Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie eksplantatów ze skóry ptaków do badania wzorców tkanek i organogenezy

DOI:

10.3791/65580

⸱

15 września 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Keck School of Medicine of University of Southern California, 2Molecular and Computational Biology, University of Southern California, 3Department of Radiology, Keck School of Medicine of University of Southern California

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokoły dla trzech typów hodowli eksplantatów skóry embrionalnej ptaków, które mogą być użyte do badania interakcji tkankowych, obrazowania 4D filmu poklatkowego (3D plus czas), globalnych lub lokalnych zaburzeń funkcji molekularnych oraz charakterystyki biologii systemów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwijająca się skóra ptaków podczas embriogenezy to unikalny model, który może dostarczyć cennych informacji na temat wzorców tkanek. Opisano tutaj trzy warianty kultur eksplantatów skóry w celu zbadania różnych aspektów rozwoju skóry. Po pierwsze, hodowle narządów ex vivo i manipulacje nimi dają naukowcom możliwość bezpośredniej obserwacji i badania rozwoju pąków piór. Hodowla eksplantatów skóry może rosnąć przez 7 dni, umożliwiając bezpośrednią analizę zachowania komórek i obrazowanie 4D w odstępach czasu w tym okresie wzrostu. Pozwala to również na fizyczne i molekularne manipulacje warunkami hodowli w celu wizualizacji odpowiedzi tkanek. Na przykład koraliki pokryte czynnikiem wzrostu mogą być stosowane miejscowo, aby wywołać zmiany w układzie piór na ograniczonym obszarze. Alternatywnie, transdukcja wirusa może być dostarczana globalnie w pożywce hodowlanej w celu zwiększenia lub zmniejszenia ekspresji genów. Po drugie, protokół rekombinacji skóry pozwala naukowcom badać interakcje tkankowe między naskórkiem a mezenchymą, które pochodzą z różnych regionów skóry, różnych etapów życia lub różnych gatunków. Daje to możliwość przetestowania okna czasowego, w którym nabłonek jest kompetentny do reagowania na sygnały i jego zdolności do tworzenia różnych przydatków skóry w odpowiedzi na sygnały z różnych źródeł mezenchymalnych. Po trzecie, rekonstytucja skóry za pomocą zdysocjowanych komórek skóry właściwej pokrytych nienaruszonym nabłonkiem resetuje rozwój skóry i umożliwia badanie początkowych procesów okresowego wzorcowania. Takie podejście zwiększa również naszą zdolność do manipulowania ekspresją genów wśród zdysocjowanych komórek przed utworzeniem odtworzonego eksplantatu skóry. W tym artykule przedstawiono trzy protokoły hodowli i przykładowe eksperymenty, aby wykazać ich użyteczność.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój skóry ptasiego zarodka jest doskonałym modelem do badania mechanizmów morfogenezy ze względu na wyraźne wzorce i dostępność do mikrochirurgii i manipulacji1,2. Jednak ocena zdarzeń komórkowych i molekularnych w nienaruszonych tkankach może być trudna, ponieważ obecność obcych tkanek może komplikować obserwacje mikroskopowe. Co więcej, możliwość manipulowania ekspresją genów w celu zbadania ich roli w morfogenezie skóry nie zawsze jest prostym zadaniem. Odkryliśmy, że możemy testować funkcje genów za pomocą transdukcji retrowirusowej z wyższym wskaźnikiem powodzenia przy użyciu modeli eksplantatów skóry.....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla eksplantatów skóry kurczaka (Rysunek 1)

  1. Inkubuj zapłodnione jaja kurze w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 38 °C i ułóż je zgodnie z Hamburger i Hamilton14.
    1. Na etapie 28 (~E5.5) drugi palec kończyny i trzeci palec u nogi są dłuższe od pozostałych; trzy palce u nóg i cztery palce u nóg są różne.
    2. Na etapie 29 (~E6) skrzydło jest zgięte w łokciu; drugi palec jest wyraźnie dłuższy od pozostałych.
    3. Na etapie 30 (~E6.5) na poziomie ramienia widoczne są dwa rzędy pąków piór grzbietowych po obu stronach rdzenia krę....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kultury eksplantatów skóry
Rozwój pąków piór z hodowli narządów skóry ex vivo można obserwować bezpośrednio pod mikroskopem. Korzystając z modelu hodowli eksplantatów skóry kurczaka w stadium 30 na grzbiecie, plakody są widoczne wzdłuż linii środkowej. Front morfogenetyczny następnie stopniowo rozprzestrzenia się na boki w kierunku obrzeża skóry, tworząc nowe zawiązki piór. Te zawiązki piór rozwiną się w krótkie pąki piór po 2 dniach w hodowli i długie pąki piór po 4 dniach w hodowli (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinacja tkanek zapewnia test do zbadania unikalnego wkładu nabłonka i mezenchymy. U kurcząt pióra zaczynają się rozwijać w 7 dniu embrionalnym (E7), podczas gdy łuski zaczynają się w E9. Kiedy mezenchyma w skali E9 jest rekombinowana z nabłonkiem piór E7, zrekombinowana tkanka tworzy łuski, a gdy mezenchyma piór E7 jest rekombinowana z nabłonkiem w skali E9, powstają pióranabłonka 11. Badania te wykazały, że mezenchyma kontroluje formację wzorca, odstępy i tożsamość narządu. Oczywiście nabłon.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest wspierana przez NIH NIAMS grant R37 AR 060306, R01 AR 047364 i RO1 AR078050. Prace są również wspierane przez umowę badawczą o współpracy między USC a Chińskim Uniwersytetem Medycznym na Tajwanie. Dziękujemy klasie USC BISC 480 Developmental Biology 2023 za pomyślne przetestowanie tego protokołu hodowli skóry ptaków podczas kilku modułów laboratoryjnych.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynie do hodowli 6 dołków FalconREF 353502Kultury na granicy faz powietrze-ciecz (ALI)  
Wkładka do hodowli komórkowych SokółREF 353090.0,4 &mikro; m Przezroczysta membrana PET
Kolagenaza typu 1Worthington BiochemicalLS004196
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s średni Corning10-013-CV4,5 g/L glukozy
Kwas etylenodiaminotetraoctowy sól disodowa dwuwodna (EDTA)Sigma-AldrichE5134
Płodowa surowica bydlęcaThermoFisher16140-071
GlukozaSigma-AldrichG8270
Hanks' s buforowany roztwór soliGibco14170-112Bez wapnia, bez magnezu
Penicylina/streptomycyna Gibco15-140-122
Fosforan pogassium monobasic (KH2PO4)Sigma-AldrichP5379
Chlorek potasu (KCl)Sigma-AldrichP9333
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)Sigma-AldrichS6014
Chlorek sodu (Nacl)EMD CAS 7647-14-5
Fosforan sodu jednozasadowy (NaH2PO4)Sigma-AldrichS0751
TrypsynaGibco27250-042

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lucas, A. M., Stettenheim, P. R. Avian anatomy: Integument part I and part II. Agriculture Handbook. 362, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Washington D.C.. (1972).
  2. Sengel, P. In Morphogenesis of Skin, l-277. , Cambridge Univ. Press. New York. (1976).
  3. Dhouailly, D., Wilehm Roux,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Badanie organogenezyrozw j zawi zk w pi rhodowla ex vivorekombinacja sk ryoddzia ywanie nab onka z mezenchymrekonstrukcja sk rysk ra zarodka kurczakawzorzec periodyczny

Powiązane artykuły