Tutaj omawiamy proces przygotowania, sekcji, montażu i obrazowania żywych mózgów eksplantatów z larw trzeciego stadium rozwojowego Drosophila melanogaster, aby obserwować dynamikę komórkową i subkomórkową w warunkach fizjologicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie żywymi komórkami mózgów larwalnych Drosophila melanogaster
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nerwowe komórki macierzyste Drosophila (neuroblasty, dalej NB) przechodzą asymetryczne podziały, regenerując samoodnawiający się neuroblast, jednocześnie tworząc różnicującą się komórkę macierzystą zwoju (GMC), która przejdzie jeden dodatkowy podział, aby dać początek dwóm neuronom lub glejowi. Badania nad nanocząsteczkami pozwoliły odkryć mechanizmy molekularne leżące u podstaw polaryzacji komórek, orientacji wrzeciona, samoodnawiania się nerwowych komórek macierzystych i różnicowania. Te asymetryczne podziały komórkowe są łatwo widoczne za pomocą obrazowania żywych komórek, co sprawia, że larwy NB idealnie nadają się do badania czasoprzestrzennej dynamiki asymetrycznego podziału komórek w żywej tkance. Po prawidłowym wypreparowaniu i zobrazowaniu w pożywce uzupełnionej składnikami odżywczymi, NB w mózgach eksplantatów solidnie dzielą się przez 12-20 godzin. Poprzednio opisane metody są technicznie trudne i mogą stanowić wyzwanie dla osób początkujących w tej dziedzinie. W tym miejscu opisano protokół przygotowania, preparacji, montażu i obrazowania żywych eksplantatów mózgu larw trzeciego stadium rozwoju przy użyciu suplementów tłuszczowych. Omówiono również potencjalne problemy i podano przykłady, w jaki sposób można zastosować tę technikę.
Wprowadzenie
Asymetryczny podział komórek (ACD) to proces, w którym składniki subkomórkowe, takie jak RNA, białka i organelle, są nierówno dzielone między komórki potomne1,2. Proces ten jest powszechnie obserwowany w komórkach macierzystych, które ulegają ACD, aby dać początek komórkom potomnym o różnych losach rozwojowych. Drosophila Nanocząsteczki dzielą się asymetrycznie, tworząc jeden NB, który zachowuje swoją łodygę, i jedną komórkę macierzystą zwoju (GMC). GMC przechodzi dalsze podziały w celu wytworzenia neuronów różnicujących lub gleju3. Asymetrycznie dzielące się NB występują obfic....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Rysunek 1 przedstawia materiały niezbędne do przeprowadzenia tego badania.
1. Rozważania i przygotowania do eksperymentu
- Zapobiegaj przeludnieniu larw.
UWAGA: Jakość eksplantów mózgów larw jest bezpośrednio związana ze stanem zdrowia i jakością larw przed sekcją. Larwy niedożywione na skutek przeludnienia zazwyczaj dają mózgi o niższej jakości30.- Upewnij się, że w każdym naczyniu typu meal cap znajduje się nie więcej niż 20-30 larw, aby uniknąć niedożywienia. Przykłady takich naczyń widoczne są na Ryc. 2.<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Disekcja i obrazowanie neuroblastów (NB) środkowego płata mózgu wykazujących ekspresję Pins::EGFP i Cherry::Jupiter
W celu zaprezentowania tego protokołu, larwy wykazujące ekspresję Cherry::Jupiter pod kontrolą UAS13 oraz endogennie znakowane Pins::EGFP16 (w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; Pins::EGFP/TM6B, Tb) obrazowano przez 4 h zgodnie z opisanym protokołem, wykorzystując wielodołkowe szkiełka do obrazowania (Rysunek 5C
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten przedstawia jedno z podejść do obrazowania żywych mózgów eksplantatów z larw Drosophila melanogaster . Opisany tutaj protokół pozwala na obserwację mózgów eksplantatów przez 12-20 godzin w odpowiednich warunkach eksperymentalnych. Szczególną uwagę należy zwrócić na przygotowanie próbek i projekt pożądanych doświadczeń. Jak wspomniano powyżej, jednym z najważniejszych czynników decydujących o jakości wypreparowanej tkanki jest zdrowie larw. Aby osiągnąć najwyższą możliwą jakość, należy upewnić się, ż.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych ujawnień finansowych do zadeklarowania.
Podziękowania
To badanie jest wspierane przez R35GM148160 (C. C.) oraz National Institutes of Health (NIH) Training Grant T32 GM007270 (R. C. S)
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,22 &mikro; m Membrana polieterosulfonowa (PES) | Genesee | 25-231 | Filtry |
| Agar | Genesee | 20-248 | agar granulowany |
| Komputer analityczny | Dell | NA | Xeon Gold 5222 z dwoma procesorami 3,80 GHz z systemem Windows 10 w 64-bitowym systemie operacyjnym |
| Ibidi | 80826 | ||
| Mikroskop konfokalny | Nikon | NA | |
| Szkiełko metalowe | obrabiane na zamówienie NA | NA Specyfikacje | znajdują się w Cabernard i Doe 2013 (Ref. 34) |
| Naczynia preparacyjne | Fisher Scientific | 5024343 | 3-dołkowa porcelanowa płytka mikropunktowa |
| Kleszcze preparacyjne | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Mikroskop preparacyjny | Nożyczki | NA | |
| Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | ||
| Klatka do pobierania zarodków | Genesee | 59-100 | |
| Flypad z dostępem do CO2 do znieczulenia dorosłych much | Genesee | 59-172 | |
| Membrana przepuszczająca gaz | YSI | 98095 | Membrana przepuszczająca gaz |
| Szklana osłona Szkiełka | Mikroskopia elektronowa Sciences | 72204-03 | # 1.5; szkiełka nakrywkowe 22 mm x 40 mm |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatywy: Fidżi, Volocity, |
| Aivia Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Drożdże instant | Saf-Instant | NA | |
| Melasa | Genesee | 62-117 | |
| szalka Petriego | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm szalka Petriego |
| Wazelina | z | ||
| Pożywka owadobójcza Schneidera z płynną L-glutaminą i wodorowęglanem sodu | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook | 3i | NA | |
| Jednostka filtracji sterowana próżnią z 0,22 i mikro; &mikro; m Filtr membranowy PES | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
Bibliografia
- Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
- Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mechanisms of asymmetric cell division.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
