Profilowanie fenotypowe neuronów dopaminergicznych śródmózgowia pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Summary

Ten protokół opisuje hodowlę komórek ludzkich neuronów dopaminergicznych śródmózgowia, a następnie barwienie immunologiczne i generowanie profili fenotypowych neuronów na podstawie uzyskanych mikroskopowych obrazów o wysokiej zawartości, co pozwala na identyfikację zmian fenotypowych spowodowanych modulacjami genetycznymi lub chemicznymi.

Abstract

Choroba Parkinsona (PD) jest związana z szeregiem procesów biologicznych komórek, które powodują utratę neuronów dopaminergicznych (mDA) w śródmózgowiu. Wiele obecnych modeli komórkowych PD in vitro jest nieskomplikowanych i nie uwzględnia wielu fenotypów. Profilowanie fenotypowe w neuronach mDA pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) może rozwiązać te problemy poprzez jednoczesny pomiar szeregu fenotypów neuronalnych w typie komórki istotnym dla PD. W tym miejscu opisujemy protokół uzyskiwania i analizowania profili fenotypowych z dostępnych na rynku ludzkich neuronów mDA. Specyficzny dla neuronów panel barwienia fluorescencyjnego służy do wizualizacji fenotypów związanych z jądrem, α-synukleiną, hydroksylazą tyrozyny (TH) i białkiem związanym z mikrotubulami 2 (MAP2). Opisany protokół profilowania fenotypowego jest skalowalny, ponieważ wykorzystuje płytki 384-dołkowe, automatyczną obsługę cieczy i mikroskopię o wysokiej przepustowości. Użyteczność protokołu jest zilustrowana przy użyciu zdrowych neuronów mDA dawcy i neuronów mDA przenoszących mutację G2019S związaną z PD w genie kinazy powtórzeniowej bogatej w leucynę 2 (LRRK2). Obie linie komórkowe potraktowano inhibitorem kinazy LRRK2 PFE-360 i zmierzono zmiany fenotypowe. Dodatkowo pokazujemy, w jaki sposób wielowymiarowe profile fenotypowe mogą być analizowane przy użyciu klastrowania lub metod klasyfikacji nadzorowanej opartej na uczeniu maszynowym. Opisany protokół szczególnie zainteresuje badaczy zajmujących się modelowaniem chorób neuronalnych lub badających wpływ związków chemicznych na ludzkie neurony.

Introduction

W chorobie Parkinsona (PD) zaburzone są różne procesy biologiczne komórek. Na przykład dysfunkcja mitochondriów, stres oksydacyjny, defekty degradacji białek, zakłócenie transportu pęcherzykowego i funkcji endolizosomalnej są związane z utratą neuronów dopaminergicznych (mDA) w śródmózgowiu, są często obserwowane w PD¹. Dlatego wydaje się, że choroba Parkinsona obejmuje wiele mechanizmów chorobowych, które mogą wchodzić ze sobą w interakcje i pogarszać się nawzajem. Jednym z użytecznych sposobów badania tej mechanistycznej zależności jest stworzenie kompleksowego fenotypowego odcisku palca lub profilu neuronów dopaminergicznych śródmózgowia (mDA).

Profilowanie fenotypowe to podejście, które polega na stworzeniu profilu próbki na podstawie zbioru mierzalnych cech, a po drugie, polega na dokonywaniu prognoz dotyczących próbki na podstawie tego profilu^2,3. Celem profilowania jest uchwycenie różnorodnych cech, z których niektóre mogły nie być wcześniej powiązane z chorobą lub leczeniem³. W rezultacie, profilowanie może ujawnić nieoczekiwane procesy biologiczne. Profilowanie fenotypowe zazwyczaj opiera się na komórkach barwionych fluorescencyjnie, a standaryzowane testy, takie jak malowanie komórek, zostały opracowane w celu stworzenia profili fenotypowych⁴. Ostatnio profilowanie fenotypowe zaczęto na przykład stosować do charakterystyki małych cząsteczek lub dokładnego przewidywania podtypów PD wyłącznie na podstawie fibroblastów pochodzących od pacjenta^5,6. Pomimo tych postępów, profilowanie fenotypowe rzadko stosuje się do komórek zróżnicowanych po mitozie, takich jak neurony mDA pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), które wyrażają mutacje związane z PD, takie jak LRRK2 G2019S. Do istotnych wyzwań związanych z modelami wywodzącymi się z iPSC należy obecność subtelnych lub zmiennych cech patologicznych w zróżnicowanych partiach lub genotypach oraz fakt, że izolowane fenotypy PD nie oddają pełnej złożoności choroby. Ponadto, chociaż modele neuronalne iPSC są fizjologicznie istotne, rzadko są one wykorzystywane w procesach odkrywania leków na chorobę Parkinsona ze względu na obawy związane ze złożonością techniczną^7,8.

Wcześniej opracowaliśmy solidną metodologię do pomiaru wielu patogennotypów patofizjologicznych związanych z PD w ludzkich neuronach mDA, które są zarówno wrażliwe na zmiany fenotypowe wywołane przez związki genetyczne, jak i chemiczne⁹. W tym artykule szczegółowo opisano bardziej zoptymalizowaną wersję tej metodologii do tworzenia profili fenotypowych z neuronów mDA (Rysunek 1). Protokół ten ma kilka zalet w porównaniu z wcześniej opisanymi podejściami do profilowania fenotypowego, takich jak wykorzystanie wysokiej jakości neuronów mDA i odtwarzalność techniczna. Po raz pierwszy protokół ten umożliwia profilowanie fenotypowe w fizjologicznie istotnych postmitotycznych neuronach mDA po zaburzeniach chemicznych w wysoce skalowalny sposób. W pełni zróżnicowane i kriokonserwowane neurony mDA są dostępne na rynku, co znacznie zmniejsza zmienność różnicowania między partiami. Po drugie, zmienność techniczną można jeszcze bardziej ograniczyć poprzez zastosowanie dobrze zdefiniowanego projektu eksperymentalnego (tj. czasu trwania hodowli lub unikania studzienek krawędziowych), zautomatyzowanej obsługi cieczy i zautomatyzowanej mikroskopii. Ponadto przedstawiono tutaj początkowe etapy analizy profilu fenotypowego przy użyciu nienadzorowanych grupowań lub nadzorowanych podejść klasyfikacyjnych, wskazując, w jaki sposób można analizować dane profilowania fenotypowego. Protokół ten będzie przydatny dla badaczy zainteresowanych zmianami fenotypowymi neuronów mDA wywołanymi zaburzeniami genetycznymi lub chemicznymi, szczególnie gdy wymagana jest wysoce skalowalna konfiguracja badania, na przykład podczas kampanii przesiewowych lub gdy ma być badany wpływ mniejszej liczby związków, na przykład w celu określenia efektów toksycznych. Podsumowując, przewiduje się, że zastosowanie profilowania fenotypowego ludzkich neuronów jest cenną techniką badania złożonych fenotypów związanych z chorobą i charakteryzowania efektów komórkowych kandydatów na leki.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie eksperymentalnego protokołu generowania profili fenotypowych opartych na obrazach z ludzkich neuronów mDA pochodzących z iPSC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protocol

1. Przygotowanie podłoża i płytek do wysiewu neuronów (Dzień 1)

1. Aby przygotować płytki do wysiewu neuronów w dniu 1, podgrzej Laminin do temperatury pokojowej (RT) tuż przed użyciem. Przygotować roztwór Lamininy, rozcieńczając roztwór podstawowy Lamininy (0,1 mg/ml) 1/10 w zimnym PBS+/+ (z Ca²⁺ i Mg²⁺).
   UWAGA: Wszystkie odczynniki są wymienione w Tabeli materiałów. Składy roztworów i opisano w tabelach 1-4.
2. Następnie dodać 25 μl roztworu laminy do każdego dołka na 384-dołkowej płytce z poli-D-lizyną (PDL) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Powlekane płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C do jednego tygodnia.
   UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany na okres do jednego tygodnia. Uszczelnij płyty za pomocą folii z tworzywa sztucznego.
3. Przygotować kompletne podłoża konserwacyjne i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca (Tabela 1).

2. Rozmrażanie neuronów (Dzień 0)

1. Aby rozmrozić neurony w dniu 0, podgrzej kąpiel wodną do 37 °C i zrównoważ kompletną pożywkę konserwacyjną do RT, chroniąc ją przed światłem.
2. Wyjąć fiolkę zawierającą uzyskane w handlu zamrożone neurony (patrz tabela materiałów) ze zbiornika z ciekłym azotem i umieścić ją na suchym lodzie. Następnie umieścić fiolkę w łaźni wodnej na 2 minuty. Po całkowitym rozmrożeniu płynu zdezynfekować fiolkę 70% etanolem.
3. Odessać rozmrożone neurony za pomocą pipety P1000 (około 370 μl) i przenieść je do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml bez pipetowania góra-dół. Następnie przepłukać fiolkę 630 μl pożywki Complete Maintenance Medium, dozować kropla po kropli (pod kątem 45°) do probówki o pojemności 50 ml. Mieszaj powoli podczas dozowania.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby dozować pożywkę powoli, kropla po kropli, aby uniknąć osmotycznego pęknięcia komórek. Kąt 45° i lekkie mieszanie minimalizują wysokie lokalne ciśnienie osmotyczne podczas pipetowania.
4. Podobnie, dodaj 1 ml pożywki do kompletnej pożywki konserwacyjnej do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml z pipetą P1000. Następnie powoli dodaj 2 ml pożywki Complete Maintenance Media. Ostrożnie mieszać podczas dozowania.
5. Policz komórki. Przygotować mikroprobówkę z 10 μl błękitu trypanowego i 10 μl zawiesiny komórek i dodać do szkiełka z komory liczenia (10 μl). Liczenie należy wykonywać za pomocą automatycznego licznika komórek (patrz Tabela materiałów) lub ręcznie.
6. Po zliczeniu odwirować probówkę o pojemności 50 ml zawierającą neurony o stężeniu 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Ostrożnie zawiesić osad ponownie za pomocą pipety P1000 i 1 ml pożywki do konserwacji. Następnie dodaj niezbędną objętość, aby osiągnąć pożądane stężenie (300 000 komórek/ml, patrz również następny krok).

3. Zasiewanie neuronów na przygotowanych płytkach (Dzień 0)

1. Aby wysiać neurony na przygotowane płytki w dniu 0, wyjmij pokryte płytki z lodówki, umieść je pod kapturem hodowli komórkowej i pozwól im zrównoważyć się do RT przez około 30 minut.
2. Tuż przed wysiewem należy zassać 15 μl roztworu powlekającego za pomocą automatycznego urządzenia do obsługi cieczy lub 16-kanałowej pipety. Pozostawić około 10 μl na studzienkę, aby zapobiec uszkodzeniu powłoki.
3. Następnie dozuj 50 μl roztworu komórkowego zawierającego 300 000 komórek/ml (przygotowanego w kroku 2.6) na dołek za pomocą 16-kanałowej pipety, co daje 15 000 wysiewanych neuronów na studzienkę i końcową objętość na studzienkę 60 μl.
4. W płytce 384-dołkowej należy unikać używania kolumn 1, 2, 23, 24 oraz rzędów A, B, O i P, aby zminimalizować możliwe efekty krawędzi, które mogą mieć wpływ na profile fenotypowe. Niewykorzystane puste studzienki należy wypełnić 80 μl PBS. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .

4. Zmiana podłoża lub leczenie związkiem (Dzień 3)

1. W zależności od liczby studzienek, należy wstępnie podgrzać odpowiednią ilość Complete Maintenance Medium w temperaturze pokojowej. Chronić przed światłem.
2. Jeśli wymagana jest zmiana podłoża, przejdź do kroku 4.4. Jeśli pożądane jest traktowanie mieszanki, należy sprawdzić stężenie mieszanki i użyty rozpuszczalnik (woda, DMSO, metanol itp.).
3. Przygotuj 1,5 x stężony roztwór związku dla wszystkich pożądanych stężeń, które mają być testowane. Przygotować rozcieńczenia złożone za pomocą Complete Maintenance Medium.
   UWAGA: Jako neutralną kontrolę należy użyć odpowiedniego rozpuszczalnika w tym samym stężeniu, co badany związek. W przypadku stosowania wielu lub nieznanych związków w różnych stężeniach, zaleca się przeprowadzenie oddzielnego doświadczenia dawka-odpowiedź w celu zmierzenia wpływu rozpuszczalnika na profil fenotypowy.
4. Jeśli używany jest automatyczny system pipetowania, dodaj 60 μl 1,5-krotnego roztworu związku do 384-dołkowej płytki do przechowywania. Alternatywnie można użyć pipety 16-kanałowej. Jeśli wymagana jest wymiana pożywki, dodaj zamiast niej 60 μl pożywki do konserwacji.
5. Korzystając z automatycznego systemu pipetowania, odessać i wyrzucić 40 μl pożywki na studzienkę z płytki zawierającej neurony, aby zachować 20 μl/studzienkę. Następnie dodaj 40 μl/basenik 1,5x roztworu złożonego z 384-dołkowej płytki do przechowywania do każdego dołka, aby uzyskać pożądane stężenie końcowe.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby nie wykonywać pełnych zmian pożywki, ale zawsze pozostawiać resztkową pożywkę w studni, aby zapobiec uszkodzeniu dywanu neuronalnego lub powłoki.
6. W przypadku, gdy hodowla neuronów jest wykonywana dłużej niż 6 dni opisanych w tym protokole, należy zmieniać pożywkę co 2-3 dni.

5. Utrwalanie i barwienie neuronów (dni 6 do 7)

1. Aby naprawić i zabarwić neurony w 6 i 7 dniu, użyj automatycznego narzędzia do obsługi płynów na wszystkich etapach dozowania i mycia. Alternatywnie można użyć pipety 16-kanałowej.
2. Przygotuj 10% roztwór Triton X-100, rozcieńczając Triton X-100 w 1x PBS. Wirować, aż roztwór będzie jednorodny. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. Aby naprawić neurony, dozuj 20 μl/studzienkę 16% PFA, co daje 4% stężenie końcowe. Inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej i umyć ją trzykrotnie 1x PBS. Pozostawić 20 μl/studzienkę PBS po ostatnim praniu.
   UWAGA: PFA jest uznawany za substancję niebezpieczną, o której wiadomo, że powoduje toksyczność ustną, skórną i oddechową. Stanowi również zagrożenie dla oczu i może prowadzić do mutacji genetycznych i raka. Właściwe obchodzenie się z PFA wymaga stosowania odpowiednich środków ochrony osobistej, takich jak ochrona oczu i twarzy, a także zapewnienia odpowiedniej wentylacji. Ważne jest, aby zapobiec uwalnianiu PFA do środowiska.
4. W celu przepuszczalności i blokowania przygotuj 2x roztwór blokujący (Tabela 2).
5. Dodać 20 μl/basenik 2x roztworu blokującego (1x stężenie końcowe), inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i przemyć raz PBS. Po umyciu zachowaj 20 μl/studzienkę PBS.
6. W przypadku barwienia przeciwciałami pierwszorzędowymi (patrz Tabela materiałów) należy przygotować 2x bufor do barwienia pierwotnego (Tabela 3).
7. Dodać 20 μl/basenik 2x buforu do barwienia pierwotnego (1x stężenie końcowe) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego ranka, w dniu 7, przemyj trzy razy PBS. Po umyciu pozostawić 20 μl/studzienkę PBS.
8. W przypadku barwienia przeciwciałami wtórnymi (patrz Tabela materiałów) należy przygotować 2x bufor do barwienia wtórnego (Tabela 4).
9. Dodać 20 μl/studzienkę 2x buforu do barwienia wtórnego (1x stężenie końcowe), inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z dala od światła i przemyć trzykrotnie PBS. Pozostawić 100 μl PBS/dobrze po ostatnim praniu.
   1. Dodaj aluminiowe uszczelnienie na płycie, aby zminimalizować parowanie. Alternatywnie przykryj talerz folią plastikową i folią aluminiową. Przejdź do akwizycji obrazu lub przechowuj płytkę w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany na okres do jednego tygodnia. Jeśli zaobserwuje się fluorescencję tła, rozważ wydłużenie czasu blokowania. Jeśli barwienie jest niewystarczające, spróbuj zwiększyć stężenie przeciwciał pierwotnych lub czas inkubacji.

6. Obrazowanie fluorescencyjnie barwionych neuronów (Dzień 7)

1. Uzyskaj obrazy platerowanych, hodowanych i barwionych neuronów w dniu 7. Najlepiej użyć automatycznego konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego (patrz tabela materiałów). Możesz też pozyskać obrazy ręcznie.
2. Uzyskaj kanały Hoechst, TH, α-synukleiny i MAP2 za pomocą laserów 405 nm, 488 nm, 561 nm i 647 nm (Rysunek 2).
   UWAGA: Aby wygenerować wystarczającą ilość szczegółowych danych do profilowania fenotypowego, użyj obiektywu 40x i uzyskaj 16 pól/studnię za pomocą stosów Z składających się z 3 warstw Z oddzielonych od siebie 2 μm. W przypadku wystąpienia uszkodzeń dywanu neuronalnego związanych z pipetowaniem, należy unikać obrazowania tych obszarów.
3. W zależności od mikroskopu i kamery należy oddzielnie dostosować czasy naświetlania i intensywność wzbudzenia dla każdego z czterech kanałów fluorescencyjnych, aby uzyskać optymalny zakres dynamiczny intensywności fluorescencji.
   UWAGA: Oprogramowanie do obrazowania często udostępnia histogram w celu określenia idealnego czasu naświetlania. Jeśli histogram jest przesunięty zbyt mocno w lewo w zakresie niskiego sygnału, oznacza to, że czas ekspozycji jest zbyt krótki lub intensywność wzbudzenia jest zbyt niska. Jeśli po prawej stronie znajduje się ostry klif na maksymalnym poziomie sygnału, wartość sygnału jest nasycona. W takim przypadku należy zmniejszyć intensywność wzbudzenia lub skrócić czas ekspozycji.
4. Przechowuj obrazy w bezstratnym i otwartym formacie, takim jak .tif.

7. Przetwarzanie obrazu (Dzień 8)

1. Segmentacja obrazu i ekstrakcja cech fenotypowych są wymagane do stworzenia ilościowych profili fenotypowych. Użyj oprogramowania PhenoLink do segmentacji obrazu i ekstrakcji cech (Tabela materiałów). Instrukcje dotyczące instalacji PhenoLink można znaleźć w repozytorium GitHub (https://github.com/Ksilink/PhenoLink).
   UWAGA: Segmentacja obrazu służy do identyfikowania i oddzielania różnych obiektów lub regionów na obrazie, podczas gdy ekstrakcja cech fenotypowych służy do analizowania i wyodrębniania odpowiednich informacji z tych regionów. Dostępnych jest kilka alternatywnych rozwiązań programowych, takich jak CellProfiler¹⁰, ImageJ/FIJI¹¹, Napari¹² lub Knime Analytics Platform¹³ do wyodrębniania informacji ilościowych z wielokanałowych obrazów fluorescencyjnych.
2. Segmentacja obrazu na obrazach RAW z korekcją oświetlenia. Określ empirycznie odpowiednie progi intensywności kanału fluorescencyjnego dla każdej płytki, tak aby sygnał tła był minimalny, a żądany sygnał segmentowy odpowiadał sygnałowi na surowym obrazie. Płytki przetworzone i wybarwione tego samego dnia zazwyczaj wymagają porównywalnych progów intensywności kanału do segmentacji.
3. Określ rozmiar i intensywność jądra, aby oddzielić żywe komórki od martwych. W przypadku korzystania z obrazów 40x zachowaj wszystkie inne parametry domyślne i uruchom oprogramowanie. Dla każdego dołka zostanie obliczonych sto dwadzieścia sześć ilościowych cech obrazu (Tabela uzupełniająca 1).
4. Wykorzystaj uzyskane tabelaryczne dane ilościowe do skonstruowania profili fenotypowych i porównania profili fenotypowych z różnych linii komórkowych lub warunków leczenia. Każdy wiersz odpowiada warunkom biologicznym (studzienkom), a każda kolumna odpowiada określonej cechom fenotypowym.
   UWAGA: Udostępniamy przykładowy plik wyjściowy wraz z potokiem analizy danych, aby zilustrować jego użycie (patrz Tabela materiałów). Dodatkowo, Rysunek 3 przedstawia skład profilu fenotypowego.

8. Generowanie i wizualizacja profilu fenotypowego (Dzień 8)

1. Jeśli na komputerze nie są zainstalowane programy Python i Jupyter, zainstaluj dystrybucję Anaconda i otwórz oprogramowanie Jupyter. Pobierz dostarczony notes Jupyter i wszystkie inne dostarczone pliki i zapisz je w tym samym katalogu (patrz Spis materiałów). Otwórz plik notesu Jupyter przy użyciu oprogramowania Jupyter.
   UWAGA: Anaconda to bezpłatna platforma typu open source dla języków programowania, takich jak Python. Ta platforma jest dostarczana z interpreterem języka Python Jupyter, który może wykonać dostarczony notes Jupyter w celu tworzenia i analizowania profilów fenotypowych (https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling).
2. Wykonaj notatnik Jupyter komórka po komórce przy użyciu oprogramowania Jupyter. Podane przykładowe dane .fth i wymagania .txt plików muszą znajdować się w tym samym katalogu co notes Jupyter. Każda komórka notesu Jupyter jest opatrzona adnotacją w celu wyjaśnienia jej funkcjonalności.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby używać notatnika Jupyter we właściwej kolejności, zaczynając od ładowania i skalowania danych, a następnie przechodzić komórka po komórce do końca. Wszystkie dane wyjściowe i grafiki będą przechowywane w nowo utworzonym folderze w katalogu źródłowym notesu Jupyter. Rysunek 4 przedstawia przepływ pracy i wynik przepływu pracy.

Results

Profilowanie fenotypowe w neuronach mDA jest skutecznym sposobem na ilościowe określenie wielu aspektów biologii komórkowej i ich zmian podczas eksperymentalnej modulacji. Aby zilustrować tę metodologię, w badaniu wykorzystano kriokonserwację LRRK2 G2019S i zdrowe neurony mDA dawcy. Neurony te różnicowały się przez około 37 dni, są postmitotycznym i ekspresyjnymi markerami neuronalnymi (TUBB3 i MAP2) oraz markerami neuronów dopaminergicznych, w tym hydroksylazą tyrozynową (TH) w połączeniu z FOXA2, podczas gdy marker gle...

Discussion

Profilowanie fenotypowe to technika pomiaru dużej liczby fenotypów w komórkach poprzez zastosowanie barwienia fluorescencyjnego, mikroskopii i analizy obrazu³. Profile fenotypowe można uzyskać i porównać między liniami komórkowymi lub w innych warunkach eksperymentalnych, aby zrozumieć złożone zmiany w biologii komórkowej, które mogą pozostać niezauważone przy użyciu pojedynczego odczytu. W tym miejscu opisujemy zastosowanie profilowania fenotypowego do ludzkich neuronów mDA pochodzących z iPSC, t...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anty-kurczak – Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Immunofluorescencyjna
Anakonda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Immunofluorescencyjna
przeciw myszom - Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Immunofluorescencyjny
anty-królik - Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	Immunofluorescencja
Hydroksylaza antytyrozynowa	Merck	T2928	Immunofluorescencja
anty-&alfa;-synukleiny	Abcam	138501	Immunofluorescencja
Bravo Zautomatyzowana platforma do obsługi cieczy z głowicą 384ST	Agilent		Jeśli nie jest dostępna żadna maszyna do obsługi cieczy, zaleca się użycie elektronicznej pipety wielokanałowej.
Mikroskop konfokalny	Yokogawa	CV7000	W celu zapewnienia stałej jakości obrazu zaleca się stosowanie automatycznego konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego.
Hrabina Automatyczny licznik komórek	Invitrogen		Liczenie komórek przed siewem. Można to również zrobić za pomocą ręcznej studzienki liczącej.
DPBS +/+	Gibco	14040-133	Bufor do mycia
EL406 Dozownik do pralki	BioTek (Agilent)		Jeśli nie jest dostępna maszyna do obsługi cieczy, zaleca się użycie elektronicznej pipety wielokanałowej.
Roztwór formaldehydu (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	Utrwalenie przed barwieniem
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Barwienie jądrowe
iCell Base Medium 1	Fujifilm	M1010	Podłoże bazowe dla neuronów
iCell DPN, Donor#01279, Fenotyp AHN, partia#106339, 1M	Fujifilm	C1087	Pozornie zdrowy dawca
iCell DPN, Dawca#11299, Fenotyp LRRK2 G2019S, partia fenotypu PD#106139	Dawca Fujifilm	C1149	z mutacją LRRK2 G2019S
iCell Nervous System Supplement	Fujifilm	M1031	Suplement dla podłoża bazowego
iCell Neural Supplement B	Fujifilm	M1029	Suplement dla podłoża bazowego
Jupyter Python Notebook	Własny https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling rozwojowy		Notebook do wizualizacji i klasyfikacji profilu fenotypowego na podstawie surowych danych.
Laminin	Biolamina	LN521	Powłoka płytkowa
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	Inhibitor kinazy LRRK2
PhenoLink	Własny rozwój	https://github.com/Ksilink/PhenoLink	Oprogramowanie do analizy obrazu
PhenoPlate 384w, powłoka	PDL Perkin Elmer	6057500	Wstępnie powlekana płytka do hodowli komórkowej i obrazowania. Płytka ta umożliwia obrazowanie wszystkich dołków przy użyciu wszystkich obiektywów mikroskopu Yokogawa CV7000.
Płyty magazynowe Abgene 120 µ L	Thermo Scientific	AB-0781	Niezbędny do dozowania mieszanek przy użyciu systemu pipetowania Vprep. Jeśli nie jest dostępna, zaleca się użycie elektronicznej pipety wielokanałowej.
Triton	Sigma	T9284	Permeabilizacja przed lizą
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	Oznaczanie żywych komórek
System pipetowania Vprep	Wymiana pożywki Agilent		i dozowanie mieszanki. Alternatywnie można użyć elektronicznej pipety wielokanałowej.