Analogowe badanie przesiewowe fentanylu przy użyciu LC-TIMS-TOF MS/MS

Podsumowanie

Metoda badania analogów fentanylu na podstawie czasu ich retencji, mobilności i wzorca fragmentacji spektrometrii mas.

Streszczenie

Użycie fentanylu i pojawienie się analogów fentanylu w ostatnich dziesięcioleciach stało się coraz większym problemem dla całej społeczności. Fentanyl i jego analogi są głównymi czynnikami przyczyniającymi się do śmiertelnych i nieśmiertelnych przedawkowań w Stanach Zjednoczonych. Najnowsze przypadki przedawkowania fentanylu są związane z nielegalnie produkowanym fentanylem i jego ekstremalną siłą działania. W niniejszej pracy opisano wysokoprzepustowy protokół analityczny do badań przesiewowych analogów fentanylu. Zastosowanie komplementarnej chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i tandemowej spektrometrii mas pozwala na separację i przypisanie setek analogów fentanylu z jednej próbki w jednym skanie. Opisane podejście wykorzystuje niedawny rozwój akwizycji zależnej od danych i akwizycji niezależnej od danych przy użyciu równoległej akumulacji w pułapce mobilności, po której następuje sekwencyjna fragmentacja przy użyciu dysocjacji wywołanej zderzeniem. Analogi fentanylu są z pewnością przypisywane na podstawie ich czasu retencji, mobilności i wzorca fragmentacji SM.

Wprowadzenie

Fentanyl i jego analogi są głównymi czynnikami przyczyniającymi się do śmiertelnych i nieśmiertelnych przedawkowań w Stanach Zjednoczonych^1,2. Centrum Kontroli i Prewencji Chorób (CDC) poinformowało, że liczba zgonów związanych z przedawkowaniem syntetycznych opioidów w latach 2013-2021 wyniosła ponad 258 000. Tylko w 2021 roku ponad 68 000 zgonów z powodu przedawkowania można przypisać syntetycznym opioidom, co stanowi 82% wszystkich zgonów związanych z przedawkowaniem w kraju³. Od 2013 roku zidentyfikowano setki analogów fentanylu o różnej sile działania⁴. Wraz z pojawieniem się nielegalnie produkowanych analogów fentanylu, syntetyczny opioid z grupy II sam w sobie pozostaje najpopularniejszym syntetycznym opioidem dostępnym w Stanach Zjednoczonych³. Według Center for Forensic Science Research and Education (CFSRE) najczęściej zgłaszanym analogiem fentanylu w 2022 r. był fluorofentanyl, a dodatkowe syntetyczne opioidy niezwiązane z fentanylem są obecnie wprowadzane do niestabilnej podaży na rynku narkotyków w szybkim tempie⁵.

Ze względu na przytłaczającą ilość fentanylu i jego analogów krążących na rynku narkotykowym, DEA wdrożyła program profilowania sygnatur fentanylu o nazwie Operacja Smok Śmierci, w celu śledzenia metodologii używanej do syntezy tych związków z nadzieją na powiązanie konfiskat narkotyków z ich pochodzeniem⁶. W 2018 r. 94% konfiskat narkotyków zidentyfikowano jako zsyntetyzowane metodą Janssena, podczas gdy pozostałe 6% zsyntetyzowano metodą Siegfrieda⁶. Podstawowa różnica między tymi dwiema metodami polega na obecności analogu fentanylu, benzylu fentanylu, wykrytego jako zanieczyszczenie w metodzie Janssena, podczas gdy obecność despropionylu fentanylu (4-ANPP), metabolitu/prekursora fentanylu, jest zanieczyszczeniem wykrytym podczas syntezy metodą Zygfryda⁷.

Stosowanie chromatografii gazowej i cieczowej w połączeniu ze spektrometrią mas (odpowiednio GC-MS i LC-MS) do ukierunkowanych badań przesiewowych i kwantyfikacji syntetycznych opioidów jest regularnie wdrażane w laboratoriach toksykologicznych. GC-MS został uznany za złoty standard w wykrywaniu narkotyków nadużywanych w próbkach biologicznych. Dostęp do publicznie dostępnych bibliotek widm masowych⁸ oraz oprzyrządowania sprzedawanego jako systemy plug and play⁹ to tylko niektóre z powodów, dla których GC-MS pozostał integralną częścią laboratoriów zarówno do kompleksowych badań przesiewowych, jak i ukierunkowanej kwantyfikacji9^,10. Jednak obecne metody kwantyfikacji GC-MS w literaturze mają zwykle ograniczony zakres analitów¹¹ i szybko stają się przestarzałe i nie mają zastosowania w bieżących pracach. Co ważniejsze, granice wykrywalności i kwantyfikacji nie są porównywalne z metodami LC-MS (< 1 ng/ml)¹², co zwiększa ryzyko uzyskania wyników fałszywie ujemnych. Jedno z takich porównań między GC-MS i LC-MS, które dotyczyło próbek pośmiertnych, wykazało, że spośród 134 pozytywnie zidentyfikowanych przypadków karfentanylu, jednego z najsilniejszych syntetycznych opioidów do tej pory, 104 z tych przypadków były negatywnie przebadane na obecność karfentanylu przy użyciu GC-MS¹³. W laboratoriach analizujących leki GC-MS jest częściej stosowany i może być modyfikowany dla syntetycznych opioidów ze względu na wysokie stężenie analizowanych próbek. Jednak GC-MS jest nadal używany w połączeniu z dodatkowymi technikami, takimi jak spektroskopia transformacji Fouriera w podczerwieni (FT-IR) i skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) w celu potwierdzenia tych związków¹⁴. Zastosowanie GC-MS do analizy próbek biologicznych w toksykologii sądowej wymaga metod przygotowania próbek, które obejmują ekstrakcję tych związków za pomocą ekstrakcji ciecz-ciecz (LLE) lub ekstrakcji do fazy stałej (SPE)¹⁵. LLE można przeprowadzić przy użyciu różnych rozpuszczalników, jednak w laboratorium o wysokiej wydajności LLE może nie być opłacalne lub terminowe. LLE zużywa duże ilości rozpuszczalników, a także objętość próbki, podczas gdy alternatywa, SPE, może być zautomatyzowana i wymaga minimalnej objętości próbki¹⁶. Niedawne badanie GC-MS wykazało oddzielenie 20 różnych izomerycznych analogów fentanylu przy użyciu trzech oddzielnych programów termicznych GC¹⁷. Chociaż separacja linii bazowej między izomerami zakończyła się sukcesem, zastosowanie tej metody do odpowiednich przypadków kryminalistycznych i przepływów pracy jest ograniczone.

LC-MS zyskał popularność w testach kryminalistycznych, szczególnie ze względu na ograniczenia GC-MS, jeśli chodzi o związki nielotne i wrażliwe na ciepło^18,19. Badania przesiewowe LC-MS z wykorzystaniem potrójnych kwadrupolów (QQQ) i oprzyrządowania pułapki jonowej odniosły sukces w wykrywaniu syntetycznych opioidów w niskich stężeniach (<1 ng / ml)^{12,20,21,22,23,24}. Zazwyczaj te metody LC-MS są stosowane jako wtórne metody potwierdzenia w celu uzupełnienia wyników testu immunologicznego i/lub GC-MS. W 2017 roku Shoff i in. w laboratorium toksykologicznym departamentu medycyny sądowej hrabstwa Miami-Dade (MDME) opracowali kompleksową metodę badań przesiewowych dla 44 związków związanych z opioidami przy użyciu ultrawysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (UHPLC)-pułapka jonowa MS^{n 13}. Podobnie jak w przypadku ukierunkowanych metod MRM, ta metoda pułapki jonowej wykorzystywała zaplanowaną listę prekursorów (SPL) zawierającą czasy retencji, jony docelowe prekursora, a także pierwotne jony potomne dla fragmentacji widmowej MS³, gdy było to możliwe. Tym, co odróżnia tę metodę przesiewową od metod opracowanych na potrójnych kwadrupolach i liniowych kwadrupolowych pułapkach jonowych, jest dodatkowa szczegółowość zawarta w danych spektralnych. To, czego ta metoda przesiewowa nie może zapewnić, to analiza ilościowa, która jest rzadko opracowywana na instrumentach pułapek jonowych, a także identyfikacja niewiadomych¹³. Metody LC-QQQ dla syntetycznych opioidów mogą jednocześnie przesiewać i określać ilościowo predefiniowaną listę celów. Stosowanie przejść monitorowania wielu reakcji (MRM) do identyfikacji i kwantyfikacji związków jest zaufaną techniką pozyskiwania danych i jest najpowszechniejszą techniką stosowaną w literaturze do wykrywania syntetycznych opioidów^12,20. Podane zakresy liniowe dla kwantyfikacji szeregu syntetycznych opioidów wahają się od 0,01 do 100 ng / ml, z silniejszymi syntetycznymi opioidami, takimi jak karfentanyl, wykrytymi w zakresie sub-ng/ml^{11,24,25,26,27}.

Separacja izomerycznych syntetycznych opioidów została rozwiązana w metodach LC-MS. Jedna z takich metod rozdzieliła 174 izomeryczne analogi fentanylu w ciągu 16 minut przy użyciu kolumny bifenylowej²⁸. Ponadto wahania parametrów zależnych od LC, takich jak wydajność kolumny, pH w fazie ruchomej i zmiany ciśnienia, powodują przesunięcia w czasie retencji, które należy uwzględnić w testach celowanych ze spójnym monitorowaniem i większymi oknami pobierania (>0,4 min), co może skutkować potencjalnym nakładaniem się tych raz rozwiązanych izomerów. Zbadano dodatkowe techniki chromatograficzne do rozdzielania izomerów, w tym zastosowanie 2-wymiarowej chromatografii cieczowej (2D-LC)²⁹; I chociaż ta technika ma zdolność do zapewnienia ortogonalnej separacji związków, wady przeważają nad zaletami, w tym zbyt długi czas działania, koszty, trudności w opracowaniu metody i użyteczność w porównaniu z alternatywnymi separacjami³⁰.

Spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości (HRMS) staje się coraz bardziej niezawodna w identyfikacji syntetycznych opioidów. Kilka firm produkujących oprzyrządowanie wprowadziło na rynek ukierunkowane metody opracowane w celu identyfikacji szerokiej gamy syntetycznych opioidów w złożonych matrycach biologicznych^19,28,31. Metody te, w przeciwieństwie do wcześniej omówionych metod, mogą przechowywać dane analityczne do analizy wstecznej. W ten sposób próbki, które były wcześniej analizowane z nieokreślonymi wynikami, mogą być później ponownie przeglądane w celu odkrycia nowo zidentyfikowanych związków. To, co odróżnia HRMS od QQQ, to dokładna identyfikacja masy. Podczas gdy obie techniki MS mogą dokładnie oznaczać ilościowo przy niskich stężeniach, udowodniono, że HRMS jest bardziej skuteczny we wstępnych badaniach przesiewowych i odkrywaniu nieznanych związków^32,33,34. HRMS, a w szczególności analizatory MS czasu przelotu (TOF), były w czołówce odkryć NPS, umożliwiając laboratoriom badawczym dostarczanie wrażliwych na czas danych na temat nowych związków zarówno organom ścigania, jak i społeczności naukowej w celu skalowania rozprzestrzeniania się niektórych z tych związków, jednocześnie zwiększając świadomość i edukację³³. Zastosowanie TOF do wykrywania narkotyków stało się niezwykle wszechstronne, z metodami zawierającymi ponad 600 związków oddzielonych w ciągu 10-minutowego programu chromatograficznego. Wcześniejsze badania wykazały zalety spektroskopii ruchliwości uwięzionych jonów (TIMS) sprzężonej z TOF do wykrywania i separacji izomerycznych opioidów³⁵.

Korzystając z ortogonalności pomiędzy chromatografią cieczową, spektrometrią ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrią mas, prezentowana metoda zapewnia szeroką charakterystykę analogów fentanylu w oparciu o czas retencji, wzór izotopowy, ruchliwość i wzór fragmentacji.

Protokół

1. Przygotowanie próbki

1. Po otrzymaniu zestawu do badań przesiewowych analogu fentanylu należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Zawiesić każdą próbkę do końcowego stężenia 400 μg/ml przez dodanie 500 μl czystego metanolu klasy LC/MS.
2. Mieszać za pomocą mieszarki płytkowej lub wirownika z prędkością 400 obr./min przez 1 godzinę lub wirować na średnich obrotach przez 15 min. Po ponownym zawieszeniu przechowywać fiolki w temperaturze -20 °C.
3. Rozcieńczyć każdy wzorzec do końcowego stężenia 1 ng/ml przy użyciu czystego metanolu klasy LC/MS.
4. Grupuj wzorce w grupy, tak aby każda grupa nie zawierała żadnych wzorców izomerycznych. Tabela uzupełniająca 1 zawiera podział 14 grup norm fentanylu.

2. Przygotowanie faz ruchomych HPLC

1. Przygotować ruchomą fazę A (MPA) przy użyciu 5 mM/L mrówczanu amonu (NH₄HCO₂) w_H2Oz 0,05% kwasem mrówkowym (85%).
   1. Odważyć 0,078 g NH₄HCO₂, przelać do kolby miarowej o pojemności 250 ml i napełnić wodą do około 2/3^rd. Zamieszaj, aby dobrze wymieszać.
   2. Po całkowitym rozpuszczeniu dodać 0,125 ml kwasu mrówkowego (85%). Napełnij wodą do linii napełniania (250 ml) i wymieszaj.
2. Przygotować ruchomą fazę B (MPB) przy użyciu 0,05% kwasu mrówkowego w mieszaninie metanolu i acetonitrylu w stosunku 1:1.
   1. Wlać 125 ml acetonitrylu do kolby miarowej i dodawać metanol, aż dotrze do linii napełniania.
   2. Zamieszaj, aby dobrze wymieszać. Dodać 0,125 ml 0,05% kwasu mrówkowego do kolby i wymieszać do homogenizacji.

3. Opracowanie metody HPLC

1. Otwórz oprogramowanie LC na ekranie głównym. W przykładowej tabeli, znajdującej się na środku okna, utwórz nowy protokół.
   1. Opisz kolumnę fiolki z lokalizacją próbki. Opisz kolumnę identyfikatora próbki przy użyciu formatu YYYYMMDD_NAME (deskryptor reprezentatywny). Opasić kolumnę objętościową odpowiednią objętością iniekcji (15 μl).
2. Dodaj adnotację do kolumny ścieżki danych z lokalizacją, w której dane zostaną zapisane.
3. Dane wejściowe metody HPLC
   1. Wybierz pozycję Nowy na pasku w przykładowej tabeli znajdującej się na środku ekranu. W obszarze metody separacji wybierz strzałkę listy rozwijanej i kliknij opcję Nowa metoda w wyskakującym okienku.
   2. Pojawi się nowe okno oznaczone jako metoda separacji, tutaj edytuj czas akwizycji lub metodę systemu struktury kontroli przyrządów (ICF).
   3. Kliknij dwukrotnie przycisk Edytuj metodę, aby system ICF otworzył wyskakujące okienko do edycji gradientu binarnego, jak pokazano na Rysunek 1.
   4. Pod zakładką gradientu binarnego wizualna reprezentacja gradientu znajduje się po lewej stronie, a podział gradientu znajduje się po prawej stronie, ustaw znaczniki czasu, natężenie przepływu oraz stężenia MPA i MPB.
   5. Upewnij się, że czas zatrzymania jest ustawiony na 18 min, natężenie przepływu na 0.400 ml/min, a limit ciśnienia min i max przy 0 psi i 6000 psi.
   6. Ustaw stężenia znacznika czasu w następujący sposób:
      Po 0,00 min ustaw stężenie B na 20,0,
      Po 1,50 min ustaw stężenie B na 25,0,0,
      Po 3.00 min ustaw stężenie B na 27.0.
      Po 6.00 min ustaw stężenie B na 27.0.
      Po 6.50 min ustaw stężenie B na 30.0.
      O 7.00 min ustaw stężenie B na 95.0.
      O godz. 16.00 ustaw stężenie B na 95.0.
      O 16.50 min ustaw stężenie B na 20.0.

4. Inicjalizacja HPLC

1. W sekcji kolumny HPLC należy umieścić kolumnę LC (monolityczna kolumna C18 HPLC 100 mm x 4,6 mm) i osłony kolumn (kolumna ochronna 5 mm x 4,6 mm). Zwróć uwagę na minimalne i maksymalne ciśnienie w kolumnie.
2. Uruchom próbkę ślepej próby (ten sam roztwór buforowy), aby sprawdzić, czy nie ma wycieków i utworzyć linię bazową. Szukaj wycieków. Nieszczelności można było zaobserwować na podstawie wahań ciśnienia w kolumnie. Jeśli występują nieszczelności, określ, skąd mogą pochodzić, i dokręć połączenia.
3. Uruchom próbną ślepą próbę (ten sam roztwór buforowy) przy użyciu żądanego programu LC, aby wstępnie kondycjonować kolumnę.

5. Rozwój metody TIMSTOF MS/MS

1. Otwórz aplikację timsControl. Po lewej stronie okna znajdują się ustawienia MS i TIMS.
   1. W ustawieniach MS ustaw początek i koniec skanowania odpowiednio na 50 m/z i 1800 m/z. Wybierz tryb dodatni dla polaryzacji jonów i wybierz równoległą akumulację-fragmentację szeregową dla trybu skanowania.
   2. W ustawieniach TIMS ustaw tryb na niestandardowy, początek 1/K0 na 0,40 Vs/cm², koniec 1/K0 na 1,85 Vs/cm², czas narastania ustawiony na 150,0 ms i uśrednianie MS ustawione na 1.
2. W dolnym zaznaczeniu kart w obszarze Źródło wykonaj następujące zmiany w dwóch polach ustawień.
   1. W źródle ustaw przesunięcie płyty końcowej na 500 V, kapilarnę na 4500 V, nebulizator na 3,0 bar, suchy gaz na 10,0 l/min i suchą temperaturę na 200 °C.
   2. W ustawieniach pompy strzykawkowej upewnij się, że strzykawka ma pojemność Hamiltona 1 ml, jest włączona aktywność, a natężenie przepływu jest ustawione na 80,0 μl/h.
3. Na karcie Dostrajanie wykonaj następujące zmiany na kartach ustawień Ogólne, Przetwarzanie i TIMS.
   1. Na karcie ustawień ogólnych skonfiguruj następujące sekcje: transfer, komórka kolizji, kwadrupol, ostrość przed TOF i wykrywanie.
      1. W ustawieniach transferu ustaw ugięcie 1 delta na 70,0 V, lejek 1 RF na 341,0 Vpp, energię CID na 0,0 eV, lejek 2 RF na 300,0 Vpp, wielobiegunowy RF na 300,0 Vpp.
      2. W ustawieniach komórki zderzeniowej upewnij się, że energia zderzenia jest ustawiona na 6.0 eV, a RF kolizji na 1200.0 Vpp.
      3. W ustawieniach kwadrupola upewnij się, że energia jonów jest ustawiona na 6.0 eV, a niska masa na 250.00 m/z.
      4. W ustawieniach ostrości przed TOF ustaw czas transferu na 75.0 μs i pamięć impulsów wstępnych na 5.0 μs.
   2. Na karcie ustawień przetwarzania skonfiguruj następujące sekcje: wykrywanie pików widm masowych i wykrywanie pików mobilności.
      1. W ustawieniach pików widm mas odznacz sumę intensywności (obszar) i ustaw próg bezwzględny na 667.
   3. Na karcie TIMS skonfiguruj następujące sekcje: przesunięcia, kontrola zmian jonowych i parametry zaawansowane.
      1. W ustawieniach offsetów ustaw Δt1 do -20,0 V, Δt2 do -100,0 V, Δt3 do 40,0 V, Δt4 do 80,0 V, Δt5 do 0,0 V, Δt6 do 120,0 i ogniwo zderzeniowe do 250,0 V.
      2. W ustawieniach kontroli ładunków jonowych kliknij pole, aby włączyć i ustawić docelową intensywność na 5.00 M.
      3. W parametrach zaawansowanych włącz akumulację zamka do zakresu mobilności.
4. Na karcie MS/MS ustaw tryb skanowania na równoległą akumulację-fragmentację szeregową i skonfiguruj następujące sekcje: jony prekursorowe, planowanie, aktywne wykluczenie, ustawienia energii zderzenia, ustawienia szerokości izolacji i krokowanie TIMS.
   1. Pod jonami prekursorowymi ustaw liczbę równoległych ramp akumulacji szeregowej fragmentacji na 8, ładunek minimalny na 1 i ładunek maksymalny na 5.
   2. W obszarze Ustawienia planowania włącz powtórzenia prekursora. W obszarze aktywnego wykluczenia zaznacz pole wyboru, aby włączyć i ustaw zwolnienie na 0,40 min po.
   3. Nie zmieniaj ustawień energii zderzenia i ustawień szerokości izolacji. Kliknij pole kroku TIMS, aby włączyć.

6. Mobilność i wzorcowanie masy

1. Wykonaj kalibrację zarówno dla domen m/z, jak i mobilności. W ustawieniach kalibracji m/z wybierz jeden z wstępnie załadowanych profili tuning mix z listy referencyjnej, która pojawi się w menu rozwijanym.
2. Aby przeprowadzić kalibrację, należy załadować strzykawkę do TOF roztworem mieszanki strojącej. Po prawej stronie okna użyj ustawień zatytułowanych Tryb kalibracji dla różnych typów kalibracji, które należy ustawić, aby osiągnąć najwyższy wynik.
3. Upewnij się, że wynik jest jak najbardziej zbliżony do 100%. Przełączaj się między liniowym, czwororadycznym i ulepszonym kwadratowym, aby osiągnąć najlepszy wynik.
4. Skalibruj pod kątem mobilności, wykonując kroki 6.1-6.3 używane do kalibracji m/z.
5. Po kalibracji zapisz metodę MS, wybierając kartę Metoda na górnym pasku. Z menu rozwijanego wybierz opcję Zapisz jako, aby wygenerować nowy plik metody MS.

7. Tworzenie metody akwizycji niezależnej od danych (dia) równoległej akumulacji szeregowej

1. Po zebraniu zestawu danych w akwizycji równoległej zależnej od danych (dda) akumulacji równoległej i fragmentacji szeregowej, uruchom eksperymenty w dia. Otwórz aplikację oprogramowania do mobilności jonów i załaduj metodę dda zapisaną w kroku 6.5.
2. Pozostaw wszystkie ustawienia takie same, jak dla ustawienia MS, zmień je z akumulacji równoległej-fragmentacji szeregowej na akumulację dia- akumulację równoległą-fragmentację szeregową.
3. Na dole panelu wybierz zakładkę MSMS, a następnie kliknij Edytor okien, aby otworzyć wyskakujące okienko dia pokazane w Rysunek 2.
4. Załaduj wcześniej zapisany zestaw danych dda (plik .m) za pomocą przycisku otwórz analizę znajdującego się w górnej części wyskakującego okienka.
5. W lewym dolnym rogu pojawi się mapa skupień z oknami z wielokątem okien biegnących po przekątnej wykresu. Kliknij i przeciągnij, aby zmienić rozmiar wielokąta tak, aby pasował do danych na mapie skupień (narożniki można wybrać, klikając dwukrotnie linie boczne, pojawi się punkt, który można przeciągnąć i zmienić jego rozmiar).
6. Po prawej stronie okien znajdują się ustawienia okien. Ustaw szerokość bryły (50 to idź do) i ustaw zakładkę poziomą, oba w Da.
7. Ustaw liczbę okien ruchomości na szerokość masy i nakładanie się w pionie.
8. Kliknij Oblicz okna w prawym dolnym rogu wyskakującego okienka, aby wyświetlić okna z nowymi ustawieniami. Gdy będzie to odpowiednie, kliknij Zastosuj dia-PASEF Windows do metody. Spowoduje to zamknięcie wyskakującego okienka, przywracając je do ekranu głównego.

8. Przetwarzanie danych TOF mobilności jonów HPLC

1. Otwórz oprogramowanie do analizy danych. W lewym górnym rogu kliknij kartę Plik i wybierz Otwórz z listy rozwijanej. W oknie nowych plików wybierz odpowiednie pliki i kliknij przycisk Otwórz.
2. Sprawdź kalibrację. Kliknij prawym przyciskiem myszy nazwę pliku w polu analizy i wybierz Właściwości. Pojawi się okno z etykietą file name_analysis właściwości. Wybierz opcję Calibration Status (Stan kalibracji).
3. Z listy rozwijanej wybierz opcję Kalibracja przyrządu dla spektrometru masowego. Upewnij się, że błąd nie jest większy niż 1 μg/ml. Wybierz opcję Initial Mobility Calibration (Wstępna kalibracja ruchliwości) i upewnij się, że błąd nie jest większy niż 1 μg/ml.
4. Przygotuj chromatogram w oprogramowaniu do analizy danych zgodnie z poniższym opisem.
   1. Kliknij prawym przyciskiem myszy Chromatogram pod nazwą pliku, wybierz Edytuj chromatogram. W polu Wpisz pole rozwijane i wybierz opcję Chromatogram wyekstrahowanych jonów.
   2. W obszarze filtru wybierz opcję Wszystkie MS, a w trybie skanowania wybierz opcję Wszystkie. Ma to na celu wyświetlenie pików interesującej cząsteczki, a nie tylko jej fragmentów.
   3. Poniżej poszukaj dwóch opcji filtrowania do wyboru cząsteczki: masy lub formuły podświetlone na niebiesko.
   4. Jeśli używasz mas do ekstrakcji jonu, wstaw teoretyczne m/z cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania. W tym przypadku wybrać (masa dla reprezentatywnego wyniku) m/z.
   5. Jeśli używasz formuły do ekstrakcji jonu, wprowadź wzór dla cząsteczki, a także formy jonów będące przedmiotem zainteresowania dla chromatogramu. W takim przypadku wybierz protonowany jon, [M+H]⁺.
   6. Ustaw polaryzację na tryb dodatni.
5. Widmo masowe
   1. Kliknij prawym przyciskiem myszy na linii bazowej szczytu związku i przeciągnij do drugiej krawędzi szczytu. Spowoduje to utworzenie masowego spektrum fragmentów w tym czasie przechowywania.
6. Generowanie mobilogramu
   1. Kliknij prawym przyciskiem myszy na lewą zakładkę zatytułowaną mobilogram i wybierz Edytuj mobilogram. Pojawi się okno zatytułowane edytuj ślady mobilogramu. Wykonaj kroki 8.4.2-8.4.7 w celu edycji chromatogramu.
   2. W danych wejściowych czasu przechowywania dodaj zakres czasu przechowywania szczytu zainteresowania.
   3. Po wybraniu parametrów kliknij przycisk Dodaj, a następnie przycisk Ok w prawym górnym rogu okna edycji śladów mobilogramu.
   4. Po krótkim czasie oprogramowanie przetworzy żądane selekcje i wygeneruje chromatogram. Powtórzyć kroki 8.6.1-8.6.3 dla wszystkich jonów w mieszaninie.
   5. Generowanie widm związków
      1. W dolnej części okna widoku widma wybierz pozycję Profil MS i Fragment MS. Pozwoli to na uwzględnienie jonów z pełnego skanowania i PASEF.
      2. W widoku widma kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Kopiuj widma złożone. Dzięki danym widma, które pojawiają się po prawej stronie, znajdź więcej informacji na temat związku, takich jak rozdzielczość, zdolność rozdzielcza, intensywność i stosunek sygnału do szumu (S/N).
   6. przetwarzanie danych
      1. Aby przetworzyć dane, należy ręcznie zintegrować chromatogram i piki ruchliwości, aby uzyskać ważne informacje o interesującej nas cząsteczce.
      2. Kliknij prawym przyciskiem myszy Znajdź i wybierz Integruj tylko chromatogram lub mobilogram. Kliknij lewym przyciskiem myszy i przeciągnij, aby podświetlić żądany szczyt. Zostaną wyświetlone informacje, które obejmują czas przechowywania, obszar, sygnał / numer i mobilność.

Wyniki

Zestaw do badania analogowego fentanylu składający się z 250 wzorców analogowych został podzielony na 14 grup: 12 grup po 17 analogów i 2 grupy po 16 analogów, aby uniknąć zakłóceń m/z. Każdy analog jest dodatkowo charakteryzowany przez ich m/z, czas retencji (RT), ruchliwość (K) i wzorzec fragmentacji MS/MS.

Przykłady separacji izomerycznych są pokazane w Rysunek 3 i Rysunek 4 dla wzoru chemicznego C₂₂H₂₈N₂O₂ i C₂₁H₂₈N₂OS.

Zestaw do badania analogu fentanylu zawiera cztery izomery o wzorze chemicznym C₂₂H₂₈N₂O₂ (zobacz Rysunek 3). Inspekcja klasy Rysunek 4 pokazuje chromatogram jonowy ekstrahowany [M+H]⁺, mobilogramy, wzór izotopowy i wzór fragmentacji MS/MS. Metoksyacetylofentanyl i karbaminian fentanylu dobrze oddzielają się w domenach LC i ruchliwości od para-metoksyacetylofentanylu i B-hydroksyfentanylu. Jednak wyraźne oddzielenie para-metoksyacetylofentanylu i B-hydroksylu fentanylu osiąga się dzięki ich wzorcom fragmentacji.

Zestaw do badań przesiewowych analogu fentanylu zawiera trzy izomery o wzorze chemicznym C₂₁H₂₈N₂OS. Inspekcja klasy Rysunek 4 pokazuje chromatogram jonowy ekstrahowany [M+H]⁺, mobilogramy, wzór izotopowy i wzór fragmentacji MS/MS. A-metylotiofentanyl i (±)-trans-3-metylotiofentanyl rozdzielają się w domenie LC, ale nie w domenie mobilności. Ponadto (±)-trans-3-metylotiofentanyl i (±)-cis-3-metylotiofentanyl rozdzielają się w domenie ruchliwości, a nie w domenie LC. Pokazuje to komplementarność LC i separację ruchliwości, poprawiając identyfikację gatunków izomerycznych poprzez ortogonalność domen. Rysunek 4D podsumowuje ten wynik dostarczony przez LC i mobilność.

Rysunek 1: Rampa gradientu w oprogramowaniu. Okno dialogowe metody systemu ICF gradienty punktów czasowych zastosowanych podczas separacji w zależności od procentowego stężenia B. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: ustawienia okna dia-PASEF. W przypadku metod dia-PASEF MS ustawienia MS/MS są unikatowe. Wykres po lewej stronie przedstawia wielokąty okien skorygowane na podstawie danych zarejestrowanych metodą dda-PASEF. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Typowy chromatogram jonowy ekstrahowany, wyekstrahowany mobilogram i wzmocniona projekcja MS dla opioidów izomerycznych. (A) Struktury metoksyacetylofentanylu, para-metoksyacetylofentanylu, β-hydroksyfentanylu, karbaminianu fentanylu i odpowiedni (B) typowy czas retencji, (C) typowa ruchliwość, (D) sygnał izomeryczny, (E) główne fragmenty i (F) reprezentującej fragmentację. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Typowe chromatogramy jonowe ekstrahowane i mobilogramy ekstrahowane dla opioidów izomerycznych. (A) Struktury α-metylotiofentanylu, (±)-trans-3-metylotiofentanylu i (±)-cis-3-metylotiofentanylu. Dla odpowiednich izomerów (B) typowy czas retencji, (C) typowa ruchliwość, (D) ortogonalność między czasem retencji a ruchliwością. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Grupy mieszane. Poniższa tabela przedstawia, jakie opioidy znajdują się w każdej z 14 mieszanin stworzonych na potrzeby tej procedury. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Analityczne rozdzielanie próbek biologicznych o wysokiej zawartości izomerów może być wyzwaniem analitycznym. W niniejszej pracy opisana metoda ma na celu scharakteryzowanie 29 zestawów izomerów, co daje łącznie 185 analogów z 250 standardowych zestawów opioidów. Podczas przygotowywania grupy testowej ważne jest, aby upewnić się, że nie ma dwóch analogów z m/z, których nie można eksperymentalnie rozróżnić. Opisane tutaj dane wykorzystują standardy, które nie pochodzą z matrycy opartej na człowieku, jeśli ta metoda ma być stosowana w doświadczeniu terenowym; Konieczne są dodatkowe badania z wykorzystaniem matrycy będącej przedmiotem zainteresowania, aby zapewnić możliwość zastosowania metody. Matryca może powodować, że anality jonizują się inaczej niż w eksperymencie bez matrycy, co sprawia, że konieczne jest określenie, jakie dominujące formy jonów będą obserwowane. W analizie identyfikacja opiera się na wzorcach izotopowych najliczniejszych form (np. [M+H]⁺¹ i [M+Na]⁺¹).

Wybór programu LC ma kluczowe znaczenie w przypadkach, gdy izomery nie są rozdzielone w domenie mobilności. Zmniejszenie nachylenia gradientu może zwiększyć specyficzność metody poprzez zwiększenie różnicy między pikami chromatograficznymi.

Podczas analizy danych ważne jest, aby nieistotne sygnały były ignorowane przy określaniu czasu retencji i mobilności. Zalety HRMS pozwalają na uzyskanie wąskich okien m/z (typowa rozdzielczość masowa ~50 000) z dodatkowym filtrowaniem mobilności, redukując w ten sposób szum chemiczny.

Opisana tutaj metoda stanowi bibliotekę referencyjną do badań przesiewowych na obecność analogów fentanylu z nieznanej próbki. Zgłoszony wzorzec fragmentacji RT, K, izotopowy i MS są używane jako kwalifikatory podczas przetwarzania danych i nieznanego przypisania. W porównaniu z tradycyjną analizą MRM LC-QQQ, podczas gdy podobny LOD jest osiągalny 13,19,27, unikalną zaletą jest badanie przesiewowe pod kątem alternatywnych opioidów, które nie zostały uwzględnione w bazie danych wygenerowanej przy użyciu zestawu FID. Każdy nowy opioid będzie wymagał analizy przy użyciu syntetycznego wzorca w celu jego ostatecznej walidacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mrówczan amonu do HPLC	Fluka	17843-50G
Eppendorf  Probówki Safe-Lock do mikrowirówek Snap-Cap	Fisher	05-402-25
ESI-L Mieszanka tuningowa o niskim stężeniu	Agilent	G1969-85000
Zestaw do badań przesiewowych analogu fentanylu (FAS)	Cayman Chemical	9003237, 9003286, 9003380, zestaw 9003381	250 opioidów snthetic, 210 analogów fentanylu, podzielony na jeden zestaw i emergentne wersje panelowe 1-4
Kwas mrówkowy Optima LC/MS	Fisher	A117-50
Kolumna ochronna Onyx (5 x 4,6 mm)	Kolumna ochronna Phenomenex	CHO-7649	do kolumn C18
Monolityczny słup HPLC Onyx C18 (100 x 4,6 mm)	Phenomenex	CHO-7643	kolumna LC C18 z odwróconą fazą
Acetonitryl klasy Optima	Metanol Fisher	A996-4
Optima Fisher		A454-4
Optima klasa wody	Fisher	W7-4
Pipeta	Fisher	05-719-510	zestaw 1-10 i mikro; L, 10-100 i mikro; L oraz 100-1000 i mikro; Pipeta L
Końcówki do pipet 10 i mikro; L	Fisher	94060100
Końcówki do pipet 1000µ L	Fisher	94056710
Końcówki do pipet 200µ L	Fisher	94060310
Mikser płytowy	IKA	MS 3 D S1	IKA MS 3 digtital
Prominence LC-20 CE ultraszybki chromatograf cieczowy	Shimadzu, Japonia		wyposażony w DGU-20A5, LC-20AD, SIL-20AC, CTO-20A, SPD-M20A, CBM-20A, SPD-20A
timsTOF Pro	Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA		instrument timsTOF z PASEF