Dwufotonowe obrazowanie wapnia aktywności przodomózgowia u zachowujących się dorosłych danio pręgowanych

Obrazowanie fluorescencyjne wapnia za pomocą genetycznie kodowanych wskaźników lub syntetycznych barwników było potężną metodą pomiaru aktywności neuronalnej u zachowujących się zwierząt, w tym naczelnych, gryzoni, ptaków i owadów¹. Aktywność setek komórek, do około 800 μm poniżej powierzchni mózgu, może być mierzona jednocześnie za pomocą obrazowania wielofotonowego^2,3. Aktywność określonych typów komórek można również mierzyć poprzez ekspresję wskaźników wapnia w genetycznie zdefiniowanych populacjach neuronów. Zastosowanie metody obrazowania w modelach małych kręgowców otwiera nowe możliwości w dziedzinie obliczeń neuronalnych w różnych regionach mózgu.

Danio pręgowany to powszechnie stosowany system modelowy w badaniach neurobiologicznych. Larwy danio pręgowanego po około 6 dniach od zapłodnienia zostały wykorzystane do obrazowania wapnia ze względu na ich miniaturowy mózg i przezroczyste ciało⁴. Młode rybki danio pręgowanego (w wieku 3-4 tygodni) są również wykorzystywane do badania mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw ścieżek sensomotorycznych^5,6. Jednak maksymalny poziom wydajności dla złożonych zachowań, w tym uczenia się asocjacyjnego i zachowań społecznych, jest osiągany w starszym wieku^7,8. W związku z tym wymagany jest wiarygodny protokół do badania wielu funkcji poznawczych w mózgach dorosłych zebry przy użyciu metod obrazowania. Podczas gdy larwy danio pręgowanego i młode danio pręgowane mogą być osadzone w agarozie w celu obrazowania in vivo, dorosłe danio pręgowane w wieku 2 miesięcy lub starsze cierpią na niedotlenienie w takich warunkach i są fizycznie zbyt silne, aby mogły zostać powstrzymane przez agarozę. Dlatego wymagany jest zabieg chirurgiczny, aby ustabilizować mózg i umożliwić zwierzęciu swobodne oddychanie przez skrzela.

Tutaj opisujemy protokół zagłówka, który obejmuje nowatorski projekt pojedynczego pałąka na głowę. Skrócony czas operacji do 25 minut jest dwa razy szybszy niż w przypadku poprzedniej metody⁹. Opisujemy również konstrukcję komory nagraniowej (półsześciokątny zbiornik), stopnia głównego i mechanizmu szybkiego blokowania w celu połączenia dwóch części⁹. Na koniec opisano również konfigurację do prezentowania immersyjnego bodźca wizualnego w celu zbadania wizualnie wyzwalanej aktywności i zachowań mózgu. Ogólnie rzecz biorąc, opisane tutaj procedury mogą być wykorzystane do przeprowadzenia dwufotonowego obrazowania wapnia w genetycznie zdefiniowanych populacjach komórek u dorosłego danio pręgowanego z unieruchomioną głową, umożliwiając badanie aktywności mózgu podczas różnych paradygmatów behawioralnych.

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Academia Sinica. Szczegóły dotyczące narzędzi badawczych znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie komory nagraniowej

1. Przygotuj półsześciokątny zbiornik, płytę podstawy i stopień czołowy (Rysunek 1A; Akta uzupełniające 1-3). Stopień główny składa się z dwóch metalowych słupków przymocowanych do okrągłej płyty. Okrągła płyta zawiera rowki, które można zablokować na płycie podstawy. Po zablokowaniu ze sobą stopień główny i płyta podstawy są układane na dnie półsześciokątnego zbiornika.
2. Umieść półsześciokątny zbiornik na platformie doświadczalnej mikroskopu. Platforma powinna być w stanie poruszać się w kierunkach X i Y bez osiągania limitu etapu tłumaczenia.
3. Skieruj światło podczerwone (IR) 810 nm i kamerę na stopień główny, aby uzyskać rejestrację behawioralną. Upewnij się, że pole widzenia kamery jest wystarczająco duże, aby zmieścić dorosłego danio pręgowanego.
   1. Aby zapobiec zakłócaniu rejestracji behawioralnej przez laser dwufotonowy i bodziec wizualny, przed kamerą należy ustawić filtr krótkoprzepustowy 875 nm i filtr długoprzepustowy 700 nm.
4. Aby zaprezentować bodziec wizualny, przymocuj folie do projekcji wstecznej po wewnętrznej stronie trzech ścian półsześciokątnego zbiornika (Rysunek 1A).
5. Skieruj trzy projektory na trzy powierzchnie zbiornika. Trzy obrazy powinny być wyrównane, aby utworzyć ciągłą scenę wizualną. Aby zapobiec zanieczyszczeniu sygnału fluorescencji wapniowej przez światła projektora, należy umieścić filtr o neutralnej gęstości i filtr koloru czerwonego (600 nm, długoprzepustowy) przed każdym projektorem, a filtr pasmowo-przepustowy (510/80 nm) przed lampą fotopowielacza (PMT).

Rysunek 1: Narzędzia niezbędne do operacji unieruchomienia głowy. (A) Mechanizm szybkiego blokowania pomiędzy okrągłą płytą stopnia głowicy a płytą podstawy wewnątrz półsześciokątnego zbiornika. Pliki projektowania komputerowego (CAD) części wykonanych na zamówienie można znaleźć w plikach uzupełniających 1-4. (B) Zagłówek w kształcie Ω. (C) Trójosiowy mikromanipulator służący do ustawiania głowicy w miejscu mocowania. Wstawka: orientacja głowicy w glinie. (D) Armata do trzymania ryby podczas operacji. Wstawka: orientacja ryb w armacie. (E) Moduł załadunku ryb i mikromanipulator używany do załadunku ryb na stopień główny. Wstawka: orientacja ryb w module. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Operacja unieruchomienia głowy

1. Przygotuj pałąk w kształcie Ω (Rysunek 1B; Plik uzupełniający 4) do zagłówka danio pręgowanego. Aby to zrobić, przymocuj kawałek modeliny na bazie oleju do trójosiowego mikromanipulatora. Upewnij się, że glina jest wystarczająco twarda, aby utrzymać pałąk, ale wystarczająco miękka, aby można ją było odłączyć od zagłówka po zagłówku.
2. Włóż ramię głowicy do gliny i ustaw ją poziomo (Rysunek 1C). Zapewni to, że późniejsze przymocowanie pręta do danio pręgowanego będzie wypoziomowane.
   UWAGA: Głowica może być wykonana z tytanu (24 mg) lub stali nierdzewnej (43 mg) i może być ponownie wykorzystana do wielu eksperymentów. Materiał, z którego wykonana jest pałąk na głowę, nie wpływa na zachowanie dorosłych ryb danio pręgowanych (waga waha się od 300-1 000 mg) pod zagłówkiem.
3. Przygotuj armatę, pustą rurkę do przytrzymywania ciała ryby na miejscu podczas operacji (Ryc. 1D).
4. Przygotować 0,03% i 0,01% metanosulfonian trikainy (TMS; patrz Tabela Materiałów) w wodzie w akwarium. Zostanie to wykorzystane do znieczulenia i utrzymania ryb w stanie uspokojenia podczas operacji.
5. Przygotuj cztery wymazy z tkanek, aby usunąć nadmiar skóry i wody z miejsc przyczepów na czaszce. Aby przygotować każdy wacik, pokrój ręcznik papierowy na kwadrat o boku 3 cm i złóż wzdłuż jego przekątnej, aby uzyskać strukturę przypominającą rurkę. Przekręć końce rurki w drobny punkt. Miejsce mocowania jest bardzo małe, więc cienki punkt pozwala na dokładniejszą kontrolę wacika.
6. Przygotuj moduł załadunku ryb do mikromanipulatora (Rysunek 1E).
   UWAGA: Moduł składa się z dwóch stalowych słupków połączonych zaciskiem słupka pod kątem prostym. Jeden słupek mocuje się do mikromanipulatora, podczas gdy drugi słupek trzyma obrotowy zacisk słupka, który przenosi rybę. Moduł służy do ustawiania ryby na stopniu głównym z precyzyjną kontrolą. Obrotowy zacisk słupka służy jako regulator nachylenia do zmiany kąta nachylenia ryby.
7. Znieczulij ryby 0,03% TMS w wodzie w akwarium. W kolejnych krokach użyj strzykawki, aby dostarczyć 0,01% TMS z wody w akwarium do ust w krótkich impulsach co 90 s. Przepływ wody z perfuzji powinien wywołać ruch skrzeli. Pozwoli to rybom przetrwać ponad 40 minut podczas operacji.
   UWAGA: Tg[neuroD:GCaMP6f] jest używany ze względu na szeroką ekspresję wskaźnika wapnia w przodomózgowiu zarówno w stadium larwalnym, jak i dorosłym¹⁰.
   UWAGA: Opcjonalnie użyj perfuzji grawitacyjnej, aby zapewnić stały przepływ wody do ust w okresach operacji, w których zajęte są obie ręce.
8. Zawiń rybę w kapsułkę (Rysunek 2A), która trzyma rybę wewnątrz armaty.
   1. Zawiń znieczuloną rybę w kawałek wilgotnej chusteczki papierowej, zaczynając od czubka ogona do około 1 mm ogona do skrzela. Upewnij się, że opakowanie jest szczelne, aby zapobiec wysunięciu się ryby z tkanki.
   2. Owiń miękką plastikową rurkę z podłużną szczeliną (np. średniej wielkości rurką termokurczliwą rozciętą) wokół papierowej chusteczki, aby przykryć rybę od końca ogona do około 2 mm ogona do skrzela. Rurki zapewniają, że ciało ryby pozostaje proste przez cały czas trwania operacji.
   3. Owiń rurkę ręcznikiem papierowym do średnicy mniej więcej podobnej do średnicy armaty.
   4. Owiń miękką plastikową rurkę wyciętą z bańki plastikowej pipety transferowej wokół ręcznika papierowego. Dzięki temu kapsuła może być płynnie ładowana do armaty.
   5. Załaduj rybę do armaty.
9. Użyj skalpela, aby usunąć skórę pokrywającą miejsca przyczepu, dwa trójkątne obszary czaszki rostrolateralne do móżdżku i powyżej skrzeli (Rysunek 2B), a następnie usuń skórę pokrywającą obszar między miejscami przyczepu. Użyj wacików higienicznych, aby wysuszyć miejsca przyczepów i usunąć pozostałą skórę.
   1. Użyj regulowanej platformy, aby podeprzeć głowę podczas usuwania skóry, ale platforma nie może stykać się z oczami, aby uniknąć obrażeń oczu podczas operacji.
      UWAGA: Dokładne usunięcie skóry w miejscach przyczepu ma kluczowe znaczenie dla zmniejszenia artefaktów ruchu podczas obrazowania.
10. Nałóż kroplę kleju tkankowego (patrz Tabela materiałów) na środek każdego miejsca mocowania za pomocą końcówki do pipety o pojemności 10 μl.
    UWAGA: Klej tkankowy pokrywa miejsca mocowania i szybko wysycha. Klej tkankowy zapewnia połączenie między czaszką a cementem dentystycznym używanym do klejenia pręta głowy i zapobiega przedostawaniu się wody ze skrzeli do miejsca przyczepu.
11. Ustaw ciało ryby w pozycji pionowej i umieść belkę głowicy nieco powyżej i doogonowo do miejsc mocowania, przygotowując się do przyklejenia głowicy.
12. Przygotuj cement dentystyczny (patrz Tabela Materiałów) i natychmiast użyj go do przyklejenia pręta na głowę do czaszki (Rysunek 2C). Procedura jest zależna od czasu i musi zostać wykonana w ciągu 45 sekund.
    1. Wymieszaj jedną małą łyżeczkę polimeru z czterema kroplami szybkiego monomeru i jedną kroplą katalizatora V. Mieszaj mieszaninę równomiernie przez 15 sekund.
    2. Za pomocą mikropipety i końcówki do pipety o pojemności 10 μl nanieść mieszaninę na miejsca mocowania i obszar między tymi miejscami. Unikaj zakrywania skrzeli i oczu.
    3. Delikatnie dociśnij listwę głowicy do cementu za pomocą mikromanipulatora. Przykryj głowicę pozostałym cementem.
    4. Odczekaj 12 minut, aby cement dentystyczny mógł się utwardzić. Unikaj kontaktu wody z cementem.
13. Aby poprawić dostęp optyczny do przodomózgowia w celu obrazowania wapnia, usuń skórę powyżej kresomózgowia. Usunięcie skóry można wykonać w ciągu 3 minut za pomocą pięciu cięć za pomocą skalpela (Rysunek 2D). Upewnij się, że kropelki lipidów przylegające do powierzchni czaszek zostały usunięte.
14. Po utwardzeniu usuń glinkę z głowicy.
15. Przenieś całą kapsułę z armaty do regulatora skoku w module ładowania ryb mikromanipulatora.
16. Użyj mikromanipulatora, aby ustawić rybę. Pałąk głowicy powinien być umieszczony na metalowych słupkach stopnia czołowego. Nieznacznie zwiększ kąt nachylenia ryby, aby powierzchnia przodomózgowia mogła być lepiej wyrównana z płaszczyzną optyczną podczas obrazowania dwufotonowego.
17. Przyklej głowicę do metalowych słupków za pomocą kleju utwardzanego promieniowaniem ultrafioletowym (UV). Do utwardzenia wystarczy 15-sekundowa ekspozycja na promieniowanie UV.
18. Wyciągnij rybę z kapsułki i zablokuj stopień głowicy na płycie podstawy w półsześciokątnym zbiorniku.
19. Zanurz zwierzę w wodzie w akwarium. Ryba powinna zacząć oddychać i dojść do siebie po znieczuleniu w ciągu 1-2 minut.
    UWAGA: Opcjonalnie użyj perfuzji strzykawkowej, aby dostarczyć świeżą wodę do ust.

Rysunek 2: Kluczowe kroki podczas operacji unieruchomienia. (A) Skład kapsuły wewnątrz armaty. (B) Miejsca przyczepu na czaszce (czerwone). Czerwone strzałki wskazują miejsca naczyń krwionośnych. (C) Góra: pręt na głowę przymocowany do czaszki ryby. Na dole: ryba załadowana na stopień główny. (D) Nacięcia potrzebne do usunięcia skóry powyżej przodomózgowia. Liczby oznaczają sekwencję cięcia. Unikaj usuwania skóry w zaznaczonym miejscu (grot strzałki), aby zapobiec krwawieniu zwierzęcia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Obrazowanie dwufotonowe

1. Włącz laser i odczekaj 30 minut, aż zasilanie się ustabilizuje. Ustaw długość fali na 920 nm i moc na około 50 mW na próbce.
   UWAGA: Wiązka laserowa sterowana przez skaner rezonansowy porusza się powoli w punktach zwrotnych ścieżki skanowania. Aby zapobiec uszkodzeniom tkanek, stosuje się ogniwo Pockelsa w celu zmniejszenia mocy lasera w punktach zwrotu.
2. Umieść komorę rejestracyjną zawierającą danio pręgowanego z unieruchomioną głową na platformie doświadczalnej (Rysunek 3A). Platforma powinna być w stanie poruszać się w kierunkach X i Y bez osiągania limitu etapu tłumaczenia.
3. Umieść soczewkę obiektywu jak najbliżej powierzchni przodomózgowia. Soczewka obiektywu powinna być skierowana na przednią krawędź źrenicy (Rysunek 3B).
4. Otwórz migawkę lasera i włącz PMT. Stopniowo podnoś soczewkę obiektywu (~1 mm), aż grzbietowa część przodomózgowia zostanie odsłonięta na obrazie fluorescencyjnym (Rysunek 3C).
5. Aby zwiększyć liczbę rejestrowanych neuronów, użyj siłownika piezoelektrycznego do pozyskiwania obrazów na wielu głębokościach (sześć płaszczyzn obrazu, oddalonych od siebie o 15 μm). Zwiększy to wydajność danych kosztem liczby klatek na sekundę. Włącz szybkie skanowanie w osi Z, aby sterować siłownikiem piezoelektrycznym (tryb jednolity, liczba warstw = 6, rozmiar kroku = 15 μm, kształt fali = piłokształtny, czas flyback = 4 ms, opóźnienie siłownika = 8 ms).
6. Aby rejestrować zachowanie, włącz światła podczerwone (IR) 810 nm po obu stronach zbiornika. Dostosuj kąt, aby oświetlić całe ciało, które powinno być wyraźnie widoczne w aparacie.
7. Włącz projektory.
8. Rozpocznij rejestrowanie danych.

Rysunek 3: Konfiguracja do wykonywania obrazowania wapnia, rejestracji zachowania i wyświetlania bodźców wizualnych. (A) Trzy projektory prezentują bodziec wizualny na ściankach półsześciokątnego zbiornika. Światła podczerwone z boku służą do oświetlania ciała danio pręgowanego. (B) Umiejscowienie soczewki obiektywu. Po lewej: widok z przodu. Po prawej: widok z boku. Odległość między soczewką obiektywu 16x a docelowym obszarem mózgu wynosi około 2,5 mm. (C) Przykładowy obraz dwufotonowy. Po lewej: maksymalna projekcja całego grzbietowego przodomózgowia w Tg[neuroD:GCaMP6f]. Po prawej: powiększony obraz, aby odsłonić neurony w wielu obszarach mózgu. Wstawka: większe powiększenie z innego obszaru mózgu. Obrazy są średnimi z 10 s danych zarejestrowanych przy 5 Hz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół składa się z dwóch części: operacji krępowania głowy i dwufotonowego obrazowania aktywności neuronalnej w przodomózgowiu. O powodzeniu operacji decyduje przeżycie zwierzęcia i stabilność zagłówka. Wskaźnik przeżycia można znacznie poprawić poprzez częstą perfuzję 0,01% roztworu TMS przez usta podczas operacji. Ryby powinny dojść do siebie po znieczuleniu i aktywnie oddychać w ciągu 1-2 minut po zanurzeniu w wodzie w akwarium. Dwufotonowe obrazowanie wapnia umożliwia rejestrację aktywności poszczególnych neuronów w grzbietowym przodomózgowiu na głębokości do 200 μm od powierzchni mózgu przez nienaruszone czaszki (o grubości ~40 μm). Ten zakres obrazowania obejmuje wiele stref kresomózgowia grzbietowego (D), w tym strefę przyśrodkową (Dm), rostralną część strefy centralnej (rDc), ogonową część strefy centralnej (cDc) i strefę boczną (Dl). Razem stanowią 30% kresomózgowia u dorosłego danio pręgowanego (ryc. 3C). W przypadku obrazowania wolumetrycznego przy użyciu siłownika piezoelektrycznego zazwyczaj rejestrujemy aktywność 150 neuronów w Dl lub cDc oraz 300 neuronów w Dm i rDc w Tg[neuroD:GCaMP6f]10. Jednoczesna rejestracja behawioralna jest wykonywana podczas obrazowania mózgu, co umożliwia identyfikację neuronalnych korelatów wyjść motorycznych (Rysunek 4).

Podczas obrazowania dwufotonowego, ruchy ogona nie powinny powodować widocznego artefaktu ruchu na obrazie. Niewielki (<1 μm) i przejściowy ruch można zaobserwować podczas ekstremalnych zmagań. Ruchy te są zazwyczaj odwracalne, więc obrazowanie można kontynuować po jego zakończeniu. Obserwujemy również powolny dryft (<1 μm min-1) w kierunku bocznym i osiowym9. Aby zapobiec utracie neuronów z powodu osiowego dryfu próbki, zazwyczaj ograniczamy naszą sesję obrazowania do 10 minut. Nie należy obserwować fotowybielania wskaźnika wapnia po 10-minutowej sesji obrazowania przy określonej mocy lasera.

Rysunek 4: Śledzenie zachowania i wzorzec aktywności neuronalnej u dorosłego danio pręgowanego. (A) Przykładowa klatka z nagrania zachowania kamery (widok brzuszny). (B) Aktywność neuronów przodomózgowia (ΔF/F,) i intensywność ruchów ogona (niebieski). Intensywność ruchu ogona określono ilościowo za pomocą średniej bezwzględnej różnicy pikseli między kolejnymi klatkami wideo. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Projekt płyty podstawy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Projekt okrągłej płyty. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Projekt półsześciokątnego zbiornika. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Projekt głowicy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Szczegóły dotyczące rozwiązywania problemów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.