Tutaj opisujemy metodę selektywnej zmiany ekspresji genów w splocie naczyniówkowym, unikając jednocześnie jakiegokolwiek wpływu na inne obszary mózgu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Celowy knockdown genów w splocie naczyniówkowym
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Splot naczyniówkowy (ChP) służy jako krytyczna brama do infiltracji komórek odpornościowych do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. Ostatnie badania wykazały, że regulacja aktywności ChP może zapewnić ochronę przed zaburzeniami OUN. Jednak badanie biologicznej funkcji ChP bez wpływu na inne obszary mózgu jest trudne ze względu na jego delikatną strukturę. W pracy przedstawiono nowatorską metodę knockdownu genów w tkance ChP przy użyciu wirusów związanych z adenowirusami (AAV) lub białkiem rekombinazy enzymu rekombinacji cyklizacji (Cre) składającego się z sekwencji TAT (CRE-TAT). Wyniki pokazują, że po wstrzyknięciu AAV lub CRE-TAT do komory bocznej, fluorescencja była skoncentrowana wyłącznie w ChP. Stosując to podejście, badanie z powodzeniem obaliło receptor adenozyny A2A (A2AR) w ChP za pomocą interferencji RNA (RNAi) lub Cre/locus układów X-overP1 (Cre / LoxP) i wykazało, że ten knockdown może złagodzić patologię eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE). Technika ta może mieć ważne implikacje dla przyszłych badań nad rolą ChP w zaburzeniach OUN.
Wprowadzenie
Często uważano, że splot naczyniówkowy (ChP) pomaga utrzymać funkcjonalną homeostazę mózgu poprzez wydzielanie płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) i neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego (BDNF)1,2. Coraz więcej badań w ciągu ostatnich trzech dekad wykazało, że ChP stanowi odrębną ścieżkę infiltracji komórek odpornościowych do ośrodkowego układu nerwowego (OUN).
Ścisłe połączenia (TJ) ChP, składające się z jednowarstwowego nabłonka ChP, utrzymują homeostazę immunologiczną, zapobiegając przedostawaniu się makrocząsteczek i komórek odpornościowych do mózgu3
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury na zwierzętach opisane w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi zawartymi w Przewodniku NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Medycznym w Wenzhou.
1. Zwierzęta
- Kup samce myszy C57BL/6 w wieku 8-12 tygodni i wadze 20-22 g.
- Uzyskaj transgeniczną linię myszy Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) i samce myszy A2ARflox / flox.
- Losowo przypisz myszy do dwóch grup i trzymaj je w klatkach, z maksymalnie pięcioma myszami na ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wyciszenie A2AR specyficzne dla ChP poprzez wstrzyknięcie do komór mózgu (ICV) AAV2/5-shRNA lub CRE-TAT
Rola A2AR w ChP jako silnego regulatora informacji neuronalnej w patogenezie EAE pozostaje niewyjaśniona. Wyciszenie specyficznej dla ChP ekspresji A2AR mogłoby rzucić światło na efekty regulacyjne A2AR w obrębie centralnego układu odpornościowego w EAE i innych stanach zapalnych układu nerwowego. W niniejszym badaniu zastosowano wstrzyknięcie ICV CRE-TAT.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W badaniu przedstawiono dwa odrębne podejścia do ukierunkowanego knockdownu genów ChP. Pierwsze podejście polegało na wstrzyknięciu ICV CRE-TAT, który zawiera rekombinazę Cre, do myszy A2AR flox/flox. Drugie podejście polegało na wstrzyknięciu ICV AAV2/5 przenoszącego shRNA A2AR. Wykorzystując te dwie strategie, udało się osiągnąć selektywne wyłączenie A2AR w ChP i było w stanie wykazać ochronne działanie hamowania sygnalizacji A2AR w ChP na patologię EAE. Warto zauw.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych ani innych ujawnień, które mogliby zadeklarować.
Podziękowania
Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (grant nr 31800903, przyznany W. Zhengowi) oraz Wenzhou Science and Technology Project (nr Y2020426, przyznany Y. Y. Weng) za tę pracę.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Myszy A2ARflox/flox | Państwowe Kluczowe Laboratorium Okulistyki, Optometrii i Nauk Wizualnych, Uniwersytet | ||
| AAV2/5-A2AR-ShRNA | Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | PT-4828 | |
| medium do montażu zapobiegającego blaknięciu | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
| kapilara ze szkła borokrzemianowego | Beijing Meiyaxian Technology Co., Ltd | B100-50-10 | |
| aparat stereotaktyczny mózgu | RWD, Shenzhen | 69100 | |
| C57BL/6 myszy | Pekin Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company | ||
| CRE-TAT rekombinaza | Millipore | SCR508 | |
| DAPI | Absin | B25A031 | |
| krajalnica do mrożonek | Leica | CM1950 | |
| H37Ra | Becton Dickinson and company | 231141 | |
| Strzykawka Hamilton | Hamilton, amerykański | P/N: 86259 | |
| Niekompletny adiuwant Freundsa | Sigma | F5506 | |
| Laserowy mikroskop konfokalny | Zeiss | LSM900 | |
| MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
| Klej OCT | Epredia | 6502p | |
| paraformaldehyd | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 30525-89-4 | |
| pentobarbital sodowy | Boyun Biotech | PC13003 | |
| Pistolet do pipet | Eppendorf | N45014F | |
| Zestaw do syntezy 1. nici cDNA | PrimeScript Takara | 6110A | |
| System PCR w czasie rzeczywistym | BioRad | CFX96 | |
| Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdMyszy pomidorowe | Jackson Laboratory | ||
| sacharoza | Sangon Biotech | A502792-0500 | |
| super szybki homogenizator | IKA | 3737025 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| roztworze | ksylenuFirma odczynników chemicznych Chengdu Kelong | 1330-20-7 |
Bibliografia
- Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).
- Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
