Zintegrowane tworzenie kości poprzez kostnienie endochrzęstne in vivo przy użyciu mezenchymalnych komórek macierzystych

Summary

Terapia kości poprzez kostnienie śródchrzęstne poprzez wszczepienie sztucznej tkanki chrzęstnej wyprodukowanej z mezenchymalnych komórek macierzystych ma potencjał do obejścia wad konwencjonalnych terapii. Hydrożele kwasu hialuronowego są skuteczne w zwiększaniu skali jednolicie zróżnicowanych przeszczepów chrząstki, a także w tworzeniu zintegrowanej kości z unaczynieniem między zrośniętymi przeszczepami in vivo.

Abstract

Konwencjonalna terapia regeneracji kości z wykorzystaniem mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) jest trudna do zastosowania w przypadku ubytków kostnych większych niż rozmiar krytyczny, ponieważ nie posiada mechanizmu indukowania angiogenezy. Wszczepienie sztucznej tkanki chrzęstnej wytworzonej z MSCs indukuje angiogenezę i tworzenie kości in vivo poprzez kostnienie śródchrzęstne (ECO). W związku z tym to podejście oparte na ECO może być obiecującą terapią regeneracji kości w przyszłości. Ważnym aspektem klinicznego zastosowania tego podejścia opartego na ECO jest ustanowienie protokołu przygotowania wystarczającej ilości chrząstki do wszczepienia w celu naprawy ubytku kostnego. Szczególnie niepraktyczne jest projektowanie pojedynczej masy przeszczepionej chrząstki o rozmiarze zgodnym z kształtem rzeczywistego ubytku kostnego. Dlatego chrząstka, która ma zostać przeszczepiona, musi mieć właściwość integralnego tworzenia kości po wszczepieniu wielu części. Hydrożele mogą być atrakcyjnym narzędziem do zwiększania skali przeszczepów inżynierii tkankowej w celu kostnienia śródchrzęstnego w celu spełnienia wymagań klinicznych. Chociaż wiele hydrożeli pochodzenia naturalnego wspomaga tworzenie chrząstki MSC in vitro i ECO in vivo, optymalny materiał rusztowania, który spełni potrzeby zastosowań klinicznych, nie został jeszcze określony. Kwas hialuronowy (HA) jest kluczowym składnikiem macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki i jest biodegradowalnym i biokompatybilnym polisacharydem. Tutaj pokazujemy, że hydrożele HA mają doskonałe właściwości wspomagające różnicowanie in vitro tkanki chrzęstnej na bazie MSC i promujące tworzenie kości śródchrzęstnej in vivo.

Introduction

Autologiczna kość jest nadal złotym standardem w naprawianiu wad kostnych spowodowanych urazami, wadami wrodzonymi i resekcją chirurgiczną. Autogenny przeszczep kości ma jednak istotne ograniczenia, w tym ból dawcy, ryzyko infekcji i ograniczoną objętość kości, którą można wyizolować od pacjentów^1,2,3,4. Opracowano wiele biomateriałów jako substytutów kości, łączących naturalne lub syntetyczne polimery z materiałami zmineralizowanymi, takimi jak fosforan wapnia lub hydroksyapatyt^5,6.....

Protocol

Ten protokół wykorzystuje 4-tygodniowe nagie myszy płci męskiej. Trzymaj cztery myszy w klatce w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność w temperaturze 22−24 °C i wilgotności względnej 50%−70%. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego i Dentystycznego w Tokio (identyfikator zezwolenia: A2019-204C, A2020-116A i A2021-121A).

1. Przygotowanie i odczynników

1. Przygotować pożywkę do pomiaru wzrostu mezenchymalnych komórek macierzystych (pożywkę wzrostową MSC), dodając zestaw uzup....

Results

Hydrożele HA w kapsułkach MSC hodowano w pożywce chondrogennej uzupełnionej TGFβ3, induktorem chondrogenezy⁴¹ (krok 4.1). Porównaliśmy właściwości HA z właściwościami kolagenu, który okazał się skuteczny w tworzeniu sztucznych przeszczepów chrząstki na bazie MSC do kostnienia śródchrzęstnego, jak opisano wcześniej³⁸. Niezróżnicowane MSCs nie zostały włączone jako kontrole ujemne w tym badaniu, ponieważ wykazano, że niezróżnicowane MSCs wymagają zmineralizowanych powierzchni.......

Discussion

Stosowanie odpowiednich materiałów rusztowaniowych, które ułatwiają przejście od chrząstki przerostowej do kości, jest obiecującym podejściem do zwiększenia skali przeszczepów chrząstki przerostowej opartej na MSC i leczenia ubytków kostnych o klinicznie istotnych rozmiarach. Tutaj pokazujemy, że kwas hialuronowy jest doskonałym materiałem rusztowania wspomagającym różnicowanie przerostowej tkanki chrzęstnej na bazie MSC in vitro i promującym tworzenie kości śródchrzęstnej in vivo³⁸

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25 W/V% Trypsyna-1mmol/L EDTA.4Na Roztwór	FUJIFILM Wako Pure Chemical	209-16941
Antisedan	Nippon Zenyaku Kogyo
askorbinian-2-fosforan	Nacalai Tesque	13571-14
Bambanker	GC Lymphotec	CS-02-001
podstawowy fibroblastyczny czynnik wzrostu	Reprocell	RCHEOT002
albumina surowicy bydlęcej	FUJIFILM Wako Pure Chemical	012-23881	7,5 z automatycznym
licznikiem komórek Countess ze szkiełkami komory zliczania komórek i barwieniem Trypan Blue 0,4%	Invitrogen	C10283
deksametazon	Merck	D8893
Domitor	Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum	Astellas Pharma
Zmodyfikowany orzeł Dulbecco Medium	Merck	D6429	wysoka zawartość glukozy
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Szynka	Merck	D6421
Płodowa surowica bydlęca	Hycon	SH30396.03
Siarczan gentamycyny	FUJIFILM Wako Pure Chemical	1676045	10 mg / ml
Haccpper Generator TechnoMax		CH-400-5QB	50 ppm woda z kwasem podchlorawym
Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste	Lonza	PT-2501
Zestaw rusztowań do hodowli komórek HyStem	Merck	HYS020
IL-1ß	PeproTech	AF-200-01B
Suplement ITS-G	FUJIFILM Wako Pure Chemical	090-06741	razy; 100
L-alanylo-L-Glutamina	FUJIFILM Wako Pure Chemical	016-21841	200mmol/L (&razy; 100)
L-prolina	Nacalai Tesque	29001-42
L-tyroksyna	Merck	T1775
MSCGM Mezenchymalne podłoże do wzrostu komórek macierzystych BulletKit	Lonza	PT-3001
parafina	FUJIFILM Wako Pure Chemical	165-13375
PBS / pH 7,4 100ml	Medicago	09-2051-100
TGF-β 3	Proteintech	HZ-1090
Vetorphale	Meiji Seika Kaisha
Visiocare Maść	SAVAVET/SAVA Healthcare
β-glicerofosforan	FUJIFILM Wako Pure Chemical	Numer katalogowy: 048-34332