Terapia kości poprzez kostnienie śródchrzęstne poprzez wszczepienie sztucznej tkanki chrzęstnej wyprodukowanej z mezenchymalnych komórek macierzystych ma potencjał do obejścia wad konwencjonalnych terapii. Hydrożele kwasu hialuronowego są skuteczne w zwiększaniu skali jednolicie zróżnicowanych przeszczepów chrząstki, a także w tworzeniu zintegrowanej kości z unaczynieniem między zrośniętymi przeszczepami in vivo.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zintegrowane tworzenie kości poprzez kostnienie endochrzęstne in vivo przy użyciu mezenchymalnych komórek macierzystych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Konwencjonalna terapia regeneracji kości z wykorzystaniem mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) jest trudna do zastosowania w przypadku ubytków kostnych większych niż rozmiar krytyczny, ponieważ nie posiada mechanizmu indukowania angiogenezy. Wszczepienie sztucznej tkanki chrzęstnej wytworzonej z MSCs indukuje angiogenezę i tworzenie kości in vivo poprzez kostnienie śródchrzęstne (ECO). W związku z tym to podejście oparte na ECO może być obiecującą terapią regeneracji kości w przyszłości. Ważnym aspektem klinicznego zastosowania tego podejścia opartego na ECO jest ustanowienie protokołu przygotowania wystarczającej ilości chrząstki do wszczepienia w celu naprawy ubytku kostnego. Szczególnie niepraktyczne jest projektowanie pojedynczej masy przeszczepionej chrząstki o rozmiarze zgodnym z kształtem rzeczywistego ubytku kostnego. Dlatego chrząstka, która ma zostać przeszczepiona, musi mieć właściwość integralnego tworzenia kości po wszczepieniu wielu części. Hydrożele mogą być atrakcyjnym narzędziem do zwiększania skali przeszczepów inżynierii tkankowej w celu kostnienia śródchrzęstnego w celu spełnienia wymagań klinicznych. Chociaż wiele hydrożeli pochodzenia naturalnego wspomaga tworzenie chrząstki MSC in vitro i ECO in vivo, optymalny materiał rusztowania, który spełni potrzeby zastosowań klinicznych, nie został jeszcze określony. Kwas hialuronowy (HA) jest kluczowym składnikiem macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki i jest biodegradowalnym i biokompatybilnym polisacharydem. Tutaj pokazujemy, że hydrożele HA mają doskonałe właściwości wspomagające różnicowanie in vitro tkanki chrzęstnej na bazie MSC i promujące tworzenie kości śródchrzęstnej in vivo.
Wprowadzenie
Autologiczna kość jest nadal złotym standardem w naprawianiu wad kostnych spowodowanych urazami, wadami wrodzonymi i resekcją chirurgiczną. Autogenny przeszczep kości ma jednak istotne ograniczenia, w tym ból dawcy, ryzyko infekcji i ograniczoną objętość kości, którą można wyizolować od pacjentów1,2,3,4. Opracowano wiele biomateriałów jako substytutów kości, łączących naturalne lub syntetyczne polimery z materiałami zmineralizowanymi, takimi jak fosforan wapnia lub hydroksyapatyt5,6.....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ten protokół wykorzystuje 4-tygodniowe nagie myszy płci męskiej. Trzymaj cztery myszy w klatce w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność w temperaturze 22−24 °C i wilgotności względnej 50%−70%. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego i Dentystycznego w Tokio (identyfikator zezwolenia: A2019-204C, A2020-116A i A2021-121A).
1. Przygotowanie i odczynników
- Przygotować pożywkę do pomiaru wzrostu mezenchymalnych komórek macierzystych (pożywkę wzrostową MSC), dodając zestaw uzup....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Hydrożele HA z enkapsulowanymi MSC hodowano w medium chondrogennym uzupełnionym o TGFβ3, induktor chondrogenezy41 (krok 4.1). Porównano właściwości HA z właściwościami kolagenu, który – jak wykazano wcześniej38 – jest skuteczny w tworzeniu sztucznych przeszczepów chrząstki opartych na MSC do kostnienia enchondralnego. Nieróżnicowane MSC nie zostały uwzględnione w tym badaniu jako kontrole negatywne, ponieważ wykazano, że nieróżnicowane MSC wymagają zmineralizowanych powierz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Stosowanie odpowiednich materiałów rusztowaniowych, które ułatwiają przejście od chrząstki przerostowej do kości, jest obiecującym podejściem do zwiększenia skali przeszczepów chrząstki przerostowej opartej na MSC i leczenia ubytków kostnych o klinicznie istotnych rozmiarach. Tutaj pokazujemy, że kwas hialuronowy jest doskonałym materiałem rusztowania wspomagającym różnicowanie przerostowej tkanki chrzęstnej na bazie MSC in vitro i promującym tworzenie kości śródchrzęstnej in vivo38
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczyli, że nie istnieją konkurencyjne interesy.
Podziękowania
Ta praca została wsparta przez Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) od Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (grant nr. JP19K10259 i 22K10032 do MAI).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,25 W/V% Trypsyna-1mmol/L EDTA.4Na Roztwór | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 209-16941 | |
| Antisedan | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
| askorbinian-2-fosforan | Nacalai Tesque | 13571-14 | |
| Bambanker | GC Lymphotec | CS-02-001 | |
| podstawowy fibroblastyczny czynnik wzrostu | Reprocell | RCHEOT002 | |
| albumina surowicy bydlęcej | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 012-23881 | 7,5 z automatycznym |
| licznikiem komórek Countess ze szkiełkami komory zliczania komórek i barwieniem Trypan Blue 0,4% | Invitrogen | C10283 | |
| deksametazon | Merck | D8893 | |
| Domitor | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
| Dormicum | Astellas Pharma | ||
| Zmodyfikowany orzeł Dulbecco Medium | Merck | D6429 | wysoka zawartość glukozy |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Szynka | Merck | D6421 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Hycon | SH30396.03 | |
| Siarczan gentamycyny | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 1676045 | 10 mg / ml |
| Haccpper Generator TechnoMax | CH-400-5QB | 50 ppm woda z kwasem podchlorawym | |
| Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste | Lonza | PT-2501 | |
| Zestaw rusztowań do hodowli komórek HyStem | Merck | HYS020 | |
| IL-1ß | PeproTech | AF-200-01B | |
| Suplement ITS-G | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 090-06741 | razy; 100 |
| L-alanylo-L-Glutamina | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 016-21841 | 200mmol/L (&razy; 100) |
| L-prolina | Nacalai Tesque | 29001-42 | |
| L-tyroksyna | Merck | T1775 | |
| MSCGM Mezenchymalne podłoże do wzrostu komórek macierzystych BulletKit | Lonza | PT-3001 | |
| parafina | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 165-13375 | |
| PBS / pH 7,4 100ml | Medicago | 09-2051-100 | |
| TGF-β 3 | Proteintech | HZ-1090 | |
| Vetorphale | Meiji Seika Kaisha | ||
| Visiocare Maść | SAVAVET/SAVA Healthcare | ||
| β-glicerofosforan | FUJIFILM Wako Pure Chemical | Numer katalogowy: 048-34332 |
Bibliografia
- Goldberg, V. M., Stevenson, S. Natural history of autografts and allografts. Clinical Orthopaedics and Related Research. (225), 7-16 (1987).
- Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
