Profilowanie fenotypowe neuronów dopaminergicznych śródmózgowia pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Amélie Weiss; Peter Sommer; Johannes H. Wilbertz

doi:10.3791/65570

Method Article

Profilowanie fenotypowe neuronów dopaminergicznych śródmózgowia pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

DOI:

10.3791/65570

⸱

July 7th, 2023

Amélie Weiss¹ , Peter Sommer¹ , Johannes H. Wilbertz¹

¹Ksilink

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje hodowlę komórek ludzkich neuronów dopaminergicznych śródmózgowia, a następnie barwienie immunologiczne i generowanie profili fenotypowych neuronów na podstawie uzyskanych mikroskopowych obrazów o wysokiej zawartości, co pozwala na identyfikację zmian fenotypowych spowodowanych modulacjami genetycznymi lub chemicznymi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Parkinsona (PD) jest związana z szeregiem procesów biologicznych komórek, które powodują utratę neuronów dopaminergicznych (mDA) w śródmózgowiu. Wiele obecnych modeli komórkowych PD in vitro jest nieskomplikowanych i nie uwzględnia wielu fenotypów. Profilowanie fenotypowe w neuronach mDA pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) może rozwiązać te problemy poprzez jednoczesny pomiar szeregu fenotypów neuronalnych w typie komórki istotnym dla PD. W tym miejscu opisujemy protokół uzyskiwania i analizowania profili fenotypowych z dostępnych na rynku ludzkich neuronów mDA. Specyficzny dla neuronów panel barwienia fluorescencyjnego służy do wizualizacji fenotypów związanych z jądrem, α-synukleiną, hydroksylazą tyrozyny (TH) i białkiem związanym z mikrotubulami 2 (MAP2). Opisany protokół profilowania fenotypowego jest skalowalny, ponieważ wykorzystuje płytki 384-dołkowe, automatyczną obsługę cieczy i mikroskopię o wysokiej przepustowości. Użyteczność protokołu jest zilustrowana przy użyciu zdrowych neuronów mDA dawcy i neuronów mDA przenoszących mutację G2019S związaną z PD w genie kinazy powtórzeniowej bogatej w leucynę 2 (LRRK2). Obie linie komórkowe potraktowano inhibitorem kinazy LRRK2 PFE-360 i zmierzono zmiany fenotypowe. Dodatkowo pokazujemy, w jaki sposób wielowymiarowe profile fenotypowe mogą być analizowane przy użyciu klastrowania lub metod klasyfikacji nadzorowanej opartej na uczeniu maszynowym. Opisany protokół szczególnie zainteresuje badaczy zajmujących się modelowaniem chorób neuronalnych lub badających wpływ związków chemicznych na ludzkie neurony.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W chorobie Parkinsona (PD) zaburzone są różne procesy biologiczne komórek. Na przykład dysfunkcja mitochondriów, stres oksydacyjny, defekty degradacji białek, zakłócenie transportu pęcherzykowego i funkcji endolizosomalnej są związane z utratą neuronów dopaminergicznych (mDA) w śródmózgowiu, są często obserwowane w PD¹. Dlatego wydaje się, że choroba Parkinsona obejmuje wiele mechanizmów chorobowych, które mogą wchodzić ze sobą w interakcje i pogarszać się nawzajem. Jednym z użytecznych sposobów badania tej mechanistycznej zależności jest stworzenie kompleksowego fenotypowego odcisku palca lub profilu neuronów dopaminergicznych śródmózgowia (mD....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie podłoża i płytek do wysiewu neuronów (Dzień 1)

Aby przygotować płytki do wysiewu neuronów w dniu 1, podgrzej Laminin do temperatury pokojowej (RT) tuż przed użyciem. Przygotować roztwór Lamininy, rozcieńczając roztwór podstawowy Lamininy (0,1 mg/ml) 1/10 w zimnym PBS+/+ (z Ca²⁺ i Mg²⁺).
UWAGA: Wszystkie odczynniki są wymienione w Tabeli materiałów. Składy roztworów i opisano w tabelach 1-4.
Następnie dodać 25 μl roztworu laminy do każdego dołka na 384-dołkowej płytce z poli-D-lizyną (PDL) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Powlekane płytki moż....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Profilowanie fenotypowe w neuronach mDA jest skutecznym sposobem na ilościowe określenie wielu aspektów biologii komórkowej i ich zmian podczas eksperymentalnej modulacji. Aby zilustrować tę metodologię, w badaniu wykorzystano kriokonserwację LRRK2 G2019S i zdrowe neurony mDA dawcy. Neurony te różnicowały się przez około 37 dni, są postmitotycznym i ekspresyjnymi markerami neuronalnymi (TUBB3 i MAP2) oraz markerami neuronów dopaminergicznych, w tym hydroksylazą tyrozynową (TH) w połączeniu z FOXA2, podczas gdy marker gle.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Profilowanie fenotypowe to technika pomiaru dużej liczby fenotypów w komórkach poprzez zastosowanie barwienia fluorescencyjnego, mikroskopii i analizy obrazu³. Profile fenotypowe można uzyskać i porównać między liniami komórkowymi lub w innych warunkach eksperymentalnych, aby zrozumieć złożone zmiany w biologii komórkowej, które mogą pozostać niezauważone przy użyciu pojedynczego odczytu. W tym miejscu opisujemy zastosowanie profilowania fenotypowego do ludzkich neuronów mDA pochodzących z iPSC, t.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy są zatrudnieni przez firmę Ksilink.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować wszystkim kolegom z Ksilink za ich cenną pomoc i dyskusje, które doprowadziły do zaprojektowania prezentowanego protokołu.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Anty-kurczak – Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Immunofluorescencyjna
Anakonda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Immunofluorescencyjna
przeciw myszom - Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Immunofluorescencyjny
anty-królik - Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	Immunofluorescencja
Hydroksylaza antytyrozynowa	Merck	T2928	Immunofluorescencja
anty-&alfa;-synukleiny	Abcam	138501	Immunofluorescencja
Bravo Zautomatyzowana platforma do obsługi cieczy z głowicą 384ST	Agilent		Jeśli nie jest dostępna żadna maszyna do obsługi cieczy, zaleca się użycie elektronicznej pipety wielokanałowej.
Mikroskop konfokalny	Yokogawa	CV7000	W celu zapewnienia stałej jakości obrazu zaleca się stosowanie automatycznego konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego.
Hrabina Automatyczny licznik komórek	Invitrogen		Liczenie komórek przed siewem. Można to również zrobić za pomocą ręcznej studzienki liczącej.
DPBS +/+	Gibco	14040-133	Bufor do mycia
EL406 Dozownik do pralki	BioTek (Agilent)		Jeśli nie jest dostępna maszyna do obsługi cieczy, zaleca się użycie elektronicznej pipety wielokanałowej.
Roztwór formaldehydu (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	Utrwalenie przed barwieniem
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Barwienie jądrowe
iCell Base Medium 1	Fujifilm	M1010	Podłoże bazowe dla neuronów
iCell DPN, Donor#01279, Fenotyp AHN, partia#106339, 1M	Fujifilm	C1087	Pozornie zdrowy dawca
iCell DPN, Dawca#11299, Fenotyp LRRK2 G2019S, partia fenotypu PD#106139	Dawca Fujifilm	C1149	z mutacją LRRK2 G2019S
iCell Nervous System Supplement	Fujifilm	M1031	Suplement dla podłoża bazowego
iCell Neural Supplement B	Fujifilm	M1029	Suplement dla podłoża bazowego
Jupyter Python Notebook	Własny https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling rozwojowy		Notebook do wizualizacji i klasyfikacji profilu fenotypowego na podstawie surowych danych.
Laminin	Biolamina	LN521	Powłoka płytkowa
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	Inhibitor kinazy LRRK2
PhenoLink	Własny rozwój	https://github.com/Ksilink/PhenoLink	Oprogramowanie do analizy obrazu
PhenoPlate 384w, powłoka	PDL Perkin Elmer	6057500	Wstępnie powlekana płytka do hodowli komórkowej i obrazowania. Płytka ta umożliwia obrazowanie wszystkich dołków przy użyciu wszystkich obiektywów mikroskopu Yokogawa CV7000.
Płyty magazynowe Abgene 120 µ L	Thermo Scientific	AB-0781	Niezbędny do dozowania mieszanek przy użyciu systemu pipetowania Vprep. Jeśli nie jest dostępna, zaleca się użycie elektronicznej pipety wielokanałowej.
Triton	Sigma	T9284	Permeabilizacja przed lizą
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	Oznaczanie żywych komórek
System pipetowania Vprep	Wymiana pożywki Agilent		i dozowanie mieszanki. Alternatywnie można użyć elektronicznej pipety wielokanałowej.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Panicker, N., Ge, P., Dawson, V. L., Dawson, T. M. The cell biology of Parkinson's disease. The Journal of Cell Biology. 220 (4), 202012095(2021).
Caicedo, J. C., et al. Data-analysis strategies for image-based cell profiling. Nature Methods. 14 (9), 849-863 (2017)....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Profilowanie fenotypowe neuronów dopaminergicznych śródmózgowia pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles