Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hodowla nicieni na dużą skalę w celu zbadania ich zbiorowych zachowań

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65569

⸱

25 sierpnia 2023

 ,  ,  ,  , 
1Program of Biomedical Science, Graduate School of Integrated Sciences for Life, Hiroshima University, 2Faculty of Design, Kyushu University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj zgłaszany jest system do badania zbiorowych zachowań nicieni poprzez hodowlę ich masowo przy użyciu pożywki agarowej z karmą dla psów. System ten pozwala naukowcom na rozmnażanie dużej liczby robaków dauer i może być stosowany do Caenorhabditis elegans i innych pokrewnych gatunków.

Streszczenie

Zwierzęta wykazują dynamiczne zachowania zbiorowe, co obserwuje się w stadach ptaków, ławicach ryb i tłumach ludzi. Zbiorowe zachowania zwierząt były badane zarówno w dziedzinie biologii, jak i fizyki. W laboratorium naukowcy wykorzystywali różne zwierzęta modelowe, takie jak muszka owocowa i danio pręgowany, przez około sto lat, ale głównym wyzwaniem pozostało badanie złożonych zachowań zbiorowych na dużą skalę, zaaranżowanych przez te genetycznie podatne zwierzęta modelowe. W pracy przedstawiono protokół tworzenia eksperymentalnego systemu zachowań zbiorowych u Caenorhabditis elegans. Rozmnożone robaki wspinają się na pokrywę płytki Petriego i wykazują zbiorowe zachowanie roju. System kontroluje również interakcje i zachowania robaków poprzez zmianę wilgotności i stymulacji świetlnej. System ten pozwala nam badać mechanizmy leżące u podstaw zachowań zbiorowych poprzez zmianę warunków środowiskowych i badanie wpływu lokomocji na poziomie indywidualnym na zachowania zbiorowe za pomocą mutantów. Dzięki temu system jest przydatny w przyszłych badaniach zarówno w fizyce, jak i biologii.

Wprowadzenie

Zarówno nienaukowcy, jak i naukowcy są zafascynowani zbiorowymi zachowaniami zwierząt, jak w przypadku stad ptaków i ławic ryb. Zachowania zbiorowe zostały przeanalizowane w szerokim zakresie dziedzin, w tym w fizyce, biologii, matematyce i robotyce. W szczególności fizyka materii aktywnej jest rozwijającą się dziedziną badań, która koncentruje się na układach złożonych z elementów samonapędzających się, czyli układach rozpraszających, takich jak stada ptaków, ławice ryb, biofilmy ruchliwych bakterii, cytoszkielety złożone z aktywnych cząsteczek oraz grupy samonapędzających się koloidów. Teoria fizyki materii czynnej utrzymuje, że bez względu na to, jak złożone są zachowania jednostek, zbiorowe ruchy ogromnej liczby istot żywych rządzą niewielką liczbą prostych reguł. Na przykład model Vicsek, kandydat do ujednoliconego opisu zbiorowego ruchu samonapędzających się cząstek, przewiduje, że interakcja krótkiego zasięgu w kierunku wyrównania poruszających się obiektów jest wymagana do utworzenia uporządkowanej fazy dalekiego zasięgu z ekscentrycznymi fluktuacjami w 2D, jak w stadach zwierząt1. Szybko rozwijają się odgórne podejścia eksperymentalne odnoszące się do fizyki materii czynnej. Wcześniejsze eksperymenty potwierdziły powstanie uporządkowanej fazy dalekiego zasięgu u Escherichia coli2. Inne ostatnie prace wykorzystywały cells3,4, bacteria5, motile colloids6, or moving proteins7,8. Proste, minimalistyczne modele, takie jak model Vicsek, z powodzeniem opisywały te rzeczywiste zjawiska. W przeciwieństwie do tych jednokomórkowych systemów eksperymentalnych, zbiorowe zachowania zwierząt są zwykle obserwowane na wolności, ponieważ nikt nie może mieć nadziei na przeprowadzenie kontrolowanych eksperymentów na 10 000 prawdziwych ptaków lub ryb.

Biolodzy dzielą te same zainteresowania co fizycy: jak jednostki oddziałują ze sobą i funkcjonalnie zachowują się jako grupa. Jedną z tradycyjnych dziedzin badawczych do analizy indywidualnych zachowań jest neuronauka, w której mechanizmy leżące u podstaw zachowania zostały zbadane na poziomie neuronalnym i molekularnym. Do tej pory opracowano wiele neurobiologicznych podejść oddolnych. Podejścia odgórne w fizyce i podejścia oddolne w biologii mogą być ułatwione przy użyciu zwierząt modelowych, takich jak muszka owocowa, robak Caenorhabditis elegans i mouse9. Znaleziono jednak niewiele informacji na temat zbiorowego zachowania tych modelowych zwierząt na dużą skalę w laboratorium10; Nadal trudno jest przygotować w laboratorium genetycznie zdolne do wykonywania modele zwierząt na dużą skalę. Dlatego w obecnych badaniach nad zachowaniami zbiorowymi w biologii i fizyce naukowcom, którzy zwykle prowadzą badania w laboratorium, trudno jest badać zbiorowe zachowania zwierząt.

W tym badaniu opracowaliśmy metodę hodowli nicieni na dużą skalę, aby badać ich zbiorowe zachowania. System ten pozwala nam zmieniać warunki środowiskowe i badać wpływ lokomocji na poziomie indywidualnym na zachowania zbiorowe za pomocą mutantów10. W fizyce materii czynnej parametry modelu matematycznego mogą być kontrolowane zarówno w eksperymentach, jak i symulacjach, co umożliwia weryfikację tego modelu w celu identyfikacji ujednoliconych opisów. Genetyka służy do zrozumienia mechanizmu obwodu neuronalnego leżącego u podstaw zbiorowego zachowania11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie robaków

UWAGA: Przygotuj dziki szczep N2 Bristol s12 i szczep ZX899 (lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP])13 do obserwacji zachowań zbiorowych i eksperymentów optogenetycznych. Utrzymuj szczep ZX899 w ciemnych warunkach.

  1. Umieść cztery dobrze odżywione dorosłe robaki na 60-milimetrowej płytce zawierającej 14 ml pożywki wzrostowej nicieni (NGM) z agarem i wysianej E. coli OP5012.
  2. Hoduj robaki F1 do głodu na płytce NGM w temperaturze 23 °C przez 7 dni. Wydajność robaków F1 wynosi w tym momencie około 100 robaków na płytkę. Stadia robaków obejmują mieszaną populację dauer i wygłodzonych larw L1.

2. Przygotowanie średnich talerzy z agarem do karmy dla psów (DFA)

  1. Autoklaw szklanej butelki zawierającej 2 g sproszkowanej karmy dla psów i 5 ml 1% pożywki agarowej i schłodzić ją do temperatury pokojowej (Rysunek 1A).
    UWAGA: W tym eksperymencie można użyć innych karm dla psów różnych producentów.

3. Inokulacja robaków na płytki z podłożem DFA

  1. Przenieś niewielkie ilości (około 0,5 g) pożywki DFA na środek płytki NGM wysianej E. coli OP50 (Rysunek 1B). W przypadku eksperymentów optogenetycznych wlej 40 μL 50 μM all-trans-retinal, kofaktora rodopsyny kanałowej 2, na DFA przed inokulacją robaków.
  2. Zbierz wygłodzone robaki z czterech płytek NGM za pomocą autoklawowanej wody.
  3. Umieść mały fragment karmy dla psów (około 0,5 g) na podłożu DFA, w odległości około 2 mm od pokrywki talerza.
  4. Oświetl płytkę NGM światłem ultrafioletowym przez 15 minut w czystej ławce, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
  5. Zebrane robaki (około 400 robaków) należy zaszczepić na pożywce DFA na płytkach NGM. Nie uszczelniaj płytki parafilmem, aby uniknąć zwiększenia wilgotności wewnątrz płytki Petriego i generowania kropelek wody, które zatrzymują robaki na pokrywce.
  6. Rozmnożyć robaki w temperaturze 23 °C i pozwolić im wspinać się do pokrywy płytki przez około 10-14 dni.
    UWAGA: Ponieważ liczba robaków na pokrywkach prawie nie wzrosła po 10-14 dniach, przypuszczano, że robakom prawdopodobnie zabrakło pożywienia.

4. Obserwacja zachowań zbiorowych

  1. W dniu eksperymentu umieść nową płytkę NGM, która nie zawierała E. coli i pożywki agarowej z karmą dla psów, na aluminiowej płytce na stoliku mikroskopu makro zoom (Rysunek 2A). Utrzymuj dolną część tej nowej płytki NGM w temperaturze 23 °C za pomocą regulatora temperatury Peltiera przez co najmniej 5 minut (Rysunek 2B). Następnie zastąp pokrywę tej nowej płytki NGM pokrywką płytki, na którą wspięły się robaki. Użyj soczewki obiektywu (x2, NA = 0,5) jako obiektywu o małym powiększeniu (Rysunek 2A).
  2. Zwiększ temperaturę dolnej części płytki Petriego z 23 °C do 26 °C, aby zmienić wilgotność wewnątrz tej płytki (Rysunek 2).
  3. Zrób zdjęcia wewnętrznej powierzchni pokrywy płyty za pomocą kamery w 20 klatkach s−1 (Dodatkowe wideo S1).
  4. Zapisz uzyskane obrazy w formacie Tagged Image File.

5. Eksperyment optogenetyczny

  1. Użyj lampy rtęciowej o mocy 100 W, aby dostarczyć niebieskie światło, przefiltrowane za pomocą zestawu filtrów. Precyzyjnie kontroluj czas oświetlenia za pomocą systemu żaluzji elektromagnetycznych (Rysunek 2B).
  2. Utrzymuj ZX899 na DFA w tych warunkach przez 5 minut przed zapaleniem się niebieskiego światła.
  3. Oświetlić robaki ZX899 przymocowane do pokrywy płytki Petriego na stoliku mikroskopu utrzymywanym w temperaturze 23 °C.
  4. Zrób zdjęcia wewnętrznej powierzchni pokrywy płyty za pomocą kamery w 20 klatkach s−1 (Dodatkowe wideo S2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym doświadczeniu do obserwacji zachowań zbiorowych wykorzystano nicienie typu dzikiego w stadium dauer. Nicienie hodowano w temperaturze 23 °C przez około 10-14 dni, aż wspięły się na wewnętrzną powierzchnię pokrywy płytki z podłożem DFA. W dniu eksperymentu przeniesiono jedynie pokrywę na nową płytkę NGM bez E. coli oraz podłoża DFA. Dno tej płytki Petriego utrzymywano początkowo w temperaturze 23 °C przy użyciu systemu Peltiera, a następnie zwiększono jej temperaturę do 26 °C. Pod mikroskopem wykonan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu pokazujemy protokół przygotowania systemu do zbiorowego zachowania C. elegans na dużą skalę w laboratorium. Metoda oparta na DFA została pierwotnie opracowana w przypadku Caenorhabditis japonica14 i Neoaplectana carpocapsae Weiser15, z których oba nie są zwierzętami modelowymi. Metoda ta nie została jednak zastosowana do badania zachowań zbiorowych. C. elegans jest genetycznie podatnym zwierzęciem modelowym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Centrum Genetyki Caenorhabditis za dostarczenie szczepów użytych w tym badaniu. Publikacja została zrealizowana przy wsparciu JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (numer grantu JP21H02532), JSPS KAKENHI Grant-in-Aid on the Innovative Areas "Science of Soft Robot" (numer grantu JP18H05474), JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Transformative Research Areas B (numer grantu JP23H03845), PRIME z Japan Agency for Medical Research and Development (numer grantu JP22gm6110022h9904), Program JST-Mirai (numer grantu JPMJMI22G3) oraz Program JST-FOREST (numer grantu JPMJFR214R).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Escherichia coli i C. elegans szczepy
E. coli OP50Caenorhabditis Genetics CenterOP50Pokarm dla C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.
lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP]authorZX899lite-1(ce314) mutant przenoszący geny eksprymujące ChR2 i RFP pod kontrolą mec-4 i unc-122 promotor, odpowiednio
N2 BristrolCaenorhabditis Genetics CenterSzczep C. elegans
Do hodowli robaków
Agar oczyszczony, proszekNakarai tesque01162-15Do przygotowania płytek NGM
All-trans retinalSigma-AldrichR2500Do optogenetyki
Bacto peptonBecton Dickinson211677Do przygotowania płytek NGM
Chlorek wapniaWako036-00485Do przygotowania płytek NGM
CholesterolWako034-03002Do przygotowania płytek NGM
di-Photassium wodorofosforanNakarai tesque28727-95Do przygotowania płytek NGM
Karmadla psów Nihon Karma dla zwierząt VITA-ONEDo przygotowania karmy dla psów agar medium
LB bulion, LennoxNakarai tesque20066-95Do hodowli E. coli OP50
Siarczan magnezu bezwodnyTGIM1890Do przygotowania płytek NGM
Szalki Petriego (60 mm)Nunc150270Do przygotowania płytek NGM
Diwodorofosforan potasuNakarai tesque28720-65Do przygotowania płytek NGM
Chlorek soduNakarai tesque31320-05Do przygotowanie płyt
NGMObservation
ComputerCT rozwiązanieCS6229Windows10 Pro z procesorem Intel Xeon Gold 6238R i 768 GB pamięci RAM
CMOS CameraHamamatsu photonics ORCA-Lightning C14120-20PDo akwizycji danych
Kamera CMOSOlympusDP74Do akwizycji danych
Mikroskop z zestawem SZX-MGFPOlympusMVX10Do akwizycji danych
x2 ObiektywOlympusMV PLAPO 2XCOdległość robocza 20 mm i przysłona numeryczna 0,5
Sterowanie migawką
MigawkaOptoSigmaBSH2-RIXDo sterowania wzorcem czasowym  oświetlenia świetlnego
Sterownik migawkiOptoSigmaSSH-C2B-ADo sterowania wzorcem czasowym oświetlenia świetlnego
Regulator temperatury
PeltieraVICSWLVPU-30Do kontrolowania wilgotności wewnątrz płytki Petriego
STEROWNIK UNI-THEMOAmpereUTC-100Do kontrolowania wilgotności wewnątrz płytki Petriego
Oprogramowanie do akwizycji danych
HCImageHamamatsu photonicsDo akwizycji danych

Bibliografia

  1. Vicsek, T., Czirók, A., Ben-Jacob, E., Cohen, I., Shochet, O. Novel type of phase transition in a system of self-driven particles. Physical Review Letters. 75 (6), 1226-1229 (1995).
  2. Nishiguchi, D., Nagai, K. H., Chaté, H., Sano, M. Long-range nematic order and anomalous fluctuations in suspensions of swimming filamentous bacteria. Physical Review E. 95 (2), 020601-020606 (2017).
  3. Saw, T. B., et al. Topological defects in epithelia govern cell death and extrusion. Nature. 544 (7649), 212-216 (2017).
  4. Kawaguchi, K., Kageyama, R., Sano, M. Topological defects control collective dynamics in neural progenitor cell cultures. Nature. 545 (7654), 327-331 (2017).
  5. Chen, C., Liu, S., Shi, X., Chaté, H., Wu, Y. Weak synchronization and large-scale collective oscillation in dense bacterial suspensions. Nature. 542 (7640), 210-214 (2017).
  6. Bricard, A., Caussin, J. -B., Desreumaux, N., Dauchot, O., Bartolo, D. Emergence of macroscopic directed motion in populations of motile colloids. Nature. 503 (7474), 95-98 (2013).
  7. Sumino, Y., et al. Large-scale vortex lattice emerging from collectively moving microtubules. Nature. 483 (7390), 448-452 (2012).
  8. Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R. Polar patterns of driven filaments. Nature. 467 (7311), 73-77 (2010).
  9. Lin, A., et al. Imaging whole-brain activity to understand behaviour. Nature Reviews Physics. 4 (5), 292-305 (2022).
  10. Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. C. elegans collectively forms dynamical networks. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
  11. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  12. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  13. Stirman, J. N., et al. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 8 (2), 153-158 (2011).
  14. Tanaka, R., Okumura, E., Yoshiga, T. A simple method to collect phoretically active dauer larvae of Caenorhabditis japonica. Nematological Research. 40 (1), 7-12 (2010).
  15. Hara, A. H., Lindegren, J. E., Kaya, H. K. Monoxenic mass production of the entomogenous nematode Neoaplectana carpocapsae. Weiser on dog food/agar medium. 16, 1-8 (1981).
  16. de Bono, M., Bargmann, C. I. Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans. Cell. 94 (5), 679-689 (1998).
  17. Artyukhin, A. B., Yim, J. J., Cheong, M. C., Avery, L. Starvation-induced collective behavior in C. elegans. Scientific Reports. 5, 10647(2015).
  18. Ding, S. S., Schumacher, L. J., Javer, A. E., Endres, R. G., Brown, A. E. Shared behavioral mechanisms underlie C. elegans aggregation and swarming. eLife. 8, 1181(2019).
  19. Chen, Y., Ferrell, J. E. C. elegans colony formation as a condensation phenomenon. Nature Communications. 12 (1), 4947(2021).
  20. Chiba, T., et al. Caenorhabditis elegans transfers across a gap under an electric field as dispersal behavior. Current Biology. 33 (13), 2668-2677 (2023).
  21. Ioannou, C. C., Guttal, V., Couzin, I. D. Predatory fish select for coordinated collective motion in virtual prey. Science. 337 (6099), 1212-1215 (2012).
  22. Couzin, I. D., Krause, J., Franks, N. R., Levin, S. A. Effective leadership and decision-making in animal groups on the move. Nature. 433 (7025), 513-516 (2005).
  23. Sumpter, D. J. T., Krause, J., James, R., Couzin, I. D., Ward, A. J. W. Consensus decision making by fish. Current Biology: CB. 18 (22), 1773-1777 (2008).
  24. Sugi, T., Nishida, Y., Mori, I. Regulation of behavioral plasticity by systemic temperature signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Neuroscience. 14 (8), 984-992 (2011).
  25. Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hodowla nicienizachowanie zbioroweCaenorhabditis eleganszachowanie rojeniamanipulacja rodowiskowaeksperymenty optogenetycznepropagacja nicienimikroskopia makrozoomkontrola wilgotno cigenetyka molekularna
Hodowla nicieni na dużą skalę w celu zbadania ich zbiorowych zachowań
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.