pompy. Wymuszone rozpraszanie Ramana jest krótkotrwałe, zwykle tylko około ~200 fs, ponieważ zachodzi w wyniku interakcji wiązki sondy z próbką w tym samym czasie, co wiązka pompy, stymulując w ten sposób proces Ramana. Jednak tej funkcji nie można uniknąć i należy ją usunąć wraz z przycinaniem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Menu główne, gdy dane są początkowo ładowane. Ogólnie rzecz biorąc, w tym oprogramowaniu do dopasowywania pojawią się pola opcji, które pojawiają się w prawym dolnym rogu okna po najechaniu na nie myszką. Te pola umożliwiają zmianę interakcji kursora z oknem, przesuwanie zaznaczeń, powiększanie lub przesuwanie wybranych okien. Dostępne są również opcje regulacji precyzji zarówno skali osi x, jak i osi y dla okna, a także przełączania wyświetlania z liniowego na logarytmiczny. Osie można również blokować lub odblokowywać. Po zablokowaniu oś pozostanie na określonym poziomie powiększenia lub zakresie wartości; Po odblokowaniu zakres przełączy się tak, aby zawierał pełny zestaw danych. Inne opcje pozwalają dostosować wyświetlanie liczb i kolorowanie siatek, jeśli są obecne. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Menu powierzchni do przeprowadzenia odejmowania rozproszonego światła. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Odejmij ekran światła rozproszonego - ustawianie widm na średnie. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4: Ustawianie zakresu przycinania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 5: Zestaw danych do przycinania. Przycięte dane zostaną trwale usunięte. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 6: Dopasuj okno reakcji rozpuszczalnika i przykład odpowiedzi rozpuszczalnika (czerwona linia) do danych (niebieskie kropki). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 7: Okno korekcji ćwierkania z "pustymi" przykładowymi danymi. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 8: Korekta ćwierkania pokazana wraz ze zbiorem danych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 9: Okno pojedynczego dopasowania kinetycznego. Dodatkowo suwak u góry pozwala użytkownikowi wybrać długość fali, przy której ma zostać wykonane dopasowanie. Wybór odpowiedniej długości fali wymaga znajomości spektroskopii systemu, aby określić, gdzie zachodzą procesy będące przedmiotem zainteresowania. Przykłady obejmują produkty przenoszenia ładunku, tworzenie trypletów lub tworzenie fotoproduktów, o których wiadomo, że cechy widmowe korelują z określonymi długościami fal. Te konkretne długości fal można dopasować w celu uzyskania czasu życia tych konkretnych zdarzeń. Ponadto można użyć wyboru długości fal w celu zapewnienia walidacji wybranego modelu dopasowania globalnego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 10: Ustawianie parametrów pojedynczego dopasowania kinetycznego. Poszczególne parametry dopasowania można w razie potrzeby ustalić lub zmienić ręcznie, aby precyzyjnie dostroić dopasowanie i zminimalizować odchylenie standardowe reszty. Uwaga: Parametry można łatwo dostosować, klikając wartość w polu, a następnie dostosowując ją za pomocą suwaka lub ręcznie wpisując wartość. Wyświetlane dopasowanie będzie dostosowywane w czasie rzeczywistym wraz ze zmianą wartości. Po osiągnięciu akceptowalnego dopasowania można je wyeksportować, klikając prawym przyciskiem myszy ekran dopasowania, co umożliwia eksport danych do schowka w celu wklejenia do żądanego programu lub jako obrazu do szybkiego przeglądania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 11: Ograniczanie i ustalanie wartości parametrów Pojedynczego Dopasowania Kinetycznego można wykonać, jeśli jeden lub więcej parametrów jest dobrze znanych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 12: Okno dekompozycji pojedynczej wartości z głównymi składnikami pokazującymi, jak będzie wyglądał ślad i składniki, gdy doda się wystarczającą liczbę głównych składników. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 13: Okno Dopasowanie globalne przed wygenerowaniem dopasowania analizy globalnej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 14: Okno Dopasowanie globalne pokazujące wyniki dopasowania analizy globalnej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 15: Menu plików do zapisywania i eksportowania plików. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 16: Przykłady nieoptymalnej korekcji i dopasowania ćwierkania. (A) wykazuje słabe pojedyncze dopasowanie kinetyczne. Typ reszt strukturalnych pokazany w panelu A zazwyczaj wskazuje, że do dopasowania danych wymagany jest dodatkowy okres istnienia. Zwróć uwagę, że reszta spada poniżej zera w krótszych czasach i jest podnoszona powyżej linii zerowej w dłuższych okresach istnienia. (B) demonstruje poprawną korekcję ćwierkania za pomocą przycisku podglądu, w którym cechy są wyprostowane, a w danych nie ma krzywizny. (C) wykazuje nieprawidłową korekcję ćwierkania, w której zauważalna jest krzywizna obecna w niebieskiej części widma, co wskazuje, że funkcja ćwierkania jest nadmiernie korygowana w tym obszarze. (D) pokazuje słabe dopasowanie globalnej analizy czasu życia, w której nadmierne dopasowanie (w tym zbyt wiele parametrów) spowodowało powstanie "symetrycznych" DADS (które wyglądają jak lustrzane odbicia siebie nawzajem na osi x) o podobnych zakresach czasu życia, które zasadniczo znoszą się nawzajem. Gdy te cechy są przestrzegane, dopasowanie nie powinno być używane. (E) wykazuje słabe dopasowanie globalne, w którym zbyt wiele parametrów spowodowało bardzo krótki czas życia przy bardzo dużej amplitudzie. Problem obecny w (E) może również pojawić się, jeśli artefakty w okolicach czasu zero nie zostaną odpowiednio skorygowane, a dopasowanie skupi się na minimalizacji pozostałości poprzez nadmierne podkreślanie bardzo krótkiego czasu życia (takiego, który nie jest fizycznie znaczący). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 17: Przykład danych TAS z rozpraszaniem Ramana. Rozpraszanie występuje około czasu zerowego i zbiega się z długością fali wzbudzenia pompy. Rozpraszanie składa się z serii ostrych pików z bardzo intensywnym dodatnim pikiem niebieskim wzbudzenia pompy i ujemnym pikiem czerwonym wzbudzenia pompy. Tej funkcji nie można w rozsądny sposób zapobiec i należy ją wyciąć z danych, aby uniknąć ingerencji w wyniki dopasowania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Plik zawierający zestaw danych dla tego samouczka (POPOP data_POPOP-inEtOH.ufs). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Plik zawierający pusty zestaw danych dla tego samouczka (POPOP data_BLANK.ufs). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Pliki z informacjami pomocniczymi zawierające dodatkowe uwagi na temat reakcji rozpuszczalnika na dopasowanie, korektę dla scattingu i odejmowanie powierzchni. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Ogólne uwagi dotyczące przygotowywania danych
Dopasowanie danych TA może wydawać się na pierwszy rzut oka stosunkowo proste i można się spodziewać, że dla danego zestawu danych powinna wyniknąć jedna jasna poprawna "odpowiedź". Jednak, jak podkreślono w protokole, istnieje wiele czynników związanych z pozyskiwaniem, przygotowywaniem i analizą danych, które należy dokładnie rozważyć, a które mogą prowadzić do niepewności co do tego, który model lub zestaw parametrów dopasowania najlepiej opisuje dane. Celem przygotowania i dopasowania danych jest ograniczenie jak największej liczby tych czynników zewnętrznych, przy jednoczesnym zachowaniu danych do analizy. Zadanie, które ma do wykonania, może wydawać się zniechęcające dla początkującego, ponieważ jest wiele do rozważenia. Aby zbudować intuicję dotyczącą procesu dopasowania, początkujący jest zachęcany do próby przygotowania tych samych danych wiele razy od podstaw na nieco inne sposoby, aby sprawdzić, jak bardzo etapy przygotowania danych wpływają na najlepsze dopasowanie. Dodatkowo dwóch różnych badaczy może przygotować i dopasować te same dane oraz porównać wyniki. Proces ten może być czasochłonny za pierwszym razem, jednak pozwoli to początkującemu rozwinąć intuicję, jak konsekwentnie przygotowywać dane dla przyszłych próbek. Jak każda umiejętność, to przygotowanie i dopasowanie danych zajmie trochę czasu, aby się rozwinąć, a początkujący jest zachęcany do cierpliwości i dyscypliny podczas eksperymentowania i uczenia się procesu. Zestaw danych wykorzystany w tym badaniu został dostarczony, aby dać początkującym szansę na dopasowanie się bezpośrednio do samouczka i bezpośrednie porównanie wyników z wynikami uzyskanymi w samouczku.

Dane mogą zawierać cechy tła , które występują we wszystkich opóźnieniach czasowych (rysunek uzupełniający 2 i rysunek uzupełniający 3), takie jak rozproszenie wiązki pompy i spontaniczna emisja próbki. Te niepożądane cechy muszą zostać usunięte w celu wyizolowania przejściowego sygnału absorpcji od gatunków będących przedmiotem zainteresowania¹¹. Usuwanie takich cech odbywa się poprzez wybór, uśrednienie i usunięcie udziału pewnej liczby widm o ujemnej różnicy czasu. Wybierając widma tła, ważne jest, aby upewnić się, że żadne cechy, które mogą być częścią procesu zainteresowania, nie są uwzględniane do usunięcia. W danych dotyczących TA można również zaobserwować cechy tła wynikające z rozpuszczalnika, takie jak absorpcja przez zanieczyszczenia lub sam rozpuszczalnik. Gdy rozpuszczalnik wytwarza sygnał, "pusty" zestaw danych zawierający tylko rozpuszczalnik przebiega w dokładnie tych samych warunkach doświadczalnych, co próbka, będzie musiał zostać odjęty od zestawu danych próbki. Szczegółowe informacje na temat tej procedury znajdują się w pliku uzupełniającym 3.

Korekcja ćwierkania to kolejny czynnik, który należy dokładnie rozważyć. Ćwierkanie występuje, gdy impuls sondy przemieszcza się do próbki i rozszerza się z powodu niedoskonałości lusterek sterujących lub przechodząc przez dyspersyjną optykę, taką jak soczewki lub filtry. Końcowy rezultat jest taki, że fotony o niższej energii w impulsie sondy (tj. czerwona strona widma sondy) docierają do próbki przed fotonami o wyższej energii (tj. niebieską stroną widma sondy). Powoduje to, że "czas zerowy" widm TA jest rozmazywany przez kilka femtosekund lub pikosekund¹⁸, co objawia się jako wyraźna krzywa w surowym zestawie danych, zaczynająca się od niebieskich długości fal, a następnie spłaszczająca się w miarę zbliżania się do czerwonej (rysunek uzupełniający 7). Ćwierkanie jest najbardziej zauważalne w krótszych skalach czasowych, takich jak te, do których uzyskuje się dostęp za pomocą ultraszybkiej TA. Ten zależny od długości fali czas zerowy można skorygować zgodnie z opisem w protokole, ale zastosowanie tego procesu może być trudne i subiektywne. Posiadanie "ślepej" próbki lub pomiaru odpowiedzi Kerra rozpuszczalnika może zminimalizować subiektywny charakter ręcznego wybierania punktów do korekcji ćwierkania potrzebnej do wygenerowania dopasowania wielomianowego używanego do regulacji i korygowania ćwierkania. Celem korekcji ćwierkania jest usunięcie wyraźnej "krzywej" czasu zerowego. Może to wymagać wielu prób dopasowania ćwierkania, aby uzyskać najlepsze dane skorygowane o ćwierkanie. Dane mogą być kilkakrotnie dopasowywane z różnymi zastosowanymi poprawkami ćwierkania w celu zrozumienia wpływu korekcji ćwierkania na wartości krótkich okresów życia TA.

Artefakty, które pojawiają się w "czasie zero"
W danych TA można zaobserwować kilka artefaktów bliskich "czasowi zero", w tym rozpraszanie Rayleigha, wymuszone rozpraszanie Ramana i modulację międzyfazową. Rozpraszanie Rayleigha belki pompy to rozpraszanie sprężyste, które następuje bez zmiany energii. Ta funkcja pojawi się na tej samej długości fali, co impuls pompy. Wymuszone rozpraszanie Ramana może towarzyszyć sygnałowi rozpraszania pompy¹⁹. Rozpraszanie Ramana, które wynika z nieelastycznego rozpraszania fotonu pompy, wytwarza piki zarówno przy wyższej (anty-Stokes), jak i niższej (Stokes) energii niż energia padającej pompy. W danych TA obserwuje się wymuszone rozpraszanie Ramana spowodowane jednoczesnym napromieniowaniem próbki za pomocą wiązki pompy i sondy. Gdy wiązka sondy oddziałuje z próbką w tym samym czasie co wiązka pompy, stymuluje proces Ramana. W związku z tym wymuszone rozpraszanie Ramana zachodzi około czasu zerowego i powoduje dodatkowe piki widm w ciągu pierwszych kilkuset femtosekund (Rysunek 6, obserwowany w ciemniejszym niebieskim widmie w podświetlonym obszarze i Rysunek Uzupełniający 17). Modulacja międzyfazowa wywodzi się z modulacji współczynnika załamania rozpuszczalnika w wyniku interakcji z intensywnym polem elektrycznym impulsu.

Wymuszone rozpraszanie Ramana można odróżnić od modulacji międzyfazowej, ponieważ piki Ramana pojawiają się przy określonych częstotliwościach, które odpowiadają modom wibracyjnym rozpuszczalnika. Ponieważ jest to proces Ramana, można zaobserwować zarówno linie Stokesa, jak i anty-Stokesa po obu stronach wzbudzenia. Chlorowane rozpuszczalniki, takie jak chlorek metylenu, wykazują bardzo wyraźne pasma Ramana ze względu na dużą polaryzację chloru. Sygnatury spektralne modulacji międzyfazowej są unikalne dla rozpuszczalnika, ale nie są tak łatwe do przewidzenia, jak cechy rozpraszania Ramana.

W zależności od kinetyki mierzonej próbki, rozpraszanie Rayleigha, rozpraszanie Ramana i modulacja międzyfazowa mogą pokrywać się z wczesnymi cechami danych TA i mogą być trudne do usunięcia z danych. Zasadniczo cechy te można dostrzec w starannym pomiarze rozpuszczalnika i odjąć od danych, programy do analizy danych mogą mieć odpowiednie funkcje, aby uwzględnić te cechy, ale w praktyce może to być trudne. Gdy odjęcie tych artefaktów bez naruszania danych próbki jest zbyt trudne, lepszym rozwiązaniem może być wycięcie zagrożonych widm w okolicach czasu zerowego, aby wyeliminować artefakty. Spowoduje to niefortunny efekt uboczny w postaci usunięcia pierwszych około 300 fs danych, ale sprawi, że dopasowanie będzie bardziej niezawodne później. W trakcie analizowania wielu zestawów danych z tych samych i różnych próbek, początkujący zdobędzie intuicję w osiąganiu tej równowagi między odejmowaniem powierzchni tła a wycinaniem początkowych danych 100-200 fs.

Ogólne przycinanie może być konieczne w przypadku części widm, które zawierają niski stosunek sygnału do szumu. Niestabilność wiązki sondy w niektórych obszarach, niska intensywność światła sondy, zbyt wysokie stężenia próbki (blokujące w ten sposób dużą część padającej sondy), niska intensywność pompy i przekrój absorpcyjny próbki są typowymi winowajcami niskiego stosunku sygnału do szumu, co może utrudniać dopasowanie danych. W takich przypadkach przycięcie zestawu danych po obu stronach okna optycznego w celu osiągnięcia pożądanego poziomu stosunku sygnału do szumu może pomóc w procesie dopasowania.

Zestaw danych jest gotowy do analizy, gdy zostanie wystarczająco przycięty, aby usunąć słabe sekcje zestawu danych, poprawi ćwierkanie oraz uśredni i odjął widma tła. Wynikiem tej procedury powinny być dane zawierające tylko te fragmenty, które są najbardziej istotne dla interesującej nas fotofizyki i fotochemii. Rzeczywiście, oczywiste jest, że proces ten ma pewien stopień subiektywizmu. Celem przygotowania danych jest osiągnięcie równowagi między usuwaniem artefaktów, aby nie zakłócały dopasowania, ale nie usuwaniem tak bardzo, aby naruszało to integralność zbioru danych, utrudniając w ten sposób jego interpretację. Znalezienie tej równowagi wymaga czasu i doświadczenia, aby zbudować intuicję dotyczącą tego, co jest artefaktem, a co są danymi. Dopasowywanie (i ponowne dopasowywanie) tego samego zestawu danych w wielu różnych dniach lub dopasowanie tych samych danych przez dwóch badaczy może być sposobem na zminimalizowanie błędu ludzkiego oraz subiektywności przygotowania i analizy danych.

Ogólne uwagi dotyczące dopasowania i interpretacji
Po przetworzeniu surowych widm TA należy je zinterpretować i zamodelować w celu wydobycia informacji o gatunkach i dynamice występującej w systemie będącym przedmiotem zainteresowania. Proces ten można opisać jako trzyetapową procedurę, która obejmuje wstępną interpretację spektralną, modelowanie/dopasowanie ilościowe oraz przypisanie interpretacji spektralnej do modelu/dopasowania.

Wstępna interpretacja spektralna: Na etapie interpretacji spektralnej celem jest przypisanie cech obecnych w widmach TA stanom elektronowym dostępnym w fotofizycznej lub fotochemicznej ewolucji układu. Na początek należy zidentyfikować różne stany. W tej pracy stany odnoszą się do unikalnych stanów elektronowych, które są częścią fotofizycznej lub fotochemicznej ewolucji układu. Stan, reprezentowany na przykład przez jedną specyficzną krzywą energii potencjalnej (PEC), posiada zestaw charakterystycznych pików reprezentujących jego widmo absorpcyjne. Zmiana, która zachodzi w obrębie jednego stanu, nazywana jest procesem. Proces fotofizyczny może pojawić się w widmach TA jako przesunięcie piku lub zmiana szerokości widma. Kluczowym aspektem procesu jest to, że populacja państwa pozostaje taka sama (tj. proces zachodzi w obrębie danego PEC); Zmienia się rozkład energii w obrębie stanu. Zmiana w populacji państwa będzie określana jako przejście. Podczas przejścia system ewoluuje do innego PEC (tj. stanu elektronicznego). Przejścia mogą obejmować konwersję wewnętrzną (IC), skrzyżowanie międzysystemowe (ISC), transfer ładunku, transfer energii, tworzenie nowych produktów lub powrót do stanu podstawowego. Wskazówki dotyczące przypisywania stanów, procesów i przejść zostały omówione w poniższych akapitach.

Przypisywanie stanów
Pierwszym krokiem w tym procesie jest przypisanie cech widmowych do określonych gatunków lub stanów chemicznych. Stan S₁ w TA powinien wykazywać czas życia, który odpowiada czasowi życia fluorescencji pobranemu za pomocą czasowo-rozdzielczej spektroskopii emisyjnej. Stan trypletowy można zweryfikować, jeśli jego żywotność jest wygaszana przez tlen. Jeśli podejrzewa się, że w ewolucji fotofizycznej występuje anion lub kation rodnikowy, można przeprowadzić spektroelektrochemię lub chemiczne utlenianie/redukcję w celu wytworzenia rodników, a widmo absorpcyjne tego rodzaju można uzyskać i porównać z kształtem pasma TA. Spektroskopia elektronowego rezonansu spinowego (ESR) może być wykonana w celu sprawdzenia obecności wolnych rodników. Doskonały wykład instruktażowy prowadzony przez Wydział Chemii Nieorganicznej ACS zawiera przegląd TA i takich rozważań przy przypisywaniu cech²⁰. Po przypisaniu pasm gatunkom, kolejnym krokiem w interpretacji widm TA jest jakościowe opisanie procesów dynamicznych zachodzących w układzie. Ten krok jest niezbędny, ponieważ daje badaczowi wyobrażenie o tym, jakie modele będą odpowiednie do opisania jego systemu i da mu punkt odniesienia do porównania parametrów dopasowania.

Zmiany w obrębie stanu
Chłodzenie wibracyjne, przegrupowanie geometryczne lub solwatacja to niezwykle szybkie procesy (od sub-ps do 10 s ps), które można zaobserwować za pomocą TA. Ochłodzenie wibracyjne obserwuje się jako gwałtowne przesunięcie widma TA do niebieskiego koloru w kilkupikosekundowej skali czasowej 21,22,23. Przegrupowanie geometryczne może nastąpić w skali czasowej 10 ps. Dynamika solwatacji jest obserwowana jako przesunięcie ku czerwieni i zawężenie widma w ciągu kilku pikosekund w konwencjonalnych cieczach dipolarnych, ale rozpuszczalniki o wysokiej lepkości, takie jak glicerol, glikol polietylenowy (PEG), ciecze jonowe i rozpuszczalniki głęboko eutektyczne, mogą wykazywać dynamikę solwatacji zachodzącą w ciągu wielu nanosekund 24,25,26.

Zmiany w populacji stanu
Reakcje charakteryzują się zmianą intensywności pasma, przy czym spadek intensywności wiąże się ze spadkiem stężenia jego związków chemicznych i odwrotnie ze wzrostem. W niektórych przypadkach zarówno reagenty, jak i gatunki produktu są widoczne w widmach, podczas gdy w innych stany produktu są zbyt krótkotrwałe lub zbyt daleko przesunięte ku czerwieni, aby można je było zaobserwować. Często przejścia między stanami można zaobserwować poprzez obecność punktu izobestowego w widmach.

Modelowanie ilościowe/dopasowanie: Model musi być następnie dopasowany do danych, aby wydobyć informacje ilościowe o dynamice systemu. Jak opisano wcześniej we wprowadzeniu, istnieje szeroki wachlarz modeli, z których można korzystać. Protokół ten koncentruje się na dwóch najpopularniejszych metodach: dopasowaniu pojedynczej długości fali i analizie globalnej. Metoda pojedynczej długości fali polega na dopasowaniu pojedynczych śladów długości fali z widm do pewnej formy funkcjonalnej, zwykle sumy wykładników:

(2)

gdzie ΔA(t) jest sygnałem TA o wybranej długości fali, n jest liczbą składowych wykładniczych, a _{a i} jest amplitudą składowej wykładniczej, i, ze stałą czasową τ_i. Można dodać kilka komponentów, aż pasowanie odtworzy dane eksperymentalne. Celem każdego procesu dopasowania jest modelowanie danych przy użyciu wystarczającej liczby okresów istnienia, aby dobrze odtworzyć dane, ale nie nadmierne dopasowanie danych przez uwzględnienie zbyt wielu składników. W związku z tym ważone parametry dobroci dopasowania, takie jak , są używane do określenia, kiedy dane są dopasowane do niepewności eksperymentalnej⁵.

Po zadowalającym dopasowaniu zaniku, parametry modelu mogą być wykorzystane do scharakteryzowania dynamiki systemu. Uzyskane stałe czasowe można następnie wyodrębnić i zinterpretować. Niestety, duża liczba nakładających się na siebie cech w widmach TA oznacza, że pojedyncza długość fali w widmie może zawierać dynamikę odpowiadającą różnym gatunkom, których sygnatury widmowe nakładają się na siebie, co oznacza, że stałe czasowe wyodrębnione z pojedynczego dopasowania długości fali mogą reprezentować złożenie wielu zbiegających się procesów. Ponadto wszelkie zmiany w kształcie pasma i położeniu będą również miały wpływ na amplitudy i stałe czasowe uzyskane z dopasowania pojedynczej długości fali. Problemy te można w niektórych przypadkach obejść za pomocą metody dopasowania zwanej "analizą kształtu pasma", w której określa się lub przyjmuje formę funkcjonalną dla pasm TA każdego gatunku absorbującego w systemie. Kształty te są następnie ważone przez zależne od czasu amplitudy i sumowane razem w celu odtworzenia obserwowanego widma. Procedura ta jest powszechnie stosowana w analizie czasowo-rozdzielczych widm fluorescencji, ale bardziej skomplikowane kształty i nakładające się na siebie składowe pasm TA sprawiają, że metoda ta jest możliwa do utrzymania tylko w kilku prostych przypadkach, jak opisano w innym miejscu¹⁰.

Inną wadą dopasowania pojedynczej długości fali jest to, że nie wykorzystuje ono z natury szerokiego zakresu spektralnego, jaki zapewniają nowoczesne eksperymenty TA. W zasadzie można by metodycznie dopasować każdą pojedynczą długość fali widma, ale taka analiza jest kłopotliwa, czasochłonna i kosztowna obliczeniowo. Aby sprostać temu wyzwaniu, można zastosować metodę zwaną "analizą globalną" w celu jednoczesnego dopasowania całego zestawu widm TA do zestawu wspólnych parametrów dynamicznych⁴. Analiza globalna i ściśle z nią związana metoda zwana analizą docelową są skutecznymi i szeroko stosowanymi metodami, ale mają również swój własny, unikalny zestaw wad i ograniczeń. Podobnie jak w przypadku każdego modelu, konieczne jest zrozumienie założeń, które są używane do jego tworzenia, a także ograniczeń, które prezentują.

W analizie globalnej widma TA są reprezentowane przez macierz m na n, gdzie m oznacza liczbę długości fal mierzonych w każdym widmie, a n oznacza liczbę zebranych punktów czasowych. Zakłada się następnie, że macierz ta ulega rozkładowi na iloczyn dwóch innych macierzy:

(3)

gdzie C(t) jest macierzą n przez k, a S(λ) jest macierzą m przez k. Wartość k reprezentuje liczbę odrębnych składowych widmowych używanych do odtworzenia widm. Każdy z tych składników reprezentuje gatunek absorpcyjny o unikalnej sygnaturze spektralnej i dynamice. Macierz S(λ) reprezentuje widma TA składników k i C(t) ich stężenia zależne od czasu. W najprostszej i najpowszechniejszej implementacji analizy globalnej zakłada się, że każdy składnik ma kinetykę jednowykładniczą (i = 1 w równaniu 2, przy czym każdy składnik ma przypisaną własną stałą czasową). Podsumowując, pełne widmo TA może być reprezentowane przez sumę k składowych widm, z których każdy ma swoje własne charakterystyczne widmo absorpcyjne i pojedynczy rozpad wykładniczy.

Gdy widma TA są dopasowane, użytkownik zgaduje, ile składników (tj. wartość k) jest potrzebnych i zgaduje stałą czasową związaną z pojedynczym rozkładem wykładniczym tych gatunków. Następnie monter generuje C_guess(t) i rozwiązuje równanie 3 dla S_fit(t). Następnie S_fit(λ) i C_guess(t) mnoży się jak w równaniu 3, aby utworzyć dopasowane widma, _ΔA(λ,t)fit. Na koniec resztki, ΔA(λ,t)_exp − A(λ,t)_fit, są minimalizowane i zwracane są optymalne_dopasowania S(λ) i stałe czasowe. Względna prostota analizy globalnej, reprezentującej cały zestaw widm przy użyciu kilku stałych czasowych i stałych składowych spektralnych, sprawia, że jest to atrakcyjna (i skuteczna) metoda rozplątywania skomplikowanych kształtów pasm i dynamiki spotykanych w spektroskopii TA. Należy jednak zadbać o to, aby analiza globalna była odpowiednim modelem dla danego systemu.

Kluczowym założeniem w analizie globalnej, zilustrowanym w równaniu 3, jest całkowita rozdzielność części dynamiki długości fali i czasu, właściwość zwana "dwuliniowością". Założenie to wymaga, aby kształty pasm składowych były niezależne od czasu (tj. miały stały kształt widmowy, który nie zmienia się ani nie przesuwa w czasie). Jedyną rzeczą, która zmienia się podczas eksperymentu, są względne populacje każdego składnika, reprezentowane przez C(t). W długich skalach czasowych, ~1 ns lub więcej, to założenie zazwyczaj się sprawdza i analiza globalna może być stosowana bez większych obaw. Z drugiej strony, procesy w stanie wzbudzonym, takie jak chłodzenie wibracyjne i dynamika solwatacji, widoczne w ultraszybkich skalach czasowych dostępnych za pomocą femtosekundowego TA, skutkują zależnymi od czasu zmianami w sygnaturze widmowej gatunku i załamaniem dwuliniowości. Nie oznacza to, że analiza globalna nie może odtworzyć zbioru danych, w rzeczywistości zawsze może zapewnić zadowalające dopasowanie, pod warunkiem, że użyta zostanie wystarczająca liczba komponentów. Problem polega więc na interpretacji widm składowych i przypisaniu stałych czasowych do poszczególnych procesów w stanie wzbudzonym, ponieważ składniki mogą już nie odpowiadać odrębnym gatunkom absorbującym. Dlatego zawsze należy zachować ostrożność przy stosowaniu analizy globalnej w sytuacjach, w których nie można założyć dwuliniowości.

Przypisywanie interpretacji spektralnej do modelu/dopasowania: Po uzyskaniu dopasowania interpretacja spektralna musi zostać odwzorowana na okresy życia uzyskane w dopasowaniu. Czasy życia od dopasowania są przypisane zarówno procesom, jak i reakcjom, które zostały zidentyfikowane we wstępnej interpretacji widm. Jednak wstępna ocena na podstawie widm i liczba dopasowanych okresów życia uzyskanych przez model mogą nie być od razu odwzorowane na siebie. W tej (częstej!) sytuacji monter musi cofnąć się i ocenić wstępną interpretację. Być może doszło do chłodzenia wibracyjnego lub innego procesu, który został pominięty we wstępnej ocenie, ale został zidentyfikowany w procesie modelowania i dopasowania. Być może dwa różne zestawy parametrów dopasowania mogą dobrze odtworzyć dane, a wstępna interpretacja może wskazać, który zestaw parametrów dopasowania zostanie wybrany. Na tym ostatnim etapie instalator musi przechodzić tam i z powrotem między interpretacją a dopasowaniem, aby znaleźć opis, który prowadzi do wiarygodnego fotofizycznego przypisania gatunku i dynamiki systemu. Inne programy dopasowania, które zawierają sekwencyjne modele dopasowania, takie jak analiza docelowa, mogą być również badane w celu uzupełnienia pasowań uzyskanych przez analizę globalną i oprogramowanie do dopasowania przedstawione w tym artykule⁴.

Podsumowując, w niniejszym protokole omówiono przygotowanie i dopasowanie danych dotyczących absorpcji stanów nieustalonych. Jego celem jest zwrócenie uwagi na wyzwania związane z tym procesem oraz przedstawienie uwag na temat sposobów uniknięcia lub złagodzenia tych wyzwań w praktyczny sposób. Dopasowanie danych TA, podobnie jak dopasowanie większości danych spotykanych w dziedzinach technicznych, może być trudne, a czasami subiektywne. Dlatego świadomość procesu i ograniczeń danych, przygotowania danych oraz narzędzi matematycznych używanych do modelowania i przypisywania znaczenia danym ma kluczowe znaczenie. Naukowcy muszą podchodzić do danych i modelowania krytycznym okiem.

Można próbować łagodzić subiektywizm ich napadów. Na przykład dane mogą być przygotowywane i pasowane z różnych punktów początkowych i w różnych dniach, aby zapewnić takie samo dopasowanie. Można porównywać dane zebrane w różnych dniach przy różnym przygotowaniu próbki. Wielu badaczy może dopasować te same dane i porównać swoje wyniki. Z biegiem czasu badacze mogą zbudować intuicję dotyczącą uzyskanych danych (w oparciu o specyfikę ich konfiguracji eksperymentalnej i parametrów eksperymentalnych), która pozwoli im być bardziej pewnymi swojego dopasowania.

Jest wiele do nauczenia się o dopasowaniu danych TA i szczegółach modeli omówionych w tym artykule. Entuzjastycznie polecamy kilka doskonałych artykułów przeglądowych, które zagłębiają się w ten temat ^4,10,27. Protokół ten ma być dla początkujących wejściem w proces analizy i dopasowania, który wzbudzi zainteresowanie głębszym zrozumieniem tego procesu.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
EtOH 200% Proof	Decon Laboratories Inc	CAS 64-17-5	Rozpuszczalnik używany do przygotowania
próbki Spektrometr absorpcji przejściowej Helios	Ultraszybkie systemy	https://ultrafast.systems/products/spectrometers-accessories/helios/	Spektrometr absorpcji przejściowej
POPOP  1,4-bis[2-(5-fenyloksazolyl)]benzen	Tokio Przemysł chemiczny	CAS 1806-34-4 Próbka	używana do przykładów
Ultraszybkie systemy	Surface Xplorer	https://ultrafast.systems/products/spectrometers-accessories/surface-xplorer/	Program dopasowania