Metoda treningu siły statycznej dla myszy z cukrzycą typu 2

Summary

Ten protokół zapewnia prostą metodę tworzenia statycznego sprzętu treningowego dla myszy. Urządzenie utrzymuje izometryczny skurcz mięśni kończyn myszy, aby zweryfikować interwencyjny wpływ tradycyjnych ćwiczeń na cukrzycę typu 2 (T2DM) i zapewnia nową terapię ruchową w klinicznym leczeniu cukrzycy typu 2.

Abstract

Leczenie cukrzycy typu 2 (T2DM) jest główną przeszkodą w poprawie zdrowia pacjenta. Ćwiczenia fizyczne są jedną z głównych interwencji w cukrzycy typu 2. Statyczny trening siłowy jest jedną z kluczowych form tradycyjnych sportów w Chinach. Badania pokazują, że statyczny trening siłowy jest skuteczną metodą kliniczną interwencji w cukrzycy typu 2, ale nie ma eksperymentalnego urządzenia odpowiedniego do treningu statycznego u myszy. Jedną z trudności w przejściu od badań klinicznych do podstawowych jest zaprojektowanie odpowiednich urządzeń eksperymentalnych. W celu dalszego zbadania mechanizmu statycznej interwencji treningowej w cukrzycy typu 2, w artykule przedstawiono prostą metodę tworzenia statycznego urządzenia treningowego dla myszy. To urządzenie ma zalety prostej obsługi, taniego materiału i wysokiej wykonalności. Wcześniejsze badania przeprowadzone zgodnie z tym protokołem wykazały, że trening statyczny może skutecznie obniżyć poziom glukozy we krwi i poprawić funkcję mitochondriów komórek mięśni szkieletowych u myszy z cukrzycą typu 2. Celem wprowadzenia tego urządzenia jest promowanie badań nad mechanizmem tradycyjnego wysiłku fizycznego w interwencji cukrzycy typu 2 oraz stworzenie podstaw dla ilościowej interwencji ćwiczeń.

Introduction

Cukrzyca typu 2 (T2DM) jest przewlekłą chorobą charakteryzującą się insulinoopornością i dysfunkcją komórek β, która stanowi poważne zagrożenie dla globalnego zdrowia¹. Ćwiczenia są kluczową interwencją w leczeniu cukrzycy typu 2. Liczne badania wykazały, że tradycyjne chińskie metody ćwiczeń, takie jak Tai Chi i Ba Duan Jin, znacznie poprawiają poziom glukozy we krwi i jakość życia osób z T2DM^2,3,4,5. Aby wykonać te ruchy, trener musi przez pewien czas utrzymywać stabilną pozycję ciała i stawów. Pozycja statyczna jest utrzymywana przez wykonywanie statycznych skurczów mięśni, które są powszechnie określane jako siła statyczna⁶.

Jednak mechanizm interwencji treningu siły statycznej w T2DM nie został wyjaśniony. Aby odpowiedzieć na to pytanie, niezbędne są eksperymenty na zwierzętach. Podczas ćwiczeń izometrycznych mięśnie są aktywowane, utrzymują stałą długość i bezpiecznie osiągają maksymalne napięcie⁷. W doświadczeniach z treningiem siły statycznej badane zwierzę jest zobowiązane do wykonywania izometrycznych skurczów mięśni i utrzymywania tego stanu skurczu mięśni. Jak wdrożyć statyczny trening siły na myszach, szczurach i innych zwierzętach laboratoryjnych, stało się dużym problemem w badaniach. Po pierwsze, zwierzęta mają trudności z wykonywaniem poleceń i napinaniem mięśni zgodnie z wymaganiami. Po drugie, zwierzęciu trudno jest utrzymać stabilną pozycję pod oporem, a cel izometrycznego skurczu mięśni nie może zostać osiągnięty. Pozwalając zwierzętom trenować zgodnie z wymaganiami, ważne jest, aby rozwiązać problemy związane z dobrostanem zwierząt, takie jak łagodzenie stresu i niepokoju, minimalizowanie bólu i poprawa ogólnych warunków. Protokół ten odnosi się do statycznego modelu treningowego dla szczurów^8,9, a tutaj wprowadzamy proste urządzenie do statycznego szkolenia myszy. Kiedy tylne nogi myszy są podnoszone, ich mięśnie brzucha kurczą się z powodu odruchu prostowania, przednie łapy chwytają poprzeczkę z przodu, a następnie przednie i tylne kończyny kurczą się wbrew grawitacji. Myszy nie mogą się poruszać po uchwyceniu krótkiego pręta, co powoduje, że ich mięśnie są w stanie skurczu izometrycznego.

Protocol

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Nankinie (pozwolenie nr 202209A033). Wybrano zdrowych samców myszy C57BL/6J z oceną SPF, w wieku 8 tygodni i masą ciała 20 ± 4 g. Myszy trzymano w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność w temperaturze 20-22 °C, a wilgotność względna była utrzymywana na poziomie 45%-50%. Zwierzęta jedzą i piją swobodnie.

1. Stworzenie mysiego modelu T2DM

1. Najpierw karm myszy przez 1 tydzień regularną dietą i pozwól myszom przystosować się do nowego środowiska centrum dla zwierząt. Po 1 tygodniu należy wprowadzić dietę wysokotłuszczową (skład diety: 20,0% smalcu, 10,0% sacharozy, 2,5% cholesterolu, 1,0% cholanu, 66,5% diety konwencjonalnej) przez okres 4 tygodni.
2. Od 1 dnia 5 tygodnia myszom należy wstrzykiwać dootrzewnowo roztwór streptozotocyny w dawce 35 mg/kg mc. każdego dnia przez 3 kolejne dni. Przygotować 1 ml roztworu streptozotocyny z 10 mg streptozotocyny w proszku, z 0,1 M/l buforem cytrynianu sodu jako rozpuszczalnikiem.
   UWAGA: Wstrzyknięcie należy wykonać w ciągu 30 minut po przygotowaniu roztworu, a roztwór należy przechowywać z dala od światła podczas stosowania.
3. Losowo oznacz poziom glukozy we krwi w 5. i 7. dniu po podaniu pierwszego wstrzyknięcia roztworu streptozotocyny. Zwierzęta z dwoma losowymi poziomami cukru we krwi wyższymi niż 16,7 mM/L są uważane za udane modele T2DM.
4. Rozpocznij interwencję treningową w 8 dniu po pierwszym wstrzyknięciu roztworu streptozotocyny.

2. Grupowanie i leczenie u myszy

1. Podziel myszy z cukrzycą typu 2 na grupę modelową, grupę treningową i grupę metforminy za pomocą metody tabeli liczb losowych, po 6 myszy w każdej grupie.
2. Nie wykonuj żadnej interwencji dla grupy modelowej.
3. Tabletki metforminy należy zmielić na proszek i rozpuścić w czystej wodzie. Grupie przyjmującej metforminę należy podawać przez zgłębnik w dawce 200 mg/kg mc., raz na dobę, przez 3 tygodnie.
4. Pozwól grupie treningowej wykonać 30 minut statycznego treningu siłowego, raz dziennie, 5 dni w tygodniu, przez 3 tygodnie. Szkolenia odbywają się od poniedziałku do piątku po południu.
5. Losowo przypisz 6 myszy innych niż T2DM jako grupę kontrolną. Myszy te nie są poddawane modelowaniu i interwencji.

3. Produkcja urządzenia do treningu siły statycznej

1. Przygotuj przezroczystą tablicę akrylową o grubości 5 mm i wymiarach 20 cm x 20 cm. Użyj przezroczystej tablicy, aby obserwować trening myszy.
2. Zaopatrz się w drewniane patyczki o średnicy 3 mm i rolkę taśmy o szerokości 1 cm. Za pomocą noża do papieru wytnij dwa patyczki o długości 4 cm i cztery patyczki o długości 1 cm.
3. Przymocuj dwa patyczki, każdy o długości 1 cm, do końców kija o długości 4 cm za pomocą taśmy (Rysunek 1A). Krótkie kije powinny być zamocowane po tej samej stronie co długi kij.
4. Umieść przezroczystą tablicę na płaskiej powierzchni i przymocuj dwa zestawy krótkich patyczków o długości 1 cm do płytki za pomocą gorącego pistoletu do klejenia. Upewnij się, że drewniane patyczki o średnicy 4 cm nie stykają się z deską. Pozostaw 2 cm odstęp między długim kijem a deską, aby utrzymać myszy na miejscu (Rysunek 1B). Niech dwa długie kije będą wyrównane i równoległe, w odległości 6 cm między nimi (Rysunek 1C).

Rysunek 1: Złóż i przymocuj patyczki do przezroczystej tablicy. (A) Przyklej 1 cm kij do obu końców 4 cm patyczka. (B) Użyj kleju topliwego, aby połączyć patyczek o długości 1 cm i przezroczystą płytę, a długość szczeliny wynosi 2 cm. (C) Dwa patyczki o długości 4 cm oddalone od siebie o 6 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Statyczny trening siłowy u myszy

1. Wytnij dwa kawałki przędzy wełnianej o długości 15 cm. Użyj węzła ślizgowego, aby zawiązać kawałek wełnianej przędzy na każdej z górnych kostek myszy (Rysunek 2A).
   UWAGA: Elastyczna lina nie może ustalić postawy myszy, a lina konopna będzie nosić kostki myszy, dlatego wybiera się tutaj nieelastyczną, ale miękką przędzę wełnianą.
2. Ułóż planszę poziomo na stole patykami do góry. Ostrożnie wciśnij mysz między dwa długie drążki, ustawiając jej głowę i ogon tak, aby wyrównały się ze szczelinami pod drążkami.
3. Przełóż przędzę przez szczelinę na końcu ogona. Następnie dopasuj przędzę, aż kostki myszy będą ściśle przylegać do krawędzi kija.
4. Zabezpiecz przędzę wełnianą taśmą (Rysunek 2B). Koniec przędzy wełnianej powinien być zabezpieczony, w przeciwnym razie mysz będzie wspinać się po opadłej wełnie. Pociągnij wełnę tak mocno, jak to możliwe, w przeciwnym razie mysz łatwo się uwolni.
5. Odwróć przezroczystą tablicę. Zdobądź 2 pudełka o tej samej wysokości (15-20 cm wysokości) na obu końcach przezroczystej planszy. Umieść deskę poziomo na określonej wysokości. Pole znajduje się na obu końcach głowy i ogona myszy. Jeśli jest zbyt wysoka, eksperymentator nie będzie w stanie łatwo sobie z nią poradzić; Jeśli jest zbyt nisko, mysz może dotknąć blatu.
6. Gdy plansza zostanie przewrócona, mysz wisi do góry nogami. Ze względu na odruch prostowania myszy zwijają brzuch i wysuwają kończyny przednie, aby chwycić tylne kończyny lub kije. Na tym etapie umieść kij o długości 20 cm przed myszą i ostrożnie poprowadź go, aby chwycił kij przednimi kończynami. Powtarzaj ten proces, aż mysz nabierze wprawy w chwytaniu ruchomego drążka.
7. Użyj patyczka, aby przesunąć przednią kończynę myszy na kolejny 4 cm drążek na przezroczystej tablicy. Stale reguluj kąt drążka, aby umożliwić myszom aktywne chwytanie nieruchomego drążka o długości 4 cm na tablicy ( Rysunek 2C).
8. Powtórz poprzedni krok, gdy mysz zwalnia przednią łapę, aż mysz się wyczerpie. Po 30 minutach większość szczurów nie była w stanie podnieść górnej części ciała i chwycić kija przednimi kończynami.
   UWAGA: Przed wdrożeniem interwencji konieczne jest tygodniowe szkolenie habituacyjne na myszach. Początkowy czas trwania treningu wynosi 10 minut dziennie, a następnie należy go zwiększać o 5 minut każdego dnia, aż do osiągnięcia łącznej liczby 30 minut dziennie.
9. Po 30 minutach treningu natychmiast zwolnij mysz i rozplątaj wełnę, aby zapobiec zaczerwienieniu i obrzękowi stóp spowodowanemu długotrwałym wiązaniem.
   1. Jeśli po treningu na kostce myszy pojawią się zmiany skórne, przerwij szkolenie myszy i zasięgnij profesjonalnej opieki weterynaryjnej, dopóki kostka nie będzie zdrowa.
   2. Niektórym myszom może od czasu do czasu udawało się uwolnić poprzez intensywną walkę podczas treningu. Myszy walczą, gdy ich tylne nogi nie są mocno zamocowane. Aby uniknąć kontuzji spowodowanych walką, obserwuj myszy przez cały trening. Kiedy okaże się, że tylne kończyny nie są mocno zamocowane lub myszy zaczynają się szarpać, poluzuj myszy i ponownie napraw.
      UWAGA: Poprzednie eksperymenty wykazały, że wieszanie myszy do góry nogami przez 30 minut dziennie, 5 dni w tygodniu, nie powoduje zużycia kostek, pod warunkiem, że zostaną one uwolnione w odpowiednim czasie¹⁰. Myszy mogą nauczyć się i przyzwyczaić do treningu w ciągu 1-3 sesji.

Rysunek 2: Metoda utrwalania w myszy. (A) Zawiąż górną część kostki węzłem. (B) Koniec liny przechodzi przez szczelinę i mocno naciąga, a następnie zabezpiecza taśmą. (C) Statyczny trening siłowy u myszy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Results

Zgodnie z powyższym protokołem, tylne kończyny myszy są nieruchome, a przednie autonomicznie chwytają przednią belkę. Wąski zakres ruchu utrzymuje mysz w stosunkowo stałej pozycji. Mięśnie myszy można potwierdzić kurczenie się, dotykając mięśni ich brzucha i nóg. Jest to zgodne z potrzebą wystąpienia stanu izometrycznego skurczu mięśni w statycznym treningu siłowym. Szkolenie myszy zgodnie z protokołem, wraz ze wzrostem czasu treningu, pomoże myszom przystosować się do treningu, jednocześnie zmniejszając ich chęć do walki. Walki o ucieczkę można uniknąć.

Wpływ na poziom glukozy i insuliny we krwi u myszy z cukrzycą typu 2DM
W sumie 24 myszy C57BL / 6J zostały losowo podzielone na grupę kontrolną (n = 6) i grupę modelu T2DM (n = 18). Myszy z cukrzycą typu 2 zostały następnie losowo podzielone na grupę modelową, grupę treningową i grupę metforminy. Nie przeprowadzono żadnego modelowania ani interwencji w grupie kontrolnej, a myszom w grupie modelowej nie podano żadnej interwencji. Myszy w grupie treningowej otrzymały 30 minut statycznego treningu siłowego raz dziennie, 5 dni w tygodniu przez 3 tygodnie. Myszom w grupie przyjmującej metforminę podawano metforminę w dawce 200 mg/kg mc. raz na dobę przez 3 tygodnie. Wyniki pomiaru stężenia glukozy we krwi na czczo (FBG) po 3 tygodniach interwencji przedstawiono na rysunku Rysunek 3A. Jak widać na rysunku, poziomy FBG u myszy z modelem T2DM były znacznie wyższe niż u myszy kontrolnych. Myszy wyszkolone w treningu statycznym wykazały znacznie niższy poziom FBG w porównaniu z grupą modelową, co sugeruje, że trening statyczny jest skuteczny w zmniejszaniu FBG u myszy z cukrzycą typu 2. Poziomy insuliny w surowicy na czczo (FINS) w grupie modelowej były znacznie niższe niż w grupie kontrolnej, jak pokazano na Rycina 3B. W grupie treningowej i grupy metforminy poziomy FINS wzrosły w porównaniu z grupą modelową. W Rysunek 3C, myszy w grupie modelowej miały znacznie wyższy wskaźnik insulinooporności (HOMA-IR) niż te w grupie kontrolnej, podczas gdy HOMA-IR w grupie treningu statycznego i metforminy był znacznie niższy niż w grupie modelowej, co pokazuje ich skuteczność w łagodzeniu stanu insulinooporności myszy z T2DM. Wyniki te pokazują, że strategia treningu siły statycznej zapewniana przez ten schemat ma podobne działanie do metforminy w regulacji poziomu glukozy we krwi myszy z cukrzycą typu 2.

Rysunek 3: Poziom cukru we krwi i insuliny. (A) Porównanie poziomu glukozy we krwi na czczo u myszy z cukrzycą typu 2 po 3 tygodniach interwencji. * p <0,05 w porównaniu z grupą kontrolną, # p <0,05 w porównaniu z grupą modelową. (B) Porównanie poziomów insuliny w surowicy na czczo u myszy z cukrzycą typu 2 po 3 tygodniach interwencji. * p <0,05 w porównaniu z grupą kontrolną, # p <0,05 w porównaniu z grupą modelową. (C) Porównanie wskaźnika insulinooporności u myszy z cukrzycą typu 2 po 3 tygodniach interwencji. * p <0,05 w porównaniu z grupą kontrolną, # p <0,05 w porównaniu z grupą modelową. Do analizy statystycznej przeprowadzono jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA). Dane ilościowe są wyrażone jako średnia ± SEM (n=6). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wpływ na mięśnie szkieletowe u myszy z T2DM
Mięsień brzuchaty łydki myszy obserwowano za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. W porównaniu z myszami kontrolnymi, miocyty mięśni szkieletowych myszy z T2DM były zdegenerowane, struktura miofibryli była luźna, a układ sarkomerowy był nieregularny (Figura 4A, B). Po treningu statycznym opisanym w protokole, Rysunek 4C pokazuje ścisłą strukturę włókien miogennych w strukturze mięśniowej oraz symetryczne ułożenie lokalnych segmentów mięśniowych. Sugeruje to, że statyczny trening siłowy może regulować morfologię mięśni szkieletowych u myszy z cukrzycą typu 2. Z drugiej strony, w mięśniu brzuchatym łydki myszy kontrolnych mitochondria były lokalnie rozmieszczone, z nienaruszonymi błonami i lokalnie podzielonymi lub połączonymi mitochondriami (oznaczonymi czerwonymi strzałkami). Podobnie w mięśniach szkieletowych myszy po statycznym treningu siłowym liczba mitochondriów jest normalna; Niektóre z nich są oczywiście połączone lub podzielone (czerwona strzałka). Z kolei w modelu T2DM u myszy liczba mitochondriów jest mniejsza, a aktywność jest niska. (Zobacz Rysunek 4) Sugeruje to, że statyczny trening siłowy może wpływać na funkcję i aktywność mitochondriów w komórkach mięśni szkieletowych.

Rysunek 4: Wpływ treningu statycznego na mięśnie szkieletowe myszy z cukrzycą typu 2. (A) Grupa kontrolna; B) grupa modeli T2DM; (C) Statyczna grupa szkoleniowa. M reprezentuje mitochondria. Białe paski skali reprezentują 50 μm, a czerwone paski skali reprezentują 10 μm. Dolny obraz jest częściowym powiększeniem górnego obrazu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Statyczny trening siłowy może zmniejszyć akumulację tłuszczu, wspomóc utratę wagi i zwiększyć metabolizm⁸. Ponadto zwiększa ekspresję PGC-1α i biogenezę mitochondriów w komórkach mięśni szkieletowych, co prowadzi do poprawy metabolizmu glukozy u myszy z cukrzycą typu 2, a w konsekwencji do obniżenia poziomu glukozy we krwi¹¹. Aby potwierdzić wpływ i mechanizm treningu statycznego na cukrzycę typu 2, należy opracować odpowiednie urządzenia do przeprowadzania treningu statycznego na zwierzętach doświadczalnych.

Protokół ten wprowadza urządzenie do statycznego treningu u myszy. Wymagany sprzęt, taki jak płyty akrylowe, patyczki, przędza wełniana i pistolety do klejenia na gorąco, jest łatwo dostępny, a metoda produkcji jest prosta i łatwa. Może to skutecznie obniżyć koszt eksperymentu oraz zwiększyć jego wykonalność i powtarzalność. Utrzymanie stałej pozycji myszy podczas treningu może być wyzwaniem podczas projektowania statycznego urządzenia treningowego. W tym protokole stopy myszy można przymocować do przedniej części małego patyczka, napinając miękką wełnę. Odruch prostowania powoduje, że mysz wygina górną część ciała do góry, umożliwiając jej w ten sposób uchwycenie drążka z przodu przednimi łapami. Drążek jest krótki, co ogranicza zakres ruchu dla łap przednich. Po dwóch lub trzech sesjach treningu adaptacyjnego myszy były w stanie utrzymać stabilną postawę. Ze względu na ograniczoną wytrzymałość przednich łap myszy często tracą przyczepność do poprzeczki. Konieczne jest, aby eksperymentatorzy monitorowali myszy przez cały czas, aby pomóc im w chwytaniu poprzeczki przednimi kończynami i zapobieganiu przypadkowym obrażeniom myszy. Dzięki treningowi myszy mogą utrzymać stałą pozycję przez 1-2 minuty na raz, powtarzaną kilka razy, przez około 30 minut po wyczerpaniu. Po wyczerpaniu myszy nie kręciły już brzuchami ani nie podnosiły przednich nóg. Kiedy mysz była prowadzona przez kij, aby chwycić ją przednimi łapami, mysz mogła chwycić, ale jej górna część ciała nie była w stanie obrócić się do góry. Rozwiąż węzeł tak szybko, jak to możliwe po uśpieniu myszy, które mogą skutecznie uniknąć obrzęku kostki i zużycia.

Wstępne eksperymenty wskazują, że po okresie treningu statycznego poziom glukozy we krwi myszy z cukrzycą typu 2 znacznie się obniżył w porównaniu z grupą kontrolną myszy modelowych. Mięśnie szkieletowe są kluczowym składnikiem obwodowego metabolizmu glukozy i są niezbędne do utrzymania homeostazy glukozy we krwi¹². Analizy mikroskopii elektronowej wykazały, że w komórkach mięśnia brzuchatego łydki myszy z T2DM wystąpiła poważna degeneracja, podczas gdy stwierdzono, że trening statyczny łagodzi degenerację tkanki mięśniowej. Wyniki te sugerują, że trening statyczny może być zaangażowany w regulację funkcji mięśni szkieletowych. Badania wykazały, że na utrzymanie funkcji mięśni szkieletowych znaczący wpływ ma dynamika mitochondriów¹³. Zaobserwowaliśmy wyraźne zmniejszenie liczby mitochondriów i brak aktywności mitochondrialnej w komórkach mięśniowych brzuchatego łydki w grupie myszy T2DM w porównaniu z dzikimi myszami i myszami ćwiczącymi statycznie. Odkrycia te sugerują, że trening statyczny może promować funkcję mięśni szkieletowych poprzez poprawę funkcji mitochondriów w komórkach mięśni szkieletowych. Na podstawie powyższych wyników eksperymentalnych można stwierdzić, że trening statyczny może znacznie poprawić metabolizm glukozy i insuliny we krwi u myszy z cukrzycą typu 2. Mechanizm interwencji może być związany z regulacją funkcji mitochondriów mięśni szkieletowych poprzez trening statyczny.

Ten protokół ma pewne ograniczenia. Początkowo istniały trudności w indywidualnym wiązaniu tylnych kończyn myszy przez jedną osobę, ponieważ wymagało to od jednej osoby chwytania tylnych nóg, podczas gdy inna wykonywała wiązanie. Po kilku poprawkach i zwiększeniu umiejętności ze strony eksperymentatora, myszy stały się bardziej przyjazne. Pozwalało to na niezależne wiązanie tylnych nóg. Dodatkowo miękka wełna może zmniejszyć siniaki na kostkach myszy.

Podsumowując, protokół ten zapewnia prostą metodę tworzenia statycznego sprzętu treningowego dla myszy. Podobnie, prosty statyczny sprzęt treningowy dla szczurów można wykonać, zwiększając rozmiar desek i patyków. Urządzenie może utrzymać izometryczny skurcz mięśni kończyn myszy, aby zweryfikować interwencyjny wpływ tradycyjnych chińskich ćwiczeń na cukrzycę typu 2 i zapewnić nową perspektywę klinicznego leczenia cukrzycy typu 2.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tablice akrylowe			Przezroczyste tablice akrylowe o grubości 5mm. Rozmiar powinien być większy niż 20 cm i razy; Pudełka 20 cm
	Dwa pudełka o tej samej wysokości (15 ~ 20 cm)
			Brak specjalnych wymagań
Kije			Kilka drewnianych patyczków o średnicy 3 mm
Streptozotocyna		Sigma	S0130
Brak			specjalnych wymagań
Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM)		HT7700	HITACHI