Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja i oczyszczanie bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkiego kału za pomocą wirowania w gradiacji gęstości

4.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65574

⸱

1 września 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, Nanfang Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie opisuje metodę izolacji i oczyszczania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (BEV) wzbogaconych z ludzkiego kału poprzez wirowanie w gradifikacji gęstości (DGC), identyfikuje fizyczne cechy BEV na podstawie morfologii, wielkości cząstek i stężenia, oraz omawia potencjalne zastosowania podejścia DGC w badaniach klinicznych i naukowych.

Streszczenie

Bakteryjne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (BEV) to nanopęcherzyki pochodzące od bakterii, które odgrywają aktywną rolę w komunikacji bakteria-bakteria i bakteria-gospodarz, przenosząc bioaktywne cząsteczki, takie jak białka, lipidy i kwasy nukleinowe odziedziczone po bakteriach rodzicielskich. Wirusy BEV pochodzące z mikrobioty jelitowej działają w obrębie przewodu pokarmowego i mogą docierać do odległych narządów, co ma istotne implikacje dla fizjologii i patologii. Badania teoretyczne, które badają rodzaje, ilości i rolę BEV pochodzących z ludzkiego kału, mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia wydzielania i funkcji BEV z mikrobioty jelitowej. Badania te wymagają również ulepszenia obecnej strategii izolowania i oczyszczania pojazdów typu BEV.

To badanie zoptymalizowało proces izolacji i oczyszczania pojazdów typu BEV, ustanawiając dwa tryby wirowania w gradiacji gęstości (DGC): Top-down i Bottom-up. Wzbogacony rozkład BEV określono we frakcjach od 6 do 8 (F6-F8). Skuteczność tego podejścia oceniono na podstawie morfologii cząstek, wielkości, stężenia i zawartości białka. Obliczono wskaźniki odzysku cząstek i białek, a także przeanalizowano obecność określonych markerów w celu porównania odzysku i czystości dwóch trybów DGC. Wyniki wykazały, że tryb wirowania od góry do dołu miał niższy poziom zanieczyszczenia i osiągnął wskaźnik odzysku oraz czystość podobną do trybu oddolnego. Czas wirowania wynoszący 7 godzin był wystarczający do osiągnięcia stężenia BEV w kale wynoszącego 108/mg.

Oprócz kału, ta metoda może być stosowana do innych rodzajów płynów ustrojowych z odpowiednią modyfikacją zgodnie z różnicami w składnikach i lepkości. Podsumowując, ten szczegółowy i niezawodny protokół ułatwiłby standaryzowaną izolację i oczyszczanie pojazdów typu BEV, a tym samym położyłby podwaliny pod późniejsze analizy multiomiczne i eksperymenty funkcjonalne.

Wprowadzenie

Jelito jest powszechnie uznawane za narząd, w którym występuje najwięcej mikroorganizmów w ludzkim ciele, z ponad 90% bakterii biorących udział w kolonizacji i namnażaniu1,2. Liczne dowody wykazały, że mikrobiota jelitowa moduluje mikrośrodowisko jelitowe i jednocześnie oddziałuje na dysfunkcje odległych narządów, głównie poprzez uszkodzoną barierę jelitową3,4. Coraz więcej dowodów wskazuje na korelację między brakiem równowagi mikrobioty jelitowej a postępem nieswoistego zapalenia jelit (IBD)5,6, a także zaburzenia poznawcze na osi jelitowo-mózgowej5,6,7,8. Bakteryjne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (BEV) wytwarzane przez bakterie odgrywają znaczącą rolę w tych procesach patologicznych.

BEV to nanoskalowe cząsteczki zawierające pochodne bakterii, o średnicach od 20 do 400 nm. Wykazano, że ułatwiają one interakcje między bakteriami a ich organizmami gospodarza9,10. Pomimo swojej niewidoczności, cząstki te przyciągają coraz większą uwagę badaczy ze względu na ich potencjalne szerokie zastosowania jako biomarkery diagnostyczne, cele terapeutyczne i nośniki dostarczania leków11. Ludzki kał, często używany jako próbki biologiczne do badania BEV, głównie pozyskiwany z bakterii jelitowych, zawiera złożoną mieszaninę między innymi wody, bakterii, lipidów, białek, niestrawionych resztek pokarmowych i złuszczonych komórek nabłonka. Skomplikowany skład kału stanowi wyzwanie dla izolacji i czystości pojazdów typu BEV, utrudniając w ten sposób kompleksową, obiektywną i realistyczną analizę pojazdów typu BEV. W związku z tym skuteczne strategie minimalizacji zakłóceń spowodowanych zanieczyszczeniem komponentów i zwiększenia wydajności pojazdów typu BEV okazały się krytycznymi kwestiami wymagającymi natychmiastowej uwagi.

Istniejące strategie izolacji w dużej mierze opierają się na technikach takich jak ultraszybkie wirowanie (UC), wirowanie w gradiacji gęstości (DGC) i chromatografia wykluczania wielkości (SEC)12,13,14,15,16,17. Obecnie DGC jest jedną z najpowszechniej stosowanych metod separacji BEV, obejmującą dwa tryby sedymentacji i pływania, "Top-down" i "Bottom-up", które są określane przez początkową pozycję obciążenia próbki. Metodologie te różnicują pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) od innych składników na podstawie różnic w wielkości i gęstości, uzyskując zmienną czystość i wskaźniki odzysku. Wcześniejsze badania wykazały, że strategie jednego podejścia są niewystarczające do odpowiedniego oddzielenia EV od rozpuszczalnych białek w próbkach płynów ustrojowych, takich jak lipoproteiny we krwi18 i białko Tamm-Horsfall w moczu19. Ponadto rozkład wielkości eukariotycznych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EEV) często pokrywa się z rozkładem wielkości BEV, co wymaga dalszych ulepszeń metodologicznych w celu optymalizacji wydajności BEV. W związku z tym postęp w badaniach nad pojazdami typu BEV zależy od opracowania skutecznych metodologii separacji i oczyszczania. Warto zauważyć, że Tulkens i wsp15 zastosowali ortogonalną strategię biofizyczną do oddzielenia kałowych pojazdów BEV od EEV, w których czas wirowania w trybie DGC typu bottom-up wynosił do 18 godzin. W przeciwieństwie do tego, to badanie skróciło go do 7 godzin, znacznie oszczędzając czas ultrawirowania gradientowego i upraszczając proces.

W obecnym badaniu, wyizolowaliśmy i oczyściliśmy kałowe BEV przy użyciu dwóch trybów DGC w zoptymalizowanych warunkach buforowych, po wzbogaceniu BEV o zakres różnicowych prędkości wirowania, od niskiej do ekstremalnie wysokiej prędkości. Oceny oparte na morfologii, wielkości cząstek i stężeniu wykazały godną pochwały wydajność tej ulepszonej metody. Badanie to może posłużyć jako podstawa dla przyszłych badań, rozszerzając ich zastosowania na szerszą dziedzinę i oferując wgląd w niejednorodność pojazdów typu BEV w ludzkim ciele. Przyczynia się również do standaryzacji technik separacji i analizy BEV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Komisja Etyki Szpitala Nanfang Południowego Uniwersytetu Medycznego zatwierdziła to badanie, które zostało przeprowadzone za świadomą zgodą uczestników. Wszystkie metody zastosowane w niniejszym dokumencie są zgodne ze standardowymi wytycznymi operacyjnymi dostarczonymi przez Międzynarodowe Standardy Mikrobiomu Człowieka (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). Wszystkie późniejsze procedury obchodzenia się z cieczami zostały nakazane do przeprowadzenia w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub na bardzo czystym stanowisku badawczym.

1. Pobieranie i porcjowanie próbek kału

  1. Rozdaj próbnik kału, szczelnie zapieczętowaną torbę i pudełko z lodem oraz udziel uczestnikom wyczerpujących instrukcji, jak zdobyć i zakonserwować próbki.
  2. Poinstruuj każdego uczestnika, aby pobrał próbkę kału za pomocą dostarczonego próbnika i przetransportował ją do laboratorium w temperaturze 4 °C w ciągu 24 godzin.
  3. Po otrzymaniu w laboratorium użyj sterylnej łyżki, aby porcjować mniej niż 3,5 g kału do wstępnie zważonej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Zanotuj masę próbki kału na probówce do kolejnych procedur obróbki wstępnej.
    PUNKT PAUZY: Jeżeli natychmiastowe przetworzenie próbek nie jest możliwe, należy przeznaczyć próbkę do długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 °C po odpowiednim odnotowaniu.

2. Przygotowanie próbki kału

  1. Schłodzić 500 ml buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (PBS) w temperaturze 4 °C. Przefiltrować wstępnie schłodzony PBS przez 0,22 μm filtr polieterosulfonowy (PES) za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml do dziesięciu probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
  2. Umieść dwie probówki o pojemności 50 ml na lodzie, z których każda zawiera 3,5 g próbek kału. Dodać 35 ml PBS do każdej probówki.
    UWAGA: Obliczyć wymaganą ilość PBS do rozpuszczenia kału, zapewniając maksymalne stężenie próbki 10% (w/v). W przypadku przetwarzania dodatkowych próbek należy użyć większej liczby probówek w razie potrzeby.
  3. Wytrząsać próbki z prędkością 300 obr./min przez 2 godziny w temperaturze 4 °C lub umieszczać je na 8 godzin w temperaturze co najmniej 4 °C, aż kał zostanie całkowicie zawieszony w widoczny sposób.

3. Wirowanie różnicowe

  1. Schłodzić szybkoobrotową wirówkę z chłodzeniem do temperatury 4 °C.
  2. Dostosować masę dwóch probówek zawierających próbki przygotowane w kroku 2.3 za pomocą PBS, aby osiągnąć łączną masę 0,1 g.
  3. Odwirować próbki o masie 3 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Ostrożnie odpipetować supernatant do dwóch czystych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml, pozostawiając około 1 ml nad osadem. Do tego procesu należy użyć jednorazowej plastikowej pipety Pasteura.
  5. Dostosuj wagę dwóch probówek za pomocą PBS, aby osiągnąć łączną wagę w granicach ± 0,1 g.
  6. Odwirować przeniesiony supernatant w temperaturze 12 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Odessać supernatant za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml, wyjąć igłę strzykawki i przefiltrować przez filtry 0,22 μm do probówek o pojemności 50 ml. W tym momencie objętość supernatantu powinna wynosić około 30 ml.
    UWAGA: Jeżeli po odwirowaniu 12 000 × g nadal widoczna jest znaczna ilość zanieczyszczeń, konieczne jest powtórzenie etapu wirowania przy 12 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Niezastosowanie się do tego może spowodować znaczną utratę BEV z powodu zablokowania porów podczas filtracji.

4. Wirowanie z bardzo dużą prędkością

  1. Wyczyść wirnik i wiadro, przecierając je 75% (v/v) alkoholem, aby usunąć wszelkie pozostałości zanieczyszczeń.
  2. Umieść probówkę ultrawirówki o pojemności 38,5 ml w uchwycie probówki.
    UWAGA: Wybierz odpowiednią probówkę do ultrawirówki na podstawie objętości próbki. Unikaj promieniowania ultrafioletowego i nieodpowiednich odczynników chemicznych do sterylizacji probówek odśrodkowych, jak wskazano w instrukcji produktu.
  3. Przenieść około 30 ml przefiltrowanego supernatantu kałowego z kroku 3.7 do probówki ultrawirówkowej.
  4. Napełnij probówkę ultrawirówki około 8 ml PBS, pozostawiając 3 mm odstęp od otworu probówki.
  5. Umieść dwie probówki do ultrawirówek z próbkami w przeciwległych wiadrach do ultrawirowania, na przykład wiadro 1 odpowiada 4 (1-4), 2-5, 3-6.
  6. Dostosuj wagę dwóch wiader za pomocą PBS, aby uzyskać łączną masę w granicach ± 0,005 g.
  7. Zamontuj wszystkie wiadra na wirniku, niezależnie od tego, czy rury są załadowane.
  8. Rozpocząć próżnię i odwirować próbki o masie 160 000 × g przez 70 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Zwolnij próżnię w komorze i otwórz drzwiczki, gdy na stronie głównej przyrządu pojawi się komunikat Gotowy.
  10. Wyjmij wirnik z ultrawirówki.
  11. Przenieś wiadra z wirnika do stojaka i wyjmij rurki za pomocą szczypiec.
  12. Wyrzucić supernatant, który będzie zawierał widoczne brązowe granulki na dnie.
  13. Zawiesić granulki, wielokrotnie pipetując je w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl z 1 ml wstępnie schłodzonego (4 °C) PBS, aż do całkowitego zawieszenia. Napełnij probówkę około 37 ml PBS, pozostawiając 3 mm odstęp od otworu.
  14. Wykonać kolejne ultrawirowanie zgodnie z krokami 4.5-4.11 przy 160 000 × g przez 70 minut w temperaturze 4 °C, aby usunąć częściowo przyczepione składniki zanieczyszczające ze ścianek rury.
  15. Odrzucić supernatant, odwrócić dwie probówki ultrawirówki na 5 minut i usunąć pozostały roztwór na wewnętrznej ściance za pomocą wycieraczek.
    UWAGA: Czyszczenie ścianki wewnętrznej minimalizuje zakłócenia spowodowane resztkami zanieczyszczeń przylegającymi do ścianki probówki ultrawirówki. Wybierz wycieraczki, które nie będą miały wpływu na analizę BEV, szczególnie jeśli chodzi o wielkość cząstek.
  16. Zawiesić granulki w każdej probówce, pipetując je w górę i w dół za pomocą 1,2 ml wstępnie schłodzonego (4 °C) PBS za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl.
  17. Przenieść 1,2 ml roztworu PBS/BEV z jednej probówki ultrawirówki do czystej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
    PUNKT PAUZY: Roztwór PBS/BEV pobrany z jednej probówki ultrawirówki można przejść do Kroku 6. Przechowywać roztwór z drugiej probówki w temperaturze -80 °C.

5. Przygotowanie roztworu do wirowania w gradiencie gęstości

  1. Przygotowanie 0,02 M buforu HEPES
    1. Połącz 0,477 g proszku HEPES i 0,8 g NaCl z 90 ml autoklawowanej wody dejonizowanej.
    2. Doprowadzić pH do 7,2, dodając 1 M wodorotlenek sodu (NaOH). Doprowadzić objętość do 100 ml wodą dejonizowaną i przefiltrować roztwór przez membrany PES 0,22 μm.
      UWAGA: Wodorotlenek sodu jest silną zasadą. Operatorzy muszą obchodzić się z nim i przygotowywać go ostrożnie w dygestorium.
  2. Przygotowanie bufora gradientu gęstości
    1. Oblicz wymaganą objętość każdego bufora gradientu gęstości na podstawie liczby probówek ultrawirówek do wirowania w gradifikacji gradientu gęstości (krok 6) (w tym protokole objętości dla roztworów gradientu 60%, 50%, 40%, 20% i 10% wynosiły odpowiednio 2,5 ml, 3 ml, 6 ml, 6 ml i 6 ml).
    2. W celu przygotowania 50% (w/v) roztworu roboczego jodiksanolu należy zmieszać 0,02 M bufor HEPES i 60% (w/v) roztwór podstawowy jodiksanolu w stosunku objętościowym 1:5 (0,5 ml: 2,5 ml).
      UWAGA: Użyj jednorazowej strzykawki o pojemności 20 ml, aby pobrać roztwór podstawowy jodiksanolu i unikać wprowadzania powietrza.
    3. Aby przygotować jodiksanolu o różnych stężeniach, należy połączyć 50% roztwór roboczy jodiksanolu z kroku 5.2.2 z buforem HEPES otrzymanym w kroku 5.1 za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl, zgodnie z proporcjami podanymi w tabeli 1.
      UWAGA: Wykonaj krok 5 na ultra czystej ławce przy wyłączonym świetle. Otwarty roztwór podstawowy jodiksanolu należy przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C, aby zapobiec rozwojowi bakterii. Roztwór jodiksanolu i bufor HEPES należy chronić przed światłem.

6. Ustanowienie systemu wirowania z gradientem gęstości

  1. Tryb DGC z widokiem od góry
    1. Połącz 500 μl roztworu PBS/BEV wyizolowanego z etapu 4 z 3 ml PBS. Delikatnie wymieszaj roztwory za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl, aby uzyskać 3,5 ml roztworu PBS/BEV.
    2. Umieść probówkę ultrawirówki o pojemności 31 ml na piankowej płytce z otworami i oznacz ją jako "↓".
    3. Dodać pionowo 3 ml 50% roztworu jodiksanolu na dno probówki za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl.
    4. Przechyl rurkę pod kątem 70° i umieść uchwyt rurki lub inny wspornik nieco powyżej poziomu płyty piankowej, poniżej otworu rurki.
    5. Dodać 3 ml 40% roztworu jodiksanolu do 50% roztworu jodiksanolu za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl.
    6. Dodać 3 ml 20% roztworu jodiksanolu do 40% roztworu jodiksanolu za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl.
    7. Dodać 3 ml 10% roztworu jodiksanolu do 20% roztworu jodiksanolu za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl.
    8. Dodać 3,5 ml roztworu PBS/BEV z kroku 6.1.1 do 10% roztworu jodiksanolu za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl.
    9. Delikatnie ustaw rurki w pozycji pionowej.
      UWAGA: Po pipetowaniu stratyfikacja powinna być widoczna.
  2. Tryb DGC od dołu do góry
    1. Umieść probówkę ultrawirówki o pojemności 31 ml na piankowej płytce z otworami i oznacz ją jako "↑".
    2. Na dno probówki dodać pionowo 2,5 ml 60% roztworu podstawowego jodiksanolu. Delikatnie wymieszać z 500 μl roztworu PBS/BEV wyizolowanego z kroku 4 za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl, aby uzyskać 3 ml 50% roztworu jodiksanolu/BEV.
    3. Przechyl rurkę pod kątem 70° i umieść uchwyt rurki lub inny wspornik nieco powyżej poziomu płyty piankowej, poniżej otworu rurki.
    4. Dodać 3 ml 40% roztworu jodiksanolu do 50% roztworu jodiksanolu/BEV za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl.
    5. Dodać 3 ml 20% roztworu jodiksanolu do 40% roztworu jodiksanolu za pomocą pipety o pojemności 1000 μl.
    6. Dodać 3 ml 10% roztworu jodiksanolu do 20% roztworu jodiksanolu za pomocą pipety o pojemności 1000 μl.
    7. Dodać 3,5 ml PBS do 10% roztworu jodiksanolu za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl.
    8. Delikatnie ustaw rurki w pozycji pionowej.
    9. W tym momencie pozostało 200 μl zawiesiny uzyskanej w kroku 4.17, którą można następnie przeanalizować jako grupę o nazwie "UC".
      UWAGA: Podczas przenoszenia roztworów w kroku 6 zawsze trzymaj końcówkę pipety przy ściance probówki ultrawirówki prostopadle do osi probówki.

7. Wirowanie w gradiencie gęstości i zbieranie frakcji

  1. Dostosuj wagę dwóch probówek za pomocą PBS, aby osiągnąć łączną wagę w granicach ± 0,005 g.
  2. Umieścić probówki w wiadrach zgodnie z krokiem 4.5 i poddać je odwirowaniu w temperaturze 160 000 × g przez 7 godzin w temperaturze 4 °C.
  3. Zebrać frakcje za pomocą pipetora (1000 μl) od góry do dołu przy ściance bocznej w następującej kolejności: 3 ml, 2 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1,5 ml i 3 ml do probówki ultrawirówki o pojemności 38,5 ml.
    UWAGA: Utrzymuj linię wzroku na tym samym poziomie co powierzchnia cieczy.
  4. Przeprowadzić ultrawirowanie dla każdej frakcji otrzymanej w kroku 7.3 zgodnie z krokiem 4 w temperaturze 160 000 × g przez 70 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Usunąć supernatant i odwrócić probówki ultrawirówkowe na 5 minut.
  6. Zawiesić granulki w 200 μl wstępnie schłodzonego (4 °C) PBS za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
  7. Przenieś roztwór PBS/BEV do czystej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
  8. Oznacz ułamki od F1 do F10 i przeanalizuj je na podstawie kroku 8.
    PUNKT PAUZY: Jeżeli próbki otrzymane w kroku 7.8 nie mogą być natychmiast przetworzone, należy je przechowywać w temperaturze -80 °C.

8. Charakterystyka i analiza ilościowa zebranych frakcji

  1. Oznaczyć wartości absorbancji (OD 340 nm) każdej frakcji za pomocą detektora mikropłytkowego ze ślepą próbą w celu obliczenia odpowiadającej im gęstości.
    UWAGA: Zastąp roztwór PBS/BEV (krok 6.1.1 i krok 6.2.2) PBS, aby ustanowić ślepą kontrolę.
    1. Przygotować po 100 μl 0%, 5%, 10%, 12,5% i 20% roztworu jodiksanolu rozcieńczonego 0,02 M HEPES na bazie 50% roztworu podstawowego (krok 5.2.2) jako wzorce, odpowiadające gęstościom odpowiednio 1,0058 g/ml, 1,0318 g/ml, 1,058 g/ml, 1,0708 g/ml i 1,111 g/ml.
    2. Dodać 50 μl każdej frakcji z ślepej próby kontrolnej (przygotowanej w kroku 7.3) i 50 μl każdego roztworu wzorcowego (przygotowanego w kroku 8.1.1) w celu zduplikowania studzienek płytki 96-dołkowej.
    3. Ustaw długość fali na 340 nm, zmierz gęstość optyczną punktu końcowego i oblicz gęstość każdej frakcji.
    4. Zidentyfikuj F4-F9 jako zakres frakcji BEV na podstawie ich gęstości.
  2. Określić stężenie białka we frakcjach BEV za pomocą testu kwasu bicynkowego (BCA).
    1. Rozcieńczyć substancję dziesięciokrotnie w PBS dostarczonym przez producenta, aby przygotować 0,5 μg/μl wzorcowego roztworu białka.
    2. Dodać wzorcowy roztwór białkowy (przygotowany w kroku 8.2.1) o różnych objętościach zgodnie z instrukcją odczynnika i uzupełnić każde dołek 96-dołkowej płytki PBS do całkowitej objętości 20 μl.
    3. Dodać 20 μl próbek przygotowanych w kroku 7.8 i próbek pozostałych po UC zdefiniowanych w kroku 6.2.9 do każdej studzienki.
    4. Wymieszać odczynniki A i B w stosunku 50:1 i przenieść 200 μl do każdego dołka.
    5. Inkubować płytkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    6. Zmierzyć wartość absorbancji za pomocą czytnika mikropłytek, obliczyć stężenie białka (μg/μl) i oznaczyć zawartość białka (μg) w próbkach na podstawie krzywej wzorcowej (x: gęstość optyczna; y: stężenie białka) uzyskanej z wartości roztworów wzorcowych rozcieńczonych w kroku 8.2.2.
  3. Scharakteryzować frakcje BEV zdefiniowane w kroku 8.1.4 za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) w celu sprawdzenia obecności BEV. Wszystkie poniższe procedury powinny być wykonywane na lodzie.
    1. Nałożyć 10 μl każdej wyizolowanej frakcji F4-F9 z kroku 7.8 i próbek pozostałych po UC zdefiniowanych w kroku 6.2.9 na siatki miedziane na podłożu Formvar/Carbon przez 20 minut i osuszyć bibułą filtracyjną.
    2. Przepłukać próbki 100 μl PBS trzy razy przez 1 minutę każda i osuszyć bibułą filtracyjną.
    3. Utrwalić próbki 100 μl 1% (w/v) aldehydu glutarowego przez 5 minut i osuszyć bibułą filtracyjną.
    4. Umyj kratki 100 μl PBS dziesięć razy przez 2 minuty każda i osusz bibułą filtracyjną.
    5. Zabarwić siatki 50 μl 1,5% (w/v) octanu uranylu przez 10 minut i osuszyć bibułą filtracyjną.
      UWAGA: Octan uranylu jest radioaktywny i wyjątkowo toksyczny w kontakcie ze skórą lub wdychaniu go. Roztwory z octanem uranylu należy obchodzić się w dygestorium i przestrzegać odpowiednich środków bezpieczeństwa.
    6. Przenieś siatki na kroplę metylocelulozy o stężeniu 1% (w/v) na 5 minut i osusz bibułą filtracyjną.
    7. Przechowuj wysuszone na powietrzu kratki w ciemnym, wolnym od kurzu otoczeniu do czasu obserwacji.
    8. Przechwytuj obrazy i analizuj je za pomocą TEM.
  4. Scharakteryzować frakcje BEV zdefiniowane w kroku 8.1.4 za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA) w celu zliczenia liczby cząstek.
    1. Skalibruj system za pomocą cząstek polistyrenu o długości fali 110 nm.
    2. Umyć pulę próbek za pomocą PBS.
    3. Rozcieńczyć próbki z różnych frakcji uzyskanych w kroku 7.8 oraz próbki pozostałe po UC zdefiniowanym w kroku 6.2.9 do stężenia w zakresie 105-10 9 cząstek/ml, przy optymalnym stężeniu 10-7 cząstek/ml.
    4. Zapis i analiza w 11 pozycjach z trzema powtórzeniami, utrzymując temperaturę około 23-30 °C.
  5. Analizować zawartość białka w próbkach za pomocą barwienia coomassie brilliant blue (CBBS) i western blotting (WB).
    1. Rozcieńczyć próbki BEV z różnych frakcji otrzymanych w kroku 7.8 oraz próbki pozostałe po UC określonym w kroku 6.2.9 przy użyciu PBS i buforu ładującego 5 × do końcowego stężenia 0,5 lub 1 μg/μl, jeżeli wymagana jest ocena ilościowa, zapewniając wystarczające obciążenie próbki 20 μl (10 μg lub 20 μg) każdej studzienki w kroku 8.5.2. Gotować próbki w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
    2. Zmontuj prefabrykowany żel poliakryloamidowy w zbiorniku do elektroforezy i przenieś próbki do studzienek.
    3. Przeprowadzić elektroforezę pionową o następujących parametrach: 160 V przez 50 min.
    4. Zabarwić żel w roztworze Coomassie w kolorze błękitu brylantowego przez 1 godzinę, spłukać w wodzie dejonizowanej, aż niebieskie tło się rozjaśni, i zrobić zdjęcia aparatem.
    5. Zabiegi blottingu białkowego należy wykonywać dla innych żeli o parametrach: 400 mA przez 20 min.
    6. Zablokować błony bibułkowe 5% (w/v) roztworem BSA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    7. Przemyć membrany w buforze TBST trzy razy przez 5 minut każda.
    8. Inkubować błony z pierwszorzędowymi przeciwciałami (markery BEV: LPS, OmpA, LTA; Markery EEV: CD63, CD9, TSG-101, Syntenina, Integryna β1; Inne markery zanieczyszczenia: Flagelina, Calnexin) przez 8-12 h w temperaturze 4 °C.
    9. Przemyć membrany w buforze TBST trzy razy przez 10 minut każda.
    10. Inkubować błony z przeciwciałami drugorzędowymi przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    11. Wykonaj krok 8.5.9.
    12. Rozwiń blotting za pomocą aparatu chemiluminescencyjnego.
    13. Zastąp roztwór PBS/BEV (krok 6.1.1 i krok 6.2.2) BEV z Escherichia coli w celu ustanowienia kontroli pozytywnej (patrz Tabela materiałów dla procedury izolacji surowych E. coli-BEV) i przeprowadź wszystkie powyższe eksperymenty w celu scharakteryzowania BEVs.
      PUNKT PAUZY: Określ F6-F8 jako rozkład frakcji wzbogaconych w BEV na podstawie wyników opisanej powyżej charakterystyki dla BEV kałowych i wykorzystaj ten zawężony zakres do późniejszej analizy.
  6. Oblicz współczynniki odzysku w odniesieniu do cząstek i białek, aby ocenić wydajność dwóch trybów DGC. Poniższe wyniki są przedstawione w procentach.
    1. Obliczyć współczynniki odzysku cząstek w trybie z góry na dół: całkowite cząstki w F6-F8/cząstki po UC zdefiniowane w kroku 6.2.9.
    2. Obliczyć współczynniki odzysku cząstek w trybie oddolnym: całkowite cząstki w F6-F8/cząstki po UC zdefiniowane w kroku 6.2.9.
    3. Obliczyć współczynniki odzysku białek w trybie odgórnym: całkowita zawartość białka w F6-F8 (μg)/zawartość białka po UC zdefiniowana w kroku 6.2.9 (μg).
    4. Obliczyć wskaźniki odzysku białek w trybie bottom-up: całkowita zawartość białka w F6-F8 (μg)/zawartość białka po UC zdefiniowana w kroku 6.2.9 (μg).
  7. Oblicz stosunek cząstek do białka, aby ocenić czystość tradycyjnie zdefiniowaną dla UC i dwóch trybów DGC, a poniższe wyniki zostały przedstawione w procentach.
    1. Stosunek cząstka/białko po UC zdefiniowany w kroku 6.2.9: cząstki po UC/zawartość białka po UC (μg).
    2. Stosunek cząstek do białka w trybie Top-down: całkowita zawartość cząstek w F6-F8 / zawartość białka w F6-F8 (μg).
    3. Stosunek cząstek do białka w trybie bottom-up: całkowita zawartość cząstek w F6-F8 / zawartość białka w F6-F8 (μg).
  8. Wybierz najbardziej odpowiedni tryb wirowania (tryb odgórny został wybrany w protokole) do oczyszczania kału BEV i przyszłej analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyznaczenie rozkładu frakcji wzbogaconych w BEV
Aby wyznaczyć rozkład frakcji wzbogaconych w bakteryjne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (BEVs), ustalono kontrolę ślepą do pomiaru wartości absorbancji przy OD 340 nm, a gęstość każdej frakcji obliczono na podstawie pomiarów oraz wytycznych dla jodiksanolu (Krok 8.1). Tabela 2 przedstawia wyniki gęstości, wykazując, że frakcje od F4 do F9 wykazywały gęstość w zakresie typowo powiązanym z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi. Wynik ten sugerowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Bakteryjne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (BEV) to dwuwarstwowe nanocząstki lipidowe wydzielane przez bakterie, przenoszące bogactwo białek, lipidów, kwasów nukleinowych i innych bioaktywnych cząsteczek, przyczyniających się do pośredniczenia w funkcjonalnym działaniu bakterii20. Udowodniono, że BEV pochodzące z jelit biorą udział w rozwoju chorób, takich jak nieswoiste zapalenie jelit, choroba Leśniowskiego-Crohna i rak jelita grubego, a także wpływają na ogólny metabolizm i pośredniczą w upośledzo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez the National Science Fund for Distinguished Young Scholars (82025024); kluczowy projekt Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (82230080); Krajowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2021YFA1300604); Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (81871735, 82272438 i 82002245); Fundusz Nauk Przyrodniczych Guangdong dla wybitnych młodych uczonych (2023B1515020058); Fundacja Nauk Przyrodniczych prowincji Guangdong (2021A1515011639);Główny Państwowy Program Rozwoju Badań Podstawowych Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Shandong w Chinach (ZR2020ZD11); Fundacja Naukowa z tytułem doktora (2022M720059); Wybitny Program Rozwoju Młodzieży Szpitala Nanfang Południowego Uniwersytetu Medycznego (2022J001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 % (w/v) aldehyd glutarowy (przygotowany z 2,5 % roztworu podstawowego w wodzie dejonizowanej)ACMECAP1126Obserwacja morfologiczna dla BEV przy użyciu TEM na etapie 8.3.3
1 % (w/v) metyloceluloza (przygotowana z oryginalnego proszku w wodzie dejonizowanej)Sigma-AldrichM7027Obserwacja morfologiczna dla BEV przy użyciu TEM na etapie 8.3.6
1,5 % (m/v) octan uranylu (przygotowany z oryginalnego proszku w wodzie dejonizowanej)Polysciences21447-25Obserwacja morfologiczna dla pojazdów typu BEV wykorzystujących TEM w kroku 8.3.5
1000 μ L, 200 μ L, 10 i mu; L PipetaKIRGENKG1313, KG1212, KG1011Przenieść roztwór
5 % (w/v) roztwór albuminy surowicy bydlęcej (przygotowany z oryginalnego proszku w buforze TBST)Fdbio scienceFD0030Stosowany w western blotting do blokowania w kroku 8.5.6
5 i razy bufor ładującyFdbio scienceFD006Stosowany w western blotting i brylantowym niebieskim barwie Coomassie na etapie 8.5.1
75 % (v/v) alkoholuLIRCONLIRCON-500 mLDezynfekcja powierzchni
Płytka 96-dołkowaRarA8096Zmierz wartości absorbancji 
Przeciwciało anty-CalnexinAbcamab92573Western blotting (przeciwciało pierwszorzędowe)
Przeciwciało anty-CD63Abcamab134045Western blotting (przeciwciało pierwszorzędowe)
Przeciwciało anty-CD9Abcamab236630Western blotting (przeciwciało pierwotne)
Przeciwciało anty-flagelinoweSino Biological40067-MM06Western blotting (przeciwciało pierwotne)
Przeciwciało anty-Integryna beta 1Abcamab30394Western blotting (przeciwciało pierwotne)
Przeciwciało anty-LPSThermo FisherMA1-83152Western blotting (przeciwciało pierwotne)
Przeciwciało anty-LTAThermo Fisher MA1-7402Western blotting (przeciwciało pierwszorzędowe)
Przeciwciało anty-OmpACUSABIOCSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/Western blotting (przeciwciało pierwotne)
Przeciwciało anty-synteninoweAbcamab133267Western blotting (przeciwciało pierwotne)
Przeciwciało anty-TSG101Abcamab125011Western blotting (przeciwciało pierwotne)
AutoklawZEALWAYGR110DPSterylizacja materiałów eksploatacyjnych i pożywek użytych w eksperymencie
WagaMettler ToledoAL104Zrównoważyć próbkę probówki załadowaną testem
PBS Kwas bicynchoninowy Fdbio scienceFD2001Pomiar zawartości białka w BEV na etapie 8.2
BioRenderBioRenderhttps://app.biorender.comWykonaj schematyczny przebieg izolacji i oczyszczania BEV pokazany na rysunku 1
Szafa bezpieczeństwa biologicznegoHaierHR1200- II B2Wykonaj procedury dotyczące obchodzenia się z próbkami kału
Wirówka 5810 R; Rotor F-34-6-38Eppendorf5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000Wstępny proces dla BEV (Krok 3)
Aparat chemiluminescencyjnyBIO-OIOI600SE-MFUżywany w western blotting do wykrywania sygnału w Kroku 8.5.12
Cytacja 5BioTekF01do pomiaru wartości absorbancji (Krok 8.1) i fluorescencji (Rysunek 6) 
Lipoproteina o niskiej gęstościACMECAC12038Definicja rozkładu składników zakłócających 
Sprzęt do elektroforezyBio-rad1658033Stosowany w western blotting do separacji i transferu białek na etapie 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5
Zestaw do ulepszonej chemiluminescencji HRP Fdbio scienceFD8020Używany w western blotting do wykrywania sygnału w kroku 8.5.12
Escherichia coli  American Type Culture CollectionATCC8739Izoluj pojazdy typu BEV jako kontrolę pozytywną. Protokół: Rozpuść 25 g proszku LB w 1 l wody dejonizowanej i autoklaw. Przenieś 800 μ L konserwowanych Escherichia coli do pożywki. Uprawiaj w 37 stopniach; C w wytrząsarce inkubatora. Następnie odwirować 3 000 i razy; g przez 20 min przy 4 stopniach; C, 12 000 i razy; g przez 30 min przy 4 stopniach; C, przefiltrować supernatant przez 0,22 μ m membrany i przeprowadzić ultraszybkie wirowanie przy 160 000 &; g przez 70 minut w temperaturze 4 stopni C. Osad zdefiniowany jako surowe BEV z Escherichia coli zawieszono w 1,2 ml PBS (Krok 3, 4).       
Probówki Falcon 50 mlKIRGENKG2811wstępny dla BEV (krok 3)
Bufor do barwienia białka FetoAbsciab.001.50Barwienie na niebiesko Coomassie w kroku 8.5.4
Bibuła filtracyjnaBiosharpBS-TFP-070BObserwacja morfologiczna dla BEV przy użyciu TEM w kroku 8.3 (Blotting the solution)
Siatki miedziane na podłożu Formvar/Carbon Sigma-AldrichTEM-FCF200CU50Obserwacja morfologiczna dla BEV przy użyciu TEM w kroku 8.3
Proszek HEPESMeilunbioMB6078Przygotuj jodiksanolu o różnych stężeniach do wirowania w gradionym gradieniu gęstości
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Fdbio scienceFDM007Western blotting (przeciwciało wtórne)
HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Fdbio naukaFDR007Western blotting (przeciwciało wtórne)
Wytrząsarka do inkubatoraQiangwenDHZ-LUprawa Escherichia coli 
Kimwipes&handel; Delikatne chusteczki do zadańKimtech Science34155Wytrzyj wewnętrzną ściankę probówki ultrawirówki w kroku 4.15
LB bulionHopebioHB0128Uprawiaj Escherichia coli 
Zamrażarka niskotemperaturowa (-80 ° C)HaierDW-86L338JPrzechowuj próbki
MetanolAlalddinM116118Stosowany w western blot do aktywacji membrany PVDF w kroku 8.5.5
Mikroprobówki 1,5 mlKIRGENKG2211Odzyskaj frakcje po odwirowaniu w gradionym gradimencie gęstości
Mikroprobówki 2 mlKIRGENKG2911Odzysk frakcji po wirowaniu w gradifikacji gęstości
Mikro probówki 5 mlBBIF610888-0001Odzyskiwanie frakcji po wirowaniu w gradiacji gradientu gęstości
Czytnik mikropłytek Thermo Fisher Multiskan MK3Pomiar zawartości białka w BEV na etapie 8.2
Filtr miliporowy 0,22 μ mMerck milliporeSLGP033RBFiltracja, sterylizacja; Materiał: polieterosulfon, PES
NaClGHTECH1.01307.040Roztwór do wirowania w gradiencie gęstości
NaOHGHTECH1.01394.068Roztwór wirujący w gradiencie gęstości (korekta pH)
Optima™ XPN-100Beckman CoulterA94469Ultrawirowanie do izolacji pojazdów typu BEV na etapie 4, 7
OptiPrep™Serumwerk Bernburg AG1893Roztwór podstawowy do wirowania w gradiacji gęstości
Wytrząsarka orbitalnaYouningCS-100Rozpuszczanie kału w kroku 2
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiProcellPB180327Rozpuszczanie kału w kroku 2
PipettorEppendorf3120000267, 3120000259Przenieś roztwór
Plastikowa pipeta PasteuraABCbioABC217003-4Usunąć supernatant podczas przetwarzania wstępnego na etapie 3.4
Membrany z polifluorku winylidenu (PVDF)MilliporeISEQ00010, IPVH00010Stosowany w western blotting do przenoszenia białek na etapie 8.5.5
Prefabrykowany żel poliakrylamidowy, 4– 20% 15 dołkówACEF15420GelStosowany w western blotting do separacji białek w kroku 8.5.2, 8.5.3
Pierwszorzędowy rozcieńczalnik przeciwciałFdbio scienceFD0040Stosowany w western blotting na etapie 8.5.8
Drabinka białkowaFdbio scienceFD0672Stosowany w western blotting i brylantowym niebieskim barwieniu Coomassie w kroku 8.5
Szybki roztwór do bibułowania białkamiUBIOUW0500Stosowany w western blotting do przenoszenia białka na kroku 8.5.5
Rotor SW 32 Ti Rotor z łyżką wahadłową BeckmanCoulter369650Ultrawirowanie do izolacji BEV na etapie 4, 7
Strzykawka 20 mL, 50 mL JetwayZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mLtransferowe i usuwają supernatant w procesie wstępnego przetwarzania
Proszek TBSFdbioscienceFD1021Używany w western blot na kroku 8.5
Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM)Hitachi H-7650Obserwacja morfologiczna dla BEV na kroku 8.3
Tween-20Fdbio scienceFD0020Używany w western blot na kroku 8.5
Probówka ultrawirówkowaBeckman326823, 355642Ultrawirowanie do izolacji BEV na etapie 4, 7
Ultra-czysta ławkaAIRTECHSW-CJ-2FDZapoznaj się z procedurami dotyczącymi obchodzenia się z cieczami
Kąpiel wodnaBluepardCU600Używany do pomiaru zawartości białka w BEV w kroku 8.2.5
ZetaViewParticle MetrixS/N 21-734, oprogramowanie ZetaView (wersja 8.05.14 SP7)Analiza śledzenia nanocząstek (NTA) do pomiaru wielkości cząstek i koncentracji BEV w kroku 8.4
Detektor mikropłytek Proces

Bibliografia

  1. Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
  2. Greenhalgh, K., Meyer, K. M., Aagaard, K. M., Wilmes, P. The human gut microbiome in health: establishment and resilience of microbiota over a lifetime. Environmental Microbiology. 18 (7), 2103-2116 (2016).
  3. de Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
  4. Zhou, P., Yang, D., Sun, D., Zhou, Y. Gut microbiome: New biomarkers in early screening of colorectal cancer. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 36 (5), 24359(2022).
  5. Paik, D., et al. Human gut bacteria produce Τ(Η)17-modulating bile acid metabolites. Nature. 603 (7903), 907-912 (2022).
  6. Parada Venegas, D., et al. Short chain fatty acids (SCFAs)-mediated gut epithelial and immune regulation and its relevance for inflammatory bowel diseases. Frontiers in Immunology. 10, 277(2019).
  7. Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The Gut microbiota and Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
  8. Morais, L. H., Schreiber, H. L. t, Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
  9. Kim, J. H., Lee, J., Park, J., Gho, Y. S. Gram-negative and Gram-positive bacterial extracellular vesicles. Seminars in Cell and Developmental Biology. 40, 97-104 (2015).
  10. Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
  11. Xie, J., Li, Q., Haesebrouck, F., Van Hoecke, L., Vandenbroucke, R. E. The tremendous biomedical potential of bacterial extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 40 (10), 1173-1194 (2022).
  12. Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  13. Northrop-Albrecht, E. J., Taylor, W. R., Huang, B. Q., Kisiel, J. B., Lucien, F. Assessment of extracellular vesicle isolation methods from human stool supernatant. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (4), 12208(2022).
  14. Park, Y. E., et al. Microbial changes in stool, saliva, serum, and urine before and after anti-TNF-α therapy in patients with inflammatory bowel diseases. Scientific Reports. 12 (1), 6359(2022).
  15. Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization. Nature Protocols. 15 (1), 40-67 (2020).
  16. Tulkens, J., et al. Increased levels of systemic LPS-positive bacterial extracellular vesicles in patients with intestinal barrier dysfunction. Gut. 69 (1), 191-193 (2020).
  17. Kang, C. S., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota, especially Akkermansia muciniphila, protect the progression of dextran sulfate sodium-induced colitis. PloS one. 8 (10), 76520(2013).
  18. Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
  19. Correll, V. L., et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12184(2022).
  20. Liang, X., et al. Gut bacterial extracellular vesicles: important players in regulating intestinal microenvironment. Gut Microbes. 14 (1), 2134689(2022).
  21. Alberti, G., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota in inflammatory bowel disease and colorectal cancer. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 165 (3), 233-240 (2021).
  22. Díez-Sainz, E., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Lorente-Cebrián, S. Effects of gut microbiota-derived extracellular vesicles on obesity and diabetes and their potential modulation through diet. Journal of Physiology and Biochemistry. 78 (2), 485-499 (2022).
  23. Lajqi, T., et al. Gut microbiota-derived small extracellular vesicles endorse memory-like inflammatory responses in murine neutrophils. Biomedicines. 10 (2), 442(2022).
  24. Lee, K. E., et al. The extracellular vesicle of gut microbial Paenalcaligenes hominis is a risk factor for vagus nerve-mediated cognitive impairment. Microbiome. 8 (1), 107(2020).
  25. Villard, A., Boursier, J., Andriantsitohaina, R. Bacterial and eukaryotic extracellular vesicles and nonalcoholic fatty liver disease: new players in the gut-liver axis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (4), G485-G495 (2021).
  26. Wei, S., et al. Outer membrane vesicles enhance tau phosphorylation and contribute to cognitive impairment. Journal of Cellular Physiology. 235 (5), 4843-4855 (2020).
  27. Bitto, N. J., Kaparakis-Liaskos, M. Methods of bacterial membrane vesicle production, purification, quantification, and examination of their immunogenic functions. Methods in Molecular Biology. 2523, 43-61 (2022).
  28. Stentz, R., Miquel-Clopés, A., Carding, S. R. Production, isolation, and characterization of bioengineered bacterial extracellular membrane vesicles derived from Bacteroides thetaiotaomicron and their use in vaccine development. Methods in Molecular Biology. 2414, 171-190 (2022).
  29. Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nature Protocols. 18 (5), 1462-1487 (2023).
  30. Iwai, K., Minamisawa, T., Suga, K., Yajima, Y., Shiba, K. Isolation of human salivary extracellular vesicles by iodixanol density gradient ultracentrifugation and their characterizations. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 30829(2016).
  31. Vandeputte, D., et al. Stool consistency is strongly associated with gut microbiota richness and composition, enterotypes and bacterial growth rates. Gut. 65 (1), 57-62 (2016).
  32. Wen, M., et al. Bacterial extracellular vesicles: A position paper by the Microbial Vesicles Task Force of the Chinese Society of Extracellular Vesicles. Interdisciplinary Medicine. 1, 12046(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja BEV z ka up cherzyki mikrobioty jelitowejoczyszczanie BEVultrawirowaniegradient jodiksanolowyodzysk cz stekanaliza zawarto ci bia ekludzkie pr bki ka u
Izolacja i oczyszczanie bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkiego kału za pomocą wirowania w gradiacji gęstości
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.