Artykuł metodologiczny

Ekspresja transgenu w hodowanych komórkach przy użyciu nieoczyszczonych rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

5.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65572

⸱

20 października 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley, 2Biophysics Graduate Group, University of California, Berkeley

W tym artykule

Podsumowanie

Rekombinowany wirus związany z adenowirusem (rAAV) jest szeroko stosowany do klinicznego i przedklinicznego dostarczania genów. Niedocenianym zastosowaniem rAAV jest silna transdukcja hodowanych komórek bez konieczności oczyszczania. Dla badaczy, którzy są nowicjuszami w rAAV, udostępniamy protokół klonowania kaset transgenowych, produkcji prymitywnych wektorów i transdukcji kultur komórkowych.

Streszczenie

Rekombinowane wektory wirusowe związane z adenowirusem (rAAV) mogą osiągnąć silną i trwałą ekspresję transgenu bez integracji w szerokim zakresie typów tkanek, co czyni je popularnym wyborem do dostarczania genów w modelach zwierzęcych i w warunkach klinicznych. Oprócz zastosowań terapeutycznych, rAAV są użytecznym narzędziem laboratoryjnym do dostarczania transgenów dostosowanych do potrzeb eksperymentalnych badacza i celów naukowych w hodowanych komórkach. Niektóre przykłady obejmują egzogenne geny reporterowe, kasety nadekspresji, interferencję RNA i narzędzia oparte na CRISPR, w tym te do badań przesiewowych całego genomu. Transdukcja rAAV jest mniej szkodliwa dla komórek niż elektroporacja lub transfekcja chemiczna i nie wymaga żadnego specjalnego sprzętu ani drogich odczynników do produkcji. Surowe lizaty lub kondycjonowane pożywki zawierające rAAV mogą być dodawane bezpośrednio do hodowanych komórek bez dalszego oczyszczania w celu transdukcji wielu typów komórek - niedoceniana cecha rAAV. W tym miejscu przedstawiamy protokoły podstawowego klonowania kaset transgenowych i pokazujemy, jak produkować i stosować surowe preparaty rAAV do hodowanych komórek. Jako dowód zasadności demonstrujemy transdukcję trzech typów komórek, które nie zostały jeszcze zgłoszone w zastosowaniach rAAV: komórek łożyska, mioblastów i organoidów jelita cienkiego. Omawiamy odpowiednie zastosowania surowych preparatów rAAV, ograniczenia rAAV w dostarczaniu genów oraz rozważania dotyczące wyboru kapsydu. Protokół ten przedstawia prostą, tanią i skuteczną metodę dla badaczy, która pozwala osiągnąć produktywne dostarczanie DNA w hodowli komórkowej przy użyciu rAAV bez konieczności pracochłonnego miareczkowania i oczyszczania.

Wprowadzenie

Wyjaśnienie molekularnych podstaw funkcji komórkowych często wymaga ekspresji transgenicznego DNA w hodowli komórkowej. Aby doszło do ekspresji, transgeny muszą przeniknąć przez selektywną błonę komórkową i dotrzeć do jądra1,2. Zatem zdolność do skutecznego ominięcia fizycznych barier komórki i manipulowania jej procesami centralnymi jest niezbędna do zastosowania transgenezy w celu odkrywania nowych zjawisk biologicznych. Jedno z podejść wykorzystuje naturalną zdolność wirusów do dostarczania i ekspresji obcego DNA3,4.

Wirus towarzyszący adenowirusom (AAV) jest jednym z najmniejszych wirusów ssaków: jego jednoniciowy genom DNA o długości 4,7 kilobazy (kb) zawiera dwa geny, rep (kodujący replikazę) i cap (kodujący kapsyd), zapakowane w 60-merowy kapsyd ikosaedryczny o rozmiarach 25 nm. Geny rep/cap posiadają wiele promotorów, ramek odczytu i produktów splicingu, które kodują co najmniej dziewięć unikalnych białek niezbędnych do replikacji, produkcji i pakowania wirusa5,6. Dodatkowo oba końce genomu zawierają struktury drugorzędowe nazywane odwróconymi powtórzeniami końcowymi (ITRs), które są niezbędne do replikacji DNA, pakowania genomu oraz dalszego przetwarzania podczas transdukcji7,8,9,10. ITRs są jedynymi elementami DNA wymaganymi do zapakowania genomu do kapsydu, w związku z czym AAV może być klonowany w celu dostarczania transgenów poprzez zastąpienie wirusowych genów rep/cap wybranymi przez badacza elementami regulacyjnymi i/lub genami zainteresowania6. Powstały rekombinowany AAV (rAAV) z zaprojektowanym genomem wektora (VG) jest szeroko stosowany w klinice w terapii genowej ludzi i odniósł wiele sukcesów11. Niedocenianym zastosowaniem tego wektora jest praca laboratoryjna; rAAV mogą efektywnie zapewniać ekspresję transgenu w hodowlach komórkowych, aby zaspokoić potrzeby eksperymentalne badacza12.

Najpowszechniejszą metodą produkcji rAAV jest transfekcja trzech plazmidów do komórek HEK293 lub 293T (Rycina 1). Pierwszy plazmid, zazwyczaj nazywany plazmidem cis, zawiera pożądany transgen flankowany przez sekwencje ITR (pAAV). W zależności od zastosowania, dostępne w sprzedaży są plazmidy cis z powszechnymi elementami, takimi jak silne promotory lub narzędzia oparte na systemie CRISPR. Drugim jest plazmid pRep/Cap, który zawiera geny rep i cap AAV typu dzikiego dostarczone w trans — tj. na oddzielnym plazmidzie niezawierającym ITR, który koduje elementy regulacyjne i strukturalne oddziałujące następnie z plazmidem cis — i jest on zatem nazywany plazmidem trans. Oprócz fizycznego zamykania VG wewnątrz, kapsyd wpływa na tropizm komórkowy12,13. Dzięki dostarczeniu specyficznego dla serotypu genu cap w trans, badacze mogą łatwo zmaksymalizować wydajność transdukcji, wybierając zoptymalizowany serotyp kapsydu dla danej komórki docelowej. Wreszcie, jako Dependoparvovirus, AAV wymaga wirusa pomocniczego do aktywacji ekspresji rep/cap z jego promotorów wirusowych, co jest osiągane za pomocą adenowirusowych genów pomocniczych dostarczonych na trzecim plazmidzie, takim jak pAdΔF614,15. Po 72 h od transfekcji trzech plazmidów, wektor może zostać uwolniony z komórek producenta do pożywki hodowlanej poprzez wielokrotne cykle zamrażania i rozmrażania. Następnie zbiera się całą zawartość płytki, a duże fragmenty komórkowe są usuwane przez wirowanie; otrzymany nadsącz z pożywki stanowi surowy preparat rAAV gotowy do dalszych transdukcji.

Proces transfekcji genów; schemat wysiewania komórek HEK 293(T), pozyskiwania wektora i cyklu transdukcji komórek.
Rycina 1: Przegląd produkcji surowego wektora rAAV. Produkcja i transdukcja surowego rAAV mogą zostać zrealizowane w ciągu 5 dni. Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

rAAV może być korzystniejszy w dostarczaniu transgenów w porównaniu z innymi metodami transfekcji, które są zazwyczaj wiązane z cytotoksycznością, niską wydajnością oraz kosztownymi odczynnikami i sprzętem, jak ma to miejsce w przypadku elektroporacji lub transfekcji chemicznej/lipidowej16,17. rAAV omija te przeszkody i często zapewnia silną ekspresję transgenu przy minimalnej toksyczności i niewielkim nakładzie pracy manualnej. Co istotne, produkcja rAAV i jego zastosowanie w hodowlach komórkowych jest proste i rzadko wymaga oczyszczania wektora z pożywki hodowlanej (Rycina 1). Ponadto rAAV nie integruje swojego VG z genomem gospodarza, w przeciwieństwie do dostarczania transgenów za pomocą lentiwirusów, co zmniejsza ryzyko mutagenezy insercyjnej18. Pomimo potencjalnych korzyści z użycia rAAV do dostarczania transgenów, należy wziąć pod uwagę pewne ograniczenia. Ważne jest, aby rozmiar transgenu, wliczając w to ITRs, nie przekraczał 4.9 kb ze względu na fizyczne ograniczenia kapsydu, co limituje możliwość efektywnego dostarczania dużych elementów regulacyjnych i transgenów. Ponadto, ponieważ rAAV jest wirusem nieintegrującym, transdukcja skutkuje przejściową ekspresją transgenu w komórkach dzielących się i może nie być praktyczna w przypadku chęci uzyskania stabilnej ekspresji. Niemniej jednak, w celu stabilnej insercji sekwencji w specyficznych locusach genomicznych, badacz może zastosować metody wykorzystujące podwójny system rAAV do dostarczania Cas9 oraz matryc naprawy kierowanej homologią (HDR)19.

Protokół

1. Pozyskiwanie plazmidu

UWAGA: Niniejszy protokół opisuje klonowanie genu docelowego (GOI) do plazmidu zawierającego sekwencje ITR, promotor cytomegalowirusa (CMV) oraz sekwencję poliadenylacji SV40 (pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40). Plazmid ten może być jednak wykorzystany bez dalszego klonowania do produkcji rAAV, pakując wygodny podwójny reporter EGFP i lucyferazy. Plazmidy z innymi elementami regulacyjnymi lub przeznaczone do innych zastosowań, np. do eksperymentów opartych na CRISPR, są dostępne online i wymagają podobnych etapów klonowania, jak opisano poniżej (dodatkowe kroki klonowania opisano w sekcji dyskusji). Ponadto można zastosować plazmidy rep/cap lub plazmidy trans dla różnych serotypów — w tym protokole wykorzystano rep/cap dla serotypu AAV 2.

  1. Nabyć szczepy bakteryjne zawierające plazmid cis z ITR, plazmid pomocniczy adenowirusa, plazmid rep/cap oraz plazmid zawierający GOI. Wysiać bakterie na oddzielne płytki agarowe z antybiotykami specyficznymi dla oporności każdego plazmidu. Inkubować bakterie przez noc w temperaturze 30 °C w celu ich namnożenia.
    UWAGA: Jeśli plazmid z GOI nie jest łatwo dostępny w sprzedaży, online można nabyć syntetyczny fragment DNA (patrz Tabela materiałów). Ponadto syntetyczny fragment DNA może zostać wykorzystany do pominięcia całego procesu PCR, jeśli jest to pożądane.
  2. Wybrać pojedynczą kolonię z każdej płytki i hodować w 3 mL buforu Luria Bertani (LB) uzupełnionego o odpowiedni antybiotyk w temperaturze 30 °C przez noc, przy wstrząsaniu z prędkością 180 rpm. Przenieść 1 mL bakterii do sterylnej kolby Erlenmeyera o pojemności 250 mL zawierającej 50 mL buforu LB uzupełnionego o odpowiedni antybiotyk. Inkubować przez noc przy wstrząsaniu w temperaturze 30 °C i prędkości 180 rpm.
  3. Przenieść bakterie do probówki stożkowej o pojemności 50 mL i wirować przez 20 min przy 3,000 x g w temperaturze pokojowej. Odrzucić nadsącz. Wyizolować plazmid za pomocą zestawu do midiprepu o niskiej zawartości endotoksyn lub wolnego od endotoksyn zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: ITR są strukturami niestabilnymi. Aby zapobiec delecjom lub mutacjom ITR, komórki bakteryjne należy hodować w temperaturze 30 °C, aby spowolnić podziały komórkowe i zminimalizować błędy w replikacji. W celu zwiększenia wydajności i czystości plazmidu idealny jest zestaw do midiprepu lub maxiprepu. Zaleca się stosowanie zestawów o niskiej zawartości endotoksyn lub wolnych od endotoksyn, aby zmniejszyć późniejsze zanieczyszczenie komórek endotoksynami. Izolacja plazmidu nie musi być przeprowadzana w komorze z laminarnym przepływem powietrza, ponieważ zanieczyszczenie preparatu plazmidowego jest mało prawdopodobne przy pracy na standardowym blacie laboratoryjnym.

2. Klonowanie genu zainteresowania do plazmidu zawierającego ITR AAV

  1. Otwórz mapę plazmidu zawierającego GOI w oprogramowaniu do wizualizacji DNA.
    UWAGA: Cała kaseta, w tym ITRs, nie powinna przekraczać 4,9 kb ze względu na fizyczne ograniczenia pakowania kapsydu. Ponadto amplifikacja PCR nie jest możliwa przez ITRs z powodu struktur drugorzędowych. W związku z tym montaż Gibsona nie jest zalecany do klonowania transgenów rAAV.
    1. Kliknij kartę Sequence , aby wyświetlić pełną sekwencję plazmidu. Przewiń do regionu 5' sekwencji GOI i kliknij First Nucleotide , przeciągając w stronę ciała genu, aby stworzyć starter forward. Puść, gdy osiągnięta zostanie temperatura topnienia (Tm) ok. 55 °C.
    2. Kliknij Forward Primer. Ręcznie wprowadź sekwencję miejsca restrykcyjnego EcoRI (5' GAATTC 3') na samym końcu 5' sekwencji startera. Dodatkowo dodaj sześć dodatkowych losowych zasad na końcu 5' tego miejsca restrykcyjnego, aby umożliwić enzymowi wydajną interakcję z DNA. Kliknij Add Primer. Przedstawiający przykład znajduje się na Rysunku 2.
    3. Sprawdź starter, aby upewnić się, że nie tworzy on spinek ani dimerów starterów (z wyjątkiem palindromowego miejsca restrykcyjnego). Jeśli tworzą się spinki, zmień losową sekwencję sześciu dodatkowych zasad. Dodatkowo upewnij się, że starter nie wiąże się w żadnym innym miejscu plazmidu.
    4. Powtórz kroki, aby stworzyć starter reverse w regionie 3' GOI, kierując się w stronę ciała genu. Kliknij Reverse Primer i wprowadź miejsce restrykcyjne NotI (5' GCGGCCGC 3').
      UWAGA: GOI nie może zawierać miejsc restrykcyjnych EcoRI lub NotI – w przeciwnym razie konieczne będzie użycie innych enzymów restrykcyjnych.
  2. Amplifikuj GOI w 50 µL reakcji PCR. Użyj wymaganych poszczególnych komponentów z Tabeli 1.
    1. Umieść reakcję w termocyklerze i zaprogramuj go zgodnie z parametrami cykli z Tabeli 2. Jeśli startery mają różne Tm, w programie zastosuj niższą wartość Tm.
    2. Zweryfikuj amplifikację prawidłowego fragmentu PCR, dodając 1 µL barwnika do ładowania żelu (6x) do 5 µL reakcji PCR. Rozdziel marker DNA oraz mieszaninę PCR na 0,8% żelu agarozowym zawierającym bromek etydyny i wizualizuj w świetle UV.
      OSTROŻNIE: Bromek etydyny jest znanym mutagenem.
    3. Jeśli na żelu pojawi się pojedynczy, specyficzny prążek, oczyść pozostały produkt PCR w probówce paskowej PCR, używając kolumnowego zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcją producenta. Jeśli pojawi się wiele prążków (wynik niespecyficznej amplifikacji), wytnij pożądany prążek i oczyść DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu zgodnie z instrukcją producenta.
  3. Przeprowadź trawienie oczyszczonego produktu PCR oraz plazmidu szkieletowego pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 w 50 µL reakcji z wymaganymi poszczególnymi komponentami z Tabeli 3 przez 1 h w 37 °C. Ze względu na przewidywaną niską wydajność odzysku po ekstrakcji z żelu wymagana jest większa ilość DNA plazmidu pAAV.
    UWAGA: Użyte enzymy restrykcyjne są wersjami o wysokiej wierności (HF). Zwykłego NotI nie można stosować z buforem CutSmart. W przypadku użycia innych enzymów może być wymagana inna temperatura inkubacji i inny bufor.
    1. Oczyść trawiony produkt PCR kolumnowym zestawem do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcją producenta.
    2. Przygotuj trawiony plazmid szkieletowy pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 do elektroforezy żelowej, dodając 10 µL barwnika do ładowania żelu (6x) do 50 µL reakcji trawienia. Nałóż marker DNA, reakcję trawienia oraz 250 ng nietrawionego plazmidu (kontrola negatywna) na 0,8% żel agarozowy zawierający bromek etydyny z szerokimi dołkami. Wizualizuj w świetle UV, wytnij pożądany fragment (~4,5 kb) i oczyść DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu zgodnie z instrukcją producenta.
  4. Przeprowadź ligację trawionego produktu PCR i trawionego plazmidu szkieletowego pAAV w 20 µL reakcji ligacji z wymaganymi poszczególnymi komponentami z Tabeli 4. Aby obliczyć potrzebną ilość produktów PCR, użyj Wzoru 1. Zazwyczaj stosuje się molowy stosunek produktu PCR (insertu) do szkieletu (pAAV) wynoszący 3:1, przy masie szkieletu 50 ng.
    Równanie masy insertu dla klonowania DNA, schemat wzoru, zastosowanie edukacyjne w biologii molekularnej.     Wzór 1
  5. Wykonaj kontrolę negatywną, zastępując produkt PCR wodą. Inkubuj reakcje ligacji w 16 °C przez noc lub w temperaturze pokojowej przez 2 h.
  6. Rozmroź na lodzie ampułkę kompetentnych komórek bakteryjnych z deficytem rekombinacji (takich jak komórki Stbl3) i przelej 50 µL do probówki 1,5 mL. Dodaj 3 µL reakcji ligacji bezpośrednio na komórki i inkubuj na lodzie przez 30 min.
    UWAGA: ITRs są strukturami niestabilnymi, dlatego wymagają szczepów bakteryjnych z deficytem rekombinacji, aby ograniczyć zdarzenia delecji i rekombinacji ITR. Komórki DH5α mogą być stosowane okazjonalnie do propagacji (raz lub dwa razy), ale nie są zalecane do długotrwałego użytkowania. Integralność ITR należy regularnie sprawdzać po oczyszczaniu metodą midiprep.
    1. Poddaj bakterie szokowi termicznemu w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C przez 30 s, a następnie natychmiast przenieś na lód na 2 min. Dodaj 200 µL buforu LB i mieszaj przez 1 h w 30 °C, 180 rpm.
    2. Wyjałowij 125 µL mieszaniny na płytce agarowej z odpowiednim antybiotykiem i inkubuj przez noc (~18 h) w 30 °C. Wybierz wiele klonów i umieść każdy z nich w sterylnej plastikowej probówce hodowlanej z 3 mL LB zawierającego odpowiedni antybiotyk. Inkubuj przez noc z wytrząsaniem w 30 °C, 180 rpm.
      ​UWAGA: Aby zapobiec delecjom lub mutacjom ITR, komórki bakteryjne należy hodować w 30 °C, aby spowolnić podziały komórkowe i zminimalizować błędy w replikacji. Dodatkowo należy wybierać mniejsze kolonie, ponieważ te bez ITR mogą mieć przewagę wzrostową nad pozostałymi.
    3. Pipetuj 1,8 mL każdej kultury do probówki 2 mL i wiruj przy 6,000 x g przez 3 min w temperaturze pokojowej. Izoluj DNA za pomocą zestawu do miniprep. Pozostałe 1,2 mL kultury przechowuj w 4 °C. Zweryfikuj prawidłowe klony za pomocą sekwencjonowania DNA lub diagnostycznego trawienia enzymami restrykcyjnymi.
      UWAGA: Zaleca się sekwencjonowanie insertu metodą Sangera, jednak procesywność przez ITRs nie jest możliwa do osiągnięcia standardowymi metodami. ITRs należy zweryfikować poprzez trawienie restrykcyjne, jak opisano poniżej.
    4. Dodaj 50 mL buforu LB zawierającego odpowiedni antybiotyk do sterylnej kolby Erlenmeyera o pojemności 250 mL. Dodaj 500 µL pozostałej kultury do kolby i mieszaj w 30 °C, 180 rpm, aż osiągnięta zostanie wartość OD600 wynosząca 0,2-0,5 (~18 h). Przenieś bakterie do 50 mL probówki stożkowej i wiruj przez 20 min przy 3,000 x g w 4 °C. Izoluj DNA za pomocą zestawu do midiprep o niskiej zawartości endotoksyn lub wolnego od endotoksyn.
    5. Sprawdź integralność ITR za pomocą 20 µL diagnostycznego trawienia enzymami restrykcyjnymi przy użyciu XmaI (lub SmaI). Przygotuj reakcję zawierającą 500 ng plazmidu, 0,5 µL enzymu i bufor 1x; inkubuj przez 1 h w 37 °C. Rozdziel reakcję na 0,8% żelu agarozowym. Jeśli ITRs są nienaruszone, trawienie da prążek przy ~2,9 kb oraz inny prążek o wielkości kasety. Jeśli ten wyraźny prążek nie zostanie zaobserwowany, ITR może być uszkodzony i klonowanie będzie wymagało powtórzenia.
      UWAGA: Plazmidy zawierające miejsca restrykcyjne XmaI (lub SmaI) (oprócz tych w ITRs) wykażą dodatkowe prążki na żelu.

Schemat procesu edycji genów z sekwencjami starterów forward i reverse, ilustrujący konfigurację PCR.
Rycina 2: Reprezentatywny przykład projektowania starterów. Projektowanie starterów forward i reverse dla transgenu mScarlet (przykład reprezentatywny). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

IlośćSkładnik
X µLMatrycowy DNA (25 ng)
1 µLStarter F (10 µM)
1 µLStarter R (10 µM)
1 µLdNTP (10 mM)
10 µLBufor Phusion (5x)
1 µLPolimeraza Phusion
X µLWoda
50 µLObjętość końcowa

Tabela 1: Odczynniki do amplifikacji PCR. Składniki niezbędne do przeprowadzenia prawidłowej reakcji PCR.

KrokTemperaturaCzas
Denaturacja wstępna98 °C1 min
30 cykli98 °C10 s
Tm startera30 s
72 °C30 s na kb
Ostateczna elongacja72 °C10 min
Przytrzymać4 °Cbezterminowo

Tabela 2: Programowanie amplifikacji PCR. Wymagane parametry cykli dla prawidłowego przebiegu reakcji PCR.

IlośćKomponent
X µLprodukt PCR (1µg) lub plazmid pAAV (3µg)
5 µL Bufor (10x)
1 µLEcoRI-HF
1 µLNotI-HF
X µLWoda
50 µLObjętość końcowa

Tabela 3: Odczynniki do trawienia. Składniki niezbędne do prawidłowego przebiegu reakcji trawienia.

IlośćKomponent 
X µLWprowadzić (X ng)
X µLSzkielet (50 ng)
2 µLBufor do T4 DNA ligazy (10x)
1 µLLigaza DNA T4
X µLWoda
20 µLObjętość końcowa

Tabela 4: Odczynniki do ligacji. Składniki niezbędne do przeprowadzenia prawidłowej reakcji ligacji.

3. Produkcja wektora z wykorzystaniem transfekcji trzech plazmidów

UWAGA: Poniższe wartości zostały zoptymalizowane dla pojedynczej studni płytki 6-dołkowej, co pozwala uzyskać końcową objętość preparatu surowego wynoszącą 2 mL. Wszystkie wartości można zwiększyć 10-krotnie dla płytki 15 cm, aby uzyskać końcową objętość 20 mL, lub zmniejszyć 4-krotnie dla płytki 24-dołkowej z końcową objętością 500 µL.

  1. Przygotować roztwór zapasowy chlorku polietylenoiminy (PEI) MAX o stężeniu 1 µg/µL, rozpuszczając 100 mg PEI MAX w 100 mL wody destylowanej. Dostosować pH do 7,1 za pomocą NaOH. Mieszaninę wysterylizować poprzez filtrację przez filtr 0,22 µm, a następnie zamrozić aliquoty o objętości 1 mL w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania. Po rozmrożeniu odczynnik przechowywać przez 1 miesiąc w temperaturze 4 °C.
  2. Wysiać 3 x 105 komórek HEK293 lub HEK293T do płytki 6-dołkowej z uprzednio ogrzanym podłożem Eagle'a modyfikowanym przez Dulbecco (DMEM, 4,5 g/L glukozy, 110 mg/L pirogronianu sodu) uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Hodować do osiągnięcia ~75%-90% konfluencji w inkubatorze ustawionym na 37 °C i 5% CO2 (Rysunek 3).
    UWAGA: Zaobserwowano, że hodowanie komórek z dodatkiem penicyliny/streptomycyny (P/S) obniża wydajność produkcji wektora. Stosowanie odpowiedniej techniki sterylnej eliminuje konieczność używania P/S, dlatego zaleca się niehodować komórek HEK293 z antybiotykiem20. Jeśli P/S jest wymagana w późniejszych transdukcjach, zaleca się dodać P/S do surowego preparatu po zbiorze.
  3. W probówce o pojemności 2 mL przygotować mieszaninę zawierającą 1,3 µg pAAV2/2 (Rep/Cap, serotyp 2), 1,3 µg pAAV.GOI, 2,6 µg pAdΔF6 oraz bezsurowicze (SF) DMEM (4,5 g/L glukozy, 110 mg/L pirogronianu sodu) do całkowitej objętości 100 µL (obliczenia pomocnicze znajdują się w Tabeli uzupełniającej 1).
  4. Przygotować kontrolę negatywną w oddzielnej probówce, zastępując pRep/Cap dowolnym niepowiązanym plazmidem. Kontrola negatywna uwzględnia nieopakowany plazmid pAAV.GOI obecny w surowym preparacie, który mógłby ewentualnie przetransfekować komórki podczas transdukcji, choć zdarza się to rzadko.
    UWAGA: Plazmid z maxiprepu lub midiprepu o niskiej zawartości lub bez endotoksyn jest idealny do potrójnej transfekcji i zazwyczaj daje wektor o wyższym mianie w porównaniu do DNA z miniprepu, choć DNA z miniprepu może być użyte do szybkich testów wstępnych.
  5. Dodać 5,2 µL PEI MAX do mieszaniny plazmidów; jest to mieszanina plazmid:PEI w stosunku 1:1. Dobrze wymieszać, używając miksera wiorowego (vortex) ustawionego na 7, wykonując 10-15 krótkich impulsów. Jeśli przygotowywanych jest wiele preparatów wektora, dodawać PEI do każdej mieszaniny plazmidów w odstępach czasu 1 min (np. preparat 1 w t = 0 min, preparat 2 w t = 1 min itd.), aby zapewnić wystarczająco dużo czasu na odessanie medium z dołków i rozcieńczenie reakcji w kolejnych krokach.
    ​UWAGA: Zaobserwowano, że optymalny jest stosunek plazmid:PEI 1:1. Jednak poszczególni użytkownicy mogą zoptymalizować ten stosunek w celu uzyskania maksymalnej wydajności. Sposób optymalizacji PEI opisano w sekcji dyskusji (patrz również Tabela uzupełniająca 2).
  6. Inkubować każdą probówkę dokładnie przez 15 min, a następnie rozcieńczyć reakcję 1,9 mL SF DMEM (4,5 g/L glukozy, 110 mg/L pirogronianu sodu) do końcowej objętości 2 mL. Delikatnie wymieszać, pipetując 2 razy. Zbyt intensywne mieszanie zniszczy kompleksy plazmid/PEI i spowoduje obniżenie wydajności transfekcji.
  7. Odssać medium z dołka i delikatnie dodać mieszaninę plazmid:PEI po ściankach dołka, aby zapobiec odklejeniu się komórek. Inkubować komórki przez 72 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Lizy i odklejanie się komórek podczas inkubacji jest normalnym procesem produkcji rAAV (Rysunek 4).

Obraz mikroskopowy hodowli komórkowej; analiza morfologii komórek; pasek skali wskazuje rozmiar.
Rycina 3: Komórki HEK293 gotowe do transfekcji. Optymalna konfluencja (75%-90%) komórek HEK293 wymagana do transfekcji trzech plazmidów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wzrost komórek w czasie, obrazy mikroskopowe, dni 0-3, analiza hodowli komórkowych w trybie time-lapse.
Rycina 4: Komórki HEK293 po transfekcji. Wygląd komórek HEK293 przed oraz 1, 2 lub 3 dni po transfekcji wektorami pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40, pAAV2/2, pAdΔF6 oraz w stosunku plazmid:PEI 1:1. Paski skali: 400 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Pozyskiwanie surowych preparatów wektora

  1. Zamrozić całą płytkę z transfektowanymi komórkami na 30 min w temperaturze -80 °C, a następnie rozmrozić przez 30 min w temperaturze 37 °C. Powtórzyć czynność, aby przeprowadzić łącznie trzy cykle zamrażania i rozmrażania. Nie zdejmować pokrywy – wnętrze płytki musi pozostać sterylne. Płytki mogą pozostawać w temperaturze -80 °C do momentu przejścia do kolejnych kroków.
    UWAGA: Do rozmrażania najlepiej nadaje się inkubator bez nawilżania, co minimalizuje skraplanie się pary wodnej na zewnętrznej stronie płytek, które może prowadzić do przypadkowej kontaminacji.
  2. Następne dwa kroki należy wykonać w komorze z laminarnym przepływem powietrza, stosując techniki aseptyczne. Wymieszać zawartość każdego dołka za pomocą pipetowania, aby zapewnić maksymalną dezintegrację komórek. Przenieść lizat do probówki 2 mL i wirować przez 15 min przy 15 000 x g w temperaturze pokojowej w celu usunięcia resztek komórkowych.
  3. Ostrożnie przenieść nadsącz do nowej probówki 2 mL. Taki surowy preparat można stosować natychmiast, bez miareczkowania lub oczyszczania. Wektor można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy lub w -20 °C przez lata.
    ​UWAGA: W razie potrzeby miana można obliczyć za pomocą ilościowej PCR (qPCR) poprzez określenie liczby genomów wektora (VG) wewnątrz cząsteczek odpornych na DNazę. W związku z tym miana podaje się w jednostkach VG/mL. Wektor przechowywany przez kilka miesięcy w temperaturze 4 °C należy ponownie zmiareczkować przed użyciem, ponieważ wektor może ulegać agregacji i/lub wiązać się ze ściankami probówki, co obniża miano preparatu.

5. Transdukcja

  1. Wysiać wybrany typ komórek (np. Huh7) na płytkę 96-dołkową, dążąc do uzyskania konfluencji na poziomie 50%-75%, w zależności od czasu trwania transdukcji. Wyższa konfluencja może skutkować obniżeniem wydajności transdukcji AAV.
  2. Dodać wektor (np. CMV.mScarlet) do komórek bez określania miana surowego preparatu w zastosowaniach, w których dawka nie jest istotna, np. podczas testowania panelu kapsydów pod kątem transdukcji w nowym typie komórek. Przygotować szereg rozcieńczeń surowego preparatu w stosunku 1:3 w pożywce bezsurowiczej (SF), aby uzyskać optymalną ilość wektora wymaganą do danej aplikacji. Odessać pożywkę z płytki 96-dołkowej i dodać 50-100 µL rozcieńczonego surowego preparatu do dołków. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
    UWAGA: Surowica może zawierać przeciwciała, które mogą neutralizować wektor AAV i obniżać wydajność transdukcji. Niemniej jednak w przypadku typów komórek wrażliwych surowicy można używać podczas transdukcji.
  3. Usunąć wektor 48 h po transdukcji (hpt) i wypłukać komórki raz podgrzanym roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). W przypadku typów komórek wrażliwych wektory można usunąć i zastąpić pożywką z surowicą już 2 hpt. W wielu zastosowaniach przeprowadza się inkubację nocną w celu transdukcji komórek, a rano wymienia pożywkę w dołkach na świeżą pożywkę z surowicą. Typy komórek odpornych, takie jak Huh7 i U2-OS, nie wymagają wymiany pożywki.
  4. Zakończyć transdukcję poprzez utrwalenie komórek w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 10 min. W zależności od zastosowania można użyć różnych metod zakończenia procesu (np. lizy). Dla większości typów komórek szczytowa ekspresja występuje do 48 hpt, co czyni ten czas powszechnym punktem końcowym eksperymentu.

6. Warianty metody transdukcji w zależności od typu komórek

UWAGA: Różne typy komórek wymagają różnych warunków hodowli. Dlatego dodawanie wektora do transdukcji powinno zostać zoptymalizowane w zależności od potrzeb danego typu komórek. Poniżej przedstawiono bardzo specyficzne protokoły transdukcji dla typów komórek uwzględnionych w wynikach reprezentatywnych, ilustrujące niektóre warianty protokołów transdukcji, które badacz może chcieć przetestować w zależności od własnych potrzeb.

  1. Organoidy jelita cienkiego myszy
    1. Wyizoluj organoidy jelita cienkiego myszy (mSIOs) z preparatu krypt jelita cienkiego myszy C57BL/6J. Osadź organoidy w 90% macierzy błony podstawnej i hoduj w płytkach 24-dołkowych zawierających albo pożywkę wzrostową dla organoidów (bez antybiotyków), albo pożywkę przedtransdukcyjną (50% pożywki warunkowanej Wnt3a [produkowanej wewnętrznie przy użyciu komórek L Wnt-3A w pożywce wzrostowej dla organoidów], 10 mM nikotynamidu, 10 µM inhibitora ROCK oraz 2,5 µM CHIR99021) przez jedno przejście (5-7 dni) przed transdukcją w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
    2. Przed transdukcją przepłucz organoidy D-PBS, rozbij kopułki macierzy błony podstawnej poprzez pipetowanie i zdysocjuj organoidy do postaci małych skupisk komórek, inkubując je w pożywce do dysocjacji przez 10 min w 37 °C i ponownie pipetując.
    3. Zatrzymaj proces dysocjacji komórek, dodając 5% FBS w DMEM/F-12 z 15 mM HEPES, przenieś skupiska komórek do probówek wirówkowych i odwirowuj przez 5 min przy 1000 x g w temperaturze pokojowej.
    4. Resuspenduj skupiska komórek w pożywce do transdukcji (pożywce przedtransdukcyjnej zawierającej 10 µg/mL polybrene lub pożywce wzrostowej dla organoidów zawierającej 10 µg/mL polybrene) i przenieś do płytek 48-dołkowych, a następnie dodaj surowe preparaty AAV pakujące CMV.mScarlet do transdukcji.
    5. Przeprowadź transdukcję organoidów poprzez wirowanie płytki przez 1 h przy 600 x g i 37 °C, a następnie inkubuj w 37 °C przez kolejne 6 h. Zbierz przetransdukowane organoidy do probówek mikrocentryfugicznych 1,5 mL, wiruj przez 5 min przy 1000 x g w temperaturze pokojowej i umieść na lodzie.
    6. Po usunięciu supernatantu resuspenduj przetransdukowane organoidy w 90% macierzy błony podstawnej w pożywce przedtransdukcyjnej lub pożywce wzrostowej dla organoidów i nanieś krople o objętości 20 µL do jednego dołka wstępnie ogrzanego szkiełka nakrywkowego z komorami.
    7. Po inkubacji przez 10 min w inkubatorze osadź kroplę w 350 µL pożywki przedtransdukcyjnej lub pożywki wzrostowej dla organoidów i inkubuj w 37 °C w inkubatorze. Określ wydajność transdukcji 2-5 dni po transdukcji poprzez obrazowanie przetransdukowanych organoidów pod mikroskopem konfokalnym i oszacuj procent czerwonych komórek fluorescencyjnych na organoid.
  2. Komórki BeWo
    1. Na 24 h przed transdukcją wysiej ludzkie komórki choriocarcinoma łożyska BeWo w zagęszczeniu 10 000 komórek na dołek płytki 96-dołkowej. Rozcieńcz surowe preparaty AAV pakujące CMV.mScarlet w stosunku 1:1 w beztłuszczowej pożywce F12-K BeWo do całkowitej objętości 50 µL na dołek. Odessać pożywkę z dołka i zastąpić ją 50 µL rozcieńczonego AAV na dołek.
    2. Inkubuj komórki w 37 °C przez noc (~18 h), a następnie dodaj 100 µL pożywki F12-K BeWo zawierającej 10% FBS, aby zwiększyć całkowitą objętość do 150 µL. Inkubuj komórki przez kolejne 6 h, łącznie przez 24 h po transdukcji (hpt).
    3. Do obrazowania zabarw żywe komórki barwnikiem Hoechst przez 30 min w pożywce F12-K, a następnie wymień pożywkę na DMEM bez fenolu zawierający 10% FBS, dodatek 1x glutamax oraz dodatek 1x pirogronianu sodu. Przeprowadź obrazowanie żywych komórek pod mikroskopem konfokalnym, używając zestawów filtrów DAPI (do obrazowania Hoechst) i mCherry (do obrazowania mScarlet) w 37 °C i 5% CO2.
  3. Komórki Hepa1-6 i Huh7
    1. Wysiej mysie komórki wątroby Hepa1-6 i ludzkie komórki wątroby Huh7 w DMEM (4,5 g/L glukozy, 110 mg/L pirogronianu sodu, 10% FBS) w zagęszczeniu 5 000 komórek na dołek płytki 96-dołkowej na 24 h przed transdukcją.
    2. Dodaj 50 µL nierozcieńczonych surowych preparatów AAV pakujących CMV.mScarlet bezpośrednio do komórek i inkubuj w 37 °C przez 48 h. Przemyj komórki raz w PBS, utrwal w 4% PFA i zabarw barwnikiem Hoechst przez 10 min. Przeprowadź obrazowanie pod mikroskopem konfokalnym, używając zestawów filtrów DAPI (do obrazowania Hoechst) i mCherry (do obrazowania mScarlet).
  4. Komórki C2C12 i HSkMC
    1. Wysiej niezróżnicowane mysie mioblasty C2C12 oraz niezróżnicowane ludzkie pierwotne mioblasty mięśni szkieletowych (HSkMC) w zagęszczeniu 5 000 komórek na dołek płytki 96-dołkowej na 72 h przed transdukcją.
    2. Rozcieńcz surowe preparaty AAV pakujące CMV.mScarlet w stosunku 1:1 w DMEM (4,5 g/L glukozy, Penn/Strep, 20% FBS) dla mioblastów C2C12 lub w pożywce wzrostowej dla mięśni szkieletowych dla mioblastów HSkMC. Zróżnicuj mioblasty HSkMC do miotub w poprzez zmianę pożywki na pożywkę do różnicowania.
    3. Inkubuj mioblasty i miotuby w rozcieńczonych preparatach AAV przez 24 h w 37 °C. Zabarw żywe komórki barwnikiem Hoechst przez 10 min i obrazuj pod mikroskopem konfokalnym, używając zestawów filtrów DAPI (do obrazowania Hoechst) i mCherry (do obrazowania mScarlet).

Wyniki

Wyznaczanie optymalnego kapsydu do transdukcji wybranych hodowli komórkowych
W celu określenia tropizmu różnych serotypów kapsydów poddano transdukcji szereg typów komórek (Rycina 5). Naturalne serotypy AAV214, AAV421, AAV522, AAV823, AAV924 oraz zmodyfikowane warianty kapsydów Anc8025, DJ26, LK0327 i KP128 zapakowano z genomem wektora ekspresyjnym dla mScarlet pod promotorem CMV, sklonowanym zgodnie z metodami opisanymi w niniejszym protokole. Nietytrowane surowe preparaty wektorów rozcieńczono w odpowiednich mediach hodowlanych, a komórki transdukowano przez ponad 24 h, po czym wykonano obrazowanie (Rycina 5B). Wydajność transdukcji obliczono jako proporcję całkowitej liczby komórek mScarlet+ lub proporcję komórek w pojedynczej płaszczyźnie z, które były mScarlet+ (w przypadku organoidów jelita cienkiego myszy; Rycina 5C). Wydajności transdukcji (komórki mScarlet+) nie podano dla zróżnicowanych miotub C2C12 i HSkMC, lecz dla niezróżnicowanych mioblastów C2C12 i HSkMC (Rycina 5A).

AAV2 i KP1 okazały się najsilniejszymi serotypami we wszystkich badanych liniach komórkowych (Rysunek 5A). Zaobserwowano również, że podobne typy komórek pochodzące od różnych gatunków są transdukowane z różną wydajnością. Na przykład Hepa1-6 (linia komórek wątroby pochodzenia mysiego) wykazuje wyraźny spadek poziomu transdukcji w porównaniu z Huh7 (linia komórek wątroby pochodzenia ludzkiego) przy zastosowaniu AAV2 (Rysunek 5B). Ponadto istotną rolę podczas transdukcji odgrywają różne warunki hodowlane. Organoidy jelita cienkiego myszy (mSIOs) hodowane w pożywce przedtransdukcyjnej są transdukowane mniej efektywnie niż te hodowane w pożywce do wzrostu organoidów (Rysunek 5C). Dodatkowo AAV2 wydajnie transdukuje niedróżnicujące się mioblasty HSkMC oraz zróżnicowane miotuby HSkMC (Rysunek 5B), choć analiza ilościowa miotub jest trudna, w związku z czym nie została przedstawiona.

Wysoka wydajność transdukcji zaobserwowana dla różnych typów komórek na Rysunku 5 wykazuje, że surowe preparaty wektorów mogą być skutecznie wykorzystywane do transdukcji wielu typów komórek bez konieczności przeprowadzania dodatkowych etapów, takich jak oczyszczanie i miareczkowanie. Należy jednak zachować szczególną ostrożność przy wyborze kapsydu, aby zmaksymalizować dostarczanie transgenu. Wiele innych linii komórkowych i kapsydów zostało wcześniej przetestowanych i opisanych w publikacjach, choć z zastosowaniem oczyszczonych preparatów wektorów12.

Efekt warunków hodowlanych, niezależny od cząsteczek wektora, może wpływać na wydajność transdukcji. Powszechnie przyjmuje się jednak, że tropizm (tj. swoiste dla typu komórki pobieranie i ekspresja wektora) jest cechą specyficzną dla kapsydu29. Do tej pory nie zaobserwowano, aby porównanie surowych i oczyszczonych preparatów o tej samej dawce wpływało na tropizm komórkowy. W związku z tym surowe preparaty wektorowe mogą być stosowane w hodowlach komórkowych w podobny sposób jak wektory oczyszczone.

Analiza ekspresji genów w liniach komórkowych; schemat, obrazowanie fluorescencyjne, mScarlet, Hoechst, wykres danych.
Rycina 5: Surowa transdukcja wektorem różnych typów komórek. (A) Procent komórek mScarlet+ po dodaniu różnych wektorów AAV zawierających transgen mScarlet. (B) Komórki wykazujące ekspresję mScarlet dostarczonego za pomocą serotypu AAV 2. Paski skali: 100 µm (Hepa1-6, Huh7, C2C12 oraz HSkMC), 200 µm (BeWo), 20 µm (mSIO). Skróty: hpt = godziny po transdukcji. (C) Mysie organoidy jelita cienkiego (mSIOs) były traktowane rAAV w pożywce przedtransdukcyjnej lub pożywce do wzrostu organoidów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela uzupełniająca 1: Arkusz obliczeniowy dla transfekcji potrójnej plazmidowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Arkusz optymalizacji PEI. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Klonowanie
Protokół klonowania nie ogranicza się do plazmidu pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 użytego powyżej i może być łatwo zmodyfikowany w zależności od potrzeb doświadczalnych badacza. Wiele plazmidów zawierających ITR jest łatwo dostępnych w sprzedaży online. Na przykład dostępne są plazmidy zawierające zarówno Cas9, jak i miejsce klonowania sgRNA, jednak wymagają one kilku dodatkowych etapów, takich jak hybrydyzacja oligonukleotydów i traktowanie PNK30. Ponadto można znaleźć plazmidy zawierające wielomiejscową sekwencję klonowania (MCS) z samymi ITR, bez wewnętrznych elementów regulacyjnych31. W przypadku użycia innych plazmidów, enzymy restrykcyjne (RE) stosowane do trawienia są zazwyczaj jedynymi elementami, które mogą wymagać zmiany w tym protokole. Ograniczeniem rAAV jest jednak jego ograniczona pojemność ładunku. Ze względu na fizyczne ograniczenia kapsydu, genom wektora nie powinien przekraczać 4,9 kb, wliczając w to ITR.

Podczas izolowania plazmidu z bakterii kluczowe jest użycie zestawu do midiprepu lub maxiprepu o niskiej zawartości endotoksyn lub wolnego od endotoksyn, aby zminimalizować uszkodzenia komórek podczas transfekcji lub transdukcji potrójnym plazmidem. Plazmidy z zestawów do miniprepu często zawierają więcej zanieczyszczeń, mają niższe stężenia i mniejszą ilość DNA superzwiniętego, co może wpłynąć na późniejszą produkcję rAAV, dlatego ich stosowanie nie jest zalecane.

Zrozumienie struktury i właściwości ITR jest kluczowe podczas klonowania. Po pierwsze, przeprowadzenie reakcji PCR przez ITR jest niezwykle trudne. Należy unikać projektów klonowania wymagających amplifikacji PCR przez ITR oraz ograniczyć stosowanie techniki klonowania Gibson assembly. W związku z tym preferowaną metodą klonowania do plazmidów zawierających ITR jest klonowanie z użyciem enzymów restrykcyjnych. Co więcej, niektóre primery do sekwencjonowania metodą Sangera mogą być niekompatybilne, jeśli sekwencjonowany region zawiera ITR. Zamiast tego zaleca się stosowanie primerów, które sekwencjonują w kierunku oddalającym od ITR, w głąb rdzenia genomu wektora, aby uzyskać bardziej precyzyjne wyniki sekwencjonowania. Po drugie, ITR są podatne na delecje, rearanżacje i mutacje podczas transformacji do bakterii w celu amplifikacji plazmidu32,33. Aby zminimalizować te zjawiska, zaleca się stosowanie szczepów bakterii kompetentnych z defektem rekombinacji, takich jak Stbl3, oraz inkubowanie ich w temperaturze 30 °C, aby spowolnić podziały komórkowe. Wreszcie zauważono, że mniejsze kolonie mogą odpowiadać klonom bez rearanżacji lub delecji, ponieważ te pozbawione ITR mogą wykazywać przewagę wzrostu i być większe. Dlatego zaleca się wybieranie małych kolonii.

Produkcja wektora
Na pomyślną produkcję wektora rAAV może wpływać wiele czynników. Jednym z krytycznych elementów jest stan zdrowia komórek HEK293 lub 293T wykorzystywanych do transfekcji. Zazwyczaj idealne są niskie numery pasaży, ponieważ komórki o wysokim numerze pasażu mogą wykazywać zmienność genotypową i fenotypową, co może prowadzić do obniżenia mian rAAV. Ponadto, dla efektywnej produkcji gęstość wysianych komórek powinna wynosić 75%-90% konfluencji. Rzadki zasiew komórek skutkuje niską wydajnością wektora, ponieważ dostępna jest mniejsza liczba komórek zdolnych do jego produkcji, natomiast komórki przerośnięte nie zostaną efektywnie transfektowane.

Różnice między partiami odczynników, zapasami komórek oraz ogólna zmienność między laboratoriami wpływają na różnice w wydajności transfekcji i mianie produktu. Jednym z czynników podlegających optymalizacji, który może prowadzić do poprawy miana, jest stosunek plazmidu do PEI w reakcjach transfekcji. Krytyczne jest stosowanie świeżego (wiek <1 miesiąca) PEI MAX. Zaleca się, aby jako punkt wyjścia zastosować stosunek plazmidu do PEI wynoszący 1:1, a w przypadku niskiej wydajności transfekcji lub transdukcji, przetestować kilka różnych stosunków. Optymalizacja miana jest najłatwiejsza przy użyciu transgenu z odczytem wizualnym, takiego jak użyty tutaj jako materiał wyjściowy do klonowania transgen reporterowy CMV.Luc.IRES.EGFP. Aby przeprowadzić optymalizację, należy wykonać krok 3 protokołu, używając płytki 12-dołkowej i zmniejszając dwukrotnie masę plazmidu oraz objętość odczynników (końcowa masa plazmidu wynosi 2,6 µg). Należy odpowiednio dostosować objętość PEI tak, aby odpowiadała stosunkom w zakresie od 1:0,75 do 1:3, z przyrostem o 0,25 (Rycina 6). Po 15 min każdą reakcję należy rozcieńczyć 950 µL pożywki SF. Dla wygody można przygotować master mix zawierający trzy plazmidy i zapipetować go do probówek 1,5 mL przed dodaniem PEI – patrz Plik uzupełniający 2. Należy zebrać wektor, przeprowadzić transdukcję wybranych komórek i wykonać obrazowanie. Dołek z najwyższą wydajnością transdukcji (odsetek komórek GFP+) odpowiada najwyższemu mianu i najbardziej optymalnemu stosunkowi PEI:DNA.

Schemat przygotowania wektora AAV; mieszanie plazmidów, transfekcja PEI, etapy transdukcji komórek HEK293.
Rysunek 6: Schemat optymalizacji PEI. Schemat kroków wymaganych do optymalizacji PEI. Testowane są różne proporcje plazmidu do PEI w celu wyznaczenia stosunku optymalnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Uwagi dotyczące zbioru i miareczkowania
Technika zamrażania i rozmrażania stosowana do zbioru wektora rAAV skutecznie lizuje komórki HEK293 w sposób umożliwiający bezpośrednie wykorzystanie klarownego lizatu do transdukcji hodowlanych komórek. Niektóre serotypy rAAV, takie jak AAV1, AAV8 i AAV9, są uwalniane z komórek podczas produkcji wektora i mogą być zbierane z pożywki hodowlanej bez cykli zamrażania i rozmrażania34. Metoda opisana w niniejszej procedurze zazwyczaj daje miana rzędu 1 x 1010 VG/mL przy użyciu kapsydów AAV2 oraz 1 x 1011 VG/mL dla AAV8. Chociaż wyższe miana można osiągnąć poprzez lizę detergentową lub inną lizę chemiczną, są one szkodliwe dla komórek w dalszych etapach wykorzystania i wymagają dodatkowego oczyszczania rAAV z lizatu. Niższe miano jest jednym z kompromisów, które badacz powinien rozważyć, określając, czy preparaty surowe są odpowiednie do jego potrzeb badawczych; jednak nieznacznie niższe miana uzyskiwane metodami opisanymi tutaj mogą bardzo dobrze transdukować wiele typów komórek (patrz wyniki reprezentatywne). Oprócz wydajności transfekcji i stanu zdrowia komórek, miana wektora różnią się w zależności od kapsydu użytego podczas produkcji rAAV oraz wielkości i sekwencji transgenu wewnątrz VG35.

Podczas pozyskiwania surowych preparatów wektorów może występować plazmidowe DNA użyte podczas transfekcji potrójnej, co w rzadkich przypadkach może prowadzić do wtórnej transfekcji w trakcie transdukcji. Co więcej, nieopakowane VGs mogą wiązać się z zewnętrzną stroną kapsydów i wywoływać wrodzoną odpowiedź immunologiczną na nagie i obce jednoniciowe DNA36,37. W związku z tym w przypadku wrażliwych typów komórek preparaty wektorów mogą wymagać trawienia DNazą i oczyszczania w celu usunięcia nieopakowanych VGs oraz plazmidów.

Jeśli chce się obliczyć miano surowego preparatu, można przeprowadzić qPCR w celu określenia liczby zapakowanych VG wewnątrz cząstek odpornych na DNazę (DRP). W skrócie, niewielką ilość surowego preparatu poddaje się trawieniu DNazą, aby usunąć DNA plazmidowe, zanieczyszczające kwasy nukleinowe lub częściowo zapakowane VG. Następnie próbkę poddaje się qPCR i kwantyfikuje chronione VG wewnątrz DRP, co pozwala uzyskać miano wyrażone w jednostkach genomu wektora na mL surowego preparatu38. Nie zaleca się przeprowadzania miareczkowania wektora za pomocą testów opartych na metodzie ELISA, które kwantyfikują miana kapsydów. W porównaniu z wirusem AAV typu dzikiego, rAAV charakteryzuje się obecnością pewnej proporcji kapsydów pustych i częściowo zapakowanych39. Test ELISA skwantyfikuje wszystkie kapsydy niezależnie od zawartości genomu i zawyży liczbę jednostek transdukcyjnych obecnych w preparacie, które wymagają zapakowanego VG.

Uwagi dotyczące transdukcji
Wiele czynników wpływa na transdukcję rAAV, dlatego przy każdym nowym eksperymencie należy odpowiednio je rozważyć. W zależności od promotora sterującego ekspresją transgenu, początek ekspresji może nastąpić już 4 h po transdukcji (hpt), a szczyt ekspresji jest zazwyczaj osiągany do 48 hpt. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę czas od początkowego wysiewu komórek do punktu końcowego eksperymentu. Pozwala to oszacować początkowy stopień konfluencji komórek i upewnić się, że nie zrosną się one zbyt gęsto do końca badania. W przypadku zbyt wysokiej konfluencji zachowanie komórek może ulec zmianie z powodu odpowiedzi stresowej, co może zafałszować wyniki eksperymentu. Niektóre typy komórek, takie jak U2-OS, dość dobrze tolerują nadmierny wzrost/hamowanie kontaktowe. Dodatkowo mogą one wytrzymać długie okresy (48 h+) w bezsurowiczym medium warunkującym – produkcie niniejszego protokołu produkcji. Jednak wrażliwe typy komórek mogą wymagać dodania surowicy lub rozcieńczenia surowego preparatu specjalną pożywką wzrostową w celu utrzymania ich żywotności podczas transdukcji. Nieznacznie obniżona wydajność transdukcji przy użyciu pożywek zawierających surowicę jest potencjalnym kompromisem w celu zachowania stanu zdrowia komórek i powinna być rozważona przez badacza.

Zazwyczaj w przypadku szybko dzielących się komórek, optymalna początkowa konfluencja wynosi około 50% dla zastosowań, które zostaną zakończone 48 hpt. Niemniej jednak konfluencję można odpowiednio dostosować w zależności od potrzeb eksperymentu. Nie zaleca się transdukcji unieśmiertelnionych linii komórkowych typu monowarstwy przy konfluencji przekraczającej 75% ze względu na obniżoną wydajność transdukcji. Większość hodowanych typów komórek zostaje pomyślnie transdukowana i pozostaje zdrowa po nocnej inkubacji z surowymi preparatami rAAV, a następnie po zmianie na świeże medium zawierające surowicę następnego ranka.

Serotyp kapsydu jest istotnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę podczas produkcji rAAV w celu transdukcji komórki docelowej, ponieważ kapsyd jest głównym determinantem tropizmu komórkowego i późniejszej ekspresji transgenu13. AAV2 jest szeroko stosowanym serotypem ze względu na jego zdolność do efektywnej transdukcji wielu typów komórek hodowlanych12. Właściwość ta AAV2 może być przypisana proteoglikanom siarczanu heparanu (HSPGs), które służą jako główny czynnik przylegania dla AAV2, oraz wysokim poziomom HSPGs w komórkach hodowlanych wynikającym z adaptacji do wzrostu in vitro40. Inne kapsydy, takie jak AAV9, są mniej skuteczne w transdukcji szerokiego spektrum typów komórek, co można wyjaśnić ich zależnością od czynników przylegania, które nie są ekspresjonowane w takich warunkach41. Dlatego rekomendujemy AAV2 jako kapsyd pierwszego wyboru w komórkach hodowlanych, jeśli wybrana komórka docelowa nie była wcześniej testowana z rAAV w literaturze.

Należy pamiętać, że głównym ograniczeniem surowych preparatów wektorów jest fakt, iż nie nadają się one do transdukcji modeli zwierzęcych. Badania in vivo wymagają oczyszczenia preparatów oraz przeprowadzenia oceny ich jakości.

Ekspresja transgenu i kwestie potencjalnej integracji
rAAV nie prowadzą w sposób niezawodny do permanentnej ekspresji transgenu. Z czasem genomy wirusowe (VG) mogą ulec wyciszeniu, a ekspresja transgeniczna może zostać zahamowana po kilku pasażach42. Ponadto większość VG pozostaje w formie episomalnej, a rAAV nie zawierają wirusowych białek Rep, które pośredniczyłyby w częstej integracji z genomem gospodarza, jak ma to miejsce w lizogennej infekcji wirusa typu dzikiego, ani nie promowałyby replikacji VG43. W konsekwencji episomy w transdukowanych komórkach będą z czasem rozcieńczane w komórkach potomnych w wyniku podziałów.

Integracja na poziomie podstawowym jest możliwa dla całego dostarczonego transgenicznego materiału DNA. Jednakże wektory genomowe (VG) zawierające sekwencje ITR wykazują tendencję do integracji z wyższą częstotliwością44. W związku z tym w niewielkiej podgrupie komórek może zostać zaobserwowana trwała ekspresja transgenu. Użytkownicy powinni wziąć pod uwagę tę możliwość, szczególnie podczas stosowania rAAV do dostarczania enzymów tnących DNA, takich jak Cas9, ponieważ pęknięcia dwuniciowe mogą prowadzić do jeszcze większej częstotliwości integracji i trwałej ekspresji45. Choć czyni to rAAV dobrym kandydatem do dostarczania matryc do naprawy sterowanej homologią w celu znakowania endogennego lub dodawania genów, należy rozważyć możliwość insercji Cas919,46.

Oświadczenia

A.C.M. jest konsultantem w Janssen Pharmaceuticals i pełni funkcję SAB w NewBiologix. Wszyscy pozostali autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Robertowi Tjianowi i Xavierowi Darzacqowi za ich wsparcie i korzystanie ze sprzętu laboratoryjnego. Dziękujemy Markowi Kayowi za podarowanie plazmidów KP1 i LK03 rep/cap oraz Lukowi Vandenberghe za plazmid AAV4 rep/cap. Finansowanie zostało zapewnione przez Howard Hughes Medical Institute (34430, R. T.) oraz California Institute for Regenerative Medicine Training Program EDUC4-12790. N.W. dziękuje za finansowanie z Berkeley Stem Cell Center w ramach stypendium podoktorskiego Siebel oraz z Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG) w ramach stypendium Waltera Benjamina.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Snapgene DNA do przeglądania sofrwareSnapgene
pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40AddGene105533
pAAV2/2 (Rep/Cap)AddGene104963
pAdΔ F6AddGene112867
LB Agar CarbenicillinSigma-AldrichL0418
Cyfrowy inkubator Boekel Scientific EconomyBoekel Scientific133000
LB podłoże, proszekMP Biomedicals113002042
Karpencylina (disód)GoldBioC-103-5
Nowy Brunszwik I26 ShakerEppendorfM1324-0000
50 ml Probówki wirówkoweCorning430828
Wirówka 5810 REppendorf22627040
QIAGEN Plasmid Plus Midi KitQiagen12945
PCR PULL-APART 8-TUBE STRIPSUSA Scientific1402-3900
Mastercycler nexusEppendorf6333000022
dNTPThermo Fisher Scientific18427013
5x Phusion BufferNEBB0518S Dostarczanyprzy zakupie Phusion Polymerase
Phusion  Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNEBM0530S
Barwnik w żelu, pomarańczowy (6X)NEBB7022S
DNA Clean & Concentrator-100ZymoD4029
Zymoclean Gel Zestaw do odzyskiwania DNAZymoD4001
NotI-HFNEBR3189S
EcoRI-HFNEBR3101S
Bufor CutSmart (10x)NEBB6004S Dostarczanyz zakupem enzymu restrykcyjnego
UltraPure AgarozaThermo Fisher Scientific16500100
Bromek etydynySigma-AldrichE1510
T4 Ligaza DNANEBM0202S
Bufor reakcyjny ligazy DNA T4NEBB0202S Dostarczanyprzy zakupie probówek T4 Ligase
Eppendorf Safe-Lock (1,5 ml)Eppendorf22363204
Precision Microprocessor Water BathThermo Scientific51221046
Sterylne plastikowe probówki hodowlaneFisher Scientific149566B
2,0 ml Probówka do mikrowirówekThomas Scientific1149Y01
ZR Plasmid Miniprep - KlasycznyZymoD4015
Xma1NEBR0180S
Sma1NEBR0141S
HEK 293T komórkiATCCCRL-3216
Falcon 6-wellCorning353046
Gibco  DMEM, wysoka zawartość glukozy, pirogronianThermo-Fisher11995065
Inkubator CO2 Sanyo MCO-18AIC(UV) MarshallScientificMCO-18AIC
PEI MAX (Chlorowodorek polietyleniny)Polysciences24765-100
Mikser Vortex Genie 2Mikroskopia elektronowa Sciences102091-234
Sanyo Ultra niska zamrażarka Sanyo14656-15267-16219
INCU-Line IL 10 z przezroczystym okienkiemVWR390-0384
Mikrowirówki EppendorfEppendorf05-400-005
Falcon 96-wellMyszy Corning353072
C57BL/6JSzczep#000664
organoidowe podłoże wzrostoweSTEMCELL Technologies6005
L Komórki Wnt-3AATCCCRL-2647
amid nikotynamiduSigmaN0636-100G
Inhibitor ROCKSTEMCELL Technologies72302
CHIR99021STEMCELL Technologies72052
Corning Matrigel Membrana podstawna o obniżonym czynniku wzrostu (GFR)Fisher356231
24-dołkowa płytkaFisher08-772-1
D-PBSThermo Fisher Scientific14-190-250
TrypLE ExpressFisher12604013
DMEM/F-12 z 15 mM HEPESSTEMCELL Technologies36254
polibreneMillipore SigmaTR-1003-G
48-dołkowe płytkiFisher08-772-3D
Thermo Scientific  Szkło nakrywane z komorą Nunc Lab-TekFisher12-565-470
Komórki BeWoATCCCCL-98
F-12K MediumATCC30-2004
Hepa1-6ATCCCRL-1830
Huh7Berkeley Zakład hodowli komórkowych BSDHUH-7
C2C12ATCCCRL-1772
HSkMCATCCPCS-950-010
Pożywka do wzrostu komórek mięśni szkieletowychSigmaC-23060
Medium do różnicowania mięśni szkieletowych SigmaC-23061
Invitrogen  Cyfrowy kolorowy mikroskop fluorescencyjny EVOSFisher Scientific12-563-340
Perkin Elmer Opera PhenixPerkin ElmerHH14001000
PhenoPlate 96-dołkowyPerkin Elmer6055302
DMEM, wysoki poziom glukozy, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowejSuplement Thermo-Fisher31053028
GlutaMAXThermo-Fisher35050079
Pirogronian soduThermo-Fisher11360070
pAAV2/5 (Rep/Cap)Addgene104964
pAAV2/8 (Rep/Cap)Addgene112864
pAAV-DJ-N589X (Rep/Cap)Addgene130878
pAAV2/9n (Rep/Cap)Addgene112865
pAnc80L65AAPAddgene92307
KP1 (rep/cap)podarowany przez profesora Marka Kaya (Uniwersytet Stanforda)
LK03 (rep/cap)podarowany przez profesora Marka Kaya (Uniwersytet Stanforda)
pAAV4 (rep/cap)podarowany przez profesora Luka Vandenberghe (Harvard Medical School)
pAAV.Cas9.sgRNAAddgene61591
pAAV.MCSAddgene46954
gBlock (syntetyczne DNA)IDT
UC

Bibliografia

  1. Pillay, S., et al. Corrigendum: An essential receptor for adeno-associated virus infection. Nature. 539 (7629), 456(2016).
  2. Nicolson, S. C., Samulski, R. J. Recombinant adeno-associated virus utilizes host cell nuclear import machinery to enter the nucleus. Journal of Virology. 88 (8), 4132-4144 (2014).
  3. Lundstrom, K. Viral Vectors in Gene Therapy. Diseases. 6 (2), 42(2018).
  4. Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).
  5. Ling, C., et al. The Adeno-Associated Virus Genome Packaging Puzzle. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 9 (3), 175(2015).
  6. Maurer, A. C., Weitzman, M. D. Adeno-Associated Virus Genome Interactions Important for Vector Production and Transduction. Human Gene Therapy. 31 (9-10), 499-511 (2020).
  7. Srivastava, A. Replication of the adeno-associated virus DNA termini in vitro. Intervirology. 27 (3), 138-147 (1987).
  8. Wang, X. S., Ponnazhagan, S., Srivastava, A. Rescue and replication of adeno-associated virus type 2 as well as vector DNA sequences from recombinant plasmids containing deletions in the viral inverted terminal repeats: selective encapsidation of viral genomes in progeny virions. Journal of Virology. 70 (3), 1668-1677 (1996).
  9. Earley, L. F., et al. Adeno-Associated Virus Serotype-Specific Inverted Terminal Repeat Sequence Role in Vector Transgene Expression. Human Gene Therapy. 31 (3-4), 151-162 (2020).
  10. Yang, J., et al. Concatamerization of adeno-associated virus circular genomes occurs through intermolecular recombination. Journal of Virology. 73 (11), 9468-9477 (1999).
  11. Au, H. K. E., Isalan, M., Mielcarek, M. Gene Therapy Advances: A Meta-Analysis of AAV Usage in Clinical Settings. Frontiers in Medicine. 8, 809118(2021).
  12. Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74(2013).
  13. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  14. Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Adenovirus-Associated Defective Virus Particles. Science. 149 (3685), 754-756 (1965).
  15. Meier, A. F., Fraefel, C., Seyffert, M. The Interplay between Adeno-Associated Virus and its Helper Viruses. Viruses. 12 (6), 662(2020).
  16. Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F., Christensen, G. Comparison of nonviral transfection and adeno-associated viral transduction on cardiomyocytes. Molecular Biotechnology. 28 (1), 21-32 (2004).
  17. Batista Napotnik, T., Polajzer, T., Miklavcic, D. Cell death due to electroporation - A review. Bioelectrochemistry. 141, 107871(2021).
  18. McCarty, D. M., Young, S. M. Jr, Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).
  19. Yang, Y., et al. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nature Biotechnology. 34 (3), 334-338 (2016).
  20. Stacey, G. N. Cell culture contamination. Methods in Molecular Biology. 731, 79-91 (2011).
  21. Parks, W. P., Melnick, J. L., Rongey, R., Mayor, H. D. Physical assay and growth cycle studies of a defective adeno-satellite virus. Journal of Virology. 1 (1), 171-180 (1967).
  22. Bantel-Schaal, U., zur Hausen, H. Characterization of the DNA of a defective human parvovirus isolated from a genital site. Virology. 134 (1), 52-63 (1984).
  23. Gao, G. P., et al. Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 99 (18), 11854-11859 (2002).
  24. Gao, G., et al. Clades of Adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues. Journal of Virology. 78 (12), 6381-6388 (2004).
  25. Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Reports. 12 (6), 1056-1068 (2015).
  26. Grimm, D., et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. Journal of Virology. 82 (12), 5887-5911 (2008).
  27. Lisowski, L., et al. Selection and evaluation of clinically relevant AAV variants in a xenograft liver model. Nature. 506 (7488), 382-386 (2014).
  28. Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. JCI Insight. 4 (22), e131610(2019).
  29. Colon-Thillet, R., Jerome, K. R., Stone, D. Optimization of AAV vectors to target persistent viral reservoirs. Virology Journal. 18 (1), 85(2021).
  30. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  31. Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair. The Journal of Cell Biology. 202 (3), 579-595 (2013).
  32. Bi, X., Liu, L. F. DNA rearrangement mediated by inverted repeats. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 93 (2), 819-823 (1996).
  33. Samulski, R. J., Berns, K. I., Tan, M., Muzyczka, N. Cloning of adeno-associated virus into pBR322: rescue of intact virus from the recombinant plasmid in human cells. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 79 (6), 2077-2081 (1982).
  34. Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
  35. Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Molecular Therapy. 7 (1), 122-128 (2003).
  36. Zhu, J., Huang, X., Yang, Y. The TLR9-MyD88 pathway is critical for adaptive immune responses to adeno-associated virus gene therapy vectors in mice. The Journal of Clinical Investigation. 119 (8), 2388-2398 (2009).
  37. Wagner, H., Bauer, S. All is not Toll: new pathways in DNA recognition. The Journal of Experimental Medicine. 203 (2), 265-268 (2006).
  38. Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. Quantitative and Digital Droplet-Based AAV Genome Titration. Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).
  39. Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Therapy. 6 (7), 1322-1330 (1999).
  40. Summerford, C., Samulski, R. J. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions. Journal of Virology. 72 (2), 1438-1445 (1998).
  41. Bell, C. L., et al. The AAV9 receptor and its modification to improve in vivo lung gene transfer in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2427-2435 (2011).
  42. McCown, T. J., Xiao, X., Li, J., Breese, G. R., Samulski, R. J. Differential and persistent expression patterns of CNS gene transfer by an adeno-associated virus (AAV) vector. Brain Research. 713 (1-2), 99-107 (1996).
  43. Weitzman, M. D., Kyostio, S. R., Kotin, R. M., Owens, R. A. Adeno-associated virus (AAV) Rep proteins mediate complex formation between AAV DNA and its integration site in human DNA. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 91 (13), 5808-5812 (1994).
  44. Miller, D. G., Petek, L. M., Russell, D. W. Adeno-associated virus vectors integrate at chromosome breakage sites. Nature Genetics. 36 (7), 767-773 (2004).
  45. Hanlon, K. S., et al. High levels of AAV vector integration into CRISPR-induced DNA breaks. Nature Communications. 10 (1), 4439(2019).
  46. Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 23 (10), 3558-3565 (2003).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Transdukcja AAVrekombinowany AAVdostarczanie genówprzygotowanie surowego AAVdostarczanie DNAtransdukcja kultur komórkowychgeny reporterowe
Ekspresja transgenu w hodowanych komórkach przy użyciu nieoczyszczonych rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenowirusem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.