Artykuł metodologiczny

Zintegrowane tworzenie kości poprzez kostnienie endochrzęstne in vivo przy użyciu mezenchymalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/65573

⸱

14 lipca 2023

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Craniofacial Embryology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Maxillofacial Surgery, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 3Department of Regenerative and Reconstructive Dental Medicine, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapia kości poprzez kostnienie śródchrzęstne poprzez wszczepienie sztucznej tkanki chrzęstnej wyprodukowanej z mezenchymalnych komórek macierzystych ma potencjał do obejścia wad konwencjonalnych terapii. Hydrożele kwasu hialuronowego są skuteczne w zwiększaniu skali jednolicie zróżnicowanych przeszczepów chrząstki, a także w tworzeniu zintegrowanej kości z unaczynieniem między zrośniętymi przeszczepami in vivo.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konwencjonalna terapia regeneracji kości z wykorzystaniem mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) jest trudna do zastosowania w przypadku ubytków kostnych większych niż rozmiar krytyczny, ponieważ nie posiada mechanizmu indukowania angiogenezy. Wszczepienie sztucznej tkanki chrzęstnej wytworzonej z MSCs indukuje angiogenezę i tworzenie kości in vivo poprzez kostnienie śródchrzęstne (ECO). W związku z tym to podejście oparte na ECO może być obiecującą terapią regeneracji kości w przyszłości. Ważnym aspektem klinicznego zastosowania tego podejścia opartego na ECO jest ustanowienie protokołu przygotowania wystarczającej ilości chrząstki do wszczepienia w celu naprawy ubytku kostnego. Szczególnie niepraktyczne jest projektowanie pojedynczej masy przeszczepionej chrząstki o rozmiarze zgodnym z kształtem rzeczywistego ubytku kostnego. Dlatego chrząstka, która ma zostać przeszczepiona, musi mieć właściwość integralnego tworzenia kości po wszczepieniu wielu części. Hydrożele mogą być atrakcyjnym narzędziem do zwiększania skali przeszczepów inżynierii tkankowej w celu kostnienia śródchrzęstnego w celu spełnienia wymagań klinicznych. Chociaż wiele hydrożeli pochodzenia naturalnego wspomaga tworzenie chrząstki MSC in vitro i ECO in vivo, optymalny materiał rusztowania, który spełni potrzeby zastosowań klinicznych, nie został jeszcze określony. Kwas hialuronowy (HA) jest kluczowym składnikiem macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki i jest biodegradowalnym i biokompatybilnym polisacharydem. Tutaj pokazujemy, że hydrożele HA mają doskonałe właściwości wspomagające różnicowanie in vitro tkanki chrzęstnej na bazie MSC i promujące tworzenie kości śródchrzęstnej in vivo.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autologiczna kość jest nadal złotym standardem w naprawianiu wad kostnych spowodowanych urazami, wadami wrodzonymi i resekcją chirurgiczną. Autogenny przeszczep kości ma jednak istotne ograniczenia, w tym ból dawcy, ryzyko infekcji i ograniczoną objętość kości, którą można wyizolować od pacjentów1,2,3,4. Opracowano wiele biomateriałów jako substytutów kości, łączących naturalne lub syntetyczne polimery z materiałami zmineralizowanymi, takimi jak fosforan wapnia lub hydroksyapatyt5,6. Tworzenie kości w tych materiałach inżynieryjnych jest zwykle osiągane przy użyciu zmineralizowanego materiału jako materiału gruntującego, aby umożliwić komórkom macierzystym różnicowanie się bezpośrednio w osteoblasty w procesie kostnienia wewnątrzbłonowego (IMO)7. Proces ten pozbawiony jest etapu angiogennego, co skutkuje niewystarczającym unaczynieniem in vivo przeszczepu po implantacji8,9,10, a zatem podejścia wykorzystujące taki proces mogą nie być optymalne w leczeniu dużych wad kostnych11.

Wykazano, że strategie stosowane do podsumowania procesu kostnienia śródchrzęstnego (ECO), wrodzonego mechanizmu w skeletogenezie podczas rozwoju, przezwyciężają istotne problemy związane z tradycyjnymi podejściami opartymi na IMO. W ECO chondrocyty w szablonie chrząstki uwalniają czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), który sprzyja infiltracji naczyniowej i przebudowie szablonu chrząstki w bone12. Podejście do osteogenezy za pośrednictwem ECO poprzez przebudowę chrząstki i angiogenezę, która jest również aktywowana podczas naprawy złamań, wykorzystuje sztucznie utworzoną tkankę chrzęstną pochodzącą z MSCs jako materiał gruntujący. Chondrocyty mogą tolerować niedotlenienie w ubytkach kostnych, indukować angiogenezę i przekształcać przeszczep chrząstki bez naczyń krwionośnych w tkankę angiogenną. Liczne badania wykazały, że przeszczepy chrząstki oparte na MSC generują kość in vivo dzięki wdrożeniu takiego programu ECO13,14,15,16,17,18,19,20,21.

Podstawowym wymogiem dla klinicznego zastosowania tego podejścia za pośrednictwem ECO jest jak przygotować pożądaną ilość przeszczepu chrząstki w warunkach klinicznych. Przygotowanie klinicznej chrząstki o rozmiarze pasującym do rzeczywistego ubytku kostnego nie jest praktyczne. W związku z tym chrząstka przeszczepiona musi integralnie tworzyć kość, gdy wszczepianych jest wiele fragmentów22. Hydrożele mogą być atrakcyjnym narzędziem do zwiększania skali przeszczepów inżynierii tkankowej w celu kostnienia śródchrzęstnego. Wiele hydrożeli pochodzenia naturalnego wspomaga tworzenie chrząstki MSC in vitro i ECO in vivo23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; Jednak optymalny materiał podporowy, który spełniałby wymagania zastosowań klinicznych, pozostał nieokreślony. Kwas hialuronowy (HA) jest biodegradowalnym i biokompatybilnym polisacharydem obecnym w macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki33. HA oddziałuje z MSC za pośrednictwem receptorów powierzchniowych, takich jak CD44, w celu wspierania różnicowania chondrogennego25,26,28,30,31,32,34. Ponadto rusztowania HA promują osteogenne różnicowanie komórek macierzystych ludzkiej miazgi zębowej za pośrednictwem IMO35, a rusztowania w połączeniu z kolagenem promują osteogenezę za pośrednictwem ECO36,37.

Tutaj prezentujemy metodę przygotowania hydrożeli HA przy użyciu MSCs pochodzących ze szpiku kostnego i ich wykorzystania do przerostowej chondrogenezy in vitro i późniejszego kostnienia śródchrzęstnego in vivo38. Porównaliśmy właściwości kwasu hialuronowego z właściwościami kolagenu, materiału szeroko stosowanego w inżynierii tkanki kostnej z MSCs i użytecznego materiału do zwiększania skali sztucznych przeszczepów w celu kostnienia śródchrzęstnego17. W mysim modelu z obniżoną odpornością, konstrukty HA i kolagenu wysiane ludzkimi MSCs oceniano pod kątem potencjału ECO in vivo przez implantację podskórną. Wyniki pokazują, że hydrożele HA doskonale sprawdzają się jako rusztowanie dla MSCs do tworzenia sztucznych przeszczepów chrząstek, które umożliwiają tworzenie kości poprzez ECO.

Protokół jest podzielony na dwa etapy. Najpierw przygotowuje się konstrukty ludzkich MSCs wysianych na hydrożelu hialuronowym i różnicuje je w przerośniętą chrząstkę in vitro. Następnie zróżnicowane konstrukty są wszczepiane podskórnie w nagim modelu w celu wywołania kostnienia chrzęstnego in vivo (Ryc. 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół wykorzystuje 4-tygodniowe nagie myszy płci męskiej. Trzymaj cztery myszy w klatce w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność w temperaturze 22−24 °C i wilgotności względnej 50%−70%. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego i Dentystycznego w Tokio (identyfikator zezwolenia: A2019-204C, A2020-116A i A2021-121A).

1. Przygotowanie i odczynników

  1. Przygotować pożywkę do pomiaru wzrostu mezenchymalnych komórek macierzystych (pożywkę wzrostową MSC), dodając zestaw uzupełniający pożywki wzrostowej MSC do pożywki podstawowej MSC i przechowywać ją w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle Medium i pożywkę Ham's F12 (DMEM/F-12), dodając 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 50 μg/ml gentamycyny, 200 μM L-alanylo-L-glutaminy i 1 ng/ml zasadowego fibroblastycznego czynnika wzrostu do pożywki i przechowując w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotuj pożywkę chondrogenne, dodając 1% suplementu ITS-G, 0,12% albuminy surowicy bydlęcej, 50 μg/ml gentamycyny, 0,35 mM L-proliny, 100 nM deksametazonu i 10 ng/ml TGF-β3 do DMEM tuż przed użyciem.
  4. Przygotuj pożywkę przerostową, dodając 10 mM β-glicerofosforanu, 0,12% albuminy surowicy bydlęcej, 10 nM deksametazonu, 200 μM 2-fosforanu askorbinianu, 50 nM L-tyroksyny, 50 μg/ml gentamycyny i 50 pg/ml IL-1β do DMEM tuż przed użyciem.
  5. Pokryć 24-dołkową naczynie hodowlane 200 μl stopionej parafiny podgrzanej w temperaturze 60 °C. Odstawić w temperaturze pokojowej do momentu, aż parafina stężeje.

2. Ekspansja ludzkich MSCs

UWAGA: Przed rozpoczęciem eksperymentów, MSC o wysokim potencjale chondrogenezy MSC powinny zostać wybrane w mikro kulturze masowej, jak opisano w17.

  1. Zgodnie z instrukcjami producenta, posiewaj pierwotne MSC pochodzące z ludzkiego szpiku kostnego (pasaż 2) z pożywką wzrostową MSC w 10 cm naczyniu o gęstości 5 x 103 komórek/cm2 w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 i 95% nawilżanym powietrzem.
  2. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni. Gdy komórki osiągną zbieżność 80%-90%, odessać pożywkę z naczynia do hodowli komórkowej za pomocą pompy próżniowej, przemyć 5 ml PBS, a następnie odessać roztwór za pomocą pompy próżniowej.
  3. Dodaj 1 ml 0,05% roztworu trypsyny/0,02% EDTA do naczynia. Inkubować naczynie przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Dodać 1 ml pożywki wzrostowej MSC, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml.
  5. Połącz zawiesinę komórkową z innych szalek w probówce o pojemności 50 ml i trzymaj ją na lodzie.
  6. Użyj licznika komórek, aby policzyć komórki, mieszając 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl 0,4% barwienia błękitem trypanowym.
  7. Pozostałą zawiesinę komórkową odwirować o sile 220 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i dodać roztwór do kriokonserwacji o stężeniu 1,0 x 106 komórek na ml.
  8. Dozować 1 ml zawiesiny komórek do każdej krioprobówki i przechowywać w temperaturze -80 °C przez 12 godzin przed przeniesieniem do ciekłego azotu. Powstałe w ten sposób zamrożone zapasy (fragment 3) są wykorzystywane w niniejszym protokole.
  9. Na potrzeby eksperymentów należy wysiać zmagazynowane MSCs w 10-centymetrowym naczyniu o gęstości 5 x 103 komórek/cm2. Hoduj komórki do 80%-90% zlewania (pasaż 4) w pożywce DMEM/F-12.

3. Przygotowanie hydrożeli w kapsułkach MSC

  1. Trypsynizować komórki i przygotować zawiesinę komórkową zgodnie z opisem w krokach 2.3 - 2.6.
  2. Aby uzyskać 10 konstruktów (2,5 x 105 komórek na konstrukt), podwielokrotność zawiesiny komórek zawierającej 2,5 x 106 komórek do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
  3. Odwirować zawiesinę o stężeniu 220 x g przez 3 minuty, usunąć supernatant za pomocą pompy próżniowej i utrzymać go na lodzie.
  4. Doprowadź zmodyfikowany tiolem kwas hialuronowy (HA), tiolowy środek sieciujący, dikrylan glikolu polietylenowego i odgazowane butelki z wodą do temperatury pokojowej.
  5. W sterylnych warunkach dodać 1,0 ml odgazowanej wody do butelki zawierającej HA (patrz instrukcja producenta) za pomocą strzykawki z igłą.
  6. Od czasu do czasu rozgrzać do temperatury 37 °C, aż roztwór stanie się klarowny, a następnie umieścić na lodzie. Całkowite rozpuszczenie ciał stałych zajmuje mniej niż 30 minut.
  7. W sterylnych warunkach dodać 0,5 ml odgazowanej wody do butelki sieciującej za pomocą strzykawki z igłą. Rozpuść kilkakrotnie odwracając, a następnie umieść na lodzie.
  8. Dodać 120 μl rozpuszczonego roztworu kwasu hialuronowego do podzielonej osadu komórkowego (2,5 x 106 komórek). Zawiesić osad komórkowy, pipetując tam i z powrotem.
  9. Dodać 30 μl rozpuszczonego roztworu środka sieciującego do probówki zawierającej kwas hialuronowy i komórki (krok 3.8) i połączyć, stukając w probówkę, a następnie krótko odwirować. Połącz roztwór HA i roztwór sieciujący w stosunku 4:1.
  10. Upuść 15 μl połączonego roztworu zawierającego MSCs (2,5 x 105 komórek) na 24-dołkową płytkę pokrytą parafiną i pozostaw do zestalenia w temperaturze 37 °C przez 30 minut (Rysunek 2). Ze względu na wysoką lepkość należy przygotować co najmniej 10% więcej mieszanki komórek/hydrożelu niż jest to potrzebne.
    UWAGA: Charakterystyka hydrożelu została opisana wcześniej39.

4. Warunki różnicowania in vitro

  1. Dodać 0,5 ml chondrogenicznej pożywki różnicującej do konstruktu hydrożeli HA z nasionami MSC. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni.
  2. Po 3 tygodniach zmień na pożywkę do różnicowania przerostowego (0,5 ml na studzienkę) i hoduj konstrukty przez dodatkowe 2 tygodnie.

5. Implantacja in vivo MSC

  1. Po łącznie 5 tygodniach hodowli in vitro wszczep konstrukty podskórnie na grzbiet nagich myszy, jak opisano wcześniej38,40.
  2. Zważyć myszy i podać złożony środek znieczulający przygotowany z 0,75 mg/kg masy ciała (m.c.) medetomidyny, 4,0 mg/kg m.c. midazolamu i 5,0 mg/kg m.c. butorfanolu we wstrzyknięciu dootrzewnowym, jak opisano38.
  3. Potwierdź odpowiednie znieczulenie poprzez unieruchomienie bodźców chirurgicznych i monitoruj głębokość oddechową poprzez powolne, regularne ruchy klatki piersiowej i prawidłowe zaopatrzenie w tlen kolorem różowej błony śluzowej okresowo podczas operacji. Używaj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  4. Umieść mysz na sterylnej serwety chirurgicznej w pozycji leżącej, wysterylizuj miejsce nacięcia 50 ppm wody z kwasem podchlorawym (pH 5,0; HAW) i umieść perforowaną serwetę chirurgiczną na myszy.
    UWAGA: Sterylizuj wszystkie materiały chirurgiczne w autoklawie, gazowym tlenku etylenu lub HAW. Chirurdzy powinni umyć palce i nosić fartuchy chirurgiczne i rękawiczki.
  5. Wykonaj nożyczki dwa nacięcia skóry o długości 5 mm w odległości 2 cm od siebie w obszarze ramion i bioder wzdłuż linii środkowej kręgosłupa.
  6. Włóż szpatułkę podskórnie przez nacięcie, aby utworzyć kieszonkę podskórną.
  7. Włóż dwa do trzech konstruktów (~15 μl każdy, krok 5.1) do każdej kieszeni za pomocą kleszczy. Konstrukty kwasu hialuronowego wszczepione do tej samej kieszeni są bardzo często podatne na fuzję. Aby zapobiec fuzji, włóż po jednym konstrukcie HA do każdej kieszeni.
  8. Zamknij nacięcia plecionymi jedwabnymi szwami 4-0. Wstrzyknąć myszowi antagonistę środków znieczulających przygotowanych z 0,75 mg/kg m.c. atipamezolu zgodnie z opisem38.
  9. Podczas gdy myszy dochodzą do siebie po znieczuleniu, umieść je w sterylnych klatkach regeneracyjnych zawierających sterylną ściółkę podłogową bez butelek z jedzeniem i wodą i stale monitoruj temperaturę ciała, puls i oddychanie.
  10. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej świadomości, aby utrzymać leżący mostek. Po pełnym wyzdrowieniu należy zwrócić zwierzęta do pomieszczenia hodowlanego wraz z innymi zwierzętami.
  11. Monitoruj zwierzęta co kilka dni w okresie gojenia pod kątem ewentualnych powikłań. Myszy należy poddać eutanazji przez wdychanie dwutlenku węgla z niewielkim cierpieniem po 4 i 8 tygodniach od implantacji.
  12. Naciąć skórę w miejscach przeszczepu i usunąć wszczepione konstrukcje za pomocą kleszczy. Utrwal konstrukty w 4% paraformaldehydzie przez 16 godzin, a następnie poddaj je analizie.

6. Analiza statystyczna

  1. Raportuj dane ilościowe jako średnią ± odchylenie standardowe (SD). Przeprowadzanie analiz statystycznych przy użyciu komercyjnego oprogramowania.
  2. Użyj testu t-Studenta lub jednoczynnikowej ANOVA, a następnie testu wielokrotnych porównań Tukeya, aby określić znaczące różnice między grupami. p<0,05 i p<0,01 wskazują na istotne różnice między dwiema grupami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hydrożele HA w kapsułkach MSC hodowano w pożywce chondrogennej uzupełnionej TGFβ3, induktorem chondrogenezy41 (krok 4.1). Porównaliśmy właściwości HA z właściwościami kolagenu, który okazał się skuteczny w tworzeniu sztucznych przeszczepów chrząstki na bazie MSC do kostnienia śródchrzęstnego, jak opisano wcześniej38. Niezróżnicowane MSCs nie zostały włączone jako kontrole ujemne w tym badaniu, ponieważ wykazano, że niezróżnicowane MSCs wymagają zmineralizowanych powierzchni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stosowanie odpowiednich materiałów rusztowaniowych, które ułatwiają przejście od chrząstki przerostowej do kości, jest obiecującym podejściem do zwiększenia skali przeszczepów chrząstki przerostowej opartej na MSC i leczenia ubytków kostnych o klinicznie istotnych rozmiarach. Tutaj pokazujemy, że kwas hialuronowy jest doskonałym materiałem rusztowania wspomagającym różnicowanie przerostowej tkanki chrzęstnej na bazie MSC in vitro i promującym tworzenie kości śródchrzęstnej in vivo38

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczyli, że nie istnieją konkurencyjne interesy.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta przez Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) od Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (grant nr. JP19K10259 i 22K10032 do MAI).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25 W/V% Trypsyna-1mmol/L EDTA.4Na RoztwórFUJIFILM Wako Pure Chemical 209-16941
AntisedanNippon Zenyaku Kogyo
askorbinian-2-fosforanNacalai Tesque13571-14
BambankerGC LymphotecCS-02-001
podstawowy fibroblastyczny czynnik wzrostuReprocellRCHEOT002 
albumina surowicy bydlęcejFUJIFILM Wako Pure Chemical 012-238817,5 z automatycznym
licznikiem komórek Countess ze szkiełkami komory zliczania komórek i barwieniem Trypan Blue 0,4%InvitrogenC10283
deksametazonMerckD8893
DomitorNippon Zenyaku Kogyo
DormicumAstellas Pharma
Zmodyfikowany orzeł Dulbecco MediumMerckD6429wysoka zawartość glukozy
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 SzynkaMerckD6421
Płodowa surowica bydlęcaHyconSH30396.03
Siarczan gentamycynyFUJIFILM Wako Pure Chemical 1676045  10 mg / ml
Haccpper Generator TechnoMaxCH-400-5QB50 ppm woda z kwasem podchlorawym
Ludzkie mezenchymalne komórki macierzysteLonzaPT-2501
Zestaw rusztowań do hodowli komórek HyStemMerckHYS020
IL-1ßPeproTechAF-200-01B
Suplement ITS-GFUJIFILM Wako Pure Chemical 090-06741razy; 100
L-alanylo-L-GlutaminaFUJIFILM Wako Pure Chemical 016-21841200mmol/L (&razy; 100)
L-prolinaNacalai Tesque29001-42
L-tyroksynaMerckT1775
MSCGM Mezenchymalne podłoże do wzrostu komórek macierzystych
BulletKit		LonzaPT-3001
parafinaFUJIFILM Wako Pure Chemical 165-13375
PBS / pH 7,4 100mlMedicago09-2051-100
TGF-β 3 ProteintechHZ-1090
VetorphaleMeiji Seika Kaisha
Visiocare MaśćSAVAVET/SAVA Healthcare
β-glicerofosforanFUJIFILM Wako Pure Chemical Numer katalogowy: 048-34332

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldberg, V. M., Stevenson, S. Natural history of autografts and allografts. Clinical Orthopaedics and Related Research. (225), 7-16 (1987).
  2. Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
  3. Vining, N. C., Warme, W. J., Mosca, V. S. Comparison of structural bone autografts and allografts in pediatric foot surgery. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 32 (7), 719-723 (2012).
  4. Roddy, E., DeBaun, M. R., Daoud-Gray, A., Yang, Y. P., Gardner, M. J. Treatment of critical-sized bone defects: clinical and tissue engineering perspectives. European Journal of Orthopaedic Surgery and Traumatology. 28 (3), 351-362 (2018).
  5. Rezwan, K., Chen, Q. Z., Blaker, J. J., Boccaccini, A. R. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
  6. Swetha, M., et al. Biocomposites containing natural polymers and hydroxyapatite for bone tissue engineering. International Journal of Biological Macromolecules. 47 (1), 1-4 (2010).
  7. Meijer, G. J., de Bruijn, J. D., Koole, R., van Blitterswijk, C. A. Cell-based bone tissue engineering. PLOS Medicine. 4 (2), e9(2007).
  8. Tremblay, P. L., Hudon, V., Berthod, F., Germain, L., Auger, F. A. Inosculation of tissue-engineered capillaries with the host's vasculature in a reconstructed skin transplanted on mice. American Journal of Transplantation. 5 (5), 1002-1010 (2005).
  9. Ko, H. C., Milthorpe, B. K., McFarland, C. D. Engineering thick tissues--the vascularisation problem. European Cells and Materials. 14, 1-19 (2007).
  10. Santos, M. I., Reis, R. L. Vascularization in bone tissue engineering: physiology, current strategies, major hurdles and future challenges. Macromolecular Bioscience. 10 (1), 12-27 (2010).
  11. Almubarak, S., et al. Tissue engineering strategies for promoting vascularized bone regeneration. Bone. 83, 197-209 (2016).
  12. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
  13. Farrell, E., et al. Chondrogenic priming of human bone marrow stromal cells: a better route to bone repair. Tissue Engineering Part C: Methods. 15 (2), 285-295 (2009).
  14. Scotti, C., et al. Recapitulation of endochondral bone formation using human adult mesenchymal stem cells as a paradigm for developmental engineering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (16), 7251-7256 (2010).
  15. Janicki, P., Kasten, P., Kleinschmidt, K., Luginbuehl, R., Richter, W. Chondrogenic pre-induction of human mesenchymal stem cells on beta-TCP: enhanced bone quality by endochondral heterotopic bone formation. Acta Biomaterialia. 6 (8), 3292-3301 (2010).
  16. Farrell, E., et al. In-vivo generation of bone via endochondral ossification by in-vitro chondrogenic priming of adult human and rat mesenchymal stem cells. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 31(2011).
  17. Scotti, C., et al. Engineering of a functional bone organ through endochondral ossification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3997-4002 (2013).
  18. Harada, N., et al. Bone regeneration in a massive rat femur defect through endochondral ossification achieved with chondrogenically differentiated MSCs in a degradable scaffold. Biomaterials. 35 (27), 7800-7810 (2014).
  19. van der Stok, J., et al. Chondrogenically differentiated mesenchymal stromal cell pellets stimulate endochondral bone regeneration in critical-sized bone defects. European Cells and Materials. 27, 137-148 (2014).
  20. Sheehy, E. J., Vinardell, T., Toner, M. E., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Altering the architecture of tissue engineered hypertrophic cartilaginous grafts facilitates vascularisation and accelerates mineralisation. PLoS One. 9 (3), e90716(2014).
  21. Sheehy, E. J., Mesallati, T., Vinardell, T., Kelly, D. J. Engineering cartilage or endochondral bone: a comparison of different naturally derived hydrogels. Acta Biomaterialia. 13, 245-253 (2015).
  22. Bahney, C. S., et al. Stem cell-derived endochondral cartilage stimulates bone healing by tissue transformation. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (5), 1269-1282 (2014).
  23. Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14 (2), 179-189 (2006).
  24. Dickhut, A., Gottwald, E., Steck, E., Heisel, C., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells in gel-like biomaterials in vitro and in vivo. Frontiers in Bioscience. 13, 4517-4528 (2008).
  25. Chung, C., Burdick, J. A. Influence of three-dimensional hyaluronic acid microenvironments on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Tissue Engineering Part A. 15 (2), 243-254 (2009).
  26. Erickson, I. E., et al. Macromer density influences mesenchymal stem cell chondrogenesis and maturation in photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels. Osteoarthritis Cartilage. 17 (12), 1639-1648 (2009).
  27. Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Chondrocytes and bone marrow-derived mesenchymal stem cells undergoing chondrogenesis in agarose hydrogels of solid and channelled architectures respond differentially to dynamic culture conditions. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5 (9), 747-758 (2011).
  28. Erickson, I. E., et al. High mesenchymal stem cell seeding densities in hyaluronic acid hydrogels produce engineered cartilage with native tissue properties. Acta Biomaterialia. 8 (8), 3027-3034 (2012).
  29. Ma, K., Titan, A. L., Stafford, M., Zheng, C., Levenston, M. E. Variations in chondrogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in fibrin/alginate blended hydrogels. Acta Biomaterialia. 8 (10), 3754-3764 (2012).
  30. Levett, P. A., et al. A biomimetic extracellular matrix for cartilage tissue engineering centered on photocurable gelatin, hyaluronic acid and chondroitin sulfate. Acta Biomaterialia. 10 (1), 214-223 (2014).
  31. Reppel, L., et al. Chondrogenic induction of mesenchymal stromal/stem cells from Wharton's jelly embedded in alginate hydrogel and without added growth factor: an alternative stem cell source for cartilage tissue engineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 260(2015).
  32. Amann, E., Wolff, P., Breel, E., van Griensven, M., Balmayor, E. R. Hyaluronic acid facilitates chondrogenesis and matrix deposition of human adipose derived mesenchymal stem cells and human chondrocytes co-cultures. Acta Biomaterialia. 52, 130-144 (2017).
  33. Hemshekhar, M., et al. Emerging roles of hyaluronic acid bioscaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. International Journal of Biological Macromolecules. 86, 917-928 (2016).
  34. Pfeifer, C. G., et al. Higher Ratios of Hyaluronic Acid Enhance Chondrogenic Differentiation of Human MSCs in a Hyaluronic Acid-Gelatin Composite Scaffold. Materials (Basel). 9 (5), (2016).
  35. La Noce, M., et al. Hyaluronan-Based Gel Promotes Human Dental Pulp Stem Cells Bone Differentiation by Activating YAP/TAZ Pathway. Cells. 10 (11), (2021).
  36. Thompson, E. M., Matsiko, A., Kelly, D. J., Gleeson, J. P., O'Brien, F. J. An Endochondral Ossification-Based Approach to Bone Repair: Chondrogenically Primed Mesenchymal Stem Cell-Laden Scaffolds Support Greater Repair of Critical-Sized Cranial Defects Than Osteogenically Stimulated Constructs In Vivo. Tissue Engineering Part A. 22 (5-6), 556-567 (2016).
  37. Wang, H., et al. Cell-mediated injectable blend hydrogel-BCP ceramic scaffold for in situ condylar osteochondral repair. Acta Biomaterialia. 123, 364-378 (2021).
  38. Yamazaki, S., et al. Hyaluronic acid hydrogels support to generate integrated bone formation through endochondral ossification in vivo using mesenchymal stem cells. PLoS One. 18 (2), e0281345(2023).
  39. Zarembinski, T., Skardal, A. Hydrogels - Smart Materials for Biomedical Applications. , (2019).
  40. Vinardell, T., Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. A comparison of the functionality and in vivo phenotypic stability of cartilaginous tissues engineered from different stem cell sources. Tissue Engineering Part A. 18 (11-12), 1161-1170 (2012).
  41. Mueller, M. B., et al. Hypertrophy in mesenchymal stem cell chondrogenesis: effect of TGF-beta isoforms and chondrogenic conditioning. Cells Tissues Organs. 192 (3), 158-166 (2010).
  42. Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
  43. Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
  44. Chan, C. K., et al. Endochondral ossification is required for haematopoietic stem-cell niche formation. Nature. 457 (7228), 490-494 (2009).
  45. Murdoch, A. D., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow stem cells in transwell cultures: generation of scaffold-free cartilage. Stem Cells. 25 (11), 2786-2796 (2007).
  46. Tortelli, F., Tasso, R., Loiacono, F., Cancedda, R. The development of tissue-engineered bone of different origin through endochondral and intramembranous ossification following the implantation of mesenchymal stem cells and osteoblasts in a murine model. Biomaterials. 31 (2), 242-249 (2010).
  47. Knuth, C. A., Witte-Bouma, J., Ridwan, Y., Wolvius, E. B., Farrell, E. Mesenchymal stem cell-mediated endochondral ossification utilising micropellets and brief chondrogenic priming. European Cells and Materials. 34, 142-161 (2017).
  48. Simmons, C. A., Alsberg, E., Hsiong, S., Kim, W. J., Mooney, D. J. Dual growth factor delivery and controlled scaffold degradation enhance in vivo bone formation by transplanted bone marrow stromal cells. Bone. 35 (2), 562-569 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Endochondral OssificationMesenchymal Stem CellsBone RegenerationArtificial CartilageHyaluronic Acid HydrogelsCartilage DifferentiationIn Vivo Bone FormationChondrogenic DifferentiationScaffold MaterialsAngiogenesis Induction

Powiązane artykuły