Wykorzystanie obrazowania STED na żywych komórkach do wizualizacji ultrastruktury wewnętrznej błony mitochondrialnej w modelach komórek neuronalnych

Mitochondria to organelle eukariotyczne pochodzenia endosymbiotycznego, które są odpowiedzialne za regulację kilku kluczowych procesów komórkowych, w tym pośredniego metabolizmu i produkcji ATP, homeostazy jonów, biosyntezy lipidów i programowanej śmierci komórki (apoptozy). Te organelle są topologicznie złożone, zawierają system podwójnej błony, który tworzy wiele podkompartmentów¹ (Rysunek 1A). Zewnętrzna błona mitochondrialna (OMM) łączy się z cytozolem i ustanawia bezpośrednie kontakty między organellami^2,3. Wewnętrzna błona mitochondrialna (IMM) jest membraną oszczędzającą energię, która utrzymuje gradienty jonów przechowywane głównie jako elektryczny potencjał błonowy (ΔΨ_m) w celu napędzania syntezy ATP i innych procesów wymagających energii^4,5. IMM jest dalej podzielony na wewnętrzną błonę graniczną (IBM), która jest ściśle przylegająca do OMM, oraz wystające struktury zwane cristae, które są połączone błoną cristae (CM). Błona ta wyznacza najbardziej wewnętrzny przedział macierzy od przestrzeni wewnątrzkrystalicznej (ICS) i przestrzeni międzybłonowej (IMS).

Mitochondria mają dynamiczną morfologię opartą na ciągłych i zrównoważonych procesach rozszczepienia i fuzji, które są zarządzane przez mechanoenzymy nadrodziny dynamin⁶. Fuzja pozwala na zwiększenie łączności i tworzenie sieci siatkowatych, podczas gdy rozszczepienie prowadzi do fragmentacji mitochondriów i umożliwia usunięcie uszkodzonych mitochondriów przez mitofagię⁷. Morfologia mitochondriów różni się w zależności od typu tkanki⁸ i etapu rozwoju⁹ i jest regulowana, aby umożliwić komórkom dostosowanie się do czynników, w tym potrzeb energetycznych^10,11 i stressors¹². Standardowe cechy morfometryczne mitochondriów, takie jak zakres tworzenia sieci (połączone ze sobą vs. fragmentaryczne), obwód, obszar, objętość, długość (współczynnik proporcji), okrągłość i stopień rozgałęzienia, można zmierzyć i określić ilościowo za pomocą standardowej mikroskopii optycznej, ponieważ rozmiary tych cech są większe niż granica dyfrakcji światła (~200 nm)13.

Architektura Cristae definiuje wewnętrzną strukturę mitochondriów (Rysunek 1B). Różnorodność morfologii cristae można ogólnie podzielić na płaską (blaszkowatą lub dyskoidalną) lub rurkowo-pęcherzykową¹⁴. Wszystkie cristae łączą się w IBM za pomocą rurowych lub szczelinowych struktur zwanych połączeniami cristae (CJ), które mogą służyć do podziału IMS na ICS i IBM na CM¹⁵. Morfologia Cristae jest regulowana przez kluczowe kompleksy białkowe IMM, w tym (1) mitochondrialne miejsce kontaktu i system organizacji grzebiaków (MICOS), który znajduje się w CJ i stabilizuje kontakty IMM-OMM¹⁶, (2) GTPaza atrofii nerwu wzrokowego 1 (OPA1), która reguluje przebudowę cristae^17,18,19, oraz (3) F_{1F O} Syntaza ATP, która tworzy stabilizujące zespoły oligomeryczne na końcach cristae (CT)^20,21. Ponadto IMM jest wzbogacony w niedwuwarstwowe fosfolipidy fosfatydyloetanoloaminę i kardiolipinę, które stabilizują wysoce zakrzywiony IMM²². Cristae są również dynamiczne, wykazując zmiany morfologiczne w różnych warunkach, takich jak różne stany metaboliczne^23,24, z różnymi podłożami oddechowymi²⁵, w warunkach głodu i stresu oksydacyjnego^26,27, z apoptozą^28,29, oraz z starzeniem się³⁰. Ostatnio wykazano, że cristae mogą przechodzić poważne wydarzenia związane z przebudową w skali sekund, co podkreśla ich dynamiczną naturę³¹. Można określić ilościowo kilka cech cristae, w tym wymiary struktur w poszczególnych cristae (np. szerokość CJ, długość i szerokość cristae) oraz parametry, które wiążą poszczególne cristae z innymi strukturami (np. odstępy wewnątrz cristae i kąt padania cristae względem OMM)³². Te kwantyfikowalne parametry cristae wykazują bezpośrednią korelację z funkcją. Na przykład zakres produkcji ATP w mitochondriach jest dodatnio związany z obfitością cristae, określaną ilościowo jako gęstość cristae lub liczba cristae znormalizowana do innej cechy (np. cristae na obszar OMM)^33,34,35. Ponieważ morfologia IMM jest definiowana przez cechy w nanoskali, obejmuje ultrastrukturę mitochondriów, która wymaga technik obrazowania zapewniających rozdzielczość większą niż granica dyfrakcji światła. Jak opisano poniżej, takie techniki obejmują mikroskopię elektronową i mikroskopię superrozdzielczą (nanoskopię).

Komórki nerwowe i glejowe ośrodkowego układu nerwowego (OUN) są szczególnie zależne od funkcji mitochondriów. Średnio mózg stanowi tylko 2% całkowitej masy ciała, ale wykorzystuje 25% całkowitego stężenia glukozy w organizmie i odpowiada za 20% zużycia tlenu przez organizm, co czyni go podatnym na zaburzenia metabolizmu energetycznego³⁶. Postępujące choroby neurodegeneracyjne (ND), w tym choroba Alzheimera (AD), stwardnienie zanikowe boczne (ALS), choroba Huntingtona (HD), stwardnienie rozsiane (SM) i choroba Parkinsona (PD), są jednymi z najszerzej badanych patologii do tej pory, a wysiłki badawcze obejmują zrozumienie molekularnych podstaw tych chorób po poszukiwanie potencjalnej profilaktyki i interwencji terapeutycznych. ND są związane ze zwiększonym stresem oksydacyjnym pochodzącym częściowo z reaktywnych form tlenu (ROS) generowanych przez mitochondrialny łańcuch transportu elektronów (ETC)³⁷, a także ze zmienionym mitochondrialnym przetwarzaniem wapnia³⁸ i mitochondrialnym metabolizmem lipidów³⁹. Tym fizjologicznym zmianom towarzyszą zauważone defekty w morfologii mitochondriów, które są związane z AD^{40,41,42,43,44}, ALS^45,46, HD^47,48,49, MS⁵⁰, oraz PD^51,52,53. Te wady strukturalne i funkcjonalne mogą być sprzężone złożonymi relacjami przyczynowo-skutkowymi. Na przykład, biorąc pod uwagę, że morfologia cristae stabilizuje enzymy OXPHOS⁵⁴, mitochondrialne ROS są nie tylko generowane przez ETC, ale także działają w celu uszkodzenia infrastruktury, w której znajduje się ETC, promując cykl ROS, który zwiększa podatność na uszkodzenia oksydacyjne. Ponadto wykazano, że dezorganizacja cristae uruchamia procesy, takie jak uwalnianie mitochondrialnego DNA (mtDNA) i szlaki zapalne związane z zaburzeniami autoimmunologicznymi, metabolicznymi i związanymi z wiekiem⁵⁵. Dlatego analiza struktury mitochondriów jest kluczem do pełnego zrozumienia ND i ich molekularnych podstaw.

Popularne metody przeglądania cristae, w tym transmisyjna mikroskopia elektronowa, tomografia elektronowa i krioelektronowa tomografia (cryo-ET), oraz tomografia rentgenowska, w szczególności kriomiękka tomografia rentgenowska, ujawniły ważne odkrycia i działają z różnymi typami próbek^{56,57,58,59,60}. Pomimo ostatnich postępów w kierunku lepszej obserwacji ultrastruktury organelli, metody te nadal wiążą się z zastrzeżeniem polegającym na wymaganiu utrwalenia próbki, a zatem nie mogą bezpośrednio uchwycić dynamiki grzebieniaków w czasie rzeczywistym. Mikroskopia fluorescencyjna o wysokiej rozdzielczości, szczególnie w postaci mikroskopii oświetlenia strukturalnego (SIM), stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (STORM), mikroskopii lokalizacji aktywowanej fotoaktywem (PALM), mikroskopii ekspansyjnej (ExM) i mikroskopii wymuszonego zubożenia emisji (STED), stały się popularnymi sposobami oglądania struktur wymagających rozdzielczości poniżej granicy dyfrakcji, która ogranicza klasyczne metody mikroskopii optycznej. Gdy ExM jest używany w połączeniu z inną techniką super-rozdzielczości, wyniki są imponujące, ale próbka musi być utrwalona i wybarwiona w gel⁶¹. Dla porównania, SIM, PALM/STORM i STED zostały z powodzeniem wykorzystane w przypadku żywych próbek, a nowe i obiecujące barwniki, które zazwyczaj barwią IMM, zapewniają nowatorskie i łatwe podejście do obrazowania na żywo dynamiki mitochondriów grzebienia^{62,63,64,65,66}. Ostatnie postępy w dziedzinie żywych barwników do obrazowania chorób przenoszonych drogą płciową poprawiły jasność i fotostabilność barwnika, a barwniki te są ukierunkowane na IMM z wyższym stopniem swoistości niż ich poprzednicy. Osiągnięcia te pozwalają na gromadzenie długoterminowych eksperymentów poklatkowych i z-stack z obrazowaniem w superrozdzielczości, otwierając drzwi do lepszej analizy ultrastruktury i dynamiki mitochondriów na żywo w komórkach.

Tutaj, dostępne są protokoły obrazowania żywych komórek niezróżnicowanych i zróżnicowanych komórek SH-SY5Y barwionych barwnikiem PKmito Orange (PKMO) przy użyciu STED⁶³. Linia komórkowa SH-SY5Y jest trzykrotnie subklonowaną pochodną macierzystej linii komórkowej SK-N-SH, wygenerowaną z biopsji szpiku kostnego nerwiaka zarodkowego z przerzutami^67,68,69,70. Ta linia komórkowa jest powszechnie stosowanym modelem in vitro w badaniach ND, szczególnie w chorobach takich jak AD, HD i PD, w których dysfunkcja mitochondriów jest silnie zaangażowana^{10,43,71,72,73}. Zdolność do różnicowania komórek SH-SY5Y w komórki o fenotypie neuronalnym poprzez manipulowanie pożywkami hodowlanymi okazała się odpowiednim modelem do badań neurobiologicznych bez polegania na pierwotnych komórkach neuronalnych^10,74. W tym protokole kwas retinowy (RA) dodano do pożywki do hodowli komórkowej w celu wywołania różnicowania komórek SH-SY5Y. RZS jest pochodną witaminy A i wykazano, że reguluje cykl komórkowy i promuje ekspresję czynników transkrypcyjnych, które regulują różnicowanie neuronów⁷⁵. Dostępny jest również protokół hodowli i obrazowania żywych komórek neuronów wyizolowanych z hipokampa szczura. Wykazano, że hipokamp jest dotknięty zwyrodnieniem mitochondriów i wraz z korą odgrywa ważną rolę w starzeniu się i ND^{76,77,78,79,80}.

1. Propagacja i różnicowanie komórek SH-SY5Y

1. Przygotowanie pożywki do wzrostu i utrzymania komórek
   1. Przygotuj kompletne, wysokoglukozowe zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle's Medium (DMEM, 4,5 g/L D-glukozy, 4 mM L-glutamina, 110 mg/L pirogronian sodu) uzupełnione końcowym 1% (v/v) antybiotyko-przeciwgrzybiczym (10 000 jednostek/ml penicyliny, 10 000 μg/ml streptomycyny i 25 μg/ml amfoterycyny B) oraz różnymi ilościami płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (patrz Tabela materiałów). Ilości FBS w pożywkach różnicujących wahają się między końcowymi 10%, 5% lub 2% (v/v) FBS.
2. Konserwacja komórek
   1. Utrzymuj komórki w DMEM uzupełnione 10% (v/v) FBS i umieść je w temperaturze 37 °C i 5% CO₂, a następnie wysiewaj w DMEM zawierającym 5% (v / v) FBS w celu różnicowania. Zamrożone zapasy komórek przechowywano w FBS z 10% (v/v) dimetylosulfotlenkiem (DMSO) w ilości 1-2 x 10⁷ komórek/ml.
3. Preparat kwasu retinowego (RZS)
   1. Rozpuścić 7,51 mg all-trans-RA (patrz tabela materiałów) w 5 ml świeżo przygotowanego 95% etanolu, aby otrzymać 5 mM roztwór podstawowy. Sprawdzić stężenie z absorbancją przy 350 nm (ɛ = 44,300 ^{M-1 cm-1}), uzyskane z karty informacyjnej produktu z protokołu producenta⁸¹, stosując rozcieńczenie roztworu podstawowego w etanolu o stężeniu 5 μM. Przechowywać 5 mM zapasu w chronionym przed światłem w temperaturze 4 °C przez okres do 6 tygodni.
4. Przygotowanie poli-D-lizyny do powlekania szkieł nakrywkowych
   UWAGA: Protokół produktu z poli-D-lizyny (PDL), który można znaleźć w sekcji Dokumenty i pliki do pobrania na stronie dostawcy⁸², zawiera informacje na temat powlekania różnych naczyń hodowlanych.
   1. Protokół ten obejmuje objętości oparte na naczyniu z 2-dołkową komorą o powierzchni 4^cm2 na studzienkę ze sterylnym dnem ze szkła borokrzemianowego #1,5 (patrz Tabela Materiałów). Rozcieńczyć roztwór podstawowy PDL dwukrotnie do 50 μg/ml PBS firmy Dulbecco (DPBS; bez wapnia, bez magnezu).
      UWAGA: Szkło nakrywkowe #1.5 lub #1.5H to dopuszczalne grubości, które mają zasadnicze znaczenie dla jakości obrazu. Inne grubości wywołują aberrację sferyczną i należy ich unikać.
5. Powłoka szkiełka nakrywkowego z PDL
   UWAGA: Szkiełka nakrywkowe można wystawić na działanie światła ultrafioletowego (UV) przez 10-15 minut w komorze bezpieczeństwa biologicznego w celu dalszej sterylizacji.
   1. Nałożyć 1,2 ml 50 μg/ml roztworu PDL do każdego dołka sterylnych szkiełek nakrywkowych w komorze do hodowli komórkowych i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Usunąć roztwór PDL i spłukać trzykrotnie 3,6 ml wody destylowanej. Po zakończeniu mycia końcowego pozostaw powlekaną komorę do wyschnięcia na 2 godziny wystawioną na działanie powietrza przed spłukaniem i natychmiastowym użyciem lub przechowywaniem w hermetycznym pojemniku w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
      UWAGA: Dokładnie spłucz szkiełka nakrywkowe, ponieważ nadmiar PDL może być toksyczny dla komórek.
6. Różnicowanie komórek SH-SY5Y z RA
   UWAGA: Nie używaj komórek powyżej przejścia 15. Komórki są pasażowane przy 80%-90% zbieganiu. Procedury różnicowania różnią się, ale przebiegają w podobny sposób. Dodatkowe różnicowanie od nerwiaków zarodkowych do dojrzałych neuronów uzyskuje się przy dalszym leczeniu czynnikiem neurotroficznym pochodzenia mózgowego (BDNF)^68,83,84,85, ale nie zostało wykonane w tym protokole.
   OPCJONALNIE: Założyć komórki na co najmniej 24 godziny przed wysiewem na szkle nakrywkowym. Aby przygotować komórki z zamrożonych zapasów, szybko rozmrozić 1 ml zamrożonej fiolki z komórkami i dodać do 9 ml wstępnie podgrzanej pożywki uzupełnionej 10% FBS, a następnie odwirować w temperaturze 350 x g przez 10 minut (w temperaturze pokojowej) i wyrzucić supernatant w celu usunięcia DMSO. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki i komórek nasiennych w kolbie T-25. Gdy komórki osiągną zbieżność 80%-90%, przechodź komórki, licząc je i zasiewając w celu różnicowania, jeśli ma to zastosowanie.
   1. Dzień 0: Komórki nasienne.
      1. Wysiać komórki na komorowym szkle nakrywkowym z zamrożonych zapasów lub kolby roboczej. Użyj gęstości wysiewu 1,5 x 10⁴ komórki/cm²,
         UWAGA: Pojedyncza studzienka w standardowym 2-dołkowym komorowym szkle nakrywkowym o powierzchni hodowli 4^cm2 będzie wymagała^6,0 x 10 4 komórek. Komórki, które pozostaną niezróżnicowane, powinny zostać wysiane DMEM uzupełnionym 10% (v/v) FBS, a komórki, które będą zróżnicowane, powinny zostać wysiane DMEM uzupełnionym 5% (v/v) FBS.
   2. Dzień 1: Rozpocznij leczenie różnicowania RZS.
      1. Przygotować DMEM uzupełniony 5% (v/v) FBS, 1% (v/v) antybiotyk-antybiotyk przeciwgrzybiczy i końcowe stężenie 10 μM RA lub etanolu o tej samej objętości dodatku, aby służyć jako kontrola nośnika dla tej procedury różnicowania. Usuń pożywkę z komorowego szkła nakrywkowego używanego do wysiewu, spłucz 1x PBS i dodaj nowy DMEM do studzienek.
   3. Dzień 3: Zastąp pożywkę świeżą pożywką zawierającą RZS lub etanol.
      1. Usunąć pożywkę z dnia 1. i zastąpić ją świeżą pożywką uzupełnioną 2% (v/v) FBS, 1% (v/v) antybiotykowo-przeciwgrzybiczym i 10 μM RA lub 95% etanolem o tej samej objętości dodatku, aby służyły jako kontrola nośnika dla tej procedury różnicowania. Usuń pożywkę z komorowego szkła nakrywkowego używanego do wysiewu, spłucz 1x PBS i dodaj nowe podłoże do dołków.
   4. Dzień 6: Wykonaj obrazowanie komórek.
      UWAGA: Czas różnicowania komórek różni się w zależności od protokołu, ale sześć dni ekspozycji na RZS wystarczy, aby wywołać fenotyp podobny do neuronu w komórkach SH-SY5Y⁸⁶.
      1. Wykonaj obrazowanie na żywo, ze szczegółami w sekcjach 3 i 4 (Rysunek 2).

2. Pierwotna hodowla neuronów hipokampa u szczurów

1. Przygotowanie materiałów do izolacji neuronów hipokampa szczura.
   1. Przygotuj świeżo uzupełniony DMEM.
      1. Filtruj i sterylizuj mieszaninę DMEM (wysoka glukoza, bez pirogronianu sodu) uzupełnioną 10% (v/v) inaktywowanym termicznie FBS, 1% (v/v) roztworem pirogronianu sodu i 1% (v/v) penicyliny-streptomycyny (10 000 U/ml). Przechowywać do 2 tygodni w temperaturze 4°C.
   2. Przygotuj świeżo uzupełnioną pożywkę do wzrostu neuronów.
      1. Filtruj i sterylizuj mieszaninę pożywek wzrostu neuronów uzupełnionych 2% (v/v) suplementem B27, 0,25% (v/v) suplementem glutaminy i 1% (v/v) penicyliną-streptomycyną (patrz tabela materiałów). Przechowywać do 2 tygodni w temperaturze 4°C.
2. Przygotuj pierwotną hodowlę neuronów hipokampa.
   1. Przygotuj pierwotną hodowlę neuronów hipokampa zgodnie z wcześniej opublikowanymi pracami⁸⁷ oraz z protokołu produktu na stronie producenta, z którego uzyskano wypreparowany hipokamp szczura E18⁸⁸ (patrz Tabela materiałów). Protokół ten powoduje, że populacja składa się głównie z neuronów z <2% astrocytów.
      UWAGA: Pożywka hibernacyjna, z którą wysyłana jest ta tkanka, będzie używana w przyszłych krokach tego protokołu. Nie wyrzucaj go.
   2. Przygotuj materiały i podłoża do dysocjacji tkanek.
      1. Podpal pipetę Pasteura, aby zmniejszyć średnicę otworu i przechowuj ją w folii, aby zapobiec zanieczyszczeniu do czasu użycia. Podgrzej przygotowany DMEM, 1X buforowany roztwór soli Hanka (HBSS) i pożywkę do wzrostu neuronów do 37 °C. Dodaj 2 płatki DNAazy za pomocą sterylnej pęsety do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
   3. Wykonaj dysocjację tkanek.
      1. Usunąć jak najwięcej hibernowanej pożywki, w której przechowywany jest wypreparowany hipokamp szczura E18 przed umieszczeniem tkanki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej DNAazę i krótką inkubacją w temperaturze 37 °C. Dodać 900 μl 1X HBSS, a następnie 100 μl 0,5% trypsyny. Inkubować tkankę w temperaturze 37 °C przez 15 min.
         UWAGA: Płytki pokryte PDL można wyjąć z magazynu i umieścić w inkubatorze do czasu użycia w tym czasie inkubacji.
   4. Wykonaj homogenizację tkanek i zliczanie komórek.
      1. Po inkubacji z trypsyną usunąć pożywkę i dodać 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki hibernacyjnej DNAazy z poprzedniego etapu do tkanki i homogenizować za pomocą pipety Pasteura. Pożywka będzie wyglądać na nieprzezroczysta, a następnie stopniowo przezroczysta w miarę postępu homogenizacji.
      2. Dodaj zdysocjowane neurony do nowej probówki z 4 ml wstępnie podgrzanego DMEM, a następnie policz komórki za pomocą licznika komórek.
   5. Wykonaj posiewanie komórek i wzrost komórek pierwotnych.
      1. Płytki o gęstości około 1,65 x 10⁴ komórki/^cm2 w DMEM. W przypadku 2-dołkowego szkła nakrywkowego (4 cm²), wysiewaj 65 000 – 70 000 komórek na studzienkę za pomocą 2 ml DMEM. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 2 godziny przed sprawdzeniem przestrzegania zaleceń lekarskich. Gdy komórki zaczną przylegać, usuń 1 ml pożywki i zastąp ją tą samą objętością pożywki hibernacji, a następnie delikatnie wymieszaj, aby wymieszać. Po wymieszaniu pożywki powtórz ten proces i usuń połowę obecnych pożywek i zastąp je taką samą objętością pożywki do wzrostu neuronów, a następnie delikatnie wymieszaj.
         UWAGA: Dzień posiewu jest uważany za dzień in vitro (DIV) 0, a komórki są gotowe do obrazowania w DIV 7 (Rysunek 2).

3. Przygotowanie komórek do obrazowania żywych komórek

UWAGA: Typy i pochodzenie komórek (tj. komórki hodowlane i pierwotne) mogą różnić się wymaganiami dotyczącymi barwienia; zobacz opublikowane raporty, aby uzyskać więcej informacji^62,63.

1. Przygotowanie PKmito Orange
   UWAGA: Inne barwniki, które zazwyczaj zabarwiają IMM, zostały zgłoszone^64,65,66 i są dostępne na rynku. PKMO jest jedynym używanym w tym protokole.
   1. Ponownie zawiesić proszek PKMO (patrz Tabela Materiałów) w DMSO zgodnie z instrukcjami producenta⁸⁹. Odessać pożywkę z komórek i przemyć we wstępnie podgrzanej pożywce wolnej od czerwieni fenolowej. Przygotuj zapas PKMO we wstępnie podgrzanym, wolnym od czerwieni fenolowej DMEM uzupełnionym 2% (v/v) FBS lub 10% (v/v) w zależności od stanu różnicowania, HEPES do końcowego stężenia 20 mM i 1% (v/v) antybiotykowo-przeciwgrzybiczego przed barwieniem komórek zgodnie z instrukcjami producenta. Ten preparat, bez PKMO, jest pożywką do obrazowania żywych komórek.
2. Barwienie komórek za pomocą PKMO
   1. Inkubować komórki z barwnikiem w temperaturze 37 °C i 5% CO 2 przez 30 minut_. Przemyć komórki trzykrotnie pożywką do obrazowania żywych komórek, a do końcowego płukania inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
   2. Dodaj świeże, wstępnie podgrzane nośniki do obrazowania żywych komórek. Komórki są teraz gotowe do obrazowania.
      UWAGA: Ostre leczenie (np. leki i/lub stresory), jeśli jest stosowane, jest dodawane przed obrazowaniem na żywo; patrz sekcja Dyskusja i Rysunek uzupełniający 1.

4. Obrazowanie żywych komórek za pomocą mikroskopii STED

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje system STED zbudowany wokół odwróconego mikroskopu, z systemem określonym w Tabeli Materiałów. System ten wyposażony jest w impulsowe lasery wzbudzające (laser 561 nm o mocy nominalnej ~300 μW) oraz impulsowy laser dezuplikacyjny STED 775 nm (moc nominalna 1,2 W), bezstopniowo regulowany skaner galwanowy oraz detektor fotodiody lawinowej oparty na filtrze 615/20 nm (APD). Zastosowano tutaj soczewkę zanurzeniową 100x/1,40 olejku do STED. Do akwizycji obrazu wykorzystywane jest oprogramowanie lightbox. Wszystkie podane szczegóły są bezpośrednio związane z tym oprogramowaniem i konfiguracją systemu.

1. Ogólne wskazówki i kroki dotyczące obrazowania
   1. Użyj inkubatora lub komory środowiskowej, aby utrzymać żywotność komórek, ale dopuszczalne są również krótkoterminowe eksperymenty w temperaturze pokojowej. Te kroki są specyficzne dla konfiguracji STED opisanej powyżej.
   2. Wybierz zestaw laserów i filtrów do obrazowania.
      1. Użyj parametrów dla barwnika pomarańczowego, wybierając barwnik(i) użyty w barwieniu z listy barwników lub ten, którego właściwości widmowe są najbardziej zbliżone do użytego barwnika(ów). Uaktywnij je, klikając dwukrotnie lub przeciągając je do listy próbek, gdzie jest napisane "Przeciągnij barwniki tutaj".
   3. Wybierz region do zobrazowania.
      1. W przeglądzie utwórz obszar zainteresowania (ROI) wokół interesującego go mitochondrium, wybierając prostokątny przycisk ROI, a następnie klikając i przeciągając, aby ukształtować region. Rozmiar ROI można zmieniać i obracać za pomocą rogów ROI lub zakrzywionych krawędzi, które pojawiają się po najechaniu myszą na róg.
         UWAGA: Podsumowanie sugerowanych parametrów obrazowania znajduje się w Tabeli 1. Parametry te zostały empirycznie dostosowane przy użyciu tych wcześniej zgłoszonych dla tej konfiguracji STED i kombinacji barwników⁶³.
   4. Skonfiguruj bramkowanie.
      1. Obok menu Ogólne wybierz menu Bramkowanie lub kliknij i przytrzymaj, aby dodać menu do widoku. Zaleca się ustawienie bramkowania detektora STED na 1-1,05 do 7,8-7,85 ns, jak pokazano tutaj. Czasy bramkowania mogą się różnić i wynosić od 1-1,05 do 7-7,05 ns.
   5. Dostosuj intensywność odpowiednio do próbki.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, moc wzbudzenia używana w STED jest 2-3 razy większa niż moc używana w przypadku konfokalu, więc próbka wymagająca 5% mocy lasera wzbudzenia dla konfokalnego może wykorzystywać 10%-15% mocy lasera wzbudzenia podczas akwizycji STED.
      1. Ustaw laser wzbudzający dla STED na 15%-20%, a laser zubożający STED na 20%-25% z 10 akumulacjami linii. Użyj czasu zatrzymania piksela 4 μs przy rozmiarze piksela 20-25 nm. Otwór otworkowy utrzymywano na poziomie 1,0 j.a. dla komórek hodowanych i 0,7 j.a. dla pierwotnych komórek hipokampa szczura w celu poprawy sekcji optycznej w gęściej upakowanych mitochondriach.
         UWAGA: Obrazy konfokalne i STED mogą być pozyskiwane zarówno w celu porównania obok siebie" (Rysunek 3A, B, Rysunek 4A) lub można uzyskać tylko STED.
2. Dodatkowe informacje dotyczące szeregów czasowych/serii z
   1. Wybierz szereg czasowy.
      1. Wybierz menu rozwijane Czas. Zdefiniuj liczbę iteracji (tutaj użytych 5) i interwał czasowy (25 lub 30 s użyty tutaj) żądany dla timelapse (Rysunek 3C, D, Rysunek 4B).
         UWAGA: Jeśli interwał jest krótszy niż czas akwizycji, iteracje będą kontynuowane bez żadnych opóźnień. Podczas wykonywania timelapse zdecydowanie zaleca się włączenie idealnej jednostki ostrości lub podobnego śledzenia ostrości, aby uniknąć potencjalnego dryfu.
   2. Ustaw zakres głośności.
      1. Ustaw zakres głośności z zgodnie z potrzebami, włączając opcję Volume i dostosowując dwa końce zakresu. Rozmiary kroków stosowane w tym protokole do obrazowania 2D wynosiły 150-200 nm. Zalecany rozmiar kroku w odniesieniu do próbkowania Nyquist wymaganego do dekonwolucji surowego STED można obliczyć za pomocą narzędzi online⁹⁰.
         UWAGA: Moc lasera zubożającego STED i liczba obrazowanych płaszczyzn mogą zwiększyć fotowybielanie barwnika i ekspozycję na światło komórki do szkodliwych poziomów. Sprawdź, czy po nabyciu nie ma oznak fototoksyczności i fotouszkodzeń.

5. Narzędzia do przetwarzania i analizy ultrastruktury mitochondriów

UWAGA: Przetwarzanie obrazów (tj. dekonwolucja) jest opcjonalne, ale zazwyczaj używane podczas tworzenia i analizowania obrazów STED do publikacji. Dekonwolucja w celu poprawy kontrastu i redukcji szumów jest wysoce zalecana w celu optymalnej segmentacji poszczególnych grzebienia, jak opisano poniżej (Rysunek 2).

1. Dekonwolucja obrazu STED
   UWAGA: Oprogramowanie używane do dekonwolucji w tym protokole znajduje się w Tabeli materiałów.
   1. Ustawianie mikroskopijnych parametrów obrazu.
      UWAGA: Upewnij się, że metadane mikroskopu zostały poprawnie wprowadzone w obrazie Parametry mikroskopowe. Obejmuje to montaż średniego współczynnika załamania światła; medium zanurzeniowe; rozmiar piksela; długości fal wzbudzenia, emisji i zubożenia; oraz wszelkie inne istotne informacje. Szablony z tymi parametrami można zapisać do ponownego wykorzystania.
   2. Dekonwolucja surowych obrazów STED za pomocą algorytmu oprogramowania.
      1. Dostęp do zautomatyzowanych algorytmów dekonwolucji w oprogramowaniu do dekonwolucji umożliwia przetwarzanie obrazu metodą dekonwolucji. Wybierz przycisk Ekspresowy i ustaw typ dekonwolucji na Szybki, Standardowy, Agresywny lub Konserwatywny dla różnych stopni mocy dekonwolucji. Pokazano reprezentatywne obrazy korzystające z ekspresowej dekonwolucji z ustawieniami agresywnymi (Rysunek 3, Rysunek 4 i Rysunek 5).
      2. Zapisz obrazy z oprogramowania do dekonwolucji w formacie ICS2.
   3. W przypadku ręcznej dekonwolucji wykonaj następujące kroki.
      1. Krótko mówiąc, podczas wykonywania ręcznej dekonwolucji zapisz szablony kreatora dekonwolucji w celu zachowania spójności i miej możliwość załadowania szablonu po uruchomieniu kreatora. Użyj informacji o funkcji pomiaru rozrzutu punktów (PSF), jeśli zostały wygenerowane z konfiguracją akwizycji i parametrami.
      2. W razie potrzeby przytnij surowy obraz STED, zanim oprogramowanie do dekonwolucji automatycznie ustabilizuje obraz. Dodatki do pakietów oprogramowania do dekonwolucji umożliwiają specyficzną kompensację możliwych artefaktów obrazowania, takich jak dryft termiczny i aberracje chromatyczne.
      3. Następnie wygeneruj histogram logarytmiczny, aby ręcznie lub automatycznie wykonać odejmowanie tła. Wybierz klasyczny algorytm dekonwolucji szacowania maksymalnego prawdopodobieństwa (CMLE).
         UWAGA: W przypadku dekonwolucji kluczowymi wartościami, które należy dostosować, są próg stosunku sygnału do szumu, liczba iteracji i próg jakości. Wartości te można dostosować, a dekonwolucję można wyświetlić podgląd w celu określenia optymalnych ustawień.
2. Segmentacja i analiza cząstek
   UWAGA: Ten protokół wykorzystuje FIJI (Is Just ImageJ), oprogramowanie typu open source (patrz tabela materiałów), do segmentacji i analizy. Do tych celów dostępne jest inne porównywalne oprogramowanie, w tym CellProfiler, Icy, Ilastik i QuPath.
   1. Przygotuj obrazy do segmentacji.
      1. Otwórz nieprzetworzone obrazy STED .obf lub pliki .ics2 z oprogramowania do dekonwolucji, przechodząc do opcji File → Open lub klikając i przeciągając pliki na pasek narzędzi ImageJ. W tym miejscu wszelkie przetwarzanie, które ułatwia segmentację obrazów, można wykonać przed segmentacją.
      2. Aby zachować spójność zmian, nagrywaj funkcje za pomocą wtyczek → makr → Nagrywaj, kopiuj i wklejaj kluczowe polecenia do nowego makra z wtyczek → nowego makra →. Upewnij się, że obraz został wybrany do przetworzenia przed uruchomieniem makra.
         UWAGA: Powszechnie akceptowane zmiany ilościowe rozmiaru i kształtu obejmują kadrowanie, rzutowanie stosu z i odejmowanie tła z wyłączonym wygładzaniem. Zmiany powinny być wykonywane spójnie między obrazami w zestawie danych i raportowane.
   2. Dostosuj ustawienia segmentacji Weka z możliwością trenowania
      UWAGA: Opublikowano dodatkowe szczegóły wraz z instrukcjami krok po kroku dotyczącymi korzystania z narzędzia do półautomatycznej segmentacji i dalszych analiz mitochondriów⁹¹.
      1. Otwórz zdekonwolucjonowane obrazy STED we wtyczce Trainable Weka Segmentation (TWS)⁹², znajdującej się w sekcji Plugins → Segmentation → Trainable Weka Segmentation. W ustawieniach segmentacji wybierz funkcje Rozmycie gaussowskie, projekcje membranowe i filtr Sobela. Domyślna grubość membrany to 1, a domyślny rozmiar łatki membrany to 19.
      2. Oznacz klasę 1 lub 2 jako "Cristae", a drugą jako "Tło" (Rysunek 2). Modele można również zapisywać za pomocą przycisku Zapisz klasyfikator. Wybierz klasyfikator obciążenia, aby ponownie użyć tych ustawień dla innych obrazów.
   3. Wykonaj ślady klasy TWS.
      1. Użyj narzędzia Linia lub innych kształtów, aby podświetlić niektóre krzyże lub tło. Przynajmniej niektóre wybory tła powinny zawierać spacje między cristae. Narysuj linię nad strukturą, którą chcesz przypisać do dowolnej klasy, a następnie wybierz przycisk Dodaj do po prawej stronie, aby wyświetlić elementy przezroczyste lub tło. Kliknij dwukrotnie ślad, aby usunąć strukturę z tej etykiety.
   4. Przeprowadź szkolenie z klasyfikacji TWS.
      1. Wybierz przycisk Train classifier po lewej stronie, aby wygenerować mapę na podstawie informacji dostarczonych do wtyczki. Nakładkę klas podzielonych na segmenty można włączać i wyłączać za pomocą przycisku Przełącz nakładkę, a krycie nakładki można dostosować w Ustawieniach. Klasyfikator można ponownie wytrenować przy użyciu dodatkowych etykiet. Po spełnieniu oczekiwań wybierz przycisk Pobierz prawdopodobieństwo.
   5. Zmierz cząstki.
      1. Korzystając z mapy prawdopodobieństwa cristae, proguj obraz, aby wygenerować maskę, a następnie przejdź do pozycji Analizuj → Analizuj cząstki. Ogólnie rzecz biorąc, można użyć domyślnego typu progu i dostosować zakres, aby zapewnić uwzględnienie wszystkich cristae. Pomiary dostarczane przez analizę cząstek można dostosować za pomocą Analyze → Set Measurements.
         UWAGA: Przykładowe parametry rozmiaru i kształtu, takie jak powierzchnia, obwód, okrągłość i współczynnik kształtu grzebienia, są mierzone i wyświetlane na podstawie wybranych pomiarów ( Rysunek 2, Rysunek 5A, Tabela uzupełniająca 1).
      2. OPCJONALNIE: Wybierz surowy obraz STED o tych samych wymiarach co obraz zdekonwoluowany i zastosuj ROI z menedżera, a następnie wybierz opcję Zmierz w menedżerze ROI, aby uzyskać wartości intensywności.
   6. Uzyskaj działki liniowe.
      1. Wykresy liniowe zostały wygenerowane na podstawie zdekonwoluowanych obrazów STED. Narysuj linię wielopunktową, dostosuj grubość linii do szerokości kilku pikseli, aby uśrednić szum, a następnie splajn linii, aby pasowała do mitochondriów (Rysunek 2, Rysunek 5B). Wygenerowany w ten sposób wykres liniowy służy do pomiaru odległości między szczytami w celu przedstawienia okresowości i rozmieszczenia cristae w określonym zakresie.
         UWAGA: W związku z tym, gęstość cristae może być podawana jako liczba niezależnych cristae na danym obszarze, określona przez pomiar zewnętrznej części mitochondriów. Obszar mitochondrialny można określić, stosując filtr do zdekonwoluowanego lub surowego obrazu STED w celu wygenerowania maski. Upewnij się, że maska dokładnie pasuje do konturu mitochondriów przed pomiarem obszaru.

Ten protokół opisuje warunki wzrostu komórek dla komórek hodowanych i pierwotnych, koncentrując się na obrazowaniu żywych komórek STED i późniejszych analizach grzebień mitochondrialnych. Projekcje mitochondriów wykonane za pomocą ImageJ z niezróżnicowanych komórek SH-SY5Y (Figura 3A) i RA-różnicowana SH-SY5Y (Figura 3B) można zebrać jako stosy z tradycyjnymi konfokalnymi i STED, a surowe obrazy STED można następnie zdekonwoluować. Można również wykonać obrazowanie poklatkowe, a następnie zdekonwoluować (Rysunek 3C,D). Używając nieco innych parametrów obrazowania dla pierwotnych neuronów hipokampa szczura (Tabela 1), konfokalne i surowe obrazy STED można uzyskać jako stosy z, a surowe obrazy STED można zdekonwoluować (Rysunek 4A). Możliwe jest również obrazowanie poklatkowe mitochondriów z pierwotnych neuronów (Rysunek 4B). Ogólnie rzecz biorąc, obrazy poklatkowe powinny być w stanie pokazać dynamiczne zdarzenia mitochondrialne.

Gdy surowe projekcje STED i dekonwolucji STED z-stack z próbek użytych do segmentacji wydają się spójne, wykonywane są pomiary ilościowe. Wtyczka TWS wykorzystuje zdekonwoluowany obraz STED do segmentacji w celu utworzenia maski prawdopodobieństwa, która jest następnie używana do tworzenia binarnej maski grzebienia w celu uzyskania parametrów rozmiaru i kształtu (Rysunek 5A). Obszary z tej maski są zapisywane w menedżerze ROI i w razie potrzeby można je zastosować do surowego obrazu STED w celu zmierzenia różnic w intensywności względnej. Zdekonwolucyjne projekcje STED mogą być również wykorzystane do określenia okresowości i gęstości cristae na danym obszarze (Rysunek 5B).

Rysunek 1: Morfologia mitochondriów. Mitochondria mają system dwubłonowy, który definiuje różne podprzedziały (A). Cristae to fałdy błony wewnętrznej o określonych cechach (B). Skróty: OMM, zewnętrzna błona mitochondrialna; ICS, przestrzeń wewnątrzkrystaliczna; IMS, przestrzeń międzybłonowa; CM, błona grzebienia; IBM, wewnętrzna membrana graniczna; IMM, wewnętrzna błona mitochondrialna; CT, końcówka cristae; CJ, skrzyżowanie cristae. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Schemat przepływu pracy. Komórki SH-SY5Y lub pierwotne neurony hipokampa szczura są hodowane na szkle nakrywkowym pokrytym PDL. Komórki SH-SY5Y są hodowane równolegle, aby pozostały niezróżnicowane lub podlegały różnicowaniu RZS w ciągu sześciu dni. Pierwotne neurony hipokampa szczura hodowano na szkle pokrytym PDL po izolacji z odcinków hipokampa przez siedem dni. Gdy komórki były gotowe do obrazowania, wybarwiono je za pomocą PKMO i zobrazowano za pomocą STED. Surowe obrazy STED są następnie dekonwoluowane, a obrazy bez konwolucji są przetwarzane na FIDŻI w celu uzyskania pomiarów rozmiaru i kształtu, takich jak gęstość grzebienia, obszar, obwód, okrągłość i współczynnik proporcji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Obrazowanie mitochondriów w komórkach SH-SY5Y. Pokazano reprezentatywne konfokalne (po lewej), surowe STED (w środku) i zdekonwolucyjne projekcje stosu STED obrazu STED (po prawej) mitochondriów z niezróżnicowanych (A) i RA-zróżnicowanych (B) komórek SH-SY5Y z barwieniem PKMO. Pokazano timelapse z 30-sekundowymi interwałami i 5 iteracjami zróżnicowanych komórek SH-SY5Y RA, (C) z wybranymi regionami (białymi polami) rozszerzonymi na (D) przy użyciu przeskalowanych obrazów tych regionów bez interpolacji. Podziałki liniowe: A,B, 250 nm; C,D, 1 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Obrazowanie mitochondriów w pierwotnych neuronach hipokampa szczura. Pokazano reprezentatywne konfokalne (po lewej), surowe STED (w środku) i zdekonwolucyjne STED Huygensa (po prawej) projekcje z-stack mitochondriów z pierwotnych neuronów hipokampa szczura (A). Pokazano timelapse z 25-sekundowymi interwałami i 5 iteracjami mitochondriów w tych neuronach (B). Podziałka skali: A, 250 nm; B, 1 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Przetwarzanie zdekonwoluowanych obrazów STED w ImageJ. Reprezentatywne użycie wtyczki Trainable Weka Segmentation do pomiaru rozmiaru i kształtu cristae jest pokazane (A). Od lewej do prawej pokazane są następujące obrazy: zdekonwoluowany obraz STED, mapa prawdopodobieństwa oparta na segmentacji z wtyczki TWS, maska przed progowaniem na FIDŻI przy użyciu mapy prawdopodobieństwa jako danych wejściowych, maska z zarysowanymi ROI oraz ROI nałożone na oryginalny zdekonwoluowany obraz STEM. Wynikowe pomiary powierzchni, obwodu, kołowości i współczynnika kształtu odpowiadające tym obiektom można znaleźć w tabeli uzupełniającej 1. Pokazano wykres liniowy wykorzystujący zdekonwoluowany obraz STED do pomiaru odległości między szczytami jako odczyt gęstości grzebienia (B). Podziałka skali: 0,5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Podsumowanie parametrów akwizycji STED. Wyświetlane są ustawienia używane do obrazowania 2D STED dla każdego typu komórek, niezróżnicowanych SH-SY5Y, SH-SY5Y zróżnicowanych RZS i pierwotnych neuronów hipokampa szczura. W przypadku wszystkich filmów poklatkowych wykonano 5 iteracji w różnych odstępach czasu w zależności od wielkości ROI.

Rysunek uzupełniający 1: Obrazowanie komórek SH-SY5Y z dodatkiem β amyloidu (Aβ). Pokazano reprezentatywne konfokalne (po lewej), surowe STED (w środku) i zdekonwolucyjne STED (po prawej) zróżnicowanych komórek SH-SY5Y z barwieniem PKMO (na górze) i Aβ-HiLyte647 (na dole) (A). Pokazano scalone rzuty stosu z surowego PKMO STED (zielony) z surowym Aβ STED (magenta) (B) lub zdekonwoluowanego PKMO STED (zielony) z dekonwoluowanym Aβ STED (magenta) (C). Podziałka skali: 0,5 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Wymiary rozmiaru i kształtu segmentowanych cristae. Pokazano wymiary i kształt obszaru (μm2), obwodu (μm), kolistości i proporcji, odpowiadające obiektom przedstawionym w Rysunek 5A z segmentowanych mitochondriów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Podsumowanie parametrów akwizycji próbek β amyloidu. Wyświetlane są ustawienia używane do obrazowania 2D STED PKMO i Aβ-HiLyte647 w niezróżnicowanych i zróżnicowanych RZS komórkach SH-SY5Y. Konfokalny Aβ-HiLyte647 może być stosowany samodzielnie, ponieważ nie ma określonej struktury do rozwiązania; Obrazy STED Aβ-HiLyte647 są pokazane tutaj dla mniejszych rozmiarów cząstek. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Protokół leczenia β amyloidem. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.