To badanie opisuje metodę izolacji i oczyszczania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (BEV) wzbogaconych z ludzkiego kału poprzez wirowanie w gradifikacji gęstości (DGC), identyfikuje fizyczne cechy BEV na podstawie morfologii, wielkości cząstek i stężenia, oraz omawia potencjalne zastosowania podejścia DGC w badaniach klinicznych i naukowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i oczyszczanie bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkiego kału za pomocą wirowania w gradiacji gęstości
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Bakteryjne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (BEV) to nanopęcherzyki pochodzące od bakterii, które odgrywają aktywną rolę w komunikacji bakteria-bakteria i bakteria-gospodarz, przenosząc bioaktywne cząsteczki, takie jak białka, lipidy i kwasy nukleinowe odziedziczone po bakteriach rodzicielskich. Wirusy BEV pochodzące z mikrobioty jelitowej działają w obrębie przewodu pokarmowego i mogą docierać do odległych narządów, co ma istotne implikacje dla fizjologii i patologii. Badania teoretyczne, które badają rodzaje, ilości i rolę BEV pochodzących z ludzkiego kału, mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia wydzielania i funkcji BEV z mikrobioty jelitowej. Badania te wymagają również ulepszenia obecnej strategii izolowania i oczyszczania pojazdów typu BEV.
To badanie zoptymalizowało proces izolacji i oczyszczania pojazdów typu BEV, ustanawiając dwa tryby wirowania w gradiacji gęstości (DGC): Top-down i Bottom-up. Wzbogacony rozkład BEV określono we frakcjach od 6 do 8 (F6-F8). Skuteczność tego podejścia oceniono na podstawie morfologii cząstek, wielkości, stężenia i zawartości białka. Obliczono wskaźniki odzysku cząstek i białek, a także przeanalizowano obecność określonych markerów w celu porównania odzysku i czystości dwóch trybów DGC. Wyniki wykazały, że tryb wirowania od góry do dołu miał niższy poziom zanieczyszczenia i osiągnął wskaźnik odzysku oraz czystość podobną do trybu oddolnego. Czas wirowania wynoszący 7 godzin był wystarczający do osiągnięcia stężenia BEV w kale wynoszącego 108/mg.
Oprócz kału, ta metoda może być stosowana do innych rodzajów płynów ustrojowych z odpowiednią modyfikacją zgodnie z różnicami w składnikach i lepkości. Podsumowując, ten szczegółowy i niezawodny protokół ułatwiłby standaryzowaną izolację i oczyszczanie pojazdów typu BEV, a tym samym położyłby podwaliny pod późniejsze analizy multiomiczne i eksperymenty funkcjonalne.
Wprowadzenie
Jelito jest powszechnie uznawane za narząd, w którym występuje najwięcej mikroorganizmów w ludzkim ciele, z ponad 90% bakterii biorących udział w kolonizacji i namnażaniu1,2. Liczne dowody wykazały, że mikrobiota jelitowa moduluje mikrośrodowisko jelitowe i jednocześnie oddziałuje na dysfunkcje odległych narządów, głównie poprzez uszkodzoną barierę jelitową3,4. Coraz więcej dowodów wskazuje na korelację między brakiem równowagi mikrobioty jelitowej a postępem nieswoistego zapalenia jelit (IBD)5,6
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Komisja Etyki Szpitala Nanfang Południowego Uniwersytetu Medycznego zatwierdziła to badanie, które zostało przeprowadzone za świadomą zgodą uczestników. Wszystkie metody zastosowane w niniejszym dokumencie są zgodne ze standardowymi wytycznymi operacyjnymi dostarczonymi przez Międzynarodowe Standardy Mikrobiomu Człowieka (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). Wszystkie późniejsze procedury obchodzenia się z cieczami zostały nakazane do przeprowadzenia w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub na bardzo czystym stanowisku badawczym.
1. Pobieranie i porcjowanie próbek kału
- Rozdaj próbnik kału, szczelnie za....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wyznaczenie rozkładu frakcji wzbogaconych w BEV
Aby wyznaczyć rozkład frakcji wzbogaconych w bakteryjne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (BEVs), ustalono kontrolę ślepą do pomiaru wartości absorbancji przy OD 340 nm, a gęstość każdej frakcji obliczono na podstawie pomiarów oraz wytycznych dla jodiksanolu (Krok 8.1). Tabela 2 przedstawia wyniki gęstości, wykazując, że frakcje od F4 do F9 wykazywały gęstość w zakresie typowo powiązanym z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi. Wynik ten sugerowa.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Bakteryjne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (BEV) to dwuwarstwowe nanocząstki lipidowe wydzielane przez bakterie, przenoszące bogactwo białek, lipidów, kwasów nukleinowych i innych bioaktywnych cząsteczek, przyczyniających się do pośredniczenia w funkcjonalnym działaniu bakterii20. Udowodniono, że BEV pochodzące z jelit biorą udział w rozwoju chorób, takich jak nieswoiste zapalenie jelit, choroba Leśniowskiego-Crohna i rak jelita grubego, a także wpływają na ogólny metabolizm i pośredniczą w upośledzo.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez the National Science Fund for Distinguished Young Scholars (82025024); kluczowy projekt Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (82230080); Krajowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2021YFA1300604); Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (81871735, 82272438 i 82002245); Fundusz Nauk Przyrodniczych Guangdong dla wybitnych młodych uczonych (2023B1515020058); Fundacja Nauk Przyrodniczych prowincji Guangdong (2021A1515011639);Główny Państwowy Program Rozwoju Badań Podstawowych Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowin....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1 % (w/v) aldehyd glutarowy (przygotowany z 2,5 % roztworu podstawowego w wodzie dejonizowanej) | ACMEC | AP1126 | Obserwacja morfologiczna dla BEV przy użyciu TEM na etapie 8.3.3 |
| 1 % (w/v) metyloceluloza (przygotowana z oryginalnego proszku w wodzie dejonizowanej) | Sigma-Aldrich | M7027 | Obserwacja morfologiczna dla BEV przy użyciu TEM na etapie 8.3.6 |
| 1,5 % (m/v) octan uranylu (przygotowany z oryginalnego proszku w wodzie dejonizowanej) | Polysciences | 21447-25 | Obserwacja morfologiczna dla pojazdów typu BEV wykorzystujących TEM w kroku 8.3.5 |
| 1000 μ L, 200 μ L, 10 i mu; L Pipeta | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Przenieść roztwór |
| 5 % (w/v) roztwór albuminy surowicy bydlęcej (przygotowany z oryginalnego proszku w buforze TBST) | Fdbio science | FD0030 | Stosowany w western blotting do blokowania w kroku 8.5.6 |
| 5 i razy bufor ładujący | Fdbio science | FD006 | Stosowany w western blotting i brylantowym niebieskim barwie Coomassie na etapie 8.5.1 |
| 75 % (v/v) alkoholu | LIRCON | LIRCON-500 mL | Dezynfekcja powierzchni |
| Płytka 96-dołkowa | Rar | A8096 | Zmierz wartości absorbancji |
| Przeciwciało anty-Calnexin | Abcam | ab92573 | Western blotting (przeciwciało pierwszorzędowe) |
| Przeciwciało anty-CD63 | Abcam | ab134045 | Western blotting (przeciwciało pierwszorzędowe) |
| Przeciwciało anty-CD9 | Abcam | ab236630 | Western blotting (przeciwciało pierwotne) |
| Przeciwciało anty-flagelinowe | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (przeciwciało pierwotne) |
| Przeciwciało anty-Integryna beta 1 | Abcam | ab30394 | Western blotting (przeciwciało pierwotne) |
| Przeciwciało anty-LPS | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (przeciwciało pierwotne) |
| Przeciwciało anty-LTA | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (przeciwciało pierwszorzędowe) |
| Przeciwciało anty-OmpA | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (przeciwciało pierwotne) |
| Przeciwciało anty-synteninowe | Abcam | ab133267 | Western blotting (przeciwciało pierwotne) |
| Przeciwciało anty-TSG101 | Abcam | ab125011 | Western blotting (przeciwciało pierwotne) |
| Autoklaw | ZEALWAY | GR110DP | Sterylizacja materiałów eksploatacyjnych i pożywek użytych w eksperymencie |
| Waga | Mettler Toledo | AL104 | Zrównoważyć próbkę probówki załadowaną testem |
| PBS Kwas bicynchoninowy | Fdbio science | FD2001 | Pomiar zawartości białka w BEV na etapie 8.2 |
| BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Wykonaj schematyczny przebieg izolacji i oczyszczania BEV pokazany na rysunku 1 |
| Szafa bezpieczeństwa biologicznego | Haier | HR1200- II B2 | Wykonaj procedury dotyczące obchodzenia się z próbkami kału |
| Wirówka 5810 R; Rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 | Wstępny proces dla BEV (Krok 3) |
| Aparat chemiluminescencyjny | BIO-OI | OI600SE-MF | Używany w western blotting do wykrywania sygnału w Kroku 8.5.12 |
| Cytacja 5 | BioTek | F01 | do pomiaru wartości absorbancji (Krok 8.1) i fluorescencji (Rysunek 6) |
| Lipoproteina o niskiej gęstości | ACMEC | AC12038 | Definicja rozkładu składników zakłócających |
| Sprzęt do elektroforezy | Bio-rad | 1658033 | Stosowany w western blotting do separacji i transferu białek na etapie 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
| Zestaw do ulepszonej chemiluminescencji HRP | Fdbio science | FD8020 | Używany w western blotting do wykrywania sygnału w kroku 8.5.12 |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Izoluj pojazdy typu BEV jako kontrolę pozytywną. Protokół: Rozpuść 25 g proszku LB w 1 l wody dejonizowanej i autoklaw. Przenieś 800 μ L konserwowanych Escherichia coli do pożywki. Uprawiaj w 37 stopniach; C w wytrząsarce inkubatora. Następnie odwirować 3 000 i razy; g przez 20 min przy 4 stopniach; C, 12 000 i razy; g przez 30 min przy 4 stopniach; C, przefiltrować supernatant przez 0,22 μ m membrany i przeprowadzić ultraszybkie wirowanie przy 160 000 &; g przez 70 minut w temperaturze 4 stopni C. Osad zdefiniowany jako surowe BEV z Escherichia coli zawieszono w 1,2 ml PBS (Krok 3, 4). |
| Probówki Falcon 50 ml | KIRGEN | KG2811 | wstępny dla BEV (krok 3) |
| Bufor do barwienia białka Feto | Absci | ab.001.50 | Barwienie na niebiesko Coomassie w kroku 8.5.4 |
| Bibuła filtracyjna | Biosharp | BS-TFP-070B | Obserwacja morfologiczna dla BEV przy użyciu TEM w kroku 8.3 (Blotting the solution) |
| Siatki miedziane na podłożu Formvar/Carbon | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Obserwacja morfologiczna dla BEV przy użyciu TEM w kroku 8.3 |
| Proszek HEPES | Meilunbio | MB6078 | Przygotuj jodiksanolu o różnych stężeniach do wirowania w gradionym gradieniu gęstości |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (przeciwciało wtórne) |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Fdbio nauka | FDR007 | Western blotting (przeciwciało wtórne) |
| Wytrząsarka do inkubatora | Qiangwen | DHZ-L | Uprawa Escherichia coli |
| Kimwipes&handel; Delikatne chusteczki do zadań | Kimtech Science | 34155 | Wytrzyj wewnętrzną ściankę probówki ultrawirówki w kroku 4.15 |
| LB bulion | Hopebio | HB0128 | Uprawiaj Escherichia coli |
| Zamrażarka niskotemperaturowa (-80 ° C) | Haier | DW-86L338J | Przechowuj próbki |
| Metanol | Alalddin | M116118 | Stosowany w western blot do aktywacji membrany PVDF w kroku 8.5.5 |
| Mikroprobówki 1,5 ml | KIRGEN | KG2211 | Odzyskaj frakcje po odwirowaniu w gradionym gradimencie gęstości |
| Mikroprobówki 2 ml | KIRGEN | KG2911 | Odzysk frakcji po wirowaniu w gradifikacji gęstości |
| Mikro probówki 5 ml | BBI | F610888-0001 | Odzyskiwanie frakcji po wirowaniu w gradiacji gradientu gęstości |
| Czytnik mikropłytek | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Pomiar zawartości białka w BEV na etapie 8.2 |
| Filtr miliporowy 0,22 μ m | Merck millipore | SLGP033RB | Filtracja, sterylizacja; Materiał: polieterosulfon, PES |
| NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Roztwór do wirowania w gradiencie gęstości |
| NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Roztwór wirujący w gradiencie gęstości (korekta pH) |
| Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultrawirowanie do izolacji pojazdów typu BEV na etapie 4, 7 |
| OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Roztwór podstawowy do wirowania w gradiacji gęstości |
| Wytrząsarka orbitalna | Youning | CS-100 | Rozpuszczanie kału w kroku 2 |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Procell | PB180327 | Rozpuszczanie kału w kroku 2 |
| Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Przenieś roztwór |
| Plastikowa pipeta Pasteura | ABCbio | ABC217003-4 | Usunąć supernatant podczas przetwarzania wstępnego na etapie 3.4 |
| Membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Stosowany w western blotting do przenoszenia białek na etapie 8.5.5 |
| Prefabrykowany żel poliakrylamidowy, 4– 20% 15 dołków | ACE | F15420Gel | Stosowany w western blotting do separacji białek w kroku 8.5.2, 8.5.3 |
| Pierwszorzędowy rozcieńczalnik przeciwciał | Fdbio science | FD0040 | Stosowany w western blotting na etapie 8.5.8 |
| Drabinka białkowa | Fdbio science | FD0672 | Stosowany w western blotting i brylantowym niebieskim barwieniu Coomassie w kroku 8.5 |
| Szybki roztwór do bibułowania białkami | UBIO | UW0500 | Stosowany w western blotting do przenoszenia białka na kroku 8.5.5 |
| Rotor SW 32 Ti Rotor z łyżką wahadłową Beckman | Coulter | 369650 | Ultrawirowanie do izolacji BEV na etapie 4, 7 |
| Strzykawka 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | transferowe i usuwają supernatant w procesie wstępnego przetwarzania |
| Proszek TBS | Fdbioscience | FD1021 | Używany w western blot na kroku 8.5 |
| Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM) | Hitachi | H-7650 | Obserwacja morfologiczna dla BEV na kroku 8.3 |
| Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Używany w western blot na kroku 8.5 |
| Probówka ultrawirówkowa | Beckman | 326823, 355642 | Ultrawirowanie do izolacji BEV na etapie 4, 7 |
| Ultra-czysta ławka | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Zapoznaj się z procedurami dotyczącymi obchodzenia się z cieczami |
| Kąpiel wodna | Bluepard | CU600 | Używany do pomiaru zawartości białka w BEV w kroku 8.2.5 |
| ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, oprogramowanie ZetaView (wersja 8.05.14 SP7) | Analiza śledzenia nanocząstek (NTA) do pomiaru wielkości cząstek i koncentracji BEV w kroku 8.4 |
Bibliografia
- Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
- Greenhalgh, K., Meyer, K. M., Aagaard, K. M., Wilmes, P. The human gut microbiome in healt....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
