Identyfikacja peptydów małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Summary

Ten protokół opisuje procedurę izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od makrofagów za pomocą różnicowego ultrawirowania i ekstrakcji peptydomu do identyfikacji za pomocą spektrometrii mas.

Abstract

Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEV) są zazwyczaj wydzielane przez egzocytozę ciał wielopęcherzykowych (MVB). Te nanopęcherzyki o średnicy <200 nm są obecne w różnych płynach ustrojowych. Te sEV regulują różne procesy biologiczne, takie jak transkrypcja i translacja genów, proliferacja i przeżycie komórek, odporność i stan zapalny poprzez ich ładunki, takie jak białka, DNA, RNA i metabolity. Obecnie opracowano różne techniki izolacji sEV. Wśród nich metoda oparta na ultrawirowaniu jest uważana za złoty standard i jest szeroko stosowana do izolacji sEVs. Peptydy są naturalnie biomakrocząsteczkami o długości mniejszej niż 50 aminokwasów. Peptydy te uczestniczą w różnych procesach biologicznych o aktywności biologicznej, takich jak hormony, neuroprzekaźniki i czynniki wzrostu komórek. Peptydome jest przeznaczone do systematycznej analizy endogennych peptydów w określonych próbkach biologicznych za pomocą chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS). W tym przypadku wprowadziliśmy protokół izolacji sEV za pomocą ultrawirowania różnicowego i ekstrakcji peptydomu do identyfikacji za pomocą LC-MS/MS. Metoda ta zidentyfikowała setki peptydów pochodzących z sEV z makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego.

Introduction

Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEVs) o średnicy mniejszej niż 200 nm są obecne w prawie wszystkich rodzajach płynów ustrojowych i wydzielane przez wszystkie rodzaje komórek, w tym mocz, pot, łzy, płyn mózgowo-rdzeniowy i płyn owodniowy¹. Początkowo sEV były uważane za pojemniki do usuwania odpadów komórkowych, co doprowadziło do minimalnych badań w następnej dekadzie². Ostatnio pojawia się coraz więcej dowodów wskazujących, że sEV zawierają określone białka, lipidy, kwasy nukleinowe i inne metabolity. Cząsteczki te są transportowane do komórek docelowych³, przyczyniając się do komunikacji międ....

Protocol

1. Izolacja małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

UWAGA: Wykonaj wszystkie wirowania w krokach 1.1-1.11 w temperaturze 4 °C.

1. Przygotowanie płodowej surowicy bydlęcej wolnej od sEVs (FBS): Odwirować FBS przez noc w temperaturze 110 000 × g w temperaturze 4 °C przez ultrawirówkę (patrz tabela materiałów) w celu usunięcia endogennych sEVs. Zebrać supernatant, przefiltrować, wysterylizować go membraną ultrafiltracyjną 0,2 μm i przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Umieść około 3 x 10⁷ unieśmiertelnionych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (iBMDM) na naczyniu hodo....

Results

Dla sEVs wyizolowanych przez różnicowe ultrawirowanie (Rysunek 1), oceniliśmy ich morfologię, rozkład wielkości cząstek i markery białkowe zgodnie z Międzynarodowym Towarzystwem Pęcherzyków Zewnątrzkomórkowych (ISEV)¹⁷.

Po pierwsze, morfologia sEVs została zaobserwowana przez TEM, wykazując typową strukturę przypominającą miseczkę (Rysunek 2A). NTA wykazała, że izolowane sEV były w większości skoncentrowane na 136 nm (

Discussion

Podczas badania funkcji sEV konieczne jest uzyskanie sEV o wysokiej czystości ze złożonych próbek biologicznych, aby uniknąć potencjalnych zanieczyszczeń. Opracowano różne metody izolacji sEV¹³ , a wśród tych metod zróżnicowane metody oparte na ultrawirowaniu wykazały stosunkowo wysoką czystość sEV. W tym badaniu pobrano 200 ml supernatantu komórkowego przez 6 godzin, a przez ultrawirowanie różnicowe uzyskano około 200-300 μg sEV. Należy jednak zauważyć, że osad sEVs może nie być widoczny podczas .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zestaw do oznaczania białek BCA	Beyotime Technology	P0012
CD9	Beyotime Technology	AF1192
Odśrodkowa rurka filtracyjna	Millipore	UFC5010BK
Butelki wirówkowe polipropylen	Beckman Coulter	357003	Wirówka szybkoobrotowa
Podłoże chemiluminescencyjne	Thermo Fisher Scientific	34580
Dithiothreitol	Solarbio	D8220	100 g
Pożywka hodowlana DMEM	Cell World	N? A
GRP94	Cell Signaling Technology	20292
Wirówka szybkoobrotowa	Beckman Coulter	Avanti JXN-26	Wirnik wirówki (JA-25.50)
Unieśmiertelnione makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (iBMDM)	Narodowy Instytut Nauk Biologicznych, Chiny		Dostarczone przez dr Feng Shao (Narodowy Instytut Nauk Biologicznych, Chiny)
Jodoacetamid	Sigma	l1149	5 g
Probówka do mikrofuge polipropylen	Beckman Coulter	357448	1,5 mL, Ultrawirówka stołowa
nano-wysokowydajny system LC	Thermo Fisher Scientific	EASY-nLC 1000
Analiza śledzenia nanocząstek	Malvern Panalytical	NanoSight LM10	NanoSight NTA3.4
Orbitrap Q Exactive HF-X Spektrometr	Thermo Fisher Scientific	N/A
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Solarbio	P1020
Probówki wirówkowe poliallomerowe	Beckman Coulter	326823	Ultrawirówka
Inhibitor proteazy	Bimake	B14002
Koncentrator próżniowy	SpeedVac Eppendorf	Concentrator plus
Ultrawirówka stołowa	Beckman Coulter	Optima MAX-XP	Wirnik ultrawirówki (TLA 55)
Transmisyjny mikroskop elektronowy	HITACHI	H-7650B
TSG101	Sigma	AF8258
Ultrawirówka	Beckman Coulter	Optima XPN-100	Wirnik ultrawirówki (SW32 Ti)
Ultradźwiękowy rozbijacz komórek	Scientz	SCIENTZ-IID
Western Blot imager	Bio-Rad	ChemiDocXRs	Image lab 4.0 (beta 7)
β-aktyna	Sigma	A3853