Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Identyfikacja peptydów małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65521

⸱

30 czerwca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Medical Sciences, Anhui Medical University, 2State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center, National Center for Protein Sciences (Beijing), Beijing Institute of Lifeomics, 3School of Life Sciences, Hebei University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje procedurę izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od makrofagów za pomocą różnicowego ultrawirowania i ekstrakcji peptydomu do identyfikacji za pomocą spektrometrii mas.

Streszczenie

Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEV) są zazwyczaj wydzielane przez egzocytozę ciał wielopęcherzykowych (MVB). Te nanopęcherzyki o średnicy <200 nm są obecne w różnych płynach ustrojowych. Te sEV regulują różne procesy biologiczne, takie jak transkrypcja i translacja genów, proliferacja i przeżycie komórek, odporność i stan zapalny poprzez ich ładunki, takie jak białka, DNA, RNA i metabolity. Obecnie opracowano różne techniki izolacji sEV. Wśród nich metoda oparta na ultrawirowaniu jest uważana za złoty standard i jest szeroko stosowana do izolacji sEVs. Peptydy są naturalnie biomakrocząsteczkami o długości mniejszej niż 50 aminokwasów. Peptydy te uczestniczą w różnych procesach biologicznych o aktywności biologicznej, takich jak hormony, neuroprzekaźniki i czynniki wzrostu komórek. Peptydome jest przeznaczone do systematycznej analizy endogennych peptydów w określonych próbkach biologicznych za pomocą chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS). W tym przypadku wprowadziliśmy protokół izolacji sEV za pomocą ultrawirowania różnicowego i ekstrakcji peptydomu do identyfikacji za pomocą LC-MS/MS. Metoda ta zidentyfikowała setki peptydów pochodzących z sEV z makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego.

Wprowadzenie

Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEVs) o średnicy mniejszej niż 200 nm są obecne w prawie wszystkich rodzajach płynów ustrojowych i wydzielane przez wszystkie rodzaje komórek, w tym mocz, pot, łzy, płyn mózgowo-rdzeniowy i płyn owodniowy1. Początkowo sEV były uważane za pojemniki do usuwania odpadów komórkowych, co doprowadziło do minimalnych badań w następnej dekadzie2. Ostatnio pojawia się coraz więcej dowodów wskazujących, że sEV zawierają określone białka, lipidy, kwasy nukleinowe i inne metabolity. Cząsteczki te są transportowane do komórek docelowych3, przyczyniając się do komunikacji międzykomórkowej, dzięki której uczestniczą w różnych procesach biologicznych, takich jak naprawa tkanek, angiogeneza, odporność4 i zapalenie5,6, rozwój nowotworu i przerzuty7,8,9, itd.

Aby ułatwić badanie sEV, konieczne jest wyizolowanie sEV ze złożonych próbek. Opracowano różne metody izolacji sEV w oparciu o właściwości fizyczne i chemiczne sEV, takie jak ich gęstość, wielkość cząstek i białka markerowe powierzchniowe. Techniki te obejmują metody oparte na ultrawirowaniu, metody oparte na wielkości cząstek, metody oparte na wychwytywaniu immunopowinowactwa, metody oparte na wytrącaniu sEVs oraz metody oparte na mikrofluidyce10,11,12. Wśród tych technik, metoda oparta na ultrawirowaniu jest powszechnie uznawana za złoty standard izolacji sEVs i jest najczęściej stosowaną techniką13.

Coraz więcej dowodów sugeruje obecność wielu nieodkrytych biologicznie aktywnych peptydów w peptydomach różnych organizmów. Peptydy te znacząco przyczyniają się do wielu procesów fizjologicznych poprzez regulację wzrostu, rozwoju, reakcji na stres14,15 i transdukcji sygnału16. Celem projektu peptidome sEVs jest odkrycie peptydów przenoszonych przez te sEV i dostarczenie wskazówek na temat ich funkcji biologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji sEV poprzez ultrawirowanie różnicowe, a następnie ekstrakcję peptydów z tych sEV w celu dalszej analizy ich peptydome.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Izolacja małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

UWAGA: Wykonaj wszystkie wirowania w krokach 1.1-1.11 w temperaturze 4 °C.

  1. Przygotowanie płodowej surowicy bydlęcej wolnej od sEVs (FBS): Odwirować FBS przez noc w temperaturze 110 000 × g w temperaturze 4 °C przez ultrawirówkę (patrz tabela materiałów) w celu usunięcia endogennych sEVs. Zebrać supernatant, przefiltrować, wysterylizować go membraną ultrafiltracyjną 0,2 μm i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Umieść około 3 x 107 unieśmiertelnionych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (iBMDM) na naczyniu hodowlanym o średnicy 150 mm i dodaj 20 ml pożywki hodowlanej DMEM (patrz tabela materiałów).
  3. Przed zebraniem sEV wyrzuć podłoże. Umyj komórki raz PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami; Tabela materiałów) i zastąp go medium zawierającym FBS wolne od 10% sEVs.
  4. Zgodnie z potrzebami eksperymentu zebrać supernatant komórek i przenieść go do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
  5. Odwirować supernatant komórek o masie 300 × g przez 10 minut w celu usunięcia komórek, wyrzucić osad i przenieść supernatant do nowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
  6. Odwirować sklarowany sklarat o stężeniu 2000 × g przez 10 minut w celu usunięcia martwych komórek, wyrzucić osad i przenieść supernatant do nowych wysokoobrotowych probówek wirówkowych (patrz tabela materiałów).
  7. Odwirować supernatant o sile 10 000 × g przez 30 minut przez wirówkę wysokoobrotową w celu usunięcia resztek komórek i mikropęcherzyków, wyrzucić osad i przenieść supernatant do nowych probówek do ultrawirówek (patrz tabela materiałów). Objętość otwartych probówek ultrawirówek wynosi 38,6 ml; Umieścić 35 ml supernatantu komórkowego w każdej probówce.
  8. Odwirować supernatant o stężeniu 110 000 × g przez 70 minut w wirówce z wirnikiem z wirnikiem wahadłowym (patrz tabela materiałów) w celu uzyskania surowych granulek sEV.
  9. Odrzucić supernatant i przemyć osad wzbogacony w sEVs 1 ml PBS. Wirować przy 110 000 × g przez 70 minut na ultrawirówce stołowej (patrz tabela materiałów). Odrzucić supernatant i dodać 1 ml PBS do probówki ultrawirówkowej.
  10. Następnie pipetować osad w sposób ciągły, przenieść 1 ml PBS do innej probówki do ultrawirówki i tak dalej, aż wszystkie probówki do ultrawirówek zostaną wymieszane przez pipetowanie.
  11. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl PBS, który jest sEVs.
  12. Zmierz całkowite białko sEV za pomocą metody kwasu bicynchoninowego (BCA), postępując zgodnie z poniższymi krokami (patrz tabela materiałów).
    1. Przygotowanie wzorca białkowego: Dodać 1,2 ml roztworu do przygotowania białka do standardowej probówki białkowej (30 mg BSA), aby całkowicie go rozpuścić i przygotować wzorcowy roztwór białka (25 mg/ml). Następnie rozcieńczyć go PBS do końcowego stężenia 0,5 mg/ml.
    2. Dodać 0 μl, 1 μl, 2 μl, 4 μl, 8 μl, 12 μl, 16 μl i 20 μl wzorca białkowego do płytki 96-dołkowej i dodać PBS do uzupełnienia 20 μl. W tym samym czasie dodaj 18 μl buforu do lizy HEPES (20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM NaF, 0,5% Triton X-100) i 2 μl próbek sEVs do dołków na próbki, które mają być badane.
    3. Przygotuj wymagany roztwór roboczy BCA zgodnie z instrukcjami producenta, dodaj 200 μl roztworu roboczego BCA do każdej studzienki i umieść w temperaturze pokojowej (RT) na 20-30 minut.
    4. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 562 nm za pomocą czytnika mikropłytek i obliczyć całkowite stężenie białka w sEV zgodnie z krzywą standardową i współczynnikiem rozcieńczenia.
      UWAGA: SEV wyekstrahowane z 40 ml supernatantu za pomocą tego protokołu mogą być wykorzystane do późniejszej identyfikacji markerów białkowych (western blot). Jednak sEV wyekstrahowane z 200 ml supernatantu komórkowego mogą być wykorzystywane zarówno do obserwacji morfologicznej (transmisyjna mikroskopia elektronowa, TEM), jak i do analizy wielkości cząstek (analiza śledzenia nanocząstek, NTA). W szczególności w przypadku sEV zebranych w kroku 1.11 należy ponownie zawiesić za pomocą 100 μl PBS. Weź 20-30 μl do obserwacji morfologii (TEM) i ponownie zawieś pozostałą próbkę w 1 ml PBS do analizy wielkości cząstek (NTA). Wszystkie wirówki są wcześniej wstępnie schładzane. W kroku 1.8 te ultrawirówki muszą być ściśle wyważone i wypełnione w co najmniej trzech czwartych. Jeśli nie, dodaj medium do makijażu. W przypadku kroku 1.11 sEV mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez krótki okres (12 godzin); w przeciwnym razie muszą być przechowywane w temperaturze -20 lub -80 °C, aby uniknąć degradacji białek, która zakłóca ekstrakcję peptydów. Jednak w przypadku próbek wykorzystywanych do obserwacji morfologii i pomiaru wielkości cząstek zaleca się przechowywanie w temperaturze 4 °C tylko przez krótki okres (12 godzin).

2. Obserwacja morfologii sEV za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

  1. Umieść kroplę świeżej próbki sEVs (około 20-30 μL) na parafilmie, umieść stronę numeryczną siatki miedzianej na kropli sEVs i pozwól jej się wchłonąć przez 3 minuty.
  2. Nadmiar płynu należy wchłonąć bibułą filtracyjną, a następnie umieścić miedzianą siatkę na kropli wody destylowanej i dwukrotnie ją umyć.
  3. Nadmiar płynu należy wchłonąć bibułą filtracyjną. Następnie umieść miedzianą siatkę na 0,5% kropli octanu uranylu w celu barwienia ujemnego przez 5 s.
  4. Powtórz krok 2.2.
  5. Umieść przygotowaną miedzianą siatkę na pręcie próbki i włóż ją do stolika na próbkę.
    1. Dostosuj powiększenie do 20 000x-25 000x, aby znaleźć próbkę do przetestowania. Następnie ustaw powiększenie na 100 000x i dostosuj odpowiednią pozycję i skalę szarości do obserwacji pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym (TEM; Tabela materiałów). Napięcie przyspieszające do pozyskiwania obrazów jest ustawione na 80 kV.
      UWAGA: W kroku 2.1, jeśli stężenie próbek sEVs jest niskie (<50 μg/μL), czas adsorpcji można wydłużyć do 5 minut lub nawet dłużej. Alternatywnie, w kroku 1.10, można użyć mniejszej objętości PBS (50 μl) do ponownego wymieszania. W przypadku kroku 2.3 czas barwienia ujemnego nie powinien być zbyt długi; w przeciwnym razie trudno jest zaobserwować trójwymiarową (3D) strukturę sEV.

3. Pomiary rozkładu wielkości cząstek i koncentracji sEV za pomocą analizy śledzenia nanocząstek

  1. W przypadku sEV zebranych w kroku 1.11 rozcieńczyć roztwór do 1 ml w celu analizy śledzenia nanocząstek (NTA). Najpierw wyczyść instrument wodą destylowaną, aż w polu widzenia nie będzie żadnych zanieczyszczeń. Następnie użyj sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml, aby powoli przepchnąć próbkę (objętość wstrzyknięcia: 0,5-1 ml).
  2. Analizuj próbki za pomocą oprogramowania pomocniczego (patrz tabela materiałów). W szczególności kliknij przycisk Start Camera (Uruchom kamerę) i dostosuj poziom kamery do odpowiedniego rozmiaru (zwykle intensywność 14-16 jednostek), a następnie wybierz metodę pomiaru, Pomiar standardowy (3 lub 5 razy) i kliknij przycisk Uruchom, aby zebrać cząstki.
  3. Po zebraniu cząstek, komputer może obserwować poruszające się cząstki sEVs. Jednocześnie ustaw próg wykrywania (zwykle 5), aby przeanalizować rozkład wielkości cząstek, tak aby końcowe zliczone cząstki były poruszającymi się sEV, a nie tłem. Po przeanalizowaniu cząstek zapisz i wyeksportuj wyniki analizy.
  4. Po użyciu umyj instrument wodą destylowaną, aż w polu widzenia nie będzie widocznych cząstek i wyłącz laser.
    UWAGA: W przeciwieństwie do próbek sEVs dla TEM, próbki sEVs dla NTA nie powinny być zbyt skoncentrowane i wymagać większych objętości próbek (co najmniej 1 ml). Ponadto do analizy rozkładu wielkości sEV można zastosować alternatywne metody, takie jak cytometria przepływowa i przestrajalne rezystancyjne wykrywanie impulsów (TRPS) itp. Zalecana liczba cząstek/ramek do pomiarów NTA (NanoSight LM10) wynosi 40.

4. Wykrywanie markerów białkowych sEV przez western blot

UWAGA: Zgodnie z wytycznymi MISEV 2018 dotyczącymi minimalnych informacji do badań pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (MISEV)17,18, do charakterystyki sEVs zaleca się 5 kategorii białek. Ocenić co najmniej jeden marker białkowy każdej kategorii od 1 do 4 dla przygotowania sEVs.

  1. W przypadku sEV zebranych w kroku 1.9 należy ostrożnie odpipetować supernatant i dodać 15 μl buforu do lizy HEPES na 5 minut. Następnie dodaj równą ilość bufora załadowczego i gotuj we wrzącej wodzie przez 15 min.
  2. W tym protokole obciążenie białka sEV wynosiło 8-10 μg. Elektroforezę białek w 10% żelach przy stałym napięciu 80 V (około 30 min).
    1. Gdy próbka dostanie się do żelu rozdzielającego, ustaw napięcie na 120 V (około 45 min). Gdy próbka znajdzie się w odległości 2-3 cm od dna szklanej płytki, odłącz zasilanie i odetnij pasek próbki do elektroporacji. Skład roztworu do elektroforezy opisano w podkroku 4.2.1.1.
      1. Aby przygotować 5x roztwór do elektroforezy, odważyć 15,1 g, 5 g i 94 g odpowiednio Tris, SDS i glicyny i rozcieńczyć do 1 l wodą dejonizowaną. Po użyciu należy go 5 razy rozcieńczyć wodą.
  3. Zmontować urządzenie do elektroporacji i umieścić w wystarczającej ilości roztworu do elektroporacji (około 1 l), a następnie elektroporować białko na membranie nitrocelulozowej (NC) stałym prądem 90 mA na lodzie przez 3,5 godziny
    UWAGA: Aby przygotować 10x roztwór do elektroporacji, odważyć odpowiednio 30,25 g i 144,1 g Tris i glicyny i rozcieńczyć do 1 l wodą dejonizowaną. Po użyciu należy go przygotować w stosunku 7:2:1 wody dejonizowanej: metanol: roztwór do elektroporacji.
  4. Po elektroporacji umieścić membranę NC w roztworze blokującym (2,5 g odtłuszczonego mleka w proszku w 50 ml soli fizjologicznej buforowanej trisem z 0,1% Tween 20 (TBST) na 1-2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Skład TBST opisano w podkroku 4.4.1.
    1. Aby przygotować 10x TBST, odważ odpowiednio 60,56 g i 175,32 g Tris i NaCl, a następnie dodaj 10 ml Tween-20 i 34 ml stężonego kwasu solnego. Dostosuj pH = 7,6 za pomocą stężonego kwasu solnego i uzupełnij do 2 l wodą dejonizowaną. Po użyciu należy go dziesięciokrotnie rozcieńczyć wodą.
  5. Zidentyfikuj markery białkowe za pomocą trzech markerów sEV (klaster różnicowania 9 [CD9]; β-aktyna; gen podatności guza [TSG101]) i jeden marker nie-sEVs (białko regulowane glukozą 94 [GRP94]).
    1. Pobrać pipetą 2 μl powyższych przeciwciał i rozcieńczyć w stosunku 1:500, a następnie inkubować błony NC w temperaturze pokojowej przez 3 godziny lub przez noc w temperaturze 4 °C. Rozcieńczalnik jest roztworem blokującym w kroku 4.4.
    2. Po inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym przemyć 3 razy 1x TBST na wytrząsarce przez 10 minut za każdym razem.
  6. Umieścić membranę NC w rozcieńczonym przeciwciałie drugorzędowym (1:500) i powoli wstrząsać na wytrząsarce w temperaturze RT przez 45-50 min. Przemyć ją 3 razy 1x TBST na wytrząsarce przez 10 minut za każdym razem.
  7. Wymieszać substraty chemiluminescencyjne A i B (patrz tabela materiałów) w stosunku 1:1, dodać zmieszany odczynnik do membrany NC i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  8. Zobrazuj membranę NC za pomocą skanera blot (patrz Tabela materiałów)
    1. Otwórz oprogramowanie Image Lab i wybierz pozycję New Experimental Protocol (Nowy protokół eksperymentalny).
    2. Wybierz aplikację Blotting-colorimetric, anuluj Highlight, kliknij Uruchom protokół eksperymentalny, uzyskaj znacznik i zapisz go.
    3. Następnie ponownie wybierz program użytkowy Blotting-chemi i ustaw Całkowita liczba obrazów i Czas ekspozycji odpowiednio na 30 s i 300 s.
    4. Kliknij przycisk Uruchom protokół eksperymentalny, pobierz obrazy i zapisz je. Na koniec usuń membranę NC i wyłącz komputer.
      UWAGA: Dla kroku 4.6 czas inkubacji przeciwciała drugorzędowego nie powinien przekraczać 50 minut; W przeciwnym razie tło będzie zbyt ciemne.

5. Ekstrakcja peptydów sEVs

  1. Przemyć sEVs dwukrotnie przez ultrawirowanie w temperaturze 110 000 × g w temperaturze 4 °C przez 70 minut, a następnie dodać 500 μl PBS (patrz Tabela Materiałów) w celu ich ponownego zawieszenia, a następnie dodać 5 μL 100-krotnego inhibitora proteazy (patrz Tabela Materiałów).
  2. Umieścić próbkę do rozdrabniania ultradźwiękowego (patrz Tabela materiałów). Ustawienia homogenizacji ultradźwiękowej są następujące: moc: 40 W, czas całkowity: 10 min, czas ultradźwiękowy: 3 s i czas interwału: 5 s.
  3. Odwirować rozdrobnioną mieszaninę o stężeniu 13 700 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Po odwirowaniu dodać ditiotreitol (DTT; Tabela materiałów) do supernatantu do końcowego stężenia 50 mmol/l i inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 56 °C przez 30 minut.
  5. Następnie dodać 50 μl jodoacetamidu (IAA; Tabela materiałów) do supernatantu w stężeniu 1 mol/l i pozostawić go do reakcji w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemności.
  6. Odwirować mieszaninę w temperaturze 13 700 × g w temperaturze 4 °C przez 15 minut i zebrać supernatant, surowy ekstrakt peptydów. Przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.
  7. Otrzymany surowy ekstrakt peptydów należy poddać ultrafiltracji za pomocą probówek ultrafiltracyjnych o masie 10 kDa19 (patrz tabela materiałów) w celu usunięcia białek i odwirować w temperaturze 13 700 × g w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę. Zebrać ścieki i wysuszyć je w próżniowym koncentratorze odśrodkowym (patrz tabela materiałów) w temperaturze 45 °C.
  8. Wysuszone próbki należy odsolić, wykonując czynności opisane w pkt 5.8.1–5.8.8. Użyj czystej wody klasy spektrometrii mas jako rozpuszczalnika do odczynników.
    1. Dodać 100 μl 0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA) do każdej próbki, aby całkowicie rozpuścić wysuszone peptydy.
    2. Dodać 100 μl 100% acetonitrylu (ACN) do każdej kolumny odsalającej, odwirować przy 400 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i wyrzucić ścieki. Następnie dodać 100 μl 50% ACN, odwirować przy 400 × g przez 3 minuty i wyrzucić ścieki.
    3. Dodać 100 μl 0,1% TFA do każdej kolumny odsalającej, odwirować przy 400 × g przez 3 minuty i wyrzucić ścieki.
    4. Powtórz krok 5.8.3.
    5. Pipetować peptydy rozpuszczone w kroku 5.8.1 do kolumny odsalającej, odwirować przy 400 × g przez 3 minuty i odzyskać ścieki. Powtórz etap ładowania próbki, aby próbka peptydu mogła się zaadsorbować w kolumnie odsalającej.
    6. Powtórz krok 5.8.3 dwukrotnie.
    7. Dodać 50 μl 50% ACN (zawierającego 0,1% TFA) do kolumny odsalającej, odwirować przy 400 × g przez 3 minuty i zebrać ścieki (peptydy) w nowej probówce wirówkowej do spektrometrii mas.

6. Suszenie odsolonych peptydów

  1. Wysuszyć odsolone peptydy w próżniowym koncentratorze odśrodkowym (ustawienia: tryb V-AQ, temperatura: 45 °C i czas: 50 min) i użyć ich do późniejszej analizy spektrometrii mas.
    UWAGA: Proces ekstrakcji peptydów sEV powinien być przeprowadzany w jak największym stopniu na lodzie, aby uniknąć degradacji białek. Wszystkie użyte odczynniki zostały przygotowane z użyciem wody o spektrometrii mas, aby uniknąć zanieczyszczenia tworzywem sztucznym. W przypadku kroku 5.8 odsalanie powoduje nieuniknioną utratę próbek peptydów. Stratę tę można zmniejszyć, powtarzając kroki 5.8.5 i 5.8.7.

7. Chromatografia cieczowa z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS)

UWAGA: Analizuj próbkę peptydów za pomocą chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS), a konkretnie spektrometru masowego Orbitrap Q Exactive HF-X połączonego z nano-wysokowydajnym systemem LC EASY-nLC 1000 (patrz Tabela Materiałów).

  1. Rozdzielić próbki na kolumnie analitycznej C18 (1,9 μm średnicy ziarna, 15 cm długości x 150 μm średnicy wewnętrznej) przy natężeniu przepływu 60 nL/min z gradientem 65 min: 4%-15% przez 4 min, 15%-28% przez 28 min, 28%-40% przez 10 min, 40%-69% przez 10 min, 95% stała przez 7 min, 95% zmniejszona do 6% przez 1 min i stała przez 5 min (rozpuszczalnik A, woda zawierająca 0,1% kwasu mrówkowego [FA]; rozpuszczalnik B, 80% acetonitrylu zawierający 0,1% FA, v/v).
  2. Zjonizuj wyluzowane peptydy w rozpylacza jonizacji nano-elektrorozpylaczem (nano-ESI) w temperaturze kapilarnej 320 °C i napięciu natryskiwania 2,2 kV.
  3. Zbieraj dane widma mas w trybie akwizycji zależnej od danych o zdolności rozdzielczej 120 000 w trybie pełnego skanowania i 15 000 w trybie MS/MS.
    1. Wykonuj pełne skany w orbitrapie od zakresu skanowania od 250 m/z do 1800 m/z i okna izolacji z prędkością 1,6 m/z.
    2. Wybierz 20 pierwszych intensywnych jonów do fragmentacji dysocjacji kolizyjnej o wyższej energii (HCD) ze znormalizowaną energią zderzenia 29% i zmierz w separatorze jonów.
      UWAGA: Typowe warunki spektrometrii mas były następujące: Cele automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC) to 3 x 106 jonów dla pełnych skanów i 2 x 105 dla skanów MS/MS; maksymalny czas wstrzyknięcia wynosił 80 ms dla pełnych skanów i 19 ms dla skanów MS/MS; a wykluczenie dynamiczne zastosowano przez 13 s.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W przypadku sEV wyizolowanych metodą różnicowego ultrawirowania (Ryc. 1), oceniono ich morfologię, rozkład wielkości cząstek oraz markery białkowe zgodnie z wytycznymi Międzynarodowego Towarzystwa Pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (ISEV)17.

W pierwszej kolejności za pomocą TEM zaobserwowano morfologię sEV, która wykazała typową strukturę przypominającą kielich (Rysunek 2A). Analiza NTA wykazała, że wyizolowane sE...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podczas badania funkcji sEV konieczne jest uzyskanie sEV o wysokiej czystości ze złożonych próbek biologicznych, aby uniknąć potencjalnych zanieczyszczeń. Opracowano różne metody izolacji sEV13 , a wśród tych metod zróżnicowane metody oparte na ultrawirowaniu wykazały stosunkowo wysoką czystość sEV. W tym badaniu pobrano 200 ml supernatantu komórkowego przez 6 godzin, a przez ultrawirowanie różnicowe uzyskano około 200-300 μg sEV. Należy jednak zauważyć, że osad sEVs może nie być widoczny podczas ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez granty z Chińskiej Fundacji Nauk Przyrodniczych (3157270). Dziękujemy dr Feng Shao (Narodowy Instytut Nauk Biologicznych, Chiny) za dostarczenie iBMDM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do oznaczania białek BCABeyotime TechnologyP0012
CD9Beyotime TechnologyAF1192
Odśrodkowa rurka filtracyjnaMilliporeUFC5010BK
Butelki wirówkowe polipropylenBeckman Coulter357003Wirówka szybkoobrotowa
Podłoże chemiluminescencyjneThermo Fisher Scientific34580
DithiothreitolSolarbioD8220100 g
Pożywka hodowlana DMEMCell WorldN? A
GRP94Cell Signaling Technology20292
Wirówka szybkoobrotowaBeckman CoulterAvanti JXN-26Wirnik wirówki (JA-25.50)
Unieśmiertelnione makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (iBMDM)Narodowy Instytut Nauk Biologicznych, ChinyDostarczone przez dr Feng Shao (Narodowy Instytut Nauk Biologicznych, Chiny)
JodoacetamidSigmal11495 g
Probówka do mikrofuge polipropylenBeckman Coulter3574481,5 mL, Ultrawirówka stołowa 
nano-wysokowydajny system LCThermo Fisher ScientificEASY-nLC 1000
Analiza śledzenia nanocząstek Malvern PanalyticalNanoSight LM10NanoSight NTA3.4
Orbitrap Q Exactive HF-X SpektrometrThermo Fisher ScientificN/A
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSolarbioP1020
Probówki wirówkowe poliallomeroweBeckman Coulter326823Ultrawirówka
Inhibitor proteazyBimakeB14002
Koncentrator próżniowySpeedVac EppendorfConcentrator plus
Ultrawirówka stołowaBeckman CoulterOptima MAX-XPWirnik ultrawirówki (TLA 55)
Transmisyjny mikroskop elektronowyHITACHIH-7650B
TSG101SigmaAF8258
UltrawirówkaBeckman CoulterOptima XPN-100Wirnik ultrawirówki (SW32 Ti)
Ultradźwiękowy rozbijacz komórekScientzSCIENTZ-IID
Western Blot imagerBio-RadChemiDocXRsImage lab 4.0 (beta 7)
β-aktynaSigmaA3853
masowy

Bibliografia

  1. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
  2. Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15(2011).
  3. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  4. Chen, G., et al. Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response. Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).
  5. Ti, D., et al. LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b. Journal of Translational Medicine. 13, 308(2015).
  6. Sun, H., et al. Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187(2021).
  7. Xun, J., et al. Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B. Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).
  8. Tai, Y. L., Chen, K. C., Hsieh, J. T., Shen, T. L. Exosomes in cancer development and clinical applications. Cancer Science. 109 (8), 2364-2374 (2018).
  9. Mashouri, L., et al. Exosomes: composition, biogenesis, and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance. Molecular Cancer. 18 (1), 75(2019).
  10. Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
  11. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
  12. Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1152-1162 (2016).
  13. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  14. Palanski, B. A., et al. An efficient urine peptidomics workflow identifies chemically defined dietary gluten peptides from patients with celiac disease. Nature Communications. 13, 888(2022).
  15. Kalaora, S., et al. Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma. Nature. 592 (7852), 138-143 (2021).
  16. Hamley, I. W. Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics. Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).
  17. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913(2014).
  18. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  19. Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach. Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).
  20. Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I. Peptidome: Chaos or inevitability. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13128(2021).
  21. Keller, M. D., et al. Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins. Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).
  22. Koeppen, K., et al. Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Makrofagi szpiku kostnegoróżnicowa ultrawirowanieanaliza peptydomuLC-MS/MSizolacja pęcherzykówkomunikacja międzykomórkowaodporność wrodzonapeptydy przeciwdrobnoustrojowezawartość pęcherzyków
Identyfikacja peptydów małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.