Artykuł metodologiczny

Ekspresja transgenu w hodowanych komórkach przy użyciu nieoczyszczonych rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

DOI:

10.3791/65572

⸱

20 października 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley, 2Biophysics Graduate Group, University of California, Berkeley

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinowany wirus związany z adenowirusem (rAAV) jest szeroko stosowany do klinicznego i przedklinicznego dostarczania genów. Niedocenianym zastosowaniem rAAV jest silna transdukcja hodowanych komórek bez konieczności oczyszczania. Dla badaczy, którzy są nowicjuszami w rAAV, udostępniamy protokół klonowania kaset transgenowych, produkcji prymitywnych wektorów i transdukcji kultur komórkowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinowane wektory wirusowe związane z adenowirusem (rAAV) mogą osiągnąć silną i trwałą ekspresję transgenu bez integracji w szerokim zakresie typów tkanek, co czyni je popularnym wyborem do dostarczania genów w modelach zwierzęcych i w warunkach klinicznych. Oprócz zastosowań terapeutycznych, rAAV są użytecznym narzędziem laboratoryjnym do dostarczania transgenów dostosowanych do potrzeb eksperymentalnych badacza i celów naukowych w hodowanych komórkach. Niektóre przykłady obejmują egzogenne geny reporterowe, kasety nadekspresji, interferencję RNA i narzędzia oparte na CRISPR, w tym te do badań przesiewowych całego genomu. Transdukcja rAAV jest mniej szkodliwa dla komórek niż elektroporacja lub transfekcja chemiczna i nie wymaga żadnego specjalnego sprzętu ani drogich odczynników do produkcji. Surowe lizaty lub kondycjonowane pożywki zawierające rAAV mogą być dodawane bezpośrednio do hodowanych komórek bez dalszego oczyszczania w celu transdukcji wielu typów komórek - niedoceniana cecha rAAV. W tym miejscu przedstawiamy protokoły podstawowego klonowania kaset transgenowych i pokazujemy, jak produkować i stosować surowe preparaty rAAV do hodowanych komórek. Jako dowód zasadności demonstrujemy transdukcję trzech typów komórek, które nie zostały jeszcze zgłoszone w zastosowaniach rAAV: komórek łożyska, mioblastów i organoidów jelita cienkiego. Omawiamy odpowiednie zastosowania surowych preparatów rAAV, ograniczenia rAAV w dostarczaniu genów oraz rozważania dotyczące wyboru kapsydu. Protokół ten przedstawia prostą, tanią i skuteczną metodę dla badaczy, która pozwala osiągnąć produktywne dostarczanie DNA w hodowli komórkowej przy użyciu rAAV bez konieczności pracochłonnego miareczkowania i oczyszczania.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyjaśnienie molekularnych podstaw funkcji komórkowych często wymaga ekspresji transgenicznego DNA w hodowli komórkowej. Aby ulec ekspresji, transgeny muszą przeniknąć przez selektywną błonę komórki i dotrzeć do jądra1,2. Dlatego zdolność do skutecznego omijania fizycznych barier komórki i manipulowania jej centralnymi procesami jest niezbędna do zastosowania transgenezy w celu odkrycia nowych zjawisk biologicznych. Jedno z podejść wykorzystuje wewnętrzną zdolność wirusów do dostarczania i ekspresji obcego DNA3,4.

Wirus związany z adenowirusem (AAV) jest jednym z najmniejszych wirusów ssaków: jego jednoniciowy genom DNA o długości 4,7 kilobazy (kb) zawiera dwa geny, rep (dla replikozy) i cap (dla kapsydu), upakowane wewnątrz 60-merowego kapsydu dwudziestościennego o długości 25 nm. Geny rep/cap mają wiele promotorów, ramek odczytu i produktów splicingu, które kodują co najmniej dziewięć unikalnych białek wymaganych do replikacji, produkcji i pakowania wirusa5,6. Ponadto oba końce genomu zawierają drugorzędowe struktury zwane odwróconymi powtórzeniami końcowymi (ITR), które są niezbędne do replikacji DNA, pakowania genomu i dalszego przetwarzania podczas transdukcji7,8,9,10. ITR są jedynymi elementami DNA, które są wymagane do upakowania genomu w kapsydzie, a zatem AAV można sklonować do celów dostarczania transgenów poprzez zastąpienie genów wirusa rep/cap wybranymi przez badacza elementami regulatorowymi i/lub genami będącymi przedmiotem zainteresowania6. Powstały w ten sposób rekombinowany AAV (rAAV), ze zmodyfikowanym genomem wektorowym (VG), jest szeroko stosowany w klinice w terapii genowej u ludzi i odniósł sukcesy11. Niedocenianym zastosowaniem wektora jest laboratorium; rAAV mogą skutecznie osiągnąć ekspresję transgenu w hodowanych komórkach, aby spełnić eksperymentalne potrzeby badacza12.

Najczęstszą metodą wytwarzania rAAV jest potrójna transfekcja plazmidu do komórek HEK293 lub 293T (Rysunek 1). Pierwszy plazmid, powszechnie nazywany plazmidem cis, zawiera pożądany transgen otoczony przez ITR (pAAV). W zależności od zastosowania, w sprzedaży dostępne są plazmidy cis ze wspólnymi pierwiastkami, takimi jak silne promotory lub narzędzia oparte na CRISPR. Drugi to plazmid pRep / Cap, który zawiera geny rekup i cap AAV typu dzikiego dostarczane w trans - tj. na oddzielnym, niezawierającym ITR plazmidzie, który wyraża elementy regulatorowe i strukturalne, które następnie oddziałują z plazmidem cis - i dlatego nazywa się plazmidem trans. Oprócz fizycznego otaczania VG, kapsyd wpływa na tropizm komórkowy12,13. Dostarczając specyficzny dla serotypu gen kapsydu in-trans, naukowcy są w stanie łatwo zmaksymalizować wydajność transdukcji, wybierając zoptymalizowany serotyp kapsydu dla danej komórki docelowej. Wreszcie, jako Dependoparvovirus, AAV wymaga wirusa pomocniczego, aby aktywować ekspresję rep/cap ze swoich wirusowych promotorów, osiągniętą przez adenowirusowe geny pomocnicze, dostarczone na trzeci plazmid, taki jak pAdΔF614,15. Po 72 godzinach transfekcji potrójnego plazmidu wektor może zostać uwolniony z komórek produkcyjnych do pożywki hodowlanej poprzez powtarzające się cykle zamrażania/rozmrażania. Cała zawartość płytki jest następnie zbierana, a duże zanieczyszczenia komórkowe są usuwane przez wirowanie; otrzymany supernatant pożywki jest surowym preparatem rAAV gotowym do dalszych transdukcji.

Transfekcja komórek HEK 293(T), zbiór wektorów, diagram procesu transdukcji, analiza ekspresji genów.
Rysunek 1: Przegląd surowej produkcji wektorów rAAV. Produkcja i transdukcja surowego rAAV może zostać zrealizowana w ciągu 5 dni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

rAAV może być bardziej korzystne dla dostarczania transgenów w porównaniu do innych metod transfekcji, które są powszechnie kojarzone z toksycznością komórkową, niską wydajnością i drogimi odczynnikami i sprzętem, takimi jak do elektroporacji lub transfekcji chemicznej/opartej na lipidach16,17. rAAV omija te przeszkody i często zapewnia silną ekspresję transgenu przy minimalnej toksyczności i minimalnym czasie pracy. Co ważne, wytworzenie rAAV i zastosowanie go w hodowli komórkowej jest proste i rzadko wymaga oczyszczania wektora z pożywki hodowlanej (Rysunek 1). Dodatkowo, rAAV nie integruje swojego VG z genomem gospodarza, w przeciwieństwie do dostarczania transgenu lentiwirusowego, a tym samym obniża ryzyko mutagenezy insercyjnej18. Pomimo potencjalnych korzyści płynących ze stosowania rAAV do dostarczania transgenów, należy wziąć pod uwagę ograniczenia. Co ważne, rozmiar transgenu, w tym ITR, nie powinien przekraczać 4,9 kb ze względu na fizyczne ograniczenia kapsydu, ograniczając w ten sposób zdolność badacza do skutecznego dostarczania dużych elementów regulatorowych i transgenów. Ponadto, ponieważ rAAV jest wirusem nieintegrującym, transdukcja powoduje przejściową ekspresję transgenu w dzielących się komórkach i może nie być praktyczna dla stabilnej ekspresji. Jednak metody wykorzystujące podwójne szablony Cas9 dostarczane przez rAAV i naprawy ukierunkowanej na homologię (HDR) mogą być używane do stabilnego wstawiania sekwencji w określonych loci genomowych, jeśli badacz sobie tego życzy19.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Akwizycja plazmidu

UWAGA: Ten protokół sklonuje gen będący przedmiotem zainteresowania (GOI) do plazmidu zawierającego ITR z promotorem wirusa cytomegalii (CMV) i sekwencją poli-adenylacji SV40 (pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40). Jednak plazmid ten może być używany bez dalszego klonowania do produkcji rAAV, pakując wygodny podwójny reporter EGFP i lucyferazy. Plazmidy z różnymi elementami regulatorowymi lub do różnych zastosowań, takich jak eksperymenty oparte na CRISPR, są dostępne online i będą przebiegać zgodnie z podobnymi krokami klonowania, jak te poniżej (zobacz dyskusję, aby zapoznać się z dodatkowymi krokami klonowania). Dodatkowo można stosować plazmidy rep/cap lub trans dla różnych serotypów - ten protokół użyje rep/cap dla serotypu 2 AAV.

  1. Kup ukłucia bakteryjne zawierające plazmid cis zawierający ITR, plazmid pomocniczy adenowirusa, plazmid rep/cap i plazmid zawierający GOI. Umieść bakterie na indywidualnych płytkach agarowych zawierających antybiotyki specyficzne dla oporności każdego plazmidu. Inkubować bakterie w temperaturze 30 °C przez noc, aby rosły.
    UWAGA: Jeśli plazmid z GOI nie jest łatwo dostępny do zakupu, syntetyczny fragment DNA (patrz Tabela materiałów) można kupić online. Dodatkowo syntetyczny fragment DNA może być użyty do pominięcia całego procesu PCR, jeśli jest to pożądane.
  2. Wybierz pojedynczą kolonię z każdej płytki i hoduj w 3 ml buforu Luria Bertani (LB) uzupełnionego odpowiednim antybiotykiem w temperaturze 30 °C przez noc, wstrząsając z prędkością 180 obr./min. Przenieść 1 ml bakterii do sterylnej kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml zawierającej 50 ml buforu LB uzupełnionego odpowiednim antybiotykiem. Wstrząsać w temperaturze 30 °C, 180 obr./min przez noc.
  3. Przenieś bakterie do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwiruj przez 20 minut w temperaturze pokojowej 3 000 x g. Odrzucić supernatant. Wyizoluj plazmid za pomocą zestawu midiprep o niskiej zawartości endotoksyn lub bez endotoksyn zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: ITR-y są strukturami niestabilnymi. Aby zapobiec delecjom lub mutacjom ITR, komórki bakteryjne powinny być hodowane w temperaturze 30 °C, aby spowolnić podział komórkowy i złagodzić błędy w replikacji. Aby zwiększyć wydajność i czystość plazmidu, idealny jest zestaw midiprep lub maxiprep. Zaleca się stosowanie zestawu o niskiej zawartości endotoksyn lub bez endotoksyn w celu zmniejszenia dalszego zanieczyszczenia komórek endotoksynami. Nie jest konieczne wykonywanie izolacji plazmidu wewnątrz okapu z przepływem laminarnym, ponieważ zanieczyszczenie preparatu plazmidowego jest mało prawdopodobne, jeśli zostanie przeprowadzone na standardowym stanowisku laboratoryjnym.

2. Klonowanie interesującego genu do plazmidu zawierającego AAV ITR

  1. Otwórz mapę plazmidu zawierającą GOI w oprogramowaniu do przeglądania DNA.
    UWAGA: Pełna kaseta, łącznie z ITR, nie powinna przekraczać 4,9 kb ze względu na ograniczenia fizycznego opakowania kapsydu. Ponadto amplifikacji PCR nie można osiągnąć za pomocą ITR ze względu na struktury drugorzędowe. W związku z tym montaż Gibsona nie jest zalecany do klonowania transgenu rAAV.
    1. Kliknij kartę Sekwencja, aby wyświetlić pełną sekwencję plazmidu. Przewiń do najbardziej oddalonego o 5 stóp obszaru sekwencji GOI i kliknij pierwszy nukleotyd, przeciągając do wewnątrz w kierunku ciała genu, aby utworzyć starter do przodu. Zwolnić po osiągnięciu temperatury topnienia (Tm) ~55 °C.
    2. Kliknij przycisk Forward Primer (Podkład do przekazywania). Ręcznie dołącz sekwencję dla miejsca restrykcji EcoRI (5', GAATTC, 3') na najbardziej wysuniętym na 5' końcu sekwencji startera. Dodatkowo dodaj sześć dodatkowych losowych zasad na końcu 5' tego miejsca restrykcyjnego, aby umożliwić enzymowi skuteczną interakcję z DNA. Kliknij przycisk Dodaj podkład. Zapoznaj się z Rysunek 2, aby zapoznać się z reprezentatywnym przykładem.
    3. Sprawdź podkład, aby upewnić się, że nie tworzy spinek do włosów ani dimerów podkładu (z wyjątkiem miejsca ograniczenia, które jest palindromiczne). Jeśli utworzą się spinki do włosów, zmień losową sekwencję sześciu dodatkowych zasad. Dodatkowo upewnij się, że podkład nie wiąże się nigdzie indziej na plazmidzie.
    4. Powtórz kroki, aby utworzyć odwrócony starter w najbardziej oddalonym o 3 stopy regionie GOI do wewnątrz ciała genu. Kliknij na Reverse Primer i dołącz stronę z ograniczeniami NotI (5' GCGGCCGC 3').
      UWAGA: Rząd Indii nie może zawierać miejsc restrykcyjnych EcoRI lub NotI – w takim przypadku konieczne będzie użycie różnych enzymów restrykcyjnych.
  2. Amplifikować rząd Indii w 50 μl reakcji PCR. Należy użyć wymaganych poszczególnych komponentów z tabeli 1.
    1. Umieść reakcję w termocyklerze i postępuj zgodnie z parametrami cyklu z tabeli 2 w celu programowania. Jeśli startery mają różneTm, użyj dolnego Tm dla programu.
    2. Sprawdź amplifikację prawidłowego fragmentu PCR, dodając 1 μl barwnika ładującego żel (6x) do 5 μl reakcji PCR. Przeprowadź drabinkę DNA i mieszaninę PCR na 0,8% żelu agarozowym zawierającym bromek etydyny i wizualizuj za pomocą światła UV.
      UWAGA: Bromek etydyny jest znanym mutagenem.
    3. Jeśli na żelu pojawi się pojedyncze, specyficzne prążki, należy oczyścić pozostały produkt PCR w probówce z paskiem PCR za pomocą zestawu do czyszczenia PCR opartego na kolumnie, zgodnie z instrukcjami producenta. Jeśli pojawi się wiele prążków (z powodu niespecyficznej amplifikacji), wytnij żądane prążki i oczyść DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Trawić oczyszczony produkt PCR i plazmid szkieletowy pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 w reakcji 50 μl z wymaganymi pojedynczymi składnikami z tabeli 3 przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Wymagana jest większa ilość plazmidowego DNA pAAV ze względu na spodziewaną nieefektywną regenerację po ekstrakcji żelem.
    UWAGA: Stosowane enzymy restrykcyjne to wersje o wysokiej wierności (HF). Zwykły NotI nie może być używany z buforem CutSmart. Jeśli stosowane są różne enzymy, może być wymagana inna temperatura inkubacji i bufor.
    1. Oczyść strawiony produkt PCR za pomocą zestawu do czyszczenia PCR opartego na kolumnie zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Przygotować strawiony plazmid szkieletowy pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 do elektroforezy żelowej, dodając 10 μl barwnika ładującego żel (6x) do 50 μl reakcji trawienia. Załaduj drabinkę DNA, reakcję trawienia i 250 ng niestrawionego plazmidu (kontrola ujemna) na 0,8% żelu agarozowym zawierającym bromek etydyny z dołkami o szerokich zębach. Wizualizuj światłem UV, wytnij żądany fragment (~4,5 kb) i oczyść DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Związać strawiony produkt PCR i strawiony plazmid szkieletowy pAAV w reakcji ligacji 20 μl z wymaganymi pojedynczymi składnikami z tabeli 4. Aby obliczyć ilość potrzebnych produktów PCR, użyj formuły 1. Zazwyczaj stosuje się stosunek molowy produktu PCR (wkładka) do szkieletu (pAAV) wynoszący 3:1 o masie 50 ng kręgosłupa.
    Wstaw wzór na masę, \( \text{Wstaw masę (ng)} = \frac{\text{masa szkieletu (ng) × wstaw długość (kb) × Stosunek}}{\text{długość szkieletu (kb)}} \), równanie do obliczeń klonowania molekularnego. Formuła 1
  5. Przeprowadzić kontrolę ujemną, zastępując produkt PCR wodą. Reakcje ligacji inkubować w temperaturze 16 °C przez noc lub w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  6. Rozmrozić fiolkę z kompetentnymi komórkami bakteryjnymi z niedoborem rekombinacji (takimi jak komórki Stbl3) na lodzie i umieścić 50 μl w probówce o pojemności 1,5 ml. Dodać 3 μl reakcji ligacji bezpośrednio na komórki i inkubować na lodzie przez 30 min.
    UWAGA: ITR są strukturami niestabilnymi i dlatego wymagają szczepów bakteryjnych z niedoborem rekombinacji, aby ograniczyć delecje i zdarzenia rekombinacji ITR. Komórki DH5α mogą być używane sporadycznie do propagacji (jeden lub dwa razy), ale nie są zalecane do długotrwałego stosowania. Integralność ITR powinna być regularnie sprawdzana po oczyszczeniu midiprepu.
    1. Szok termiczny bakterii w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 30 sekund, a następnie natychmiast przenieść do lodu na 2 minuty. Dodać 200 μl buforu LB i wstrząsać przez 1 godzinę w temperaturze 30 °C, 180 obr./min.
    2. Rozprowadzić 125 μl mieszaniny na płytce agarowej z odpowiednim antybiotykiem i inkubować przez noc (~18 godzin) w temperaturze 30 °C. Wybrać wiele klonów i umieścić każdy z nich w sterylnej plastikowej probówce hodowlanej z 3 ml LB zawierającej odpowiedni antybiotyk. Inkubować przez noc, wytrząsając w temperaturze 30 °C, 180 obr./min.
      UWAGA: Aby zapobiec delecjom lub mutacjom ITR, komórki bakteryjne powinny być hodowane w temperaturze 30 °C, aby spowolnić podział komórkowy i złagodzić błędy w replikacji. Dodatkowo należy wybierać mniejsze rodziny, ponieważ te bez ITR mogą mieć przewagę wzrostu nad innymi.
    3. Odpipetować 1,8 ml każdej kultury do probówki o pojemności 2 ml i odwirować przy 6 000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Wyizoluj DNA za pomocą zestawu do miniprzygotowania. Pozostałe 1,2 ml kultury należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Sprawdzić poprawność klonów za pomocą sekwencjonowania DNA lub diagnostycznego trawienia enzymów restrykcyjnych.
      UWAGA: Zalecane jest sekwencjonowanie wkładki metodą Sangera, ale procesywność za pomocą ITR nie jest możliwa do osiągnięcia przy użyciu standardowych metod. ITR powinny być weryfikowane za pomocą przeglądu ograniczeń, jak opisano poniżej.
    4. Dodać 50 ml buforu LB zawierającego odpowiedni antybiotyk do sterylnej kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml. Dodać 500 μl pozostałej kultury do kolby i wstrząsać w temperaturze 30 °C, 180 obr./min, aż do osiągnięcia OD600 0,2-0,5 (~18 h). Przenieść bakterie do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i wirować przez 20 minut w temperaturze 3 000 x g, 4 °C. Wyizolować DNA za pomocą zestawu midiprep o niskiej zawartości endotoksyn lub bez endotoksyn
      5. .
    5. Sprawdź integralność ITR za pomocą 20 μl diagnostycznego enzymu restrykcyjnego przy użyciu XmaI (lub SmaI). Przygotować reakcję zawierającą 500 ng plazmidu, 0,5 μl enzymu i 1x bufor; inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Przeprowadzić reakcję na 0,8% żelu agarozowym. Jeśli ITR są nienaruszone, trawienie da pasmo o wielkości ~2,9 kb i inne pasmo wielkości kasety. Jeśli to wyraźne pasmo nie zostanie zaobserwowane, ITR może nie być nienaruszony, a klonowanie będzie musiało zostać wykonane ponownie.
      UWAGA: Plazmidy zawierające miejsca restrykcyjne XmaI (lub SmaI) (oprócz tych w ITR) będą miały dodatkowe prążki pojawiające się na żelu.

Schemat projektu startera PCR, adnotacja sekwencji DNA, startery do przodu i do tyłu, ciało genu.
Rysunek 2: Reprezentatywny przykład dla projektu podkładu. Projekt startera do przodu i do tyłu dla transgenu mScarlet (reprezentatywny przykład). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

kwotaskładnik
X μLMatrycowy DNA (25 ng)
1 μLPodkład F (10 μM)
1 μLPodkład R (10 μM)
1 μLdNTP (10 mM)
10 μLBufor Phusion (5x)
1 μLPolimeraza Phusion
X μLWoda
50 μLOstatni tom

Tabela 1: Odczynniki do amplifikacji PCR. Składniki niezbędne do udanej reakcji PCR.

kroktemperaturaGodzina
Początkowa denaturacja98 °C1 min
30 cykli98 °C10 sekund
Tm Podkładu30 sekund
72 °C30 s na KB
Końcowe przedłużenie72 °CCzas trwania: 10 min
trzymać4 °CPrzez czas nieokreślony

Tabela 2: Programowanie amplifikacji PCR. Parametry cykliczne wymagane do pomyślnej reakcji PCR.

kwotaskładnik
X μLProdukt PCR (1 μg) lub plazmid pAAV (3 μg)
5 μL Bufor (10x)
1 μLEcoRI-HF
1 μLNotI-HF
X μLWoda
50 μLOstatni tom

Tabela 3: Odczynniki do mineralizacji. Składniki niezbędne do udanej reakcji trawienia.

kwotaskładnik
X μLWkładka (X ng)
X μLSieć szkieletowa (50 ng)
2 μlBufor ligazy DNA T4 (10x)
1 μLLigaza DNA T4
X μLWoda
20 μLOstatni tom

Tabela 4: Odczynniki do podwiązywania. Składniki niezbędne do pomyślnej reakcji ligacji.

3. Produkcja wektorów z potrójną transfekcją plazmidu

UWAGA: Poniższe wartości są zoptymalizowane dla pojedynczego dołka na płytce 6-dołkowej, która daje końcową objętość przygotowania ropy naftowej wynoszącą 2 ml. Wszystkie wartości można przeskalować 10-krotnie w górę dla płytki 15 cm, która daje końcową objętość 20 ml lub 4-krotnie w przypadku płytki 24-dołkowej o końcowej objętości 500 μl.

  1. Przygotować zapas 1 μg/μl chlorowodorku polietyleneniminy (PEI) MAX, rozpuszczając 100 mg PEI MAX w 100 ml wody destylowanej. Dostosuj pH do 7,1 za pomocą NaOH. Przefiltrować, wysterylizować mieszaninę filtrem 0,22 μm i zamrozić 1 ml porcji w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania. Po rozmrożeniu odczynnik należy przechowywać przez 1 miesiąc w temperaturze 4 °C.
  2. Wysiewaj 3 x 105 komórek HEK293 lub HEK293T na 6-dołkową płytkę z wstępnie podgrzanym zmodyfikowanym podłożem orła Dulbecco (DMEM, 4,5 g/l glukozy, 110 mg/l pirogronianu sodu) uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Wzrost do ~75%-90% konfluencji w inkubatorze ustawionym na 37 °C i 5% CO2 (Rysunek 3).
    UWAGA: Zaobserwowano, że komórki hodowane z penicyliną/streptomycyną (P/S) zmniejszają wydajność produkcji wektora. Stosowanie odpowiedniej techniki sterylnej omija konieczność stosowania P/S, dlatego zaleca się, aby nie hodować komórek HEK293 z antybiotykiem20. Jeśli P/S jest wymagany w dalszych transdukcjach, zaleca się dodanie P/S do surowego preparatu po zbiorach.
  3. W probówce o pojemności 2 ml przygotować mieszaninę zawierającą 1,3 μg pAAV2/2 (Rep/Cap, serotyp 2), 1,3 μg pAAV.GOI, 2,6 μg pAdΔF6 i DMEM bez surowicy (SF) (4,5 g/l glukozy, 110 mg/l pirogronianu sodu) w całkowitej objętości 100 μl (patrz tabela uzupełniająca 1 w celu uzyskania wygodnych obliczeń).
  4. Przygotować kontrolę ujemną w oddzielnej probówce, zastępując pRep/Cap dowolnym niepowiązanym plazmidem. Kontrola ujemna odpowiada za nieopakowany plazmid pAAV.GOI obecny w surowym preparacie, który może potencjalnie transfekować komórki podczas transdukcji, chociaż rzadko.
    UWAGA: Plazmid maxiprep lub midiprep o niskiej zawartości endotoksyn lub wolny od endotoksyn jest idealny do potrójnej transfekcji i generalnie wytwarza wektor o wyższym mianie w porównaniu z DNA miniprep, chociaż DNA miniprep może być używany do szybkich i brudnych testów wstępnych.
  5. Dodać 5,2 μl PEI MAX do mieszaniny plazmidowej; jest to mieszanina plazmid:PEI w stosunku 1:1. Dobrze wymieszaj, pulsując 10-15 razy na mikserze wirowym ustawionym na 7. Jeżeli wytwarzanych jest wiele preparatów wektorowych, należy dodać PEI do każdej mieszaniny plazmidów w rozłożonych odstępach czasu wynoszących 1 minutę (tj. preparat 1 w t = 0 min, preparat 2 w t = 1 min itd.), aby zapewnić wystarczający czas na aspirację studzienek i rozcieńczenie reakcji w następujących krokach.
    UWAGA: Zaobserwowano, że stosunek plazmidu do PEI wynosi 1:1 i jest optymalny. Jednak indywidualni użytkownicy mogą zoptymalizować ten współczynnik, aby uzyskać maksymalną wydajność. Zapoznaj się z dyskusją, aby dowiedzieć się, jak przeprowadzić optymalizację PEI (patrz również Tabela Uzupełniająca 2).
  6. Inkubować każdą probówkę dokładnie przez 15 minut, a następnie rozcieńczyć reakcję 1,9 ml SF DMEM (4,5 g/l glukozy, 110 mg/l pirogronianu sodu) do końcowej objętości 2 ml. Delikatnie odpipetować 2x do wymieszania. Nadmierne mieszanie zakłóci działanie kompleksów plazmid/PEI i spowoduje niższą wydajność transfekcji.
  7. Odessać pożywkę ze studni i delikatnie dodać mieszaninę plazmid: PEI po bokach studzienki, aby zapobiec odłączeniu komórek. Inkubować komórki przez 72 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Liza i odklejanie komórek podczas inkubacji jest normalnym procesem produkcji rAAV (Rysunek 4).

Hodowla komórkowa na obrazie mikroskopowym; analiza morfologii komórkowej.
Rysunek 3: Komórki HEK293 gotowe do transfekcji. Idealna konfluencja (75%-90%) komórek HEK293 potrzebnych do transfekcji potrójnego plazmidu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wzrost kultury komórkowej w ciągu czterech dni; obrazy mikroskopowe Dzień 0-3; obserwacja proliferacji komórek.
Rysunek 4: Komórki HEK293 po transfekcji. Pojawienie się komórek HEK293 przed i po 1, 2 lub 3 dniach po transfekcji z pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40, pAAV2/2, pAdΔF6 i stosunkiem 1:1 plazmidu:PEI. Podziałka skali: 400 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Zbieranie surowych preparatów wektorowych

  1. Zamrozić całą płytkę z transfekowanymi komórkami przez 30 minut w temperaturze -80 °C, a następnie rozmrażać przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Czynność powtarzać łącznie przez trzy cykle zamrażania/rozmrażania. Nie zdejmuj pokrywki — płytka musi pozostać sterylna w środku. Płytki mogą pozostać w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będą gotowe do przejścia do kolejnych kroków.
    UWAGA: Do rozmrażania najlepiej nadaje się nienawilżany inkubator, który minimalizuje kondensację pary wodnej na zewnątrz płyt, która może prowadzić do przypadkowego zanieczyszczenia.
  2. Wykonaj następujące dwa kroki w okapie z przepływem laminarnym, stosując techniki aseptyczne. Wymieszaj każdą studzienkę przez pipetowanie, aby zapewnić maksymalne rozbicie komórek. Przenieś lizat do probówki o pojemności 2 ml i odwiruj przez 15 minut w temperaturze pokojowej 15 000 x g w celu usunięcia resztek komórek.
  3. Ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 2 ml. Ten surowy preparat może być natychmiast użyty bez miareczkowania lub oczyszczania. Vector może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy lub -20°C przez lata.
    UWAGA: W razie potrzeby miana można obliczyć metodą ilościowego PCR (qPCR) poprzez ilościowe określenie liczby genomów wektorowych (VG) wewnątrz cząstek odpornych na DNazy. W związku z tym miana podaje się w jednostkach VG/ml. Wektor przechowywany przez kilka miesięcy w temperaturze 4 °C powinien być ponownie miareczkowany przed użyciem, ponieważ wektor może agregować i/lub wiązać ścianki probówki, zmniejszając miano preparatu.

5. Transdukcja

  1. Umieść żądany typ komórki (np. Huh7) na 96-dołkowej płytce przy docelowej konfluencji 50%-75%, w zależności od czasu trwania transdukcji. Większa konfluencja może skutkować zmniejszoną wydajnością transdukcji AAV.
  2. Dodać wektor (np. CMV.mScarlet) do komórek, nie znając miana surowego preparatu do zastosowań, w których dawka nie jest istotna, takich jak testowanie panelu kapsydów pod kątem transdukcji w nowym typie komórki. Wykonać serię rozcieńczeń 1:3 surowego preparatu w podłożu bez surowicy (SF), aby uzyskać optymalną ilość wektora wymaganą do aplikacji. Odessać pożywkę z płytki 96-dołkowej i dodać 50-100 μl rozcieńczonego surowego preparatu do studzienek. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
    UWAGA: Surowica może zawierać przeciwciała, które mogą neutralizować wektor AAV i zmniejszać skuteczność transdukcji. Jednak surowica może być używana podczas transdukcji dla wrażliwych typów komórek.
  3. Usuń wektor po 48 godzinach po transdukcji (hpt) i umyj komórki raz wstępnie podgrzanym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wektory można również usunąć i zastąpić pożywką zawierającą surowicę już po 2 hpt dla wrażliwych typów komórek. W przypadku wielu zastosowań należy przeprowadzić nocną inkubację w celu transdukcji komórek i rano zastąpić studzienki świeżą pożywką zawierającą surowicę. Wytrzymałe typy ogniw, takie jak Huh7 i U2-OS, nie wymagają wymiany nośnika.
  4. Zakończ transdukcję, utrwalając komórki w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 10 minut. W zależności od zastosowania można również zastosować różne metody zakończenia (np. liza). W przypadku większości typów komórek ekspresja szczytowa występuje przy 48 hpt i dlatego jest to powszechny eksperymentalny punkt końcowy.

6. Wariacje na temat metody transdukcji według typu komórki

UWAGA: Różne typy komórek wymagają różnych warunków hodowli. Dlatego dodanie wektora do transdukcji powinno być zoptymalizowane w oparciu o potrzeby typu komórki. Poniżej znajdują się bardzo szczegółowe protokoły transdukcji dla typów komórek uwzględnionych w reprezentatywnych wynikach, ilustrujące niektóre warianty protokołów transdukcji, które badacz może chcieć wypróbować na własne potrzeby.

  1. Organoidy jelita cienkiego myszy
    1. Wyprowadź organoidy jelita cienkiego myszy (mSIO) z preparatu krypty jelita cienkiego od myszy C57BL / 6J. Osadź organoidy w 90% macierzy błony podstawnej i kulturę na 24-dołkowych płytkach zawierających pożywkę wzrostową organoidów (bez antybiotyków) lub pożywkę przed transdukcją (50% pożywki kondycjonowanej Wnt3a [wyprodukowanej we własnym zakresie przy użyciu komórek L Wnt-3A w pożywce wzrostowej organoidów], 10 mM nikotynamidu, 10 μM inhibitora ROCK i 2,5 μM CHIR99021) przez jedno przejście (5-7 dni) przed transdukcją w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    2. Przed transdukcją przepłukać organoidy D-PBS, rozbić kopuły macierzy błony podstawnej przez pipetowanie i zdysocjować organoidy na małe klastry komórek, inkubując je w pożywce dysocjacyjnej przez 10 minut w temperaturze 37 °C i dalej pipetując.
    3. Zatrzymaj proces dysocjacji komórek, dodając 5% FBS do DMEM/F-12 z 15 mM HEPES, przenieś klastry komórek do probówek wirówkowych i zbierz klastry komórek przez wirowanie przez odwirowanie przez 5 minut w 1000 x g w temperaturze pokojowej.
    4. Ponownie zawiesić klastry komórek w pożywce transdukcyjnej (pożywka przed transdukcją zawierająca 10 μg/ml polibrenu lub organoidalna pożywka wzrostowa zawierająca 10 μg/ml polibrenu) i przenieść na płytki 48-dołkowe, a następnie dodać surowe preparaty AAV pakujące CMV.mScarlet do transdukcji.
    5. Przeprowadzić transdukcję organoidów przez odwirowanie płytki przez 1 godzinę w temperaturze 600 x g i temperaturze 37 °C, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez dodatkowe 6 godzin. Zebrać transdukowane organoidy do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, wirować przez 5 minut w temperaturze 1000 x g i umieścić na lodzie.
    6. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić transdukowane organoidy w 90% macierzy błony podstawnej w pożywce wstępnej transdukcji lub pożywce wzrostowej organoidów i kropelkach nasion o objętości 20 μl w jednym dołku wstępnie ogrzanego komorowego szkła nakrywkowego.
    7. Po inkubacji przez 10 minut w inkubatorze, zanurzyć kropelkę w 350 μl pożywki do wstępnej transdukcji lub pożywki wzrostowej organoidów i inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Określ wydajność transdukcji 2-5 dni po transdukcji, obrazując transdukowane organoidy pod mikroskopem konfokalnym i oszacuj procent czerwonych komórek fluorescencyjnych na organoid
      8. .
  2. Ogniwa BeWo
    1. Po 24 godzinach przed transdukcją płytki ludzkiego łożyskowego raka kosmówki BeWo w 10 000 komórek na studzienkę 96-dołkowej płytki. Rozcieńczyć surowe preparaty AAV pakujące CMV.mScarlet w stosunku 1:1 w pożywce F12-K BeWo bez surowicy do całkowitej objętości 50 μl na studzienkę. Odessać pożywkę ze studzienki i zastąpić 50 μl rozcieńczonego AAV na studzienkę.
    2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez noc (~18 h), a następnie dodać 100 μl pożywki F12-K BeWo zawierającej 10% FBS, aby zwiększyć całkowitą objętość do 150 μL. Inkubować komórki przez dodatkowe 6 godzin, w sumie 24 godziny po transdukcji (hpt).
    3. Do obrazowania wybarwić żywe komórki barwnikiem Hoechst przez 30 minut w pożywce F12-K, a następnie wymienić pożywkę na DMEM bez fenolu zawierającą 10% FBS, 1x suplement glutamax i 1x suplement pirogronianu sodu do obrazowania. Przeprowadzić obrazowanie żywych komórek w mikroskopie konfokalnym przy użyciu zestawów filtrów DAPI (do obrazowania Hoechst) i mCherry (do obrazowania mScarlet) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. Komórki Hepa1-6 i Huh7
    1. Mysie komórki wątroby Hepa1-6 i ludzkie komórki wątroby Huh7 w DMEM (4,5 g / L glukozy, 110 mg / L pirogronianu sodu, 10% FBS) w 5,000 komórek na dołek 96-dołkowej płytki 24 godziny przed transdukcją.
    2. Dodać 50 μl nierozcieńczonych surowych preparatów AAV pakujących CMV.mScarlet bezpośrednio do komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 48 godzin. Umyć komórki raz w PBS, utrwalić w 4% PFA i barwić barwnikiem Hoechst przez 10 min. Przeprowadzić obrazowanie pod mikroskopem konfokalnym przy użyciu zestawów filtrów DAPI (do obrazowania Hoechst) i mCherry (do obrazowania mScarlet).
  4. Ogniwa C2C12 i HSkMC
    1. Płytka niezróżnicowane mysie mioblasty C2C12 i niezróżnicowane mioblasty ludzkich pierwotnych komórek mięśni szkieletowych (HSkMC) w 5,000 komórek na dołku 96-dołkowej płytki, 72 godziny przed transdukcją.
    2. Rozcieńczyć surowe preparaty AAV pakujące CMV.mScarlet do 1:1 w DMEM (4,5 g/L glukozy, Penn/Strep, 20% FBS) dla mioblastów C2C12 lub pożywki dla wzrostu mięśni szkieletowych dla mioblastów HSkMC. Różnicuj mioblasty HSkMC do miotub, zmieniając pożywki na ośrodki różnicujące.
    3. Inkubować mioblasty i miotube'y w rozcieńczonych preparatach AAV przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Żywe komórki barwić barwnikiem Hoechst przez 10 minut i obrazować pod mikroskopem konfokalnym przy użyciu zestawów filtrów DAPI (do obrazowania Hoechst) i mCherry (do obrazowania mScarlet).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znalezienie optymalnego kapsydu do transdukcji interesujących komórek hodowlanych
Przeprowadzono transdukcję różnych typów komórek w celu określenia tropizmu różnych serotypów kapsydu (Ryc. 5). Naturalne serotypy AAV214, AAV421, AAV522, AAV823, AAV924, oraz zmodyfikowane warianty kapsydu Anc8025, DJ26, LK0327 i KP128 zostały spakowane w genom wektorowy wyrażający mScarlet pod promotorem CMV, sklonowanym przy użyciu metod przewidzianych w tym protokole. Niemiareczkowane surowe preparaty wektorowe rozcieńczono w odpowiednich pożywkach hodowlanych, a komórki transdukowano przez 24+ h i zobrazowano (Figura 5B). Wydajność transdukcji obliczono na podstawie proporcji wszystkich komórek, które były mScarlet+, lub proporcji komórek w pojedynczej płaszczyźnie z, które były mScarlet+ (dla organoidów jelita cienkiego myszy; Rysunek 5C). Wydajność transdukcji (komórki mScarlet+) nie jest zapewniona dla zróżnicowanych miotub C2C12 i HSkMC, ale raczej dla niezróżnicowanych mioblastów C2C12 i HSkMC (Figura 5A).

AAV2 i KP1 były najsilniejszymi serotypami we wszystkich badanych liniach komórkowych (Rysunek 5A). Zaobserwowano również, że podobne typy komórek pochodzące od różnych gatunków są transdukowane z różną wydajnością. Na przykład Hepa1-6 (mysia linia komórkowa wątroby) wykazuje wyraźny spadek transdukcji w porównaniu z Huh7 (linia komórek wątroby pochodząca od człowieka) przy użyciu AAV2 (Figura 5B). Co więcej, różne warunki pożywki odgrywają ważną rolę podczas transdukcji. Mysie organoidy jelita cienkiego (mSIO) hodowane w pożywkach przed transdukcją są mniej skutecznie transdukowane w porównaniu z tymi hodowanymi w pożywkach organoidowych (Rysunek 5C). Dodatkowo, AAV2 skutecznie transdukuje niezróżnicowane mioblasty HSkMC i zróżnicowane miorurki HSkMC (Figura 5B), chociaż analiza ilościowa miotubek jest trudna i dlatego nie jest zapewniona.

Wysoka skuteczność transdukcji obserwowana dla różnych typów komórek w Rysunek 5 pokazuje, że surowe preparaty wektorowe mogą być skutecznie stosowane do transdukcji różnych typów komórek bez dalszych etapów, takich jak oczyszczanie i miareczkowanie. Należy jednak dokładnie rozważyć przy wyborze kapsydu, aby zmaksymalizować dostarczanie transgenu. Wiele innych linii komórkowych i kapsydów zostało wcześniej przetestowanych i zostało opublikowanych, choć z oczyszczonymi preparatami wektorowymi12.

Niezależny od cząstki wektorowej wpływ warunków medium może wpływać na efektywność transdukcji. Jednak ogólnie przyjmuje się, że tropizm (tj. specyficzny dla typu komórki wychwyt i ekspresja wektora) jest właściwością, która jest specyficzna dla kapsydu29. Nie zaobserwowano jeszcze, aby porównanie między dopasowanymi dawkami surowymi i oczyszczonymi preparatami wpływało na tropizm komórkowy. Dlatego surowe preparaty wektorowe mogą być stosowane w podobny sposób, jak oczyszczone wektory w hodowli komórkowej.

Efektywność transdukcji wektora AAV w liniach komórkowych; wykres danych, obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej.
Rysunek 5: Surowa transdukcja wektorowa różnych typów komórek. (A) Procent mScarlet+ po dodaniu różnych wektorów AAV zawierających transgen mScarlet. (B) Komórki wykazujące ekspresję mScarlet dostarczone z AAV serotyp 2. Podziałki: 100 μm (Hepa1-6, Huh7, C2C12 i HSkMC), 200 μm (BeWo), 20 μm (mSIO). Skróty: hpt = godziny po transdukcji. (C) Organoidy jelita cienkiego myszy (mSIO) były albo traktowane rAAV w pożywkach przed transdukcją, albo w pożywkach wzrostowych organoidów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Arkusz potrójnej transfekcji plazmidu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Arkusz optymalizacji PEI. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klonowanie
Protokół klonowania nie jest ograniczony do plazmidu pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 użytego powyżej i może być łatwo zmieniony w zależności od potrzeb eksperymentalnych badacza. Wiele plazmidów zawierających ITR jest łatwo dostępnych w Internecie do zakupu. Na przykład plazmidy zawierające zarówno Cas9, jak i miejsce klonowania sgRNA są dostępne, ale wymagają kilku dodatkowych etapów, takich jak wyżarzanie oligonukleotydów i obróbka PNK30. Ponadto można znaleźć plazmidy zawierające wiele miejsc klonowania (MCS) z tylko ITR i bez wewnętrznych elementów regulatorowych31. Jeśli mają być używane różne plazmidy, enzymy restrykcyjne (RE) używane do trawienia są zazwyczaj jedynymi elementami, które mogą wymagać zmiany w tym protokole. Ograniczeniem rAAV jest jednak jego ograniczona ładowność. Ze względu na fizyczne ograniczenia kapsydu, genom wektora nie powinien przekraczać 4,9 kb, łącznie z ITR.

Podczas izolowania plazmidu od bakterii bardzo ważne jest, aby użyć zestawu midiprep lub maxiprep o niskiej zawartości endotoksyn lub bez endotoksyn, aby złagodzić uszkodzenia komórek podczas transfekcji lub transdukcji potrójnego plazmidu. Plazmid z zestawów miniprep często zawiera wyższe zanieczyszczenia, zmniejszone stężenia i mniej superskręconego DNA, co może wpływać na dalszą produkcję rAAV i dlatego nie jest zalecane.

Kluczowe znaczenie ma zrozumienie struktury i właściwości ITR podczas klonowania. Po pierwsze, niezwykle trudno jest korzystać z PCR za pośrednictwem ITR. Należy unikać klonowania projektów, które wymagają amplifikacji PCR za pomocą ITR, a dodatkowo ograniczyć stosowanie techniki klonowania montażu Gibsona. W związku z tym klonowanie enzymów restrykcyjnych jest preferowaną metodą klonowania plazmidów zawierających ITR. Ponadto niektóre startery do sekwencjonowania Sangera mogą nie być zgodne, jeśli sekwencjonowany region zawiera ITR. Zamiast tego zaleca się stosowanie starterów, które sekwencjonują z dala od ITR i do ciała genomu wektora, aby uzyskać bardziej precyzyjne wyniki sekwencjonowania. Po drugie, ITR są podatne na delecje, rearanżacje i mutacje po przekształceniu w bakterie w celu amplifikacji plazmidu32,33. Aby złagodzić te zdarzenia, zaleca się stosowanie kompetentnych szczepów bakteryjnych z niedoborem rekombinacji, takich jak Stbl3, i inkubację ich w temperaturze 30 °C w celu spowolnienia podziałów komórkowych. Wreszcie, zaobserwowano, że mniejsze kolonie mogą odpowiadać klonom bez rearanżacji lub delecji, ponieważ te bez ITR mogą dawać przewagę wzrostu i być większe. Dlatego zaleca się wybieranie małych kolonii.

Produkcja wektorowa
Na pomyślną produkcję wektora rAAV może mieć wpływ wiele elementów. Jednym z krytycznych czynników jest zdrowie komórek HEK293 lub 293T używanych do transfekcji. Ogólnie rzecz biorąc, niskie liczby pasaży są idealne, ponieważ komórki o wysokim pasażowaniu mogą wykazywać wariancje genotypowe i fenotypowe, które mogą zmniejszać miana rAAV. Dodatkowo gęstość wysiewanych komórek powinna wynosić 75%-90% zbieżności, aby zapewnić efektywną produkcję. Rzadkie komórki generują niską wydajność wektorów, ponieważ jest mniej komórek dostępnych do produkcji wektorów, podczas gdy przerośnięte komórki nie będą skutecznie transfekowane.

Różnice między partiami odczynników, zapasami komórek i ogólna zmienność między laboratoriami przyczyniają się do różnic w wydajności transfekcji i mianie produkcji. Jednym z optymalnych czynników, który może prowadzić do poprawy miana, jest stosunek plazmidu do PEI w reakcjach transfekcji. Bardzo ważne jest, aby używać świeżego (<1 miesiąc) PEI MAX. Zaleca się, aby jako punkt wyjścia zastosować stosunek plazmidu do PEI wynoszący 1:1, a jeśli wydajność transfekcji lub transdukcji wydaje się słaba, przetestuj kilka różnych stosunków. Optymalizacja miana jest najłatwiejsza w przypadku użycia transgenu z odczytem wizualnym, takiego jak transgen reporterowy CMV.Luc.IRES.EGFP używany w niniejszym dokumencie jako materiał wyjściowy do klonowania. Aby przeprowadzić optymalizację, postępuj zgodnie z krokiem protokołu 3 przy użyciu 12-dołkowej płytki i zmniejszając masy plazmidu i objętości odczynnika o dwa (końcowa masa plazmidu wynosi 2,6 μg). Dostosuj odpowiednio głośność PEI, aby odpowiadała stosunkom w zakresie od 1:0,75 do 1:3, ze zwiększającymi się krokami co 0,25 (Rysunek 6). Rozcieńczyć każdą reakcję 950 μl pożywki SF po 15 minutach. Dla wygody można przygotować mieszankę wzorcową zawierającą potrójne plazmidy i indywidualnie pipetować ją do probówek o pojemności 1,5 ml przed dodaniem PEI - patrz plik uzupełniający 2. Zbierz wektor, przeprowadź transdukcję interesujących Cię komórek i obrazu. Studnia o najwyższej wydajności transdukcji (proporcja komórek GFP+) odpowiada najwyższemu mianu i najbardziej optymalnemu stosunkowi PEI:DNA.

Plasmid transfection process diagram: Prepare master mix, vary PEI ratios, transduce cells, harvest vector.
Rysunek 6: Przepływ pracy związany z optymalizacją PEI. Schemat kroków wymaganych do optymalizacji PEI. Wiele proporcji plazmidu: PEI są testowane w celu określenia optymalnego stosunku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Uwagi dotyczące zbiorów i miana
Technika zamrażania/rozmrażania stosowana do zbierania wektora rAAV skutecznie lizuje komórki HEK293 w sposób zgodny z bezpośrednim zastosowaniem oczyszczonego lizatu do transdukcji hodowanych komórek. Niektóre serotypy rAAV, takie jak AAV1, AAV8 i AAV9, są uwalniane z komórek podczas produkcji wektorów i mogą być zbierane z pożywki komórkowej bez cykli zamrażania/rozmrażania34. Opisana tutaj metoda zazwyczaj daje miana rzędu 1 x10 10 VG / ml przy użyciu kapsydów AAV2 i 1 x 1011 VG / ml dla AAV8. Chociaż wyższe miana można osiągnąć za pomocą detergentu lub innej lizy na bazie chemikaliów, są one szkodliwe dla komórek w dalszym użyciu i wymagają dalszego oczyszczania rAAV z lizatu. Niższe miano jest jednym z kompromisów, które badacz powinien wziąć pod uwagę przy określaniu, czy surowe preparaty są odpowiednie dla jego potrzeb badawczych, jednak nieznacznie niższe miana wytwarzane przez opisane tutaj metody mogą bardzo dobrze transdukować wiele typów komórek (patrz reprezentatywne wyniki). Oprócz skuteczności transfekcji i zdrowia komórek, miana wektorów różnią się w zależności od kapsydu użytego podczas produkcji rAAV oraz wielkości i sekwencji transgenu w VG35.

Podczas zbioru surowych preparatów wektorowych plazmidowe DNA, które zostało użyte podczas transfekcji potrójnego plazmidu, może być obecne i, choć rzadko, powodować dalszą transfekcję podczas transdukcji. Co więcej, nieopakowane VG mogą wiązać się z zewnętrzną stroną kapsydów i wywoływać wrodzoną odpowiedź immunologiczną na nagie i obce jednoniciowe DNA36,37. Dlatego wrażliwe typy komórek mogą wymagać przygotowania wektorów, które mają być trawione i oczyszczane przez DNazę w celu usunięcia nieopakowanych VG i plazmidu.

Jeśli ktoś chce obliczyć miano surowego preparatu, qPCR można przeprowadzić w celu ilościowego określenia liczby upakowanych VG wewnątrz cząstek odpornych na DNazy (DRP). Krótko mówiąc, niewielka ilość surowego preparatu jest trawiona przez DNazę w celu usunięcia plazmidowego DNA, zanieczyszczających kwasów nukleinowych lub częściowo upakowanego VG. Próbka jest następnie poddawana qPCR, a chroniony VG wewnątrz DRP jest oznaczany ilościowo, w wyniku czego uzyskuje się miano z jednostkami genomu wektora na ml surowego preparatu38. Nie zaleca się miareczkowania wektorowego przy użyciu testów opartych na ELISA, które określają ilościowo miano kapsydu. W porównaniu z wirusem AAV typu dzikiego, rAAV cierpi na odsetek pustych i częściowo upakowanych kapsydów39. Test ELISA pozwoli określić ilościowo wszystkie kapsydy, niezależnie od zawartości ich genomu, i zawyży liczbę jednostek transdukowalnych obecnych w preparacie, który wymaga zapakowanego VG.

Zagadnienia dotyczące transdukcji
Na transdukcję rAAV wpływa wiele czynników i należy wziąć pod uwagę każdy nowy eksperyment. W zależności od promotora napędzającego ekspresję transgenu, początek ekspresji może nastąpić już po 4 godzinach od transdukcji (hpt), a szczytowa ekspresja jest zwykle osiągana po 48 hpt. Ważne jest, aby pamiętać o czasie, jaki upływa od początkowego wysiewu komórek do eksperymentalnego punktu końcowego. Ma to na celu oszacowanie początkowej zbieżności komórek i upewnienie się, że nie przerosną one do końca eksperymentu. Jeśli komórki stają się nadmiernie zlewne, zachowanie komórek może zostać zmienione z powodu reakcji na stres i może zakłócić wyniki eksperymentalne. Niektóre typy komórek, takie jak U2-OS, mogą dość dobrze tolerować przerost/hamowanie kontaktu. Dodatkowo mogą wytrzymać długie okresy (48 godzin+) w kondycjonowanym podłożu bez surowicy - produkcie tego protokołu produkcyjnego. Jednak wrażliwe typy komórek mogą wymagać dodania surowicy lub rozcieńczenia surowicy surowego preparatu specjalną pożywką wzrostową w celu utrzymania zdrowia podczas transdukcji. Nieznacznie zmniejszona wydajność transdukcji wynikająca z użycia pożywek zawierających surowicę jest potencjalnym kompromisem dla zdrowia komórek i powinna być brana pod uwagę przez badacza.

Zazwyczaj w przypadku szybko dzielących się komórek początkowa konfluencja około 50% jest optymalna dla aplikacji, które zostaną zakończone 48 hpt. Jednak konfluencja może być odpowiednio dostosowana w zależności od potrzeb eksperymentu. Nie zaleca się transdukcji jednowarstwowych nieśmiertelnych linii komórkowych powyżej 75% konfluencji ze względu na zmniejszoną wydajność transdukcji. Większość hodowanych typów komórek jest z powodzeniem transdukowana i zdrowa po całonocnej inkubacji z prymitywnymi preparatami rAAV, a następnie rano zmianie na świeże podłoża zawierające surowicę.

Serotyp kapsydu jest ważnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę podczas wytwarzania rAAV w celu transdukcji komórki docelowej, ponieważ kapsyd jest głównym wyznacznikiem tropizmu komórkowego i późniejszej ekspresji transgenu13. AAV2 jest szeroko stosowanym serotypem ze względu na jego zdolność do skutecznej transdukcji wielu typów hodowanych komórek12. Ta właściwość AAV2 może być przypisana proteoglikanom siarczanu heparyny (HSPG) służącym jako główny czynnik przyłączeniowy dla AAV2 i wysokim poziomom HSPG na hodowanych komórkach od adaptacji do wzrostu w naczyniu40. Inne kapsydy, takie jak AAV9, są mniej skuteczne w transdukcji szerokich typów komórek i można je wytłumaczyć ich czynnikami przyłączenia zależności, które nie są wyrażane w tym ustawieniu41. Dlatego zalecamy AAV2 jako kapsyd pierwszego wyboru w hodowanych komórkach, jeśli pożądana komórka docelowa nie była wcześniej testowana z rAAV w literaturze.

Należy pamiętać, że głównym ograniczeniem prymitywnych preparatów wektorowych jest to, że nie nadają się one do transdukcji modeli zwierzęcych. Badania in vivo wymagają oczyszczenia preparatów i poddania ich ocenie jakości.

Zagadnienia dotyczące ekspresji transgenu i potencjalnej integracji
Wirusy rAAV nie powodują niezawodnie trwałej ekspresji transgenu. Z biegiem czasu VG mogą zostać wyciszone, a ekspresja transgeniczna może zostać wyłączona po kilku przejściach42. Ponadto większość VG pozostaje episomalna, a rAAV nie zawierają wirusowych białek Rep, które pośredniczyłyby w częstej integracji z genomem gospodarza, jak w przypadku lizogenicznej infekcji wirusowej typu dzikiego, lub sprzyjałyby replikacji VG43. W rezultacie episomy w transdukowanych komórkach zostaną ostatecznie rozcieńczone wśród komórek potomnych poprzez podziały.

Integracja na poziomie podstawowym jest możliwa dla całego dostarczonego transgenicznego materiału DNA. Jednak VG zawierające ITR są podatne na integrację z wyższą częstotliwością44. W związku z tym trwałą ekspresję transgenu można zaobserwować w niewielkiej podgrupie komórek. Użytkownicy powinni rozważyć tę możliwość, zwłaszcza w przypadku stosowania rAAV do dostarczania enzymów tnących DNA, takich jak Cas9, ponieważ dwuniciowe pęknięcia mogą skutkować jeszcze większą częstotliwością integracji i trwałą ekspresją45. Chociaż to sprawia, że rAAV jest dobrym kandydatem do dostarczania szablonów naprawczych ukierunkowanych na homologię do endogennego znakowania lub dodawania genów, należy rozważyć możliwość insercji Cas919,46.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.C.M. jest konsultantem w Janssen Pharmaceuticals i pełni funkcję SAB w NewBiologix. Wszyscy pozostali autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Robertowi Tjianowi i Xavierowi Darzacqowi za ich wsparcie i korzystanie ze sprzętu laboratoryjnego. Dziękujemy Markowi Kayowi za podarowanie plazmidów KP1 i LK03 rep/cap oraz Lukowi Vandenberghe za plazmid AAV4 rep/cap. Finansowanie zostało zapewnione przez Howard Hughes Medical Institute (34430, R. T.) oraz California Institute for Regenerative Medicine Training Program EDUC4-12790. N.W. dziękuje za finansowanie z Berkeley Stem Cell Center w ramach stypendium podoktorskiego Siebel oraz z Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG) w ramach stypendium Waltera Benjamina.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Snapgene DNA do przeglądania sofrwareSnapgene
pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40AddGene105533
pAAV2/2 (Rep/Cap)AddGene104963
pAdΔ F6AddGene112867
LB Agar CarbenicillinSigma-AldrichL0418
Cyfrowy inkubator Boekel Scientific EconomyBoekel Scientific133000
LB podłoże, proszekMP Biomedicals113002042
Karpencylina (disód)GoldBioC-103-5
Nowy Brunszwik I26 ShakerEppendorfM1324-0000
50 ml Probówki wirówkoweCorning430828
Wirówka 5810 REppendorf22627040
QIAGEN Plasmid Plus Midi KitQiagen12945
PCR PULL-APART 8-TUBE STRIPSUSA Scientific1402-3900
Mastercycler nexusEppendorf6333000022
dNTPThermo Fisher Scientific18427013
5x Phusion BufferNEBB0518S Dostarczanyprzy zakupie Phusion Polymerase
Phusion  Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNEBM0530S
Barwnik w żelu, pomarańczowy (6X)NEBB7022S
DNA Clean & Concentrator-100ZymoD4029
Zymoclean Gel Zestaw do odzyskiwania DNAZymoD4001
NotI-HFNEBR3189S
EcoRI-HFNEBR3101S
Bufor CutSmart (10x)NEBB6004S Dostarczanyz zakupem enzymu restrykcyjnego
UltraPure AgarozaThermo Fisher Scientific16500100
Bromek etydynySigma-AldrichE1510
T4 Ligaza DNANEBM0202S
Bufor reakcyjny ligazy DNA T4NEBB0202S Dostarczanyprzy zakupie probówek T4 Ligase
Eppendorf Safe-Lock (1,5 ml)Eppendorf22363204
Precision Microprocessor Water BathThermo Scientific51221046
Sterylne plastikowe probówki hodowlaneFisher Scientific149566B
2,0 ml Probówka do mikrowirówekThomas Scientific1149Y01
ZR Plasmid Miniprep - KlasycznyZymoD4015
Xma1NEBR0180S
Sma1NEBR0141S
HEK 293T komórkiATCCCRL-3216
Falcon 6-wellCorning353046
Gibco  DMEM, wysoka zawartość glukozy, pirogronianThermo-Fisher11995065
Inkubator CO2 Sanyo MCO-18AIC(UV) MarshallScientificMCO-18AIC
PEI MAX (Chlorowodorek polietyleniny)Polysciences24765-100
Mikser Vortex Genie 2Mikroskopia elektronowa Sciences102091-234
Sanyo Ultra niska zamrażarka Sanyo14656-15267-16219
INCU-Line IL 10 z przezroczystym okienkiemVWR390-0384
Mikrowirówki EppendorfEppendorf05-400-005
Falcon 96-wellMyszy Corning353072
C57BL/6JSzczep#000664
organoidowe podłoże wzrostoweSTEMCELL Technologies6005
L Komórki Wnt-3AATCCCRL-2647
amid nikotynamiduSigmaN0636-100G
Inhibitor ROCKSTEMCELL Technologies72302
CHIR99021STEMCELL Technologies72052
Corning Matrigel Membrana podstawna o obniżonym czynniku wzrostu (GFR)Fisher356231
24-dołkowa płytkaFisher08-772-1
D-PBSThermo Fisher Scientific14-190-250
TrypLE ExpressFisher12604013
DMEM/F-12 z 15 mM HEPESSTEMCELL Technologies36254
polibreneMillipore SigmaTR-1003-G
48-dołkowe płytkiFisher08-772-3D
Thermo Scientific  Szkło nakrywane z komorą Nunc Lab-TekFisher12-565-470
Komórki BeWoATCCCCL-98
F-12K MediumATCC30-2004
Hepa1-6ATCCCRL-1830
Huh7Berkeley Zakład hodowli komórkowych BSDHUH-7
C2C12ATCCCRL-1772
HSkMCATCCPCS-950-010
Pożywka do wzrostu komórek mięśni szkieletowychSigmaC-23060
Medium do różnicowania mięśni szkieletowych SigmaC-23061
Invitrogen  Cyfrowy kolorowy mikroskop fluorescencyjny EVOSFisher Scientific12-563-340
Perkin Elmer Opera PhenixPerkin ElmerHH14001000
PhenoPlate 96-dołkowyPerkin Elmer6055302
DMEM, wysoki poziom glukozy, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowejSuplement Thermo-Fisher31053028
GlutaMAXThermo-Fisher35050079
Pirogronian soduThermo-Fisher11360070
pAAV2/5 (Rep/Cap)Addgene104964
pAAV2/8 (Rep/Cap)Addgene112864
pAAV-DJ-N589X (Rep/Cap)Addgene130878
pAAV2/9n (Rep/Cap)Addgene112865
pAnc80L65AAPAddgene92307
KP1 (rep/cap)podarowany przez profesora Marka Kaya (Uniwersytet Stanforda)
LK03 (rep/cap)podarowany przez profesora Marka Kaya (Uniwersytet Stanforda)
pAAV4 (rep/cap)podarowany przez profesora Luka Vandenberghe (Harvard Medical School)
pAAV.Cas9.sgRNAAddgene61591
pAAV.MCSAddgene46954
gBlock (syntetyczne DNA)IDT
UC

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pillay, S., et al. Corrigendum: An essential receptor for adeno-associated virus infection. Nature. 539 (7629), 456(2016).
  2. Nicolson, S. C., Samulski, R. J. Recombinant adeno-associated virus utilizes host cell nuclear import machinery to enter the nucleus. Journal of Virology. 88 (8), 4132-4144 (2014).
  3. Lundstrom, K. Viral Vectors in Gene Therapy. Diseases. 6 (2), 42(2018).
  4. Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).
  5. Ling, C., et al. The Adeno-Associated Virus Genome Packaging Puzzle. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 9 (3), 175(2015).
  6. Maurer, A. C., Weitzman, M. D. Adeno-Associated Virus Genome Interactions Important for Vector Production and Transduction. Human Gene Therapy. 31 (9-10), 499-511 (2020).
  7. Srivastava, A. Replication of the adeno-associated virus DNA termini in vitro. Intervirology. 27 (3), 138-147 (1987).
  8. Wang, X. S., Ponnazhagan, S., Srivastava, A. Rescue and replication of adeno-associated virus type 2 as well as vector DNA sequences from recombinant plasmids containing deletions in the viral inverted terminal repeats: selective encapsidation of viral genomes in progeny virions. Journal of Virology. 70 (3), 1668-1677 (1996).
  9. Earley, L. F., et al. Adeno-Associated Virus Serotype-Specific Inverted Terminal Repeat Sequence Role in Vector Transgene Expression. Human Gene Therapy. 31 (3-4), 151-162 (2020).
  10. Yang, J., et al. Concatamerization of adeno-associated virus circular genomes occurs through intermolecular recombination. Journal of Virology. 73 (11), 9468-9477 (1999).
  11. Au, H. K. E., Isalan, M., Mielcarek, M. Gene Therapy Advances: A Meta-Analysis of AAV Usage in Clinical Settings. Frontiers in Medicine. 8, 809118(2021).
  12. Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74(2013).
  13. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  14. Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Adenovirus-Associated Defective Virus Particles. Science. 149 (3685), 754-756 (1965).
  15. Meier, A. F., Fraefel, C., Seyffert, M. The Interplay between Adeno-Associated Virus and its Helper Viruses. Viruses. 12 (6), 662(2020).
  16. Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F., Christensen, G. Comparison of nonviral transfection and adeno-associated viral transduction on cardiomyocytes. Molecular Biotechnology. 28 (1), 21-32 (2004).
  17. Batista Napotnik, T., Polajzer, T., Miklavcic, D. Cell death due to electroporation - A review. Bioelectrochemistry. 141, 107871(2021).
  18. McCarty, D. M., Young, S. M. Jr, Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).
  19. Yang, Y., et al. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nature Biotechnology. 34 (3), 334-338 (2016).
  20. Stacey, G. N. Cell culture contamination. Methods in Molecular Biology. 731, 79-91 (2011).
  21. Parks, W. P., Melnick, J. L., Rongey, R., Mayor, H. D. Physical assay and growth cycle studies of a defective adeno-satellite virus. Journal of Virology. 1 (1), 171-180 (1967).
  22. Bantel-Schaal, U., zur Hausen, H. Characterization of the DNA of a defective human parvovirus isolated from a genital site. Virology. 134 (1), 52-63 (1984).
  23. Gao, G. P., et al. Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 99 (18), 11854-11859 (2002).
  24. Gao, G., et al. Clades of Adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues. Journal of Virology. 78 (12), 6381-6388 (2004).
  25. Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Reports. 12 (6), 1056-1068 (2015).
  26. Grimm, D., et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. Journal of Virology. 82 (12), 5887-5911 (2008).
  27. Lisowski, L., et al. Selection and evaluation of clinically relevant AAV variants in a xenograft liver model. Nature. 506 (7488), 382-386 (2014).
  28. Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. JCI Insight. 4 (22), e131610(2019).
  29. Colon-Thillet, R., Jerome, K. R., Stone, D. Optimization of AAV vectors to target persistent viral reservoirs. Virology Journal. 18 (1), 85(2021).
  30. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  31. Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair. The Journal of Cell Biology. 202 (3), 579-595 (2013).
  32. Bi, X., Liu, L. F. DNA rearrangement mediated by inverted repeats. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 93 (2), 819-823 (1996).
  33. Samulski, R. J., Berns, K. I., Tan, M., Muzyczka, N. Cloning of adeno-associated virus into pBR322: rescue of intact virus from the recombinant plasmid in human cells. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 79 (6), 2077-2081 (1982).
  34. Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
  35. Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Molecular Therapy. 7 (1), 122-128 (2003).
  36. Zhu, J., Huang, X., Yang, Y. The TLR9-MyD88 pathway is critical for adaptive immune responses to adeno-associated virus gene therapy vectors in mice. The Journal of Clinical Investigation. 119 (8), 2388-2398 (2009).
  37. Wagner, H., Bauer, S. All is not Toll: new pathways in DNA recognition. The Journal of Experimental Medicine. 203 (2), 265-268 (2006).
  38. Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. Quantitative and Digital Droplet-Based AAV Genome Titration. Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).
  39. Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Therapy. 6 (7), 1322-1330 (1999).
  40. Summerford, C., Samulski, R. J. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions. Journal of Virology. 72 (2), 1438-1445 (1998).
  41. Bell, C. L., et al. The AAV9 receptor and its modification to improve in vivo lung gene transfer in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2427-2435 (2011).
  42. McCown, T. J., Xiao, X., Li, J., Breese, G. R., Samulski, R. J. Differential and persistent expression patterns of CNS gene transfer by an adeno-associated virus (AAV) vector. Brain Research. 713 (1-2), 99-107 (1996).
  43. Weitzman, M. D., Kyostio, S. R., Kotin, R. M., Owens, R. A. Adeno-associated virus (AAV) Rep proteins mediate complex formation between AAV DNA and its integration site in human DNA. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 91 (13), 5808-5812 (1994).
  44. Miller, D. G., Petek, L. M., Russell, D. W. Adeno-associated virus vectors integrate at chromosome breakage sites. Nature Genetics. 36 (7), 767-773 (2004).
  45. Hanlon, K. S., et al. High levels of AAV vector integration into CRISPR-induced DNA breaks. Nature Communications. 10 (1), 4439(2019).
  46. Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 23 (10), 3558-3565 (2003).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transdukcja AAVrekombinowany AAVdostarczanie gen wprzygotowanie surowego AAVdostarczanie DNAtransdukcja kultur kom rkowychgeny reporterowe

Powiązane artykuły