Artykuł metodologiczny

Zacisk hiperglikemiczny i zacisk hipoglikemiczny u świadomych myszy

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65581

⸱

26 stycznia 2024

 , 
1Department of Neuroscience for Metabolic Control, Graduate School of Medical Science, Kumamoto University

W tym artykule

Podsumowanie

Zacisk hiperglikemiczny służy do pomiaru uwalniania insuliny przy utrzymującym się wyższym stężeniu glukozy we krwi. Zacisk hipoglikemiczny służy do pomiaru produkcji glukozy indukowanej reakcjami przeciwregulacyjnymi. Obie metody wykorzystują tę samą procedurę chirurgiczną. W tym miejscu przedstawiamy technikę zaciskową do oceny ogólnoustrojowego metabolizmu glukozy.

Streszczenie

Cukrzyca (DM) jest spowodowana niedostatecznym uwalnianiem insuliny z komórek β trzustki (Typ 1 DM) oraz wrażliwością na insulinę w mięśniach, wątrobie i tkance tłuszczowej (DM typu 2). Wstrzyknięcie insuliny leczy pacjentów z cukrzycą, ale prowadzi do hipoglikemii jako efektu ubocznego. Kortyzol i katecholaminy są uwalniane w celu aktywacji produkcji glukozy z wątroby w celu odzyskania hipoglikemii, zwanej reakcjami przeciwregulatorowymi (CRR). W badaniach nad cukrzycą z wykorzystaniem modeli gryzoni testy tolerancji glukozy i wstrzyknięcie 2-deoksy-glukozy są stosowane odpowiednio do pomiaru uwalniania insuliny i CRR. Jednak stężenie glukozy we krwi zmienia się uporczywie podczas eksperymentów, powodując trudności w ocenie uwalniania insuliny netto i CRR. W tym artykule opisano metodę, w której poziom glukozy we krwi jest utrzymywany na poziomie 250 mg/dl lub 50 mg/dl u świadomych myszy w celu porównania uwalniania odpowiednio insuliny i hormonów CRR.

Rurka polietylenowa jest wszczepiana do tętnicy szyjnej i żyły szyjnej myszy, a myszom pozwala się na powrót do zdrowia po operacji. Rurka żyły szyjnej jest podłączona do strzykawki Hamiltona z pompą strzykawkową, aby umożliwić infuzję insuliny lub glukozy ze stałą i zmienną szybkością. Rurka tętnicy szyjnej służy do pobierania krwi. W przypadku zacisku hiperglikemicznego 30% glukozy jest podawane do żyły, a poziom glukozy we krwi jest mierzony z krwi tętniczej co 5 minut lub 10 minut. Szybkość infuzji 30% glukozy zwiększa się, aż poziom glukozy we krwi osiągnie 250 mg/dl. Pobiera się krew w celu zmierzenia stężenia insuliny. W przypadku klamry hipoglikemicznej insulinę 10 mU/kg/min podaje się w infuzji razem z 30% glukozą, której szybkość infuzji jest zmienna, aby utrzymać poziom glukozy we krwi na poziomie 50 mg/dl. Krew jest pobierana w celu pomiaru hormonów przeciwregulacyjnych, gdy zarówno wlew glukozy, jak i poziom glukozy we krwi osiągają stan ustalony. Zarówno klamry hiperglikemiczne, jak i hipoglikemiczne mają tę samą procedurę chirurgiczną i konfiguracje eksperymentalne. Dlatego metoda ta jest przydatna dla badaczy ogólnoustrojowego metabolizmu glukozy.

Wprowadzenie

Glukoza jest ważnym źródłem energii dla komórek, a brak glukozy może prowadzić do różnych objawów i powikłań. W przypadku niskiego poziomu glukozy (hipoglikemia, zwykle poniżej 70 mg/dl poziomu glukozy we krwi na czczo, ale nie powinna być określana przez pojedynczą wartość1), najczęstszymi objawami są osłabienie, splątanie, pocenie się i ból głowy. Może również zaburzać funkcjonowanie mózgu i zwiększać ryzyko zdarzeń sercowo-naczyniowych i śmiertelności2. I odwrotnie, hiperglikemia jest stanem chorobowym, w którym stężenie glukozy w osoczu przekracza normalny poziom (zwykle > 126 mg/dl przy poziomie glukozy we krwi na czczo3). Może się to zdarzyć u osób z cukrzycą, które mają deficyt w produkcji lub wykorzystaniu insuliny. Hiperglikemia może prowadzić do cukrzycowej kwasicy ketonowej, która występuje, gdy organizm nie może wykorzystać glukozy jako energii, ale zamiast tego rozkłada kwasy tłuszczowe jako paliwo. Hiperglikemiczny stan hiperosmolarny również zwiększa śmiertelność4. Długotrwała hiperglikemia może powodować uszkodzenie naczyń krwionośnych, nerwów i narządów, prowadząc do rozwoju kilku przewlekłych powikłań, takich jak choroby układu krążenia, retinopatie i choroby nerek. W związku z tym stężenie glukozy we krwi musi być utrzymywane w wąskim zakresie od 100 mg/dl do 120 mg/dl.

Stężenie glukozy we krwi jest regulowane przez równowagę między wejściem i wyjściem glukozy w modelu jednokomorowym (Rysunek 1A). Wejście glukozy obejmuje glukozę wchłoniętą z pożywienia i produkcję glukozy z wątroby, nerek i jelita cienkiego. Wyrzut glukozy obejmuje wychwyt glukozy w tkankach i usuwanie glukozy z nerek. Zarówno ilość wprowadzanej, jak i wydalanej glukozy jest regulowana przez hormony endokrynne. Na przykład glukagon, kortykosteron i katecholaminy, znane jako hormony przeciwregulacyjne, są uwalniane, gdy poziom glukozy we krwi spada5. Stymulują rozkład glikogenu i syntezę glukozy, głównie z wątroby; Procesy te są znane odpowiednio jako glikogenoliza i glukoneogeneza. Hiperglikemia zwiększa uwalnianie insuliny z komórek β trzustki i stymuluje wychwyt glukozy w mięśniach, tkance tłuszczowej i sercu6,7,8,9. Ćwiczenia zwiększają wychwyt glukozy niezależny od insuliny10. Współczulny układ nerwowy zwiększa wychwyt glukozy w mięśniach i brunatnej tkance tłuszczowej6,11. Aby zmierzyć zdolność do regulowania metabolizmu glukozy w tkankach obwodowych, naukowcy zazwyczaj używają testu tolerancji glukozy (GTT) i testu tolerancji insuliny (ITT) (Rysunek 1B, C). W GTT należy wziąć pod uwagę dwa czynniki: uwalnianie insuliny i wrażliwość na insulinę (Rysunek 1B). Jednak krzywa stężenia glukozy podczas 120-minutowego testu jest inna u każdej myszy, co może wpływać na różne ilości uwalniania hormonów. W ITT poziom glukozy we krwi jest regulowany zarówno przez wrażliwość na insulinę, jak i uwalnianie hormonów przeciwregulacyjnych. W związku z tym trudno jest określić dokładne znaczenie metabolizmu glukozy, uwalniania insuliny i wrażliwości na insulinę w GTT i ITT, w sytuacjach, gdy poziom glukozy we krwi nie jest stały.

Aby przezwyciężyć te problemy, pożądane jest utrzymanie poziomu glukozy we krwi na stałym poziomie (lub "zacisk"). W zacisku hiperglikemicznym glukoza jest podawana do krwiobiegu w celu podniesienia poziomu glukozy we krwi do określonego poziomu, a następnie utrzymywana na tym poziomie przez pewien czas. Ilość podawanej glukozy w infuzji jest dostosowywana na podstawie pomiarów poziomu glukozy we krwi co 5-10 minut, aby utrzymać stały stan. Technika ta jest szczególnie przydatna do zrozumienia parametrów wydzielania insuliny przy zaciśniętym poziomie glukozy. Klamra hipoglikemiczna to metoda utrzymywania niskiego poziomu glukozy we krwi poprzez podawanie insuliny. Glukoza jest podawana w infuzji ze zmienną szybkością, aby utrzymać określony poziom glukozy we krwi. Jeśli mysz nie może wyzdrowieć z hipoglikemii, należy podać więcej glukozy.

Chociaż istnieje wiele zalet wykonywania zacisków hiperglikemicznych i hipoglikemicznych, procedury chirurgiczne i eksperymentalne są uważane za technicznie trudne. W związku z tym niewiele grup badawczych było w stanie to zrobić. Naszym celem było opisanie tych metod naukowcom z ograniczeniami finansowymi i kadrowymi, aby mogli rozpocząć te eksperymenty przy niższym budżecie.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Kumamoto.

UWAGA: Dla uśmierzenia bólu, ibuprofen podawano w wodzie pitnej (0,11 mg/mL) przez 48 godzin, a buprenorfinę (0,05-0,1 mg/kg i.p.) podawano 30 minut przed operacją. Sterylne warunki obejmują rękawiczki, maski i autoklawowane narzędzia sterylizowane tlenkiem etylenu między zwierzętami. Zabieg przeprowadzono na poduszce grzewczej ustawionej w temperaturze 37 °C i pokrytej nową matą laboratoryjną dla każdego zwierzęcia. Przed zabiegiem obszar operacyjny został oczyszczony roztworem betadyny i alkoholem. Wszystkie narzędzia chirurgiczne zostały wysterylizowane w autoklawie (na nie więcej niż dwie operacje). Przed wykonaniem nacięcia myszy zostały sprawdzone, aby upewnić się, że są w pełni znieczulone. Głębokość znieczulenia dla każdej myszy oceniano przed i w trakcie operacji za pomocą uszczypnięcia palca u nogi. Okres aklimatyzacji wynosił za każdym razem nie więcej niż 5 minut. Postępuj zgodnie z instrukcjami IACUC w danej instytucji.

1. Przygotowanie rurki do żyły szyjnej i tętnicy szyjnej

  1. Wysterylizuj wszystkie rurki, materiały polipropylenowe (np. końcówki pipet) i szwy za pomocą autoklawu lub tlenku etylenu. W przypadku żyły szyjnej połącz 8 cm rurki1 (patrz Materiały) i 3 cm rurki2 za pomocą kleju (Rysunek 2A). Umieść 2 mm rurki1 na górze, ponieważ rurka 2 (polietylen) jest zbyt twarda i może uszkodzić naczynia krwionośne (rurka 1.1).
  2. Rurka przedłużająca do żyły szyjnej (rurka 1.2) do infuzji glukozy i insuliny
    1. Przygotuj dwie rurki 30 cm i jedną rurkę 10 cm z rurką2 (Rysunek 2A). Odetnij ostry koniec końcówki pipety o pojemności 20 μl (lub czegokolwiek, co ma wąską końcówkę o średnicy zewnętrznej < 0,5 mm, aby połączyć ją z rurką 1,1) i umieść w niej trzy rurki2 (30 cm, 30 cm i 10 cm). Uszczelnij klejem samoprzylepnym.
    2. Umieść 5 cm rurki1 na drugim końcu rurki2.
  3. W przypadku tętnicy szyjnej (rurka 1.3): Rozciągnij rurkę2, aby była cieńsza. Połącz 8 cm rurki1 i 3 cm rozciągniętej rurki2 za pomocą kleju (Rysunek 2A). Zrób znak w odległości 9 mm od końcówki.
  4. Igła z nieostrym końcem, która łączy rurkę ze strzykawką: Wykonaj zadrapanie w pobliżu ostrego końca igły (23 G) metalowym pilnikiem, delikatnie zegnij ją kilka razy szczypcami w przód iw tył i złami. Wykonaj to samo nacięcie na środku igły, aby zrobić kawałek metalowego łącznika (Rysunek 2A).
  5. Rurka przedłużająca tętnicę do pobierania krwi (zestaw rurek 1.4): Połącz 10 cm rurki1 z metalowym łącznikiem i nieostrą igłą, która została wykonana w kroku 1.4.
    UWAGA: Wszystkie rurki i szwy są sterylizowane autoklawem lub tlenkiem etylenu

2. Chirurgia

  1. Znieczulić mysz izofluranem (1,5-2,0%) lub ketaminą/ksylazyną (ketamina 10 mg/ml, ksylazyna 1 mg/ml w 0,9% sterylnym roztworze soli fizjologicznej, 0,1 ml/10 g masy ciała (BW) poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe [ip]). Trzymaj mysz na ciepłej podkładce (37 °C), aby zmniejszyć stres fizyczny. Poczekaj na głębokie znieczulenie 5-10 min. Potwierdź głębokość znieczulenia za pomocą odruchu pedałowania, oddychania i tętna oraz reakcji na bodźce poprzez szczypanie palców. Podczas operacji należy użyć taśmy chirurgicznej, aby przymocować nasadkę na nos do stołu operacyjnego w celu ciągłego wdychania znieczulenia. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  2. Napełnij heparynizowaną sól fizjologiczną (100 U/ml) w rurkach 1.1 i 1.3 i połącz je strzykawką o pojemności 1 ml z nieostrą igłą (Rysunek 2B). Zamknij koniec rurki3 (patrz Tabela materiałów), topiąc go za pomocą lutownicy, która będzie używana jako nasadki do rurki1.1 i rurki1.3.
  3. Ogolić i wytrzeć pierwszy (międzyłopatkowy z tyłu) i drugi (szyja z przodu) obszar nacięcia trzema cyklami 10% betadyny, a następnie preparatem przedoperacyjnym ze sterylnym 70% alkoholem. Wykonaj małe pionowe nacięcie linii środkowej 5 mm głowowo do mostka, tępo wypreparuj tkanki i odsłoń tętnicę. Oddziel nerw błędny od tętnicy. Zmniejsza to negatywny wpływ usunięcia nerwu błędnego na metabolizm glukozy.
    UWAGA: Krok od nacięcia brzusznego do etapu, w którym cewnik jest wprowadzany do żyły i zabezpieczany jedwabnymi szwami, jest wykonywany pod mikroskopem.
  4. Umieść dwa jedwabne szwy pod tętnicą. Zatrzymaj przepływ krwi, zawiązując jeden szew ciasno po stronie czaszki (Rysunek 2C-1), a drugi luźno po stronie ogonowej (Rysunek 2C-2), co wystarczy, aby zatrzymać przepływ krwi, ale wystarczająco, aby otworzyć się ponownie później. Umieść jeszcze jeden szew pod tętnicą (Rysunek 2C-3).
  5. Przeciąć tętnicę w pobliżu Rysunek 2C-1 za pomocą nożyczek sprężynowych i umieścić rurkę 1.3 w tętnicy. Zrób luźny krawat zarówno na tętnicy, jak i rurce (Rysunek 2C-3, nie wiąż mocno. Rurka zostanie wprowadzona głębiej do tętnicy). Otwórz węzeł po stronie ogonowej (Rysunek 2C-2), aby włożyć rurkę, aż znak 9 mm dotrze do węzła pośrodku (Rysunek 2C-3). Bezpiecznie zawiąż wszystkie ligatury i spłucz heparynizowaną sterylną solą fizjologiczną.
  6. Odsłoń prawą żyłę szyjną z tego samego nacięcia, co prawa tętnica szyjna dla cewnika szyjnego. Odizoluj koniec czaszki i podwiąż go jedwabnym szwem (Rysunek 2D-1, Tabela materiałów). Umieść kolejny kawałek szwu na ogonowym końcu odsłoniętej żyły (Rysunek 2D-2). Przetnij żyłę w pobliżu znaku Rysunek 2D-1 za pomocą nożyczek sprężynowych.
  7. Włóż cewnik (niezbyt głęboko, aby zapobiec przenikaniu do naczyń), zawiąż go i potwierdź wizualnie, że pobiera próbki krwi. Przepłukać heparynizowanym sterylnym roztworem soli fizjologicznej (0,2 ml) i wizualnie potwierdzić, że w cewniku nie pozostała krew.
  8. Umieść mysz na nowej sterylnej serwety chirurgicznej, aby zapobiec infekcji z pierwszej rany. Odwróć mysz, przetrzyj trzema cyklami betadyny, a następnie preparatem przedoperacyjnym sterylnym alkoholem i wykonaj małe nacięcie między łopatkami.
  9. Przełóż uchwyt igły pod skórą od nacięcia na grzbiecie do strony brzusznej. Zacisnąć cewniki za pomocą uchwytu igły, wprowadzić je pod skórę i przynieść z powrotem. Oczyść miejsce nacięcia i zamknij nacięcia brzuszne szwem syntetycznym (średnica 0,15-0,2 mm). Zacisnąć cewnik żylny za pomocą mikro serrefine w miejscu nacięcia między łopatkami.
  10. Przeciąć cewnik 1 cm powyżej zacisku, przepłukać go heparynizowaną solą fizjologiczną i zamknąć nasadką (krok 2.4). Postępuj zgodnie z tą samą procedurą dla cewnika tętniczego. Zamknij nacięcie grzbietowe syntetycznym szwem (średnica 0,15-0,2 mm).
  11. Umieść mysz w ciepłej, czystej klatce (Rysunek 2E). Codziennie wykonuj opiekę pooperacyjną.

3. Odzyskiwanie

  1. Mysz należy trzymać pojedynczo, ponieważ inna mysz może ugryźć cewnik w obudowie grupowej.
    1. Aby zmniejszyć stres związany z izolacją społeczną, trzymaj myszy ze wzbogaceniami środowiskowymi (np. schronieniami). Codziennie wykonuj opiekę pooperacyjną. Aby złagodzić ból, niepokój i dyskomfort, zapewnij opiekę pooperacyjną, w tym analgezję (ibuprofen w wodzie do picia (0,11 mg/ml).
    2. Obserwuj myszy pod kątem oznak infekcji, takich jak ropienie, letarg lub ból w miejscu nacięcia. Większość zdrowych myszy zaczyna chodzić i jeść około 2 godziny po zabiegu. Zgarbiona postawa, potargana sierść i zmniejszone spożycie pokarmu mogą wskazywać na ból. Jeśli te objawy zostaną zaobserwowane, natychmiast poddaj myszy eutanazji, odcinając im głowy w głębokim znieczuleniu lub uduszeniu dwutlenkiem węgla.
  2. Krew dostanie się do cewnika w tętnicy i utworzy skrzep. Aby utrzymać linie cewnika, należy codziennie usuwać skrzep, wykonując kroki 3-6.
  3. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml i igłę 23 G (nieostry koniec) heparynizowaną solą fizjologiczną (100 j./ml). Korzystając z komory indukcyjnej, lekko znieczul mysz izofluranem (1,0%-1,5%). Następnie wyjmij mysz z komory i wykonaj usuwanie skrzepów w znieczuleniu izofluranem za pomocą nasadki na nos.
  4. Zaciśnij rurkę tętnicy z tyłu myszy za pomocą mikro serrefine, zdejmij nasadkę i usuń krew i skrzepy. Przepłukać cewnik heparynizowaną solą fizjologiczną za pomocą kolejnej strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 23 G (nieostry koniec) i ponownie go zamknąć. Oczyść linię żylną jak linię tętniczą w przypadku ciężkiego krzepnięcia.
  5. Wykonaj tę samą procedurę, aby wyczyścić cewnik raz dziennie przez 3-5 dni.
  6. Sprawdź masę ciała myszy. Jeśli masa ciała zmniejszy się o więcej niż 10% od dnia operacji, zastosuj leczenie wspomagające i spróbuj poprawić normalną ocenę kondycji ciała, a następnie użyj myszy do kolejnego eksperymentu.
    UWAGA: Utrata masy ciała zwierząt wyniosła mniej niż 10% w eksperymentach w tym badaniu. Utrata masy ciała silnie wpłynie na ogólnoustrojowy metabolizm glukozy. Dlatego zaleca się poczekanie na odzyskanie masy ciała lub usunięcie z eksperymentu z zaciskiem.

4. Ustaw system pompy (dla zacisku hipoglikemicznego)

  1. Przygotuj 1 j./ml insuliny w 0,1% soli fizjologicznej BSA, 30% glukozy w soli fizjologicznej i soli fizjologicznej heparynizowanej.
  2. Zmierz masę ciała myszy. Obliczyć objętość 1 j.m./ml insuliny do wytworzenia infuzji insuliny (10 mU/kg/min). Wlej 1,7 μl / min roztworu insuliny myszom w eksperymencie zaciskowym. Aby wytworzyć 300 μl infuzji insuliny, wymagana objętość dla 1 U/ml insuliny (μL) wynosi 2,647 (μL/g) x masa ciała (g). Objętość 300 μl infuzji insuliny wystarcza do zakończenia eksperymentu z zaciskiem na 1 myszy. Tabela 1 przedstawia przykład wytwarzania wlewu insuliny.
  3. Napełnij infuzję insuliny i 30% glukozy do każdej strzykawki Hamiltona, połącz je rurką 1.2 i ustaw strzykawkę na pompie strzykawkowej (Rysunek 3A). Napełnić każdy roztwór rurką 1.2. Napełnij solą fizjologiczną strzykawkę o pojemności 1 ml i zestaw rurek 1.4 (Rysunek 2A).
  4. Znieczulij mysz izofluranem (1,0%-1,5%) i podłącz rurkę 1,2 do cewnika żylnego, a zestaw rurek 1,4 do cewnika tętniczego (Rysunek 3A). Użyj taśmy celofanowej, aby utrzymać rurki razem.
  5. Umieść mysz w pustej zlewce o pojemności 500 ml.
    UWAGA: W przypadku zacisku hiperglikemicznego użyj soli fizjologicznej zamiast 1 U/ml insuliny.

5. Zacisk hipoglikemiczny

  1. Mierz poziom glukozy we krwi co 5-10 minut, jak pokazano w Rysunek 3B, i pobieraj próbki krwi do pomiarów hormonów po -15 min, 10 min, 20 min, 40 min, 60 min, 80 min, 100 min i 120 min. Postępuj zgodnie z krokiem 5.2, aby zmierzyć poziom glukozy we krwi.
    UWAGA: Nie jest konieczne mierzenie stężenia glukozy we krwi we wszystkich punktach czasowych, ale zaleca się mierzenie go co najmniej co 10 minut. Mierz poziom glukozy we krwi co 5 minut, gdy jego poziom i szybkość infuzji glukozy nie są stałe.
  2. Zacisnąć górny koniec zestawu rurek 1.4 i podłączyć nową strzykawkę, pobrać 50 μl krwi i umieścić ją w probówce o pojemności 1.5 ml do umycia. Zmierz poziom glukozy we krwi.
    UWAGA: Jest to krew rozcieńczona roztworem soli fizjologicznej w probówce w wyniku przemycia cewnika po poprzednim pobraniu próbki. Objętość 50 μl wystarczy, aby zastąpić rozcieńczoną krew czystą krwią.
  3. Przechowywać rozcieńczoną krew (czerwone krwinki). Przemyj zebraną krew (~500 μL) solą fizjologiczną (patrz kroki 5.11-5.12) i wróć do organizmu, aby zapobiec niedotlenieniu.
  4. Cewnik jest połączony z tętnicą przy wysokim ciśnieniu krwi, więc gdy zacisk zostanie poluzowany, krew wypłynie i zostanie użyta do pomiaru glukozy za pomocą poręcznego glukometru. Wlej 50 μl soli fizjologicznej, aby utrzymać wystarczającą ilość płynu krwi.
  5. W celu pobrania próbki krwi należy pobrać dodatkowe 50 μl krwi i umieścić ją w probówce o pojemności 1,5 ml na lodzie. Wlać 100 μl (50 μl zamiennika + 50 μl pobierania próbek) soli fizjologicznej.
  6. Po 0 minutach pomiaru stężenia glukozy we krwi uruchomić pompę strzykawki insulinowej. Najpierw podawać w infuzji 30 mU/kg/min w bolusie przez 2 minuty (5,1 μL/min), a następnie 10 mU/kg/min (1,7 μL/min) infuzji przez pozostałą część czasu.
  7. Zmierz poziom glukozy we krwi i zmieniaj szybkość wlewu glukozy co 5-10 minut przez 120 minut.
  8. Stwórz stan stacjonarny, w którym szybkość wlewu glukozy nie zmienia się, a poziom glukozy we krwi wynosi 50 mg/dl.
  9. Po pobraniu próbki krwi po t = 120 min wprowadzić środek do eutanazji do żyły szyjnej i pobrać tkanki do analizy RNA lub białka.
  10. Odwirować krew o sile 1000 x g przez 5 minut i zmierzyć stężenie hormonów, takich jak insulina lub peptyd c, za pomocą zestawu ELISA zgodnie z protokołem producenta.
  11. Do przemywania krwi odwirować krew o stężeniu 1000 x g przez 3 min. Usunąć supernatant, dodać 500 μl heparynizowanego roztworu soli fizjologicznej i wykonać pipetowanie.
  12. Powtórzyć płukanie ponownie i umieścić umyte czerwone krwinki w strzykawce o pojemności 1 ml na tętnicę. Komórki krwi zostaną ponownie wprowadzone automatycznie po podaniu 50 lub 100 μl soli fizjologicznej w krokach 5.2 i 5.3. Uważnie monitoruj hematokryt, aby zapobiec niedotlenieniu.
    UWAGA: Do pomiaru stężenia glukozy we krwi użyto komercyjnego poręcznego glukometru.

6. Zacisk hiperglikemiczny

  1. Postępuj zgodnie z instrukcjami techniki zacisku hipoglikemicznego, ale bez wlewu insuliny i z poziomem glukozy we krwi dostosowanym do 250-300 mg/dl. Mierz poziom glukozy we krwi co 5-10 minut, jak pokazano w Rysunek 3B, i zbieraj próbki krwi do pomiarów hormonów po -15 min, 10 min, 20 min, 40 min, 60 min, 80 min, 100 min i 120 min.
  2. Podłącz nową strzykawkę do zestawu rurek 1.4, odciągnij 50 μl krwi i umieść ją w probówce o pojemności 1.5 ml do umycia.
  3. W celu pobrania próbki krwi należy pobrać dodatkowe 50 μl krwi i umieścić ją w probówce o pojemności 1,5 ml na lodzie. Wlać 100 μl (50 μl zamiennika + 50 μl pobierania próbek) soli fizjologicznej.
  4. Po 0 minutach pomiaru stężenia glukozy we krwi uruchomić pompę strzykawkową do glukozy. Najpierw podawać w bolusie 30 g/kg/min przez 2 minuty (5,1 μl/min), a następnie 10 g/kg/min (1,7 μl/min) przez pozostałą część czasu.
  5. Zmierz poziom glukozy we krwi i zmieniaj szybkość infuzji glukozy co 5 -10 minut przez 120 minut. Stwórz stan stacjonarny, w którym szybkość wlewu glukozy nie zmienia się, a poziom glukozy we krwi wynosi 250-300 mg/dl, stan hiperglikemii zaciśniętej.

Wyniki

Badanie zacisku hipoglikemicznego przeprowadzono u samców myszy C57BL/6N (8 tygodni, masa ciała powyżej 25 g), które na początku eksperymentu były na 3-godzinnej głodówce (Rycina 4A,B). Początkowy poziom glukozy we krwi wynosił 136 mg/dL (t = -15 min). Jeśli wartość ta jest niższa niż 90 mg/dL, może to wynikać z nieprawidłowego przebiegu operacji, zbyt głębokiego wprowadzenia cewnika tętniczego lub przedostania się skrzepów krwi do krwiobiegu. Stan myszy po operacji wpływa na jej metabolizm energetyczny. Fizjologicznego metabolizmu glukozy nie można mierzyć w przypadku złego stanu zdrowia zwierzęcia. Myszy C57BL są bardziej podatne na krzepnięcie po operacji; myszy o większej masie ciała, takie jak szczepy FVB lub ICR, rzadziej tracą wagę z powodu wypłukiwania skrzepów po zabiegu. Dlatego dla osób początkujących lepsze do ćwiczenia procedur zaciskowych są myszy FVB. Myszy C57BL wymagają bardziej intensywnej opieki. Wprowadzenie cewnika o długości 9 mm do tętnicy nie sprawiło nam żadnych problemów podczas pobierania krwi, nawet u myszy FVB i ICR. Podawanie insuliny rozpoczęto w t = 0 min, co spowodowało spadek poziomu glukozy we krwi (Rycina 4A). GIR nie był stabilny między t = 0 min a t = 70 min. Następnie, po 80 min, osiągnięto stan stacjonarny.

Badanie zacisku hiperglikemicznego przeprowadzono również u samców myszy C57BL/6N (w wieku 8 tygodni, masa ciała powyżej 25 g), które na początku eksperymentu pozostawały bez pokarmu przez 3 h (Rysunek 4C,D). Po zmierzeniu poziomu glukozy we krwi i pobraniu próbek krwi w t = -15 i t = -5 min, od t = 0 min rozpoczęto infuzję glukozy. Poziom glukozy we krwi osiągnął 250 mg/dL w t = 40 min. Stan stacjonarny utrzymywał się od t = 30 min do końca badania.

Schemat metabolizmu glukozy; równania ΣFx=0, MA=0; test tolerancji glukozy; wykresy danych.
Rycina 1: Regulacja poziomu glukozy we krwi. (A) Schemat koncepcyjny ilustrujący regulację glukozy we krwi w organizmie. (B,C) Regulacja metabolizmu glukozy w (B) teście tolerancji glukozy (GTT) i (C) teście tolerancji insuliny (ITT). Na poziom glukozy we krwi wpływa wiele czynników. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat układu drenów chirurgicznych ze strzykawkami i procedura chirurgiczna u gryzoni w celu podawania płynów.
Rycina 2: Przygotowanie drenów i etapy operacji. (A) Zdjęcia drenów do tętnicy szyjnej i żyły szyjnej. Numery drenów odpowiadają numerom kroków protokołu. (B) Metoda przygotowania drenów do operacji. (C, D) Ponumerowane pozycje, w których wiązane są nici jedwabne w celu wprowadzenia cewnika do (C) tętnicy i (D) żyły. Pozycje nici jedwabnych po stronie kranialnej (C-(1)) i kaudalnej tętnicy (C-(2)), oraz jedna dodatkowa pomiędzy nimi (C-(3)) (procedura 2-4). Pozycje nici jedwabnych po stronie kranialnej (D-(1)) i kaudalnej żyły (D-(2)), oraz jedna dodatkowa pomiędzy nimi (D-(3)) (procedura 2-6). (E) Schemat kaniul tętniczych i żylnych wychodzących z tyłu Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat eksperymentu z wlewem insuliny z układem strzykawek i tabelą danych do pomiaru glukozy.
Rysunek 3: Konfiguracja zacisku (clamp). (A) Schemat przedstawiający układ drenów, pomp, strzykawek oraz myszy. (B) Arkusz do zapisywania poziomów glukozy we krwi i szybkości wlewu glukozy. 50 μL krwi pobierano w t = -15 min, 10 min, 20 min, 40 min, 60 min, 80 min, 100 min i 120 min. Szybkość wlewu insuliny wynosiła 5,1 μL/min od t = 0 do 2 min, a następnie zmieniła się na 1,7 w t = 2 min. Poziom glukozy we krwi mierzono co 10 min. Poziom glukozy we krwi mierzono co 5 min w przypadku braku stabilizacji jej wartości. Szybkość wlewu glukozy zmieniano po każdym pomiarze poziomu glukozy we krwi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki clampu hipoglikemicznego i hiperglikemicznego, glukoza we krwi, szybkości wlewu glukozy, wykresy naukowe.
Rycina 4: Reprezentatywne wyniki clampu hipoglikemicznego i clampu hiperglikemicznego. (A) Poziomy glukozy we krwi i (B) szybkość wlewu glukozy podczas clampu hipoglikemicznego. (C) Poziomy glukozy we krwi i (D) szybkość wlewu glukozy podczas clampu hiperglikemicznego. Dane przedstawiają średnią ± SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

RoztwórObliczeniaDla myszy o masie 20 g
1 U/mL insuliny(2,647 x masa ciała) μL52.9 μL
solanka z 0,1% BSA300 μL - objętość insuliny (μL)247.1 μL

Tabela 1: Przykład obliczeń dla przygotowania infuzji insuliny.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda jest prosta, można ją wykonać za pomocą końcówek do pipet, strzykawek i innych przedmiotów znajdujących się w zwykłych laboratoriach. Chociaż naukowcy mogą być zmuszeni do zakupu dodatkowych rurek i pomp, drogi sprzęt nie jest potrzebny. Tak więc ten protokół cewnikowania i zacisku jest łatwiejszy do rozpoczęcia w porównaniu z poprzednimi raportami 12,13,14.

Technika zacisku została opracowana około 1970 roku i była stosowana u myszy i ludzi15. Jest to przydatna metoda dokładnego pomiaru metabolizmu glukozy i mówi się, że jest złotym standardem. Nie jest to jednak powszechna technika stosowana przez wielu badaczy. Technika zacisku hiperinsulinemiczno-euglikemicznego została opisana u myszy13 i szczurów14, ale metoda cewnikowania jest tutaj inna, a czytelnicy mogą wybrać łatwiejszą do swoich eksperymentów. Jednym z celów tego artykułu jest zmniejszenie przeszkód związanych z rozpoczęciem eksperymentu. W związku z tym podaliśmy szczegółowe informacje na temat materiałów, z których wykonane są ręcznie wykonywane cewniki, zabiegi chirurgiczne oraz przykładowy przebieg eksperymentu. Są one pouczające dla badacza, który próbuje wykonać zacisk po raz pierwszy.

Wydzielanie insuliny w otyłości i cukrzycy jest zależne od etapu choroby. Wiele doniesień sugeruje, że wydzielanie insuliny jest zwiększone w otyłości w celu obniżenia poziomu glukozy we krwi w stanie insulinooporności16, ale funkcja komórek β zostanie uszkodzona w DM typu 217,18. W rzeczywistości doniesiono, że liczba i obszar wysp trzustkowych i wydzielanie insuliny są zwiększone w modelach myszy otyłych, takich jak myszy karmione dietą wysokotłuszczową19 lub myszy z niedoborem leptyny20. W tych modelach mysich, które mają oczywisty fenotyp, różnice można określić, badając poziom insuliny we krwi 15-30 minut po podaniu glukozy w GTT. Jednak w niektórych przypadkach nie jest łatwo określić różnice w wydzielaniu insuliny. Na przykład, jeśli myszy transgeniczne (Tg) mają poziom glukozy we krwi 500 mg / dl, podczas gdy mysz WT ma 300 mg / dl i obie myszy mają ten sam poziom insuliny we krwi, czy możemy powiedzieć, że wydzielanie insuliny zmniejsza się w Tg? W tym przypadku nie możemy porównać zdolności wydzielania insuliny, chyba że poziom glukozy we krwi jest taki sam przy użyciu przedstawionej tutaj metody. Jest to jeden z powodów, dla których nie ma ustalonej teorii na temat tego, kiedy funkcja komórek β zaczyna się pogarszać w procesie przechodzenia od otyłości do cukrzycy. Możemy również zmierzyć wydzielanie insuliny za pomocą pierwotnego posiewu trzustki21 lub ex vivo22. Zrujnuje to jednak wpływ ośrodkowego układu nerwowego na uwalnianie insuliny, ponieważ unerwienie nerwu błędnego zostanie usunięte. Poabsorpcyjne wydzielanie insuliny jest dobrze znane, ale mózg i autonomiczny układ nerwowy również regulują uwalnianie insuliny23. Eksperyment mający na celu analizę tych ostatnich powinien być przeprowadzony w nieznieczulonym, nieskrępowanym, bezbolesnym pobraniu krwi. Z tego powodu nerw błędny musi zostać oddzielony od tętnicy szyjnej w kroku 2.3.

Doniesiono, że cukrzyca powoduje hiperglikemię z powodu insulinooporności i zwiększonego wydzielania glukagonu24 i innych hormonów przeciwregulacyjnych25. Ponadto powtarzające się epizody hipoglikemii u ludzi z cukrzycą spowodowane nieprawidłowym dawkowaniem insuliny lub innymi przyczynami mogą prowadzić do stanu zwanego nawracającą hipoglikemią, w którym pacjenci są podatni na hipoglikemię26. Sugeruje się, że tempo spadku glikemii w zacisku hipoglikemicznym wpływa na obwodowe lub centralne wykrywanie hipoglikemii27. Powolny początek hipoglikemii może być odpowiedni do badania roli czujników glukozy w żyłach wrotno-krezkowych, podczas gdy bardzo szybki spadek stężenia glukozy we krwi może być odpowiedni do badania czujników glukozy w mózgu27. 1 U/ml Insulina jest stosowana u szczupłych myszy C57BL. Ale wyższe stężenie insuliny będzie potrzebne u otyłych myszy, ponieważ mają one insulinooporność, a 1 U/ml nie wystarczy, aby obniżyć poziom glukozy we krwi.

W jednokompartmentowym modelu puli glukozy we krwi (ryc. 1A) ilość wchłoniętej glukozy może wpływać na szybkość wprowadzania glukozy14. Tak więc na tempo produkcji glukozy, jeden z głównych celów pomiaru zacisku hiperinsulinemiczno-euglikemicznego, może mieć wpływ czas trwania postu. Jednak długi czas postu może zwiększyć uwalnianie hormonów przeciwregulacyjnych. W związku z tym badacze ustalają czas postu zgodnie z celem swojej analizy. Inna metoda zacisku obejmuje pobieranie krwi z ogona, co jest proste, ponieważ wystarczy wprowadzić kaniulę dożylną14. Jednak krew jest zbierana w unieruchomieniu, co powoduje umiarkowany stres związany z unieruchomieniem i wzrost katecholamin i innych hormonów stresu w osoczu14. Ponadto lepiej jest mierzyć stężenie hormonów w przepływie krwi w centrum ciała, a nie we krwi na kończynach. Dlatego pobieranie próbek krwi z tętnic u myszy poruszających się jest najlepsze do fizjologicznego pomiaru metabolizmu glukozy. Myszy nie poruszają się, a obracanie nie jest potrzebne, gdy są zaaklimatyzowane w środowisku eksperymentalnym. Zaleca się jednak użycie krętlika, aby zapobiec splątaniu przewodów infuzyjnych i do pobierania próbek. Przewody 1.2 i zestaw węży 1.4 (Rysunek 3A) nie nadają się do używania krętlika. System powinien zostać ulepszony, jeśli badacz musi używać krętlika. Refuzja komórek krwi nie wpływa na ustalony stan stacjonarny stężenia glukozy we krwi i insuliny. Obecna metoda może być również zastosowana do badań metabolomicznych z wykorzystaniem izotopów. Na przykład, jeśli 13C-glukoza jest stale podawana do żyły, można zmierzyć ogólnoustrojową szybkość obrotu metabolicznego i wewnątrzkomórkowe metabolity pośrednie28. Jest to więc przydatna metoda analizy metabolizmu glukozy.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Inicjatywę Wiodącą dla Doskonałych Młodych Badaczy (z MEXT); Grant-in-Aid na Badania Naukowe (B) (Numer Grantu JP21H02352); Japońska Agencja Badań i Rozwoju Medycznego (AMED-RPIME, numer grantu JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h9901); Fundacja Pamięci Uehara; Fundacja Astellas na rzecz Badań nad Zaburzeniami Metabolicznymi; Suzuken Memorial Foundation, Akiyama Life Science Foundation oraz Narishige Neuroscience Research Foundation. Dziękujemy również dr Nur Farehan Asgar za zredagowanie szkicu tego manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Klej klejącyHenkel AG & Co. KGaALOCTITE 454
Zestaw ELISA (peptyd C)Morinaga Institute of Bilogical Science IncM1304Mysi zestaw ELISA z peptydem
Zestaw ELISA (insulina)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation633-03411Zestaw ELISA do insuliny dla myszy LBIS (typ U)
Poręczny glukometrNipro Co.11-777Insulina Free Style Freedom Lite
(100U/ml)Eli Lilly & Co.428021014Humulin R (100U/ml)
MyszJaponia SLC Inc.C57BL / 6NCrSlcC57BL
SzewNatsume seisakushoC-23S-560 No.2Sterylizowane
pomp strzykawkowychInc.NE-1000
Szew syntetycznyVÖ Rurki MELHR-171
AS ONE Corporation9-869-01Rurki silikonowe LABORAN(R)
2Fisher Scientific427400BD Rurki PE Intramedic3
IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.rozmiar5Rurka polietylenowa rozmiar5
C systemy

Bibliografia

  1. Seaquist, E. R., et al. Hypoglycemia and diabetes: A report of a workgroup of the american diabetes association and the endocrine society. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (5), 1845-1859 (2013).
  2. Amiel, S. A., et al. Hypoglycaemia, cardiovascular disease, and mortality in diabetes: epidemiology, pathogenesis, and management. The Lancet Diabetes and Endocrinology. 7 (5), 385-396 (2019).
  3. Leanne Riley Mean fasting blood glucose. , World Health Organisation. https://www.who.int/data/gho/indicator-metadata-registry/imr-details/2380 (2022).
  4. Umpierrez, G., Korytkowski, M. Diabetic emergencies-ketoacidosis, hyperglycaemic hyperosmolar state and hypoglycaemia. Nature Reviews Endocrinology. 12 (4), 222-232 (2016).
  5. Sprague, J. E., Arbeláez, A. M. Glucose counterregulatory responses to hypoglycemia. Pediatric Endocrinology Reviews. 9 (1), 463-473 (2011).
  6. Toda, C., et al. Distinct effects of leptin and a melanocortin receptor agonist injected into medial hypothalamic nuclei on glucose uptake in peripheral tissues. Diabetes. 58 (12), 2757-2765 (2009).
  7. Toda, C., et al. Extracellular signal-regulated kinase in the ventromedial hypothalamus mediates leptin-Induced glucose uptake in red-type skeletal muscle. Diabetes. 62 (7), 2295-2307 (2013).
  8. Toda, C., Kim, J. D., Impellizzeri, D., Cuzzocrea, S., Liu, Z. -W., Diano, S. UCP2 regulates mitochondrial fission and ventromedial nucleus control of glucose responsiveness. Cell. 164 (5), 872-883 (2016).
  9. Lee, M. L., et al. Prostaglandin in the ventromedial hypothalamus regulates peripheral glucose metabolism. Nature Communications. 12 (1), 2330(2021).
  10. Jessen, N., Goodyear, L. J. Contraction signaling to glucose transport in skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 99 (1), 330-337 (2005).
  11. Shiuchi, T., et al. Induction of glucose uptake in skeletal muscle by central leptin is mediated by muscle β2-adrenergic receptor but not by AMPK. Scientific Reports. 7 (1), 15141(2017).
  12. Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 57, e3188(2011).
  13. Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp in the conscious rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 48, e2432(2010).
  14. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
  15. DeFronzo, R. A., Soman, V., Sherwin, R. S., Hendler, R., Felig, P. Insulin binding to monocytes and insulin action in human obesity, starvation, and refeeding. Journal of Clinical Investigation. 62 (1), 204-213 (1978).
  16. Czech, M. P. Insulin action and resistance in obesity and type 2 diabetes. Nature Medicine. 23 (7), 804-814 (2017).
  17. Saisho, Y. β-cell dysfunction: Its critical role in prevention and management of type 2 diabetes. World Journal of Diabetes. 6 (1), 109(2015).
  18. Mittendorfer, B., Patterson, B. W., Smith, G. I., Yoshino, M., Klein, S. β Cell function and plasma insulin clearance in people with obesity and different glycemic status. Journal of Clinical Investigation. 132 (3), 154068(2022).
  19. Nchienzia, H., et al. Hedgehog interacting protein (Hhip) regulates insulin secretion in mice fed high fat diets. Scientific reports. 9 (1), 11183(2019).
  20. Tomita, T., Doull, V., Pollock, H. G., Krizsan, D. Pancreatic islets of obese hyperglycemic mice (ob/ob). Pancreas. 7 (3), 367-375 (1992).
  21. Uchida, K., et al. Lack of TRPM2 impaired insulin secretion and glucose metabolisms in mice. Diabetes. 60 (1), 119-126 (2011).
  22. Zhu, Y. X., Zhou, Y. C., Zhang, Y., Sun, P., Chang, X. A., Han, X. Protocol for in vivo and ex vivo assessments of glucose-stimulated insulin secretion in mouse islet β cells. STAR Protocols. 2 (3), 100728(2021).
  23. Moullé, V. S. Autonomic control of pancreatic beta cells: What is known on the regulation of insulin secretion and beta-cell proliferation in rodents and humans. Peptides. 148, 170709(2022).
  24. Honzawa, N., Fujimoto, K., Kitamura, T. Cell autonomous dysfunction and insulin resistance in pancreatic α cells. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3699(2019).
  25. Siddiqui, A., Madhu, S. V., Sharma, S. B., Desai, N. G. Endocrine stress responses and risk of type 2 diabetes mellitus. Stress. 18 (5), 498-506 (2015).
  26. Chan, O., Sherwin, R. Influence of VMH fuel sensing on hypoglycemic responses. Trends in Endocrinology & Metabolism. 24 (12), 616-624 (2013).
  27. Donovan, C. M., Watts, A. G. Peripheral and central glucose sensing in hypoglycemic detection. Physiology. 29 (5), 314-324 (2014).
  28. TeSlaa, T., et al. The source of glycolytic intermediates in mammalian tissues. Cell Metabolism. 33 (2), 367-378.e5 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Regulacja poziomu glukozy we krwiwra liwo na insulinodpowiedzi kontrregulacyjneinfuzja glukozycewnik y y szyjnejcewnik t tnicy szyjnejmetabolizm glukozy
Zacisk hiperglikemiczny i zacisk hipoglikemiczny u świadomych myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.