Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie obrazowania STED na żywych komórkach do wizualizacji ultrastruktury wewnętrznej błony mitochondrialnej w modelach komórek neuronalnych

DOI:

10.3791/65561

⸱

30 czerwca 2023

 ,  ,  , 
1Center for Open Research Resources and Equipment, University of Connecticut, 2Department of Molecular and Cell Biology, University of Connecticut

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia proces propagacji, różnicowania i barwienia hodowanych komórek SH-SY5Y oraz pierwotnych neuronów hipokampa szczura do wizualizacji i analizy ultrastruktury mitochondriów za pomocą mikroskopii stymulowanego zubożenia emisji (STED).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria odgrywają wiele istotnych ról w komórce, w tym produkcję energii, regulację homeostazyCa2+, biosyntezę lipidów i produkcję reaktywnych form tlenu (ROS). Te procesy za pośrednictwem mitochondriów odgrywają wyspecjalizowane role w neuronach, koordynując metabolizm tlenowy w celu zaspokojenia wysokiego zapotrzebowania energetycznego tych komórek, modulując sygnalizację Ca2 +, dostarczając lipidy do wzrostu i regeneracji aksonów oraz dostrajając produkcję ROS do rozwoju i funkcji neuronów. Dysfunkcja mitochondriów jest zatem głównym czynnikiem powodującym choroby neurodegeneracyjne. Struktura i funkcja mitochondriów są ze sobą nierozerwalnie związane. Złożona morfologicznie błona wewnętrzna z fałdami strukturalnymi zwanymi cristae kryje w sobie wiele systemów molekularnych, które wykonują procesy sygnaturowe mitochondrium. Cechy architektoniczne membrany wewnętrznej są ultrastrukturalne i dlatego zbyt małe, aby można je było uwidocznić za pomocą tradycyjnej mikroskopii rozdzielczej o ograniczonej dyfrakcji. Tak więc większość spostrzeżeń na temat ultrastruktury mitochondriów pochodzi z mikroskopii elektronowej na utrwalonych próbkach. Jednak nowe technologie w mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości zapewniają obecnie rozdzielczość do dziesiątek nanometrów, umożliwiając wizualizację cech ultrastrukturalnych w żywych komórkach. Obrazowanie w superrozdzielczości oferuje zatem bezprecedensową możliwość bezpośredniego obrazowania drobnych szczegółów struktury mitochondriów, rozkładu białek w nanoskali i dynamiki cristae, dostarczając fundamentalnych nowych informacji, które łączą mitochondria ze zdrowiem i chorobami człowieka. Protokół ten przedstawia zastosowanie mikroskopii superrozdzielczej ze sterowanym zubożeniem emisji (STED) do wizualizacji ultrastruktury mitochondriów żywych ludzkich komórek nerwiaka zarodkowego i pierwotnych neuronów szczurów. Procedura ta jest podzielona na pięć sekcji: (1) wzrost i różnicowanie linii komórkowej SH-SY5Y, (2) izolacja, posiew i wzrost pierwotnych neuronów hipokampa szczura, (3) procedury barwienia komórek do obrazowania żywych komórek STED, (4) procedury eksperymentów z żywymi komórkami STED przy użyciu mikroskopu STED jako odniesienie oraz (5) wytyczne dotyczące segmentacji i przetwarzania obrazu na przykładach do pomiaru i ilościowego określenia cech morfologicznych błony wewnętrznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria to organelle eukariotyczne pochodzenia endosymbiotycznego, które są odpowiedzialne za regulację kilku kluczowych procesów komórkowych, w tym pośredniego metabolizmu i produkcji ATP, homeostazy jonów, biosyntezy lipidów i programowanej śmierci komórki (apoptozy). Te organelle są topologicznie złożone, zawierają system podwójnej błony, który tworzy wiele podkompartmentów1 (Rysunek 1A). Zewnętrzna błona mitochondrialna (OMM) łączy się z cytozolem i ustanawia bezpośrednie kontakty między organellami2,3. Wewnętrzna błona mitochondrialna (IMM) jest membraną oszczędzającą energię, która utrzymuje gradienty jonów przechowywane głównie jako elektryczny potencjał błonowy (ΔΨm) w celu napędzania syntezy ATP i innych procesów wymagających energii4,5. IMM jest dalej podzielony na wewnętrzną błonę graniczną (IBM), która jest ściśle przylegająca do OMM, oraz wystające struktury zwane cristae, które są połączone błoną cristae (CM). Błona ta wyznacza najbardziej wewnętrzny przedział macierzy od przestrzeni wewnątrzkrystalicznej (ICS) i przestrzeni międzybłonowej (IMS).

Mitochondria mają dynamiczną morfologię opartą na ciągłych i zrównoważonych procesach rozszczepienia i fuzji, które są zarządzane przez mechanoenzymy nadrodziny dynamin6. Fuzja pozwala na zwiększenie łączności i tworzenie sieci siatkowatych, podczas gdy rozszczepienie prowadzi do fragmentacji mitochondriów i umożliwia usunięcie uszkodzonych mitochondriów przez mitofagię7. Morfologia mitochondriów różni się w zależności od typu tkanki8 i etapu rozwoju9 i jest regulowana, aby umożliwić komórkom dostosowanie się do czynników, w tym potrzeb energetycznych10,11 i stressors12. Standardowe cechy morfometryczne mitochondriów, takie jak zakres tworzenia sieci (połączone ze sobą vs. fragmentaryczne), obwód, obszar, objętość, długość (współczynnik proporcji), okrągłość i stopień rozgałęzienia, można zmierzyć i określić ilościowo za pomocą standardowej mikroskopii optycznej, ponieważ rozmiary tych cech są większe niż granica dyfrakcji światła (~200 nm)13.

Architektura Cristae definiuje wewnętrzną strukturę mitochondriów (Rysunek 1B). Różnorodność morfologii cristae można ogólnie podzielić na płaską (blaszkowatą lub dyskoidalną) lub rurkowo-pęcherzykową14. Wszystkie cristae łączą się w IBM za pomocą rurowych lub szczelinowych struktur zwanych połączeniami cristae (CJ), które mogą służyć do podziału IMS na ICS i IBM na CM15. Morfologia Cristae jest regulowana przez kluczowe kompleksy białkowe IMM, w tym (1) mitochondrialne miejsce kontaktu i system organizacji grzebiaków (MICOS), który znajduje się w CJ i stabilizuje kontakty IMM-OMM16, (2) GTPaza atrofii nerwu wzrokowego 1 (OPA1), która reguluje przebudowę cristae17,18,19, oraz (3) F1F O Syntaza ATP, która tworzy stabilizujące zespoły oligomeryczne na końcach cristae (CT)20,21. Ponadto IMM jest wzbogacony w niedwuwarstwowe fosfolipidy fosfatydyloetanoloaminę i kardiolipinę, które stabilizują wysoce zakrzywiony IMM22. Cristae są również dynamiczne, wykazując zmiany morfologiczne w różnych warunkach, takich jak różne stany metaboliczne23,24, z różnymi podłożami oddechowymi25, w warunkach głodu i stresu oksydacyjnego26,27, z apoptozą28,29, oraz z starzeniem się30. Ostatnio wykazano, że cristae mogą przechodzić poważne wydarzenia związane z przebudową w skali sekund, co podkreśla ich dynamiczną naturę31. Można określić ilościowo kilka cech cristae, w tym wymiary struktur w poszczególnych cristae (np. szerokość CJ, długość i szerokość cristae) oraz parametry, które wiążą poszczególne cristae z innymi strukturami (np. odstępy wewnątrz cristae i kąt padania cristae względem OMM)32. Te kwantyfikowalne parametry cristae wykazują bezpośrednią korelację z funkcją. Na przykład zakres produkcji ATP w mitochondriach jest dodatnio związany z obfitością cristae, określaną ilościowo jako gęstość cristae lub liczba cristae znormalizowana do innej cechy (np. cristae na obszar OMM)33,34,35. Ponieważ morfologia IMM jest definiowana przez cechy w nanoskali, obejmuje ultrastrukturę mitochondriów, która wymaga technik obrazowania zapewniających rozdzielczość większą niż granica dyfrakcji światła. Jak opisano poniżej, takie techniki obejmują mikroskopię elektronową i mikroskopię superrozdzielczą (nanoskopię).

Komórki nerwowe i glejowe ośrodkowego układu nerwowego (OUN) są szczególnie zależne od funkcji mitochondriów. Średnio mózg stanowi tylko 2% całkowitej masy ciała, ale wykorzystuje 25% całkowitego stężenia glukozy w organizmie i odpowiada za 20% zużycia tlenu przez organizm, co czyni go podatnym na zaburzenia metabolizmu energetycznego36. Postępujące choroby neurodegeneracyjne (ND), w tym choroba Alzheimera (AD), stwardnienie zanikowe boczne (ALS), choroba Huntingtona (HD), stwardnienie rozsiane (SM) i choroba Parkinsona (PD), są jednymi z najszerzej badanych patologii do tej pory, a wysiłki badawcze obejmują zrozumienie molekularnych podstaw tych chorób po poszukiwanie potencjalnej profilaktyki i interwencji terapeutycznych. ND są związane ze zwiększonym stresem oksydacyjnym pochodzącym częściowo z reaktywnych form tlenu (ROS) generowanych przez mitochondrialny łańcuch transportu elektronów (ETC)37, a także ze zmienionym mitochondrialnym przetwarzaniem wapnia38 i mitochondrialnym metabolizmem lipidów39. Tym fizjologicznym zmianom towarzyszą zauważone defekty w morfologii mitochondriów, które są związane z AD40,41,42,43,44, ALS45,46, HD47,48,49, MS50, oraz PD51,52,53. Te wady strukturalne i funkcjonalne mogą być sprzężone złożonymi relacjami przyczynowo-skutkowymi. Na przykład, biorąc pod uwagę, że morfologia cristae stabilizuje enzymy OXPHOS54, mitochondrialne ROS są nie tylko generowane przez ETC, ale także działają w celu uszkodzenia infrastruktury, w której znajduje się ETC, promując cykl ROS, który zwiększa podatność na uszkodzenia oksydacyjne. Ponadto wykazano, że dezorganizacja cristae uruchamia procesy, takie jak uwalnianie mitochondrialnego DNA (mtDNA) i szlaki zapalne związane z zaburzeniami autoimmunologicznymi, metabolicznymi i związanymi z wiekiem55. Dlatego analiza struktury mitochondriów jest kluczem do pełnego zrozumienia ND i ich molekularnych podstaw.

Popularne metody przeglądania cristae, w tym transmisyjna mikroskopia elektronowa, tomografia elektronowa i krioelektronowa tomografia (cryo-ET), oraz tomografia rentgenowska, w szczególności kriomiękka tomografia rentgenowska, ujawniły ważne odkrycia i działają z różnymi typami próbek56,57,58,59,60. Pomimo ostatnich postępów w kierunku lepszej obserwacji ultrastruktury organelli, metody te nadal wiążą się z zastrzeżeniem polegającym na wymaganiu utrwalenia próbki, a zatem nie mogą bezpośrednio uchwycić dynamiki grzebieniaków w czasie rzeczywistym. Mikroskopia fluorescencyjna o wysokiej rozdzielczości, szczególnie w postaci mikroskopii oświetlenia strukturalnego (SIM), stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (STORM), mikroskopii lokalizacji aktywowanej fotoaktywem (PALM), mikroskopii ekspansyjnej (ExM) i mikroskopii wymuszonego zubożenia emisji (STED), stały się popularnymi sposobami oglądania struktur wymagających rozdzielczości poniżej granicy dyfrakcji, która ogranicza klasyczne metody mikroskopii optycznej. Gdy ExM jest używany w połączeniu z inną techniką super-rozdzielczości, wyniki są imponujące, ale próbka musi być utrwalona i wybarwiona w gel61. Dla porównania, SIM, PALM/STORM i STED zostały z powodzeniem wykorzystane w przypadku żywych próbek, a nowe i obiecujące barwniki, które zazwyczaj barwią IMM, zapewniają nowatorskie i łatwe podejście do obrazowania na żywo dynamiki mitochondriów grzebienia62,63,64,65,66. Ostatnie postępy w dziedzinie żywych barwników do obrazowania chorób przenoszonych drogą płciową poprawiły jasność i fotostabilność barwnika, a barwniki te są ukierunkowane na IMM z wyższym stopniem swoistości niż ich poprzednicy. Osiągnięcia te pozwalają na gromadzenie długoterminowych eksperymentów poklatkowych i z-stack z obrazowaniem w superrozdzielczości, otwierając drzwi do lepszej analizy ultrastruktury i dynamiki mitochondriów na żywo w komórkach.

Tutaj, dostępne są protokoły obrazowania żywych komórek niezróżnicowanych i zróżnicowanych komórek SH-SY5Y barwionych barwnikiem PKmito Orange (PKMO) przy użyciu STED63. Linia komórkowa SH-SY5Y jest trzykrotnie subklonowaną pochodną macierzystej linii komórkowej SK-N-SH, wygenerowaną z biopsji szpiku kostnego nerwiaka zarodkowego z przerzutami67,68,69,70. Ta linia komórkowa jest powszechnie stosowanym modelem in vitro w badaniach ND, szczególnie w chorobach takich jak AD, HD i PD, w których dysfunkcja mitochondriów jest silnie zaangażowana10,43,71,72,73. Zdolność do różnicowania komórek SH-SY5Y w komórki o fenotypie neuronalnym poprzez manipulowanie pożywkami hodowlanymi okazała się odpowiednim modelem do badań neurobiologicznych bez polegania na pierwotnych komórkach neuronalnych10,74. W tym protokole kwas retinowy (RA) dodano do pożywki do hodowli komórkowej w celu wywołania różnicowania komórek SH-SY5Y. RZS jest pochodną witaminy A i wykazano, że reguluje cykl komórkowy i promuje ekspresję czynników transkrypcyjnych, które regulują różnicowanie neuronów75. Dostępny jest również protokół hodowli i obrazowania żywych komórek neuronów wyizolowanych z hipokampa szczura. Wykazano, że hipokamp jest dotknięty zwyrodnieniem mitochondriów i wraz z korą odgrywa ważną rolę w starzeniu się i ND76,77,78,79,80.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Propagacja i różnicowanie komórek SH-SY5Y

  1. Przygotowanie pożywki do wzrostu i utrzymania komórek
    1. Przygotuj kompletne, wysokoglukozowe zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle's Medium (DMEM, 4,5 g/L D-glukozy, 4 mM L-glutamina, 110 mg/L pirogronian sodu) uzupełnione końcowym 1% (v/v) antybiotyko-przeciwgrzybiczym (10 000 jednostek/ml penicyliny, 10 000 μg/ml streptomycyny i 25 μg/ml amfoterycyny B) oraz różnymi ilościami płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (patrz Tabela materiałów). Ilości FBS w pożywkach różnicujących wahają się między końcowymi 10%, 5% lub 2% (v/v) FBS.
  2. Konserwacja komórek
    1. Utrzymuj komórki w DMEM uzupełnione 10% (v/v) FBS i umieść je w temperaturze 37 °C i 5% CO2, a następnie wysiewaj w DMEM zawierającym 5% (v / v) FBS w celu różnicowania. Zamrożone zapasy komórek przechowywano w FBS z 10% (v/v) dimetylosulfotlenkiem (DMSO) w ilości 1-2 x 107 komórek/ml.
  3. Preparat kwasu retinowego (RZS)
    1. Rozpuścić 7,51 mg all-trans-RA (patrz tabela materiałów) w 5 ml świeżo przygotowanego 95% etanolu, aby otrzymać 5 mM roztwór podstawowy. Sprawdzić stężenie z absorbancją przy 350 nm (ɛ = 44,300 M-1 cm-1), uzyskane z karty informacyjnej produktu z protokołu producenta81, stosując rozcieńczenie roztworu podstawowego w etanolu o stężeniu 5 μM. Przechowywać 5 mM zapasu w chronionym przed światłem w temperaturze 4 °C przez okres do 6 tygodni.
  4. Przygotowanie poli-D-lizyny do powlekania szkieł nakrywkowych
    UWAGA: Protokół produktu z poli-D-lizyny (PDL), który można znaleźć w sekcji Dokumenty i pliki do pobrania na stronie dostawcy82, zawiera informacje na temat powlekania różnych naczyń hodowlanych.
    1. Protokół ten obejmuje objętości oparte na naczyniu z 2-dołkową komorą o powierzchni 4cm2 na studzienkę ze sterylnym dnem ze szkła borokrzemianowego #1,5 (patrz Tabela Materiałów). Rozcieńczyć roztwór podstawowy PDL dwukrotnie do 50 μg/ml PBS firmy Dulbecco (DPBS; bez wapnia, bez magnezu).
      UWAGA: Szkło nakrywkowe #1.5 lub #1.5H to dopuszczalne grubości, które mają zasadnicze znaczenie dla jakości obrazu. Inne grubości wywołują aberrację sferyczną i należy ich unikać.
  5. Powłoka szkiełka nakrywkowego z PDL
    UWAGA: Szkiełka nakrywkowe można wystawić na działanie światła ultrafioletowego (UV) przez 10-15 minut w komorze bezpieczeństwa biologicznego w celu dalszej sterylizacji.
    1. Nałożyć 1,2 ml 50 μg/ml roztworu PDL do każdego dołka sterylnych szkiełek nakrywkowych w komorze do hodowli komórkowych i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Usunąć roztwór PDL i spłukać trzykrotnie 3,6 ml wody destylowanej. Po zakończeniu mycia końcowego pozostaw powlekaną komorę do wyschnięcia na 2 godziny wystawioną na działanie powietrza przed spłukaniem i natychmiastowym użyciem lub przechowywaniem w hermetycznym pojemniku w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
      UWAGA: Dokładnie spłucz szkiełka nakrywkowe, ponieważ nadmiar PDL może być toksyczny dla komórek.
  6. Różnicowanie komórek SH-SY5Y z RA
    UWAGA: Nie używaj komórek powyżej przejścia 15. Komórki są pasażowane przy 80%-90% zbieganiu. Procedury różnicowania różnią się, ale przebiegają w podobny sposób. Dodatkowe różnicowanie od nerwiaków zarodkowych do dojrzałych neuronów uzyskuje się przy dalszym leczeniu czynnikiem neurotroficznym pochodzenia mózgowego (BDNF)68,83,84,85, ale nie zostało wykonane w tym protokole.
    OPCJONALNIE: Założyć komórki na co najmniej 24 godziny przed wysiewem na szkle nakrywkowym. Aby przygotować komórki z zamrożonych zapasów, szybko rozmrozić 1 ml zamrożonej fiolki z komórkami i dodać do 9 ml wstępnie podgrzanej pożywki uzupełnionej 10% FBS, a następnie odwirować w temperaturze 350 x g przez 10 minut (w temperaturze pokojowej) i wyrzucić supernatant w celu usunięcia DMSO. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki i komórek nasiennych w kolbie T-25. Gdy komórki osiągną zbieżność 80%-90%, przechodź komórki, licząc je i zasiewając w celu różnicowania, jeśli ma to zastosowanie.
    1. Dzień 0: Komórki nasienne.
      1. Wysiać komórki na komorowym szkle nakrywkowym z zamrożonych zapasów lub kolby roboczej. Użyj gęstości wysiewu 1,5 x 104 komórki/cm2,
        UWAGA: Pojedyncza studzienka w standardowym 2-dołkowym komorowym szkle nakrywkowym o powierzchni hodowli 4cm2 będzie wymagała6,0 x 10 4 komórek. Komórki, które pozostaną niezróżnicowane, powinny zostać wysiane DMEM uzupełnionym 10% (v/v) FBS, a komórki, które będą zróżnicowane, powinny zostać wysiane DMEM uzupełnionym 5% (v/v) FBS.
    2. Dzień 1: Rozpocznij leczenie różnicowania RZS.
      1. Przygotować DMEM uzupełniony 5% (v/v) FBS, 1% (v/v) antybiotyk-antybiotyk przeciwgrzybiczy i końcowe stężenie 10 μM RA lub etanolu o tej samej objętości dodatku, aby służyć jako kontrola nośnika dla tej procedury różnicowania. Usuń pożywkę z komorowego szkła nakrywkowego używanego do wysiewu, spłucz 1x PBS i dodaj nowy DMEM do studzienek.
    3. Dzień 3: Zastąp pożywkę świeżą pożywką zawierającą RZS lub etanol.
      1. Usunąć pożywkę z dnia 1. i zastąpić ją świeżą pożywką uzupełnioną 2% (v/v) FBS, 1% (v/v) antybiotykowo-przeciwgrzybiczym i 10 μM RA lub 95% etanolem o tej samej objętości dodatku, aby służyły jako kontrola nośnika dla tej procedury różnicowania. Usuń pożywkę z komorowego szkła nakrywkowego używanego do wysiewu, spłucz 1x PBS i dodaj nowe podłoże do dołków.
    4. Dzień 6: Wykonaj obrazowanie komórek.
      UWAGA: Czas różnicowania komórek różni się w zależności od protokołu, ale sześć dni ekspozycji na RZS wystarczy, aby wywołać fenotyp podobny do neuronu w komórkach SH-SY5Y86.
      1. Wykonaj obrazowanie na żywo, ze szczegółami w sekcjach 3 i 4 (Rysunek 2).

2. Pierwotna hodowla neuronów hipokampa u szczurów

  1. Przygotowanie materiałów do izolacji neuronów hipokampa szczura.
    1. Przygotuj świeżo uzupełniony DMEM.
      1. Filtruj i sterylizuj mieszaninę DMEM (wysoka glukoza, bez pirogronianu sodu) uzupełnioną 10% (v/v) inaktywowanym termicznie FBS, 1% (v/v) roztworem pirogronianu sodu i 1% (v/v) penicyliny-streptomycyny (10 000 U/ml). Przechowywać do 2 tygodni w temperaturze 4°C.
    2. Przygotuj świeżo uzupełnioną pożywkę do wzrostu neuronów.
      1. Filtruj i sterylizuj mieszaninę pożywek wzrostu neuronów uzupełnionych 2% (v/v) suplementem B27, 0,25% (v/v) suplementem glutaminy i 1% (v/v) penicyliną-streptomycyną (patrz tabela materiałów). Przechowywać do 2 tygodni w temperaturze 4°C.
  2. Przygotuj pierwotną hodowlę neuronów hipokampa.
    1. Przygotuj pierwotną hodowlę neuronów hipokampa zgodnie z wcześniej opublikowanymi pracami87 oraz z protokołu produktu na stronie producenta, z którego uzyskano wypreparowany hipokamp szczura E1888 (patrz Tabela materiałów). Protokół ten powoduje, że populacja składa się głównie z neuronów z <2% astrocytów.
      UWAGA: Pożywka hibernacyjna, z którą wysyłana jest ta tkanka, będzie używana w przyszłych krokach tego protokołu. Nie wyrzucaj go.
    2. Przygotuj materiały i podłoża do dysocjacji tkanek.
      1. Podpal pipetę Pasteura, aby zmniejszyć średnicę otworu i przechowuj ją w folii, aby zapobiec zanieczyszczeniu do czasu użycia. Podgrzej przygotowany DMEM, 1X buforowany roztwór soli Hanka (HBSS) i pożywkę do wzrostu neuronów do 37 °C. Dodaj 2 płatki DNAazy za pomocą sterylnej pęsety do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    3. Wykonaj dysocjację tkanek.
      1. Usunąć jak najwięcej hibernowanej pożywki, w której przechowywany jest wypreparowany hipokamp szczura E18 przed umieszczeniem tkanki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej DNAazę i krótką inkubacją w temperaturze 37 °C. Dodać 900 μl 1X HBSS, a następnie 100 μl 0,5% trypsyny. Inkubować tkankę w temperaturze 37 °C przez 15 min.
        UWAGA: Płytki pokryte PDL można wyjąć z magazynu i umieścić w inkubatorze do czasu użycia w tym czasie inkubacji.
    4. Wykonaj homogenizację tkanek i zliczanie komórek.
      1. Po inkubacji z trypsyną usunąć pożywkę i dodać 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki hibernacyjnej DNAazy z poprzedniego etapu do tkanki i homogenizować za pomocą pipety Pasteura. Pożywka będzie wyglądać na nieprzezroczysta, a następnie stopniowo przezroczysta w miarę postępu homogenizacji.
      2. Dodaj zdysocjowane neurony do nowej probówki z 4 ml wstępnie podgrzanego DMEM, a następnie policz komórki za pomocą licznika komórek.
    5. Wykonaj posiewanie komórek i wzrost komórek pierwotnych.
      1. Płytki o gęstości około 1,65 x 104 komórki/cm2 w DMEM. W przypadku 2-dołkowego szkła nakrywkowego (4 cm2), wysiewaj 65 000 – 70 000 komórek na studzienkę za pomocą 2 ml DMEM. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 godziny przed sprawdzeniem przestrzegania zaleceń lekarskich. Gdy komórki zaczną przylegać, usuń 1 ml pożywki i zastąp ją tą samą objętością pożywki hibernacji, a następnie delikatnie wymieszaj, aby wymieszać. Po wymieszaniu pożywki powtórz ten proces i usuń połowę obecnych pożywek i zastąp je taką samą objętością pożywki do wzrostu neuronów, a następnie delikatnie wymieszaj.
        UWAGA: Dzień posiewu jest uważany za dzień in vitro (DIV) 0, a komórki są gotowe do obrazowania w DIV 7 (Rysunek 2).

3. Przygotowanie komórek do obrazowania żywych komórek

UWAGA: Typy i pochodzenie komórek (tj. komórki hodowlane i pierwotne) mogą różnić się wymaganiami dotyczącymi barwienia; zobacz opublikowane raporty, aby uzyskać więcej informacji62,63.

  1. Przygotowanie PKmito Orange
    UWAGA: Inne barwniki, które zazwyczaj zabarwiają IMM, zostały zgłoszone64,65,66 i są dostępne na rynku. PKMO jest jedynym używanym w tym protokole.
    1. Ponownie zawiesić proszek PKMO (patrz Tabela Materiałów) w DMSO zgodnie z instrukcjami producenta89. Odessać pożywkę z komórek i przemyć we wstępnie podgrzanej pożywce wolnej od czerwieni fenolowej. Przygotuj zapas PKMO we wstępnie podgrzanym, wolnym od czerwieni fenolowej DMEM uzupełnionym 2% (v/v) FBS lub 10% (v/v) w zależności od stanu różnicowania, HEPES do końcowego stężenia 20 mM i 1% (v/v) antybiotykowo-przeciwgrzybiczego przed barwieniem komórek zgodnie z instrukcjami producenta. Ten preparat, bez PKMO, jest pożywką do obrazowania żywych komórek.
  2. Barwienie komórek za pomocą PKMO
    1. Inkubować komórki z barwnikiem w temperaturze 37 °C i 5% CO 2 przez 30 minut. Przemyć komórki trzykrotnie pożywką do obrazowania żywych komórek, a do końcowego płukania inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    2. Dodaj świeże, wstępnie podgrzane nośniki do obrazowania żywych komórek. Komórki są teraz gotowe do obrazowania.
      UWAGA: Ostre leczenie (np. leki i/lub stresory), jeśli jest stosowane, jest dodawane przed obrazowaniem na żywo; patrz sekcja Dyskusja i Rysunek uzupełniający 1.

4. Obrazowanie żywych komórek za pomocą mikroskopii STED

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje system STED zbudowany wokół odwróconego mikroskopu, z systemem określonym w Tabeli Materiałów. System ten wyposażony jest w impulsowe lasery wzbudzające (laser 561 nm o mocy nominalnej ~300 μW) oraz impulsowy laser dezuplikacyjny STED 775 nm (moc nominalna 1,2 W), bezstopniowo regulowany skaner galwanowy oraz detektor fotodiody lawinowej oparty na filtrze 615/20 nm (APD). Zastosowano tutaj soczewkę zanurzeniową 100x/1,40 olejku do STED. Do akwizycji obrazu wykorzystywane jest oprogramowanie lightbox. Wszystkie podane szczegóły są bezpośrednio związane z tym oprogramowaniem i konfiguracją systemu.

  1. Ogólne wskazówki i kroki dotyczące obrazowania
    1. Użyj inkubatora lub komory środowiskowej, aby utrzymać żywotność komórek, ale dopuszczalne są również krótkoterminowe eksperymenty w temperaturze pokojowej. Te kroki są specyficzne dla konfiguracji STED opisanej powyżej.
    2. Wybierz zestaw laserów i filtrów do obrazowania.
      1. Użyj parametrów dla barwnika pomarańczowego, wybierając barwnik(i) użyty w barwieniu z listy barwników lub ten, którego właściwości widmowe są najbardziej zbliżone do użytego barwnika(ów). Uaktywnij je, klikając dwukrotnie lub przeciągając je do listy próbek, gdzie jest napisane "Przeciągnij barwniki tutaj".
    3. Wybierz region do zobrazowania.
      1. W przeglądzie utwórz obszar zainteresowania (ROI) wokół interesującego go mitochondrium, wybierając prostokątny przycisk ROI, a następnie klikając i przeciągając, aby ukształtować region. Rozmiar ROI można zmieniać i obracać za pomocą rogów ROI lub zakrzywionych krawędzi, które pojawiają się po najechaniu myszą na róg.
        UWAGA: Podsumowanie sugerowanych parametrów obrazowania znajduje się w Tabeli 1. Parametry te zostały empirycznie dostosowane przy użyciu tych wcześniej zgłoszonych dla tej konfiguracji STED i kombinacji barwników63.
    4. Skonfiguruj bramkowanie.
      1. Obok menu Ogólne wybierz menu Bramkowanie lub kliknij i przytrzymaj, aby dodać menu do widoku. Zaleca się ustawienie bramkowania detektora STED na 1-1,05 do 7,8-7,85 ns, jak pokazano tutaj. Czasy bramkowania mogą się różnić i wynosić od 1-1,05 do 7-7,05 ns.
    5. Dostosuj intensywność odpowiednio do próbki.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, moc wzbudzenia używana w STED jest 2-3 razy większa niż moc używana w przypadku konfokalu, więc próbka wymagająca 5% mocy lasera wzbudzenia dla konfokalnego może wykorzystywać 10%-15% mocy lasera wzbudzenia podczas akwizycji STED.
      1. Ustaw laser wzbudzający dla STED na 15%-20%, a laser zubożający STED na 20%-25% z 10 akumulacjami linii. Użyj czasu zatrzymania piksela 4 μs przy rozmiarze piksela 20-25 nm. Otwór otworkowy utrzymywano na poziomie 1,0 j.a. dla komórek hodowanych i 0,7 j.a. dla pierwotnych komórek hipokampa szczura w celu poprawy sekcji optycznej w gęściej upakowanych mitochondriach.
        UWAGA: Obrazy konfokalne i STED mogą być pozyskiwane zarówno w celu porównania obok siebie" (Rysunek 3A, B, Rysunek 4A) lub można uzyskać tylko STED.
  2. Dodatkowe informacje dotyczące szeregów czasowych/serii z
    1. Wybierz szereg czasowy.
      1. Wybierz menu rozwijane Czas. Zdefiniuj liczbę iteracji (tutaj użytych 5) i interwał czasowy (25 lub 30 s użyty tutaj) żądany dla timelapse (Rysunek 3C, D, Rysunek 4B).
        UWAGA: Jeśli interwał jest krótszy niż czas akwizycji, iteracje będą kontynuowane bez żadnych opóźnień. Podczas wykonywania timelapse zdecydowanie zaleca się włączenie idealnej jednostki ostrości lub podobnego śledzenia ostrości, aby uniknąć potencjalnego dryfu.
    2. Ustaw zakres głośności.
      1. Ustaw zakres głośności z zgodnie z potrzebami, włączając opcję Volume i dostosowując dwa końce zakresu. Rozmiary kroków stosowane w tym protokole do obrazowania 2D wynosiły 150-200 nm. Zalecany rozmiar kroku w odniesieniu do próbkowania Nyquist wymaganego do dekonwolucji surowego STED można obliczyć za pomocą narzędzi online90.
        UWAGA: Moc lasera zubożającego STED i liczba obrazowanych płaszczyzn mogą zwiększyć fotowybielanie barwnika i ekspozycję na światło komórki do szkodliwych poziomów. Sprawdź, czy po nabyciu nie ma oznak fototoksyczności i fotouszkodzeń.

5. Narzędzia do przetwarzania i analizy ultrastruktury mitochondriów

UWAGA: Przetwarzanie obrazów (tj. dekonwolucja) jest opcjonalne, ale zazwyczaj używane podczas tworzenia i analizowania obrazów STED do publikacji. Dekonwolucja w celu poprawy kontrastu i redukcji szumów jest wysoce zalecana w celu optymalnej segmentacji poszczególnych grzebienia, jak opisano poniżej (Rysunek 2).

  1. Dekonwolucja obrazu STED
    UWAGA: Oprogramowanie używane do dekonwolucji w tym protokole znajduje się w Tabeli materiałów.
    1. Ustawianie mikroskopijnych parametrów obrazu.
      UWAGA: Upewnij się, że metadane mikroskopu zostały poprawnie wprowadzone w obrazie Parametry mikroskopowe. Obejmuje to montaż średniego współczynnika załamania światła; medium zanurzeniowe; rozmiar piksela; długości fal wzbudzenia, emisji i zubożenia; oraz wszelkie inne istotne informacje. Szablony z tymi parametrami można zapisać do ponownego wykorzystania.
    2. Dekonwolucja surowych obrazów STED za pomocą algorytmu oprogramowania.
      1. Dostęp do zautomatyzowanych algorytmów dekonwolucji w oprogramowaniu do dekonwolucji umożliwia przetwarzanie obrazu metodą dekonwolucji. Wybierz przycisk Ekspresowy i ustaw typ dekonwolucji na Szybki, Standardowy, Agresywny lub Konserwatywny dla różnych stopni mocy dekonwolucji. Pokazano reprezentatywne obrazy korzystające z ekspresowej dekonwolucji z ustawieniami agresywnymi (Rysunek 3, Rysunek 4 i Rysunek 5).
      2. Zapisz obrazy z oprogramowania do dekonwolucji w formacie ICS2.
    3. W przypadku ręcznej dekonwolucji wykonaj następujące kroki.
      1. Krótko mówiąc, podczas wykonywania ręcznej dekonwolucji zapisz szablony kreatora dekonwolucji w celu zachowania spójności i miej możliwość załadowania szablonu po uruchomieniu kreatora. Użyj informacji o funkcji pomiaru rozrzutu punktów (PSF), jeśli zostały wygenerowane z konfiguracją akwizycji i parametrami.
      2. W razie potrzeby przytnij surowy obraz STED, zanim oprogramowanie do dekonwolucji automatycznie ustabilizuje obraz. Dodatki do pakietów oprogramowania do dekonwolucji umożliwiają specyficzną kompensację możliwych artefaktów obrazowania, takich jak dryft termiczny i aberracje chromatyczne.
      3. Następnie wygeneruj histogram logarytmiczny, aby ręcznie lub automatycznie wykonać odejmowanie tła. Wybierz klasyczny algorytm dekonwolucji szacowania maksymalnego prawdopodobieństwa (CMLE).
        UWAGA: W przypadku dekonwolucji kluczowymi wartościami, które należy dostosować, są próg stosunku sygnału do szumu, liczba iteracji i próg jakości. Wartości te można dostosować, a dekonwolucję można wyświetlić podgląd w celu określenia optymalnych ustawień.
  2. Segmentacja i analiza cząstek
    UWAGA: Ten protokół wykorzystuje FIJI (Is Just ImageJ), oprogramowanie typu open source (patrz tabela materiałów), do segmentacji i analizy. Do tych celów dostępne jest inne porównywalne oprogramowanie, w tym CellProfiler, Icy, Ilastik i QuPath.
    1. Przygotuj obrazy do segmentacji.
      1. Otwórz nieprzetworzone obrazy STED .obf lub pliki .ics2 z oprogramowania do dekonwolucji, przechodząc do opcji File → Open lub klikając i przeciągając pliki na pasek narzędzi ImageJ. W tym miejscu wszelkie przetwarzanie, które ułatwia segmentację obrazów, można wykonać przed segmentacją.
      2. Aby zachować spójność zmian, nagrywaj funkcje za pomocą wtyczek → makr → Nagrywaj, kopiuj i wklejaj kluczowe polecenia do nowego makra z wtyczek → nowego makra →. Upewnij się, że obraz został wybrany do przetworzenia przed uruchomieniem makra.
        UWAGA: Powszechnie akceptowane zmiany ilościowe rozmiaru i kształtu obejmują kadrowanie, rzutowanie stosu z i odejmowanie tła z wyłączonym wygładzaniem. Zmiany powinny być wykonywane spójnie między obrazami w zestawie danych i raportowane.
    2. Dostosuj ustawienia segmentacji Weka z możliwością trenowania
      UWAGA: Opublikowano dodatkowe szczegóły wraz z instrukcjami krok po kroku dotyczącymi korzystania z narzędzia do półautomatycznej segmentacji i dalszych analiz mitochondriów91.
      1. Otwórz zdekonwolucjonowane obrazy STED we wtyczce Trainable Weka Segmentation (TWS)92, znajdującej się w sekcji Plugins → Segmentation → Trainable Weka Segmentation. W ustawieniach segmentacji wybierz funkcje Rozmycie gaussowskie, projekcje membranowe i filtr Sobela. Domyślna grubość membrany to 1, a domyślny rozmiar łatki membrany to 19.
      2. Oznacz klasę 1 lub 2 jako "Cristae", a drugą jako "Tło" (Rysunek 2). Modele można również zapisywać za pomocą przycisku Zapisz klasyfikator. Wybierz klasyfikator obciążenia, aby ponownie użyć tych ustawień dla innych obrazów.
    3. Wykonaj ślady klasy TWS.
      1. Użyj narzędzia Linia lub innych kształtów, aby podświetlić niektóre krzyże lub tło. Przynajmniej niektóre wybory tła powinny zawierać spacje między cristae. Narysuj linię nad strukturą, którą chcesz przypisać do dowolnej klasy, a następnie wybierz przycisk Dodaj do po prawej stronie, aby wyświetlić elementy przezroczyste lub tło. Kliknij dwukrotnie ślad, aby usunąć strukturę z tej etykiety.
    4. Przeprowadź szkolenie z klasyfikacji TWS.
      1. Wybierz przycisk Train classifier po lewej stronie, aby wygenerować mapę na podstawie informacji dostarczonych do wtyczki. Nakładkę klas podzielonych na segmenty można włączać i wyłączać za pomocą przycisku Przełącz nakładkę, a krycie nakładki można dostosować w Ustawieniach. Klasyfikator można ponownie wytrenować przy użyciu dodatkowych etykiet. Po spełnieniu oczekiwań wybierz przycisk Pobierz prawdopodobieństwo.
    5. Zmierz cząstki.
      1. Korzystając z mapy prawdopodobieństwa cristae, proguj obraz, aby wygenerować maskę, a następnie przejdź do pozycji Analizuj → Analizuj cząstki. Ogólnie rzecz biorąc, można użyć domyślnego typu progu i dostosować zakres, aby zapewnić uwzględnienie wszystkich cristae. Pomiary dostarczane przez analizę cząstek można dostosować za pomocą Analyze → Set Measurements.
        UWAGA: Przykładowe parametry rozmiaru i kształtu, takie jak powierzchnia, obwód, okrągłość i współczynnik kształtu grzebienia, są mierzone i wyświetlane na podstawie wybranych pomiarów ( Rysunek 2, Rysunek 5A, Tabela uzupełniająca 1).
      2. OPCJONALNIE: Wybierz surowy obraz STED o tych samych wymiarach co obraz zdekonwoluowany i zastosuj ROI z menedżera, a następnie wybierz opcję Zmierz w menedżerze ROI, aby uzyskać wartości intensywności.
    6. Uzyskaj działki liniowe.
      1. Wykresy liniowe zostały wygenerowane na podstawie zdekonwoluowanych obrazów STED. Narysuj linię wielopunktową, dostosuj grubość linii do szerokości kilku pikseli, aby uśrednić szum, a następnie splajn linii, aby pasowała do mitochondriów (Rysunek 2, Rysunek 5B). Wygenerowany w ten sposób wykres liniowy służy do pomiaru odległości między szczytami w celu przedstawienia okresowości i rozmieszczenia cristae w określonym zakresie.
        UWAGA: W związku z tym, gęstość cristae może być podawana jako liczba niezależnych cristae na danym obszarze, określona przez pomiar zewnętrznej części mitochondriów. Obszar mitochondrialny można określić, stosując filtr do zdekonwoluowanego lub surowego obrazu STED w celu wygenerowania maski. Upewnij się, że maska dokładnie pasuje do konturu mitochondriów przed pomiarem obszaru.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje warunki wzrostu komórek dla komórek hodowanych i pierwotnych, koncentrując się na obrazowaniu żywych komórek STED i późniejszych analizach grzebień mitochondrialnych. Projekcje mitochondriów wykonane za pomocą ImageJ z niezróżnicowanych komórek SH-SY5Y (Figura 3A) i RA-różnicowana SH-SY5Y (Figura 3B) można zebrać jako stosy z tradycyjnymi konfokalnymi i STED, a surowe obrazy STED można następnie zdekonwoluować. Można również wykonać obrazowanie poklatkowe, a następnie zdekonwoluować (Rysunek 3C,D). Używając nieco innych parametrów obrazowania dla pierwotnych neuronów hipokampa szczura (Tabela 1), konfokalne i surowe obrazy STED można uzyskać jako stosy z, a surowe obrazy STED można zdekonwoluować (Rysunek 4A). Możliwe jest również obrazowanie poklatkowe mitochondriów z pierwotnych neuronów (Rysunek 4B). Ogólnie rzecz biorąc, obrazy poklatkowe powinny być w stanie pokazać dynamiczne zdarzenia mitochondrialne.

Gdy surowe projekcje STED i dekonwolucji STED z-stack z próbek użytych do segmentacji wydają się spójne, wykonywane są pomiary ilościowe. Wtyczka TWS wykorzystuje zdekonwoluowany obraz STED do segmentacji w celu utworzenia maski prawdopodobieństwa, która jest następnie używana do tworzenia binarnej maski grzebienia w celu uzyskania parametrów rozmiaru i kształtu (Rysunek 5A). Obszary z tej maski są zapisywane w menedżerze ROI i w razie potrzeby można je zastosować do surowego obrazu STED w celu zmierzenia różnic w intensywności względnej. Zdekonwolucyjne projekcje STED mogą być również wykorzystane do określenia okresowości i gęstości cristae na danym obszarze (Rysunek 5B).

Schemat struktury mitochondrium; etykiety: Crista, Matrix, Membrany; badanie biologii komórkowej.
Rysunek 1: Morfologia mitochondriów. Mitochondria mają system dwubłonowy, który definiuje różne podprzedziały (A). Cristae to fałdy błony wewnętrznej o określonych cechach (B). Skróty: OMM, zewnętrzna błona mitochondrialna; ICS, przestrzeń wewnątrzkrystaliczna; IMS, przestrzeń międzybłonowa; CM, błona grzebienia; IBM, wewnętrzna membrana graniczna; IMM, wewnętrzna błona mitochondrialna; CT, końcówka cristae; CJ, skrzyżowanie cristae. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Proces obrazowania mitochondriów z wykorzystaniem mikroskopii STED; Diagram przetwarzania i analizy obrazu.
Rysunek 2: Schemat przepływu pracy. Komórki SH-SY5Y lub pierwotne neurony hipokampa szczura są hodowane na szkle nakrywkowym pokrytym PDL. Komórki SH-SY5Y są hodowane równolegle, aby pozostały niezróżnicowane lub podlegały różnicowaniu RZS w ciągu sześciu dni. Pierwotne neurony hipokampa szczura hodowano na szkle pokrytym PDL po izolacji z odcinków hipokampa przez siedem dni. Gdy komórki były gotowe do obrazowania, wybarwiono je za pomocą PKMO i zobrazowano za pomocą STED. Surowe obrazy STED są następnie dekonwoluowane, a obrazy bez konwolucji są przetwarzane na FIDŻI w celu uzyskania pomiarów rozmiaru i kształtu, takich jak gęstość grzebienia, obszar, obwód, okrągłość i współczynnik proporcji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Obrazy mikroskopowe STED; komórki niezróżnicowane vs. zróżnicowane; sekwencja czasowa; Skala 250 nm.
Rysunek 3: Obrazowanie mitochondriów w komórkach SH-SY5Y. Pokazano reprezentatywne konfokalne (po lewej), surowe STED (w środku) i zdekonwolucyjne projekcje stosu STED obrazu STED (po prawej) mitochondriów z niezróżnicowanych (A) i RA-zróżnicowanych (B) komórek SH-SY5Y z barwieniem PKMO. Pokazano timelapse z 30-sekundowymi interwałami i 5 iteracjami zróżnicowanych komórek SH-SY5Y RA, (C) z wybranymi regionami (białymi polami) rozszerzonymi na (D) przy użyciu przeskalowanych obrazów tych regionów bez interpolacji. Podziałki liniowe: A,B, 250 nm; C,D, 1 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Porównanie mikroskopii STED, vs. raw konfokalne i zdekonwolucyjne obrazy STED, analiza fluorescencyjna.
Rysunek 4: Obrazowanie mitochondriów w pierwotnych neuronach hipokampa szczura. Pokazano reprezentatywne konfokalne (po lewej), surowe STED (w środku) i zdekonwolucyjne STED Huygensa (po prawej) projekcje z-stack mitochondriów z pierwotnych neuronów hipokampa szczura (A). Pokazano timelapse z 25-sekundowymi interwałami i 5 iteracjami mitochondriów w tych neuronach (B). Podziałka skali: A, 250 nm; B, 1 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Obrazy i wykres z mikroskopii dekonwolucyjnej przedstawiający rozdzielczość przestrzenną i analizę intensywności.
Rysunek 5: Przetwarzanie zdekonwoluowanych obrazów STED w ImageJ. Reprezentatywne użycie wtyczki Trainable Weka Segmentation do pomiaru rozmiaru i kształtu cristae jest pokazane (A). Od lewej do prawej pokazane są następujące obrazy: zdekonwoluowany obraz STED, mapa prawdopodobieństwa oparta na segmentacji z wtyczki TWS, maska przed progowaniem na FIDŻI przy użyciu mapy prawdopodobieństwa jako danych wejściowych, maska z zarysowanymi ROI oraz ROI nałożone na oryginalny zdekonwoluowany obraz STEM. Wynikowe pomiary powierzchni, obwodu, kołowości i współczynnika kształtu odpowiadające tym obiektom można znaleźć w tabeli uzupełniającej 1. Pokazano wykres liniowy wykorzystujący zdekonwoluowany obraz STED do pomiaru odległości między szczytami jako odczyt gęstości grzebienia (B). Podziałka skali: 0,5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt. szt. szt.
Rozmiar piksela (nm)Czas przebywania (μs)Linia wg.Wzbudzenie 561 nm podczas akwizycji STED (%)Moc wyczerpywania się technologii STED 775 nm (%)Rozmiar kroku (nm)Otworek (AU)Interwał poklatkowy (s)Iteracje poklatkowe
Niezróżnicowany SH-SY5Y2041015202001,0Rozdział 305
SH-SY5Y o różnoraku20-25410-121520-22150-2001,0Rozdział 305
Neurony pierwotne20-2541010252000,7Rozdział 305
UWAGA: Rozmiar piksela może się różnić w zależności od wymagań dotyczących obrazowania i intencji dekonwoluacji obrazów. Do dekonwolucji wymagane jest prawidłowe pobieranie próbek. Rozmiary pikseli dla surowych obrazów STED bez dekonwolucji mogą sięgać do 30 nm.

Tabela 1: Podsumowanie parametrów akwizycji STED. Wyświetlane są ustawienia używane do obrazowania 2D STED dla każdego typu komórek, niezróżnicowanych SH-SY5Y, SH-SY5Y zróżnicowanych RZS i pierwotnych neuronów hipokampa szczura. W przypadku wszystkich filmów poklatkowych wykonano 5 iteracji w różnych odstępach czasu w zależności od wielkości ROI.

Rysunek uzupełniający 1: Obrazowanie komórek SH-SY5Y z dodatkiem β amyloidu (Aβ). Pokazano reprezentatywne konfokalne (po lewej), surowe STED (w środku) i zdekonwolucyjne STED (po prawej) zróżnicowanych komórek SH-SY5Y z barwieniem PKMO (na górze) i Aβ-HiLyte647 (na dole) (A). Pokazano scalone rzuty stosu z surowego PKMO STED (zielony) z surowym Aβ STED (magenta) (B) lub zdekonwoluowanego PKMO STED (zielony) z dekonwoluowanym Aβ STED (magenta) (C). Podziałka skali: 0,5 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Wymiary rozmiaru i kształtu segmentowanych cristae. Pokazano wymiary i kształt obszaru (μm2), obwodu (μm), kolistości i proporcji, odpowiadające obiektom przedstawionym w Rysunek 5A z segmentowanych mitochondriów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Podsumowanie parametrów akwizycji próbek β amyloidu. Wyświetlane są ustawienia używane do obrazowania 2D STED PKMO i Aβ-HiLyte647 w niezróżnicowanych i zróżnicowanych RZS komórkach SH-SY5Y. Konfokalny Aβ-HiLyte647 może być stosowany samodzielnie, ponieważ nie ma określonej struktury do rozwiązania; Obrazy STED Aβ-HiLyte647 są pokazane tutaj dla mniejszych rozmiarów cząstek. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Protokół leczenia β amyloidem. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten przedstawia wykorzystanie ludzkiej linii komórkowej nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y i pierwotnych neuronów hipokampa szczura z nowym barwnikiem PKMO ukierunkowanym na IMM do obrazowania żywych komórek STED. Ze względu na nowość PKMO, obecnie niewiele jest publikacji wykorzystujących ten barwnik do obrazowania na żywo chorób przenoszonych drogą płciową. Wykorzystanie tych typów komórek do obrazowania chorób przenoszonych drogą płciową stanowi wyzwanie, szczególnie dlatego, że komórki neuronalne mają węższe mitochondria. Jednym z ograniczeń tego protokołu jest zastosowany barwnik PKMO, ponieważ może on być toksyczny dla komórek. Różne komórki i linie komórkowe różnie reagują na barwnik, dlatego może być konieczne dostosowanie stężenia barwnika i czasu inkubacji w celu optymalizacji wyników pod kątem silnego sygnału bez uszkadzania komórek. Sugerowanym rozwiązaniem jest obniżenie stężenia i wydłużenie czasu barwienia63; Może to jednak skutkować gorszym wybarwieniem bez zwiększania żywotności komórek.

Podobnie jak PKMO, komercyjny barwnik Live Orange mito (Tabela Materiałów) również wykazuje pewną toksyczność komórkową. Barwnik ten był używany do różnych hodowanych komórek, ale nie był w stanie wykazać porównywalnego barwienia w komórkach SH-SY5Y zróżnicowanych RA, z powodzeniem o tych samych parametrach, co ich niezróżnicowane odpowiedniki (nasze niepublikowane obserwacje). Jednak podatne protokoły barwienia mogą być zoptymalizowane dla tej sondy i wybranych typów komórek. W przypadku tego barwnika zastosowano czasy bramkowania detektora od 1-1,05 do 7-7,05 ns, przy czym wszystkie inne parametry w tabeli 1 pozostały bez zmian. Ogólnie rzecz biorąc, barwienie komórek 200-250 nM Live Orange mito przez 45 minut dało porównywalne wyniki, jak wykazały wyniki PKMO. Barwienie o wyższym stężeniu przez krótszy czas lub barwienie o niższym stężeniu przez ten sam czas lub nieco dłużej może przynieść różne wyniki i może być korzystne dla innych typów komórek lub warunków wzrostu.

Obrazowanie pierwotnych neuronów hipokampa szczura różni się od komórek unieśmiertelnionych ze względu na charakter projekcji aksonów i dendrytów, a także rozmieszczenie mitochondriów w czasie obrazowania. Jedną z trudności w tej części protokołu jest to, że gęstość wysiewu określa, czy pierwotne kultury będą w stanie przylegać i zdrowo rosnąć, a przy wyższych gęstościach projekcje mają tendencję do przerastania do DIV 10. Dlatego mitochondria zobrazowane z tych pierwotnych neuronów prawdopodobnie będą pochodzić z ciała komórki, a nie z projekcji; Jednak pomyślny wzrost z niższej początkowej gęstości komórek daje lepsze wyniki obrazowania w późniejszym okresie wzrostu. Kluczem jest zapewnienie niskiego tła i nieostrego światła, aby uzyskać najlepszy kontrast dla STED. Aby rozwiać obawy dotyczące populacji komórek, hodowla pierwotnych komórek hipokampa w pożywkach wzrostu neuronów uzupełnionych witaminą B27 zapobiega wzrostowi komórek glejowych, a źródło podaje, że <5% komórek to astrocyty, a brak suplementu NbActiv1 w pożywce wzrostowej zmniejsza liczbę astrocytów w hodowlach do <2%87. Zarówno w przypadku hodowanych komórek SH-SY5Y, jak i pierwotnych neuronów hipokampa szczura, powłoka PDL używana do wzrostu przyczynia się do zamglenia tła na obrazach. Przy ustawieniach podanych w Tabeli 1 osiągnięto wystarczający stosunek sygnału do szumu, a dekonwolucja usuwa większość obserwowanego tła.

Oprócz omówionego tutaj obrazowania, możliwe jest również dodanie zabiegów lub stresu do komórek przed lub w trakcie obrazowania. Na przykład dodanie nadtlenku wodoru tert-butylu (tBHP) indukuje stres oksydacyjny i możliwe jest monitorowanie zmian w mitochondriach w czasie po dodaniu. Dodatek β amyloidu (Aβ) ze znacznikiem fluorescencyjnym pozwala na monitorowanie dystrybucji tego peptydu w stosunku do mitochondriów, a także struktury mitochondriów w czasie. Zdrowie mitochondriów jest silnie związane z chorobą Alzheimera i powszechnie uważa się, że odgrywa rolę w toksyczności Aβ 43,71,72. Warto zauważyć, że status różnicowania komórek SH-SY5Y wpływa na lokalizację prekursora białka Aβ (AβPP)85, a eksperymenty z użyciem AβPP powinny być starannie skonstruowane.

Jako przykład tego, jak można dostosować ten protokół, pokazano, że fluorescencyjny wariant Aβ(1-42)-HiLyte 647 można dodać do komórek barwionych PKMO 15 minut przed obrazowaniem (rysunek uzupełniający 1). Parametry obrazowania są podobne (tabela uzupełniająca 2), przy czym główna różnica polega na tym, że przy obrazowaniu węższych mitochondriów potrzebny jest mniejszy otwór. Obrazowanie Aβ-HiLyte647 za pomocą STED wymaga mniejszego ogólnego wzbudzenia (6%-8%) i wyczerpania STED (10%-12%) mocy lasera oraz mniejszej akumulacji (sześć). Wydłużono również bramkowanie detektora z 0,1 do 10 ns. Chociaż rozdzielczość STED Aβ nie jest konieczna, ogólny stosunek sygnału do szumu i wielkość cząstek Aβ w surowym STED były lepsze niż w przypadku obrazów konfokalnych, a późniejsza dekonwolucja może być również przeprowadzona. Zbieranie obrazów STED i dekonwolucja surowych projekcji z-stosu STED Aβ wydaje się szczególnie przydatne podczas łączenia z surowymi lub zdekonwolującymi obrazami STED plamy PKMO (rysunek uzupełniający 1B,C). Oba kanały zostały zebrane w jednym kroku klatki. Pomiary lokalizacji zależnej od czasu, podobne do tych wymienionych na rysunku 2 i pokazanych na rysunku 5, w stosownych przypadkach, oraz różnic w architekturze cristae można uzyskać po obróbce naprężeniowej lub innych dodatkach.

Inne możliwe metody podwójnego znakowania mitochondriów w żywych komórkach STED, które nie zostały tutaj zgłoszone, ale zostały zgłoszone przez innych, obejmują użycie białek znakowanych SNAP93, białek znakowanych Halo oraz stosowanie innych przepuszczalnych dla komórek barwników o celach ogólnych, takich jak mtDNA63. Warto zauważyć, że strategia znakowania SNAP i Halo wpływa na uzyskaną intensywność sygnału fluorescencji i długowieczność podczas obrazowania94. Ponadto, chociaż protokół ten przedstawia kilka przykładów analiz, które można zastosować do segmentacji mitochondriów, istnieje wiele innych analiz, które pakiety oprogramowania mogą wykonać na tych obrazach.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotne neurony hipokampa szczura zostały dostarczone przez Dr. George'a Lykotrafitisa i Shiju Gu z Wydziału Inżynierii Biomedycznej na Uniwersytecie Connecticut (Storrs, CT, USA). Instrument Abberior STED znajdujący się w Zaawansowanym Zakładzie Mikroskopii Świetlnej w Centrum Otwartych Zasobów i Sprzętu Badawczego został zakupiony dzięki grantowi NIH S10OD023618 przyznanemu Christopherowi O'Connellowi. Badania te zostały sfinansowane z grantu NIH R01AG065879 przyznanego Nathanowi N. Alderowi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% Trypsyna-EDTAGibco25300054
0,4% Błękit trypanowyInvitrogenT10282
0,5% Trypsyna-EDTA, bez czerwieni fenolowejGibco15400054
100 X antybiotykowo-przeciwgrzybiczyGibco15240062
100 X/1,40 UPlanSApo olejek immersyjnyOlympusWyposażony w mikroskop Olympus IX83 do STED konfiguracja opisana w sekcji 4
Kwas all-trans-retinowySigmaR2625
Amyloid-β (1-42, HiLyte Fluor647, 0,1 mg)AnaSpecAS-64161Dostępne inne koniugaty fluorescencyjne
Suplement B27 (50 X), bez surowicyGibco17504044
Licznik komórek (Countess II FL)Life TechnologiesAMQAF1000
WirówkaEppendorf5804-R
Szkiełka licznikoweInvitrogenC10283
Rurki stożkowe (15 mL)Thermo Kuwety Fisher Scientific339650
(ogniwa kwarcowe)Starna Cells, Inc.9-Q-10Używany ze spektrometrem opisanym w sekcji 1.3
DMEM (wysoki poziom glukozy z pirogronianem sodu)Gibco11995073Stosowany do materiałów komórkowych SH-SY5Y zgodnie z opisem w sekcji 1
DMEM (wysoka glukoza bez pirogronianu sodu)Gibco11965092Stosowany do pierwotnych materiałów komórkowych zgodnie z opisem w sekcji 2
DMEM (bez czerwieni fenolowej)Gibco31053028Używany do obrazowania zgodnie z opisem w Sekcja 3
DMSOSigmaD8418
DNAaza I z trzustki bydlęcejSigmaDN25Stosowana do pierwotnych materiałów komórkowych, jak opisano w sekcjach 2.2.1 i 2.2.2
DPBS (bez wapnia, bez magnezu)Gibco14190144
E18 Hipokamp Szczura TkankatransnetyxSDEHP
Etanol (200 dowodów)BioodczynnikiFisher
Surowica bydlęca płodu (FBS), nieinaktywowana termicznieGibco26140079Dla komórek hodowanych, w sekcji 1
Surowica bydlęca płodu (inaktywowana termicznie)Gibco10082147Dla pierwotnej hodowli komórkowej, sekcja 2
Jednostka sterylizacji filtra (0,1 &mikro; m, 500 mL)Wtyczka Thermo Fisher Scientific5660010
FIJI (Is Just ImageJ) i Trainable Weka Segmentation (TWS)---- Bezpłatneoprogramowanie do analizy obrazów typu open source, które zawiera wtyczki, w tym Trainable Weka Segmentation opisane w sekcji 5; Wtyczka TWS od odnośnika 90 tekstu głównego
Suplement GlutaMAX (100 X)Gibco35050061Suplement glutaminy stosowany do pierwotnych materiałów komórkowych opisanych w sekcji 2.1.2
Komory liczące Hausser Scientific bright-Line i Hy-LiteHausser Scientific267110
HBSS (bez wapnia, bez magnezu)Gibco14170120Stosowany do pierwotnych materiałów komórkowych opisanych w sekcjach 2.2.1 i 2.2.2
HEPESGibco15630080
Huygens Professional (V. 20.10)Scientific Volume Imaging (SVI)-Oprogramowanie do dekonwolucji używane w tym protokole i opisane w sekcji 5
Mikroskop odwrócony IX83 z ciągłym autofokusemOlympus-W tym artykule wykorzystano system STED Infinity Line zbudowany wokół mikroskopu odwróconego Olympus IX83, opisanego w sekcji 4
Oprogramowanie Lightbox (V. 16.3.16118)Abberior—Oprogramowanie dostawcy używane do akwizycji obrazu STED, opisane w sekcji 4
Live Orange Mito dyeAbberiorLVORANGE-0146-30NMOLBarwnik ukierunkowany na IMM do obrazowania żywych komórek opisany w Dyskusja
Pożywka neuropodstawowaGibco21103049Stosowany do pierwotnych materiałów komórkowych, o których mowa w sekcji 2.1.2
Nunc Lab-Tek II 2-komorowa szklana pokrywowaNunc155379Można kupić różne komory, ale upewnij się, że szkło nakrywkowe to #1.5
Pipety Pasteura (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific22183632
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Gibco15140122
PKmito Pomarańczowy barwnikSpirochromeSC053
Poli-D-lizynaGibco
SH-SY5Y Linia komórkowaATCCCRL2266
Pirogronian sodu (100 mM)Gibco11360070Stosowany do pierwotnych materiałów komórkowych opisanych w sekcji 2
Spektrometr (GENESYS 180 UV-Vis)Thermo Fisher Scientific840309000
STED Expert Line MikroskopAbberior--Konfigurację STED można dostosować, ale w momencie zakupu instrument był uważany za Abberior' s Linia ekspercka; Krótki opis konfiguracji jest dostępny w sekcji 4 protokołu
Kolba T25 (z powłoką TC, nasadka filtra)Thermo Fisher Scientific156367Dostępne inne naczynia hodowlane i rozmiary
BP28184 Oprogramowanie do dekonwolucji A3890401

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Iovine, J. C., Claypool, S. M., Alder, N. N. Mitochondrial compartmentalization: emerging themes in structure and function. Trends in Biochemical Sciences. 46 (11), 902-917 (2021).
  2. Gupta, A., Becker, T. Mechanisms and pathways of mitochondrial outer membrane protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1862 (1), 148323(2021).
  3. Gordaliza-Alaguero, I., Cantó, C., Zorzano, A. Metabolic implications of organelle-mitochondria communication. EMBO Reports. 20 (9), e47928(2019).
  4. Klecker, T., Westermann, B. Pathways shaping the mitochondrial inner membrane. Open Biology. 11 (12), 210238(2021).
  5. Navarro, A., Boveris, A. The mitochondrial energy transduction system and the aging process. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292 (2), C670-C686 (2007).
  6. Yu, R., Lendahl, U., Nistér, M., Zhao, J. Regulation of mammalian mitochondrial dynamics: opportunities and challenges. Frontiers in Endocrinology. 11, 374(2020).
  7. Horn, A., Raavicharla, S., Shah, S., Cox, D., Jaiswal, J. K. Mitochondrial fragmentation enables localized signaling required for cell repair. The Journal of Cell Biology. 219 (5), e201909154(2020).
  8. Glancy, B., Kim, Y., Katti, P., Willingham, T. B. The functional impact of mitochondrial structure across subcellular scales. Frontiers in Physiology. 11, 541040(2020).
  9. Bahat, A., et al. MTCH2-mediated mitochondrial fusion drives exit from naïve pluripotency in embryonic stem cells. Nature Communications. 9 (1), 5132(2018).
  10. Detmer, S. A., Chan, D. C. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 870-879 (2007).
  11. Bertholet, A. M., et al. Mitochondrial fusion/fission dynamics in neurodegeneration and neuronal plasticity. Neurobiology of Disease. 90, 3-19 (2016).
  12. Zemirli, N., Morel, E., Molino, D. Mitochondrial dynamics in basal and stressful conditions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 564(2018).
  13. Harwig, M. C., et al. Methods for imaging mammalian mitochondrial morphology: a prospective on mitograph. Analytical Biochemistry. 552, 81-99 (2018).
  14. Pánek, T., Eliáš, M., Vancová, M., Lukeš, J., Hashimi, H. Returning to the fold for lessons in mitochondrial crista diversity and evolution. Current Biology. 30 (10), R575-R588 (2020).
  15. Gottschalk, B., Madreiter-Sokolowski, C. T., Graier, W. F. Cristae junction as a fundamental switchboard for mitochondrial ion signaling and bioenergetics. Cell Calcium. 101, 102517(2022).
  16. Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
  17. Frezza, C., et al. OPA1 controls apoptotic cristae remodeling independently from mitochondrial fusion. Cell. 126 (1), 177-189 (2006).
  18. Meeusen, S., et al. Mitochondrial inner-membrane fusion and crista maintenance requires the dynamin-related GTPase Mgm1. Cell. 127 (2), 383-395 (2006).
  19. Patten, D. A., et al. OPA1-dependent cristae modulation is essential for cellular adaptation to metabolic demand. The EMBO Journal. 33 (22), 2676-2691 (2014).
  20. Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. The EMBO Journal. 21 (3), 221-230 (2002).
  21. Strauss, M., Hofhaus, G., Schröder, R. R., Kühlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. The EMBO Journal. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  22. Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of nonbilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
  23. Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of Cell Biology. 30 (2), 269-297 (1966).
  24. Dlasková, A., et al. Mitochondrial cristae narrowing upon higher 2-oxoglutarate load. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1860 (8), 659-678 (2019).
  25. Pérez-Hernández, C. A., et al. Mitochondrial ultrastructure and activity are differentially regulated by glycolysis-, krebs cycle-, and microbiota-derived metabolites in monocytes. Biology. 11 (8), 1132(2022).
  26. Mannella, C. A. Structural diversity of mitochondria: functional implications. Annals of the New York Academy of Sciences. 1147, 171-179 (2008).
  27. Plecitá-Hlavatá, L., Ježek, P. Integration of superoxide formation and cristae morphology for mitochondrial redox signaling. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 31-50 (2016).
  28. Scorrano, L., et al. A distinct pathway remodels mitochondrial cristae and mobilizes cytochrome c during apoptosis. Developmental Cell. 2 (1), 55-67 (2002).
  29. Heath-Engel, H. M., Shore, G. C. Mitochondrial membrane dynamics, cristae remodelling and apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1763 (5-6), 549-560 (2006).
  30. Brandt, T., et al. Changes of mitochondrial ultrastructure and function during ageing in mice and Drosophilia. eLife. 6, e24662(2017).
  31. Kondadi, A. K., et al. Cristae undergo continuous cycles of membrane remodelling in a MICOS-dependent manner. EMBO Reports. 21, e49776(2020).
  32. Quintana-Cabrera, R., Mehrotra, A., Rigoni, G., Soriano, M. E. Who and how in the regulation of mitochondrial cristae shape and function. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 94-101 (2018).
  33. Nielsen, J., et al. Plasticity in mitochondrial cristae density allows metabolic capacity modulation in human skeletal muscle: Enlarged mitochondrial cristae density in athletes. The Journal of Physiology. 595 (9), 2839-2847 (2017).
  34. Afzal, N., Lederer, W. J., Jafri, M. S., Mannella, C. A. Effect of crista morphology on mitochondrial ATP output: A computational study. Current Research in Physiology. 4, 163-176 (2021).
  35. Heine, K. B., Parry, H. A., Hood, W. R. How does density of the inner mitochondrial membrane influence mitochondrial performance. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 324 (2), R242-R248 (2023).
  36. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15, 30(2020).
  37. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: a key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules. 24, 1583(2019).
  38. Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases. Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).
  39. Estes, R. E., Lin, B., Khera, A., Davis, M. Y. Lipid metabolism influence on neurodegenerative disease progression: is the vehicle as important as the cargo. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 788695(2021).
  40. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
  41. Petersen, C. A. H., et al. The amyloid beta-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (35), 13145-13150 (2008).
  42. Gan, X., et al. Inhibition of ERK-DLP1 signaling and mitochondrial division alleviates mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease cybrid cell. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1842 (2), 220-231 (2014).
  43. Baloyannis, S. J., Costa, V., Michmizos, D. Mitochondrial alterations Alzheimer's disease. American Journal of Alzheimer's Disease & Other Dementias. 19 (2), 89-93 (2004).
  44. Tillement, L., Lecanu, L., Papadopoulos, V. Alzheimer's disease: Effects of β-amyloid on mitochondria. Mitochondrion. 11 (1), 13-21 (2011).
  45. Choi, S. Y., et al. C9ORF72-ALS/FTD-associated poly(GR) binds Atp5a1 and compromises mitochondrial function in vivo. Nature Neuroscience. 22 (6), 851-862 (2019).
  46. Smith, E. F., Shaw, P. J., De Vos, K. J. The role of mitochondria in amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience Letters. 710, 132933(2019).
  47. Costa, V., et al. Mitochondrial fission and cristae disruption increase the response of cell models of Huntington's disease to apoptotic stimuli. EMBO Molecular Medicine. 2 (12), 490-503 (2010).
  48. Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease: Mitochondrial and Huntington's disease. The EMBO Journal. 31 (8), 1853-1864 (2012).
  49. Vanisova, M., et al. Mitochondrial organization and structure are compromised in fibroblasts from patients with Huntington's disease. Ultrastructural Pathology. 46 (5), 462-475 (2022).
  50. de Barcelos, I. P., Troxell, R. M., Graves, J. S. Mitochondrial dysfunction and multiple sclerosis. Biology. 8 (2), 37(2019).
  51. Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441, 1157-1161 (2006).
  52. Meng, H., et al. Loss of Parkinson's disease-associated protein CHCHD2 affects mitochondrial crista structure and destabilizes cytochrome c. Nature Communications. 8, 15500(2017).
  53. Lu, L., et al. CHCHD2 maintains mitochondrial contact site and cristae organizing system stability and protects against mitochondrial dysfunction in an experimental model of Parkinson's disease. Chinese Medical Journal. 135 (13), 1588-1596 (2022).
  54. Cogliati, S., et al. Mitochondrial Cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
  55. He, B., et al. Mitochondrial cristae architecture protects against mtDNA release and inflammation. Cell Reports. 41 (10), 111774(2022).
  56. Polo, C. C., et al. Three-dimensional imaging of mitochondrial cristae complexity using cryo-soft X-ray tomography. Scientific Reports. 10, 21045(2020).
  57. Rybka, V., et al. Transmission electron microscopy study of mitochondria in aging brain synapses. Antioxidants. 8 (6), 171(2019).
  58. Mannella, C. A. Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1763 (5-6), 542-548 (2006).
  59. Fry, M. Y., et al. In situ architecture of Opa1-dependent mitochondrial cristae remodeling. biorxiv. , (2023).
  60. Barad, B. A., Medina, M., Fuentes, D., Wiseman, R. L., Grotjahn, D. A. Quantifying organellar ultrastructure in cryo-electron tomography using a surface morphometrics pipeline. The Journal of Cell Biology. 222 (4), 202204093(2023).
  61. Kunz, T. C., Götz, R., Gao, S., Sauer, M., Kozjak-Pavlovic, V. Using expansion microscopy to visualize and characterize the morphology of mitochondrial cristae. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 617(2020).
  62. Yang, Z., et al. Cyclooctatetraene-conjugated cyanine mitochondrial probes minimize phototoxicity in fluorescence and nanoscopic imaging. Chemical Science. 11 (32), 8506-8516 (2020).
  63. Liu, T., et al. Multi-color live-cell STED nanoscopy of mitochondria with a gentle inner membrane stain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (52), e2215799119(2022).
  64. Yang, X., et al. Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe. Nature Communications. 11, 3699(2020).
  65. Zheng, S., et al. Long-term, super-resolution HIDE imaging of the inner mitochondrial membrane in live cells with a cell-permeant lipid probe. biorxiv. , (2022).
  66. Wang, C., et al. A photostable fluorescent marker for the superresolution live imaging of the dynamic structure of the mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15817-15822 (2019).
  67. Feles, S., et al. Streamlining culture conditions for the neuroblastoma cell line sh-sy5y: a prerequisite for functional studies. Methods and Protocols. 5 (4), 58(2022).
  68. Shipley, M. M., Mangold, C. A., Szpara, M. L. Differentiation of the SH-SY5Y human neuroblastoma cell line. Journal of Visualized Experiments. (108), e53193(2016).
  69. Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Neuronal Cell Culture. Amini, S., White, M. K. 1078, Humana Press. 9-21 (2013).
  70. Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. Cancer Research. 33 (11), 2643-2652 (1973).
  71. Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 62 (3), 1403-1416 (2018).
  72. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15, 30(2020).
  73. Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction in aging and alzheimer's disease: strategies to protect neurons. Antioxidants & Redox Signaling. 9 (10), 1647-1658 (2007).
  74. Horn, A., Raavicharla, S., Shah, S., Cox, D., Jaiswal, J. K. Mitochondrial fragmentation enables localized signaling required for cell repair. Journal of Cell Biology. 219 (5), e201909154(2020).
  75. Korecka, J. A., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PLoS ONE. 8 (5), e63862(2013).
  76. Baghel, M. S., Thakur, M. K. Vdac1 downregulation causes mitochondrial disintegration leading to hippocampal neurodegeneration in scopolamine-induced amnesic mice. Molecular Neurobiology. 56 (3), 1707-1718 (2019).
  77. Jiang, S., et al. Mfn2 ablation causes an oxidative stress response and eventual neuronal death in the hippocampus and cortex. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 5(2018).
  78. Mu, Y., Gage, F. H. Adult hippocampal neurogenesis and its role in Alzheimer's disease. Molecular Neurodegeneration. 6, 85(2011).
  79. Rao, Y. L., et al. Hippocampus and its involvement in Alzheimer's disease: a review. 3 Biotech. 12 (2), 55(2022).
  80. Weerasinghe-Mudiyanselage, P. D. E., Ang, M. J., Kang, S., Kim, J. -S., Moon, C. Structural Plasticity of the hippocampus in neurodegenerative diseases. International Journal of Molecular Sciences. 23 (6), 3349(2022).
  81. Retinoic acid = 98 HPLC, powder 302-79-4. SigmaAldrich. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/ (2023).
  82. Poly-D-Lysine. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401 (2023).
  83. Dravid, A., Raos, B., Svirskis, D., O'Carroll, S. J. Optimised techniques for high-throughput screening of differentiated SH-SY5Y cells and application for neurite outgrowth assays. Scientific Reports. 11, 23935(2021).
  84. Hromadkova, L., et al. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) promotes molecular polarization and differentiation of immature neuroblastoma cells into definitive neurons. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1867 (9), 118737(2020).
  85. Riegerová, P., et al. Expression and Localization of AβPP in SH-SY5Y cells depends on differentiation state. Journal of Alzheimer's Disease. 82 (2), 485-491 (2021).
  86. Hoffmann, L. F., et al. Neural regeneration research model to be explored: SH-SY5Y human neuroblastoma cells. Neural Regeneration Research. 18 (6), 1265-1266 (2022).
  87. Abiraman, K., Tzingounis, A. V., Lykotrafitis, G. K. Ca 2 channel localization and regulation in the axon initial segment. The FASEB Journal. 32 (4), 1794-1805 (2018).
  88. E18 Rat Hippocampus. Transnetyx Tissue. , Available from: https://tissue.transnetyx.com/E18-Rat-Hippocampus_4 (2023).
  89. Kmito ORANGE - Probe for live cell imaging of mitochondria. Spirochrome. , Available from: https://spirochrome.com/product/pkmito_orange/ (2023).
  90. Nyquist Calculator. Scientific Volume Imaging. , Available from: https://svi.nl/Nyquist-Calculator (2023).
  91. Segawa, M., et al. Quantification of cristae architecture reveals time-dependent characteristics of individual mitochondria. Life Science Alliance. 3 (7), e2019000620(2020).
  92. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
  93. Stephan, T., Roesch, A., Riedel, D., Jakobs, S. Live-cell STED nanoscopy of mitochondrial cristae. Scientific Reports. 9, 12419(2019).
  94. Erdmann, R. S., et al. Labeling strategies matter for super-resolution microscopy: A comparison between HaloTags and SNAP-tags. Cell Chemical Biology. 26 (4), 584-592 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Live Cell STEDMitochondrial UltrastructureInner Membrane ImagingNeuronal Cell ModelsSuper Resolution MicroscopyCristae ArchitectureSH SY5Y CellsPrimary Rat NeuronsImage DeconvolutionTrainable Weka Segmentation

Powiązane artykuły