Przedstawiona tutaj jest metoda badania struktur lipidowych poprzez znakowanie stabilnych izotopów przy użyciu czasu ich retencji, mobilności i fragmentacji.
Artykuł metodologiczny
Śledzenie lipidów de novo przy użyciu znakowania stabilnych izotopów LC-TIMS-TOF MS/MS
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Lipidy są bardzo różnorodne, a niewielkie zmiany w strukturze i składzie lipidów mogą mieć głęboki wpływ na krytyczne funkcje biologiczne. Znakowanie stabilnych izotopów (SIL) oferuje kilka korzyści w badaniu dystrybucji, mobilizacji i metabolizmu lipidów, a także syntezy lipidów de novo. Pomyślne wdrożenie techniki SIL wymaga usunięcia zakłóceń z cząsteczek endogennych. W niniejszej pracy opisano wysokoprzepustowy protokół analityczny do badań przesiewowych lipidów SIL z próbek biologicznych; Przedstawione zostaną przykłady identyfikacji lipidów de novo podczas rozwoju jajników komara. Zastosowanie komplementarnej chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas pozwala na separację i przypisanie lipidów z pojedynczej próbki w jednym skanie (<1 h). Opisane podejście wykorzystuje najnowsze osiągnięcia w zakresie akwizycji zależnej od danych i akwizycji niezależnej od danych, wykorzystując równoległą akumulację w pułapce mobilności, po której następuje sekwencyjna fragmentacja i dysocjacja wywołana kolizją. Pomiar SIL na poziomie łańcucha kwasów tłuszczowych ujawnia zmiany w dynamice lipidów podczas rozwoju jajników komarów. Struktury lipidów de novo są pewnie przypisywane na podstawie ich czasu retencji, ruchliwości i wzorca fragmentacji.
Wprowadzenie
Podczas analizy danych dotyczących lipidów, znakowanie stabilnych izotopów (SIL) jest skuteczną metodą oceny szlaków metabolicznych w organizmach żywych. W tej metodzie atomy w analicie są zastępowane stabilnymi izotopami zawierającymi 13C lub 2H. Izotopy te są dalej włączane do prekursorów, które są później osadzane w kwasach tłuszczowych, oznaczając obszary, w których się znajdują. Dzięki tym izotopom można zidentyfikować rozmieszczenie i metabolizm lipidów, ponieważ będą one kontrastować z nieoznakowanym tłem1. Popularne platformy spektrometrii mas nie są w stanie rozróżnić sygnału pochodzącego od cząsteczek endogennych2. Sukces SIL wymaga zastosowania narzędzi analitycznych o ultrawysokiej rozdzielczości. Chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią ruchliwości uwięzionych jonów o wysokiej rozdzielczości - równoległa akumulacja sekwencyjna fragmentacja - czas przelotu tandemowa spektrometria mas (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) umożliwia separację gatunków znakowanych i nieznakowanych2. Zaletą analizy LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS jest to, że sygnał MS może być filtrowany przez czas retencji (RT) i ruchliwość, zmniejszając w ten sposób potencjalne zakłócenia endogenicznych cząsteczek, a także kwantyfikację i separację wszystkich pożądanych gatunków2. W systemie TIMS jon jest najpierw utrzymywany nieruchomo w stosunku do fazy gazoruchowej, a następnie uwalniany zgodnie ze swoją ruchliwością. Zapewnia to mobilogramy o wysokiej rozdzielczości podczas pracy przy niższym napięciu niż wcześniejsze oprzyrządowanie IMS3. Mobilogramy to wykresy masy do naładowania w funkcji czasu dryftu, które mogą być używane do rozróżniania związków na podstawie ich czasu dryftu i stopnia nakładania się4.
Dzięki zastosowaniu dodatkowej techniki PASEF, prędkość sekwencjonowania jest znacznie zwiększona bez poświęcania czułości5. Teoria PASEF zakłada akumulację jonów, po której następuje ich sekwencyjne uwalnianie w kolejności ich ruchliwości. Odbywa się to poprzez akumulację jonów w równoległym dopasowaniu do ich ruchliwości. Akumulacja w ten sposób zapobiega utracie jonów. Co więcej, selekcja jonów prekursorowych zachodzi jednocześnie z gromadzeniem i uwalnianiem jonów. Dzięki tej metodzie PASEF wybiera wiele prekursorów w serii podczas każdego skanowania TIMS, a nie pojedyncze prekursory na skan typowe dla instrumentu TIMS, który nie korzysta z PASEF. Gdy jony prekursorowe są jednocześnie akumulowane i uwalniane w pikach 2 ms w ramach skanowania TIMS około 100 ms na klatkę, sygnał jest wzmacniany o ponad jeden rząd wielkości, zwiększając w ten sposób stosunek sygnału do szumu3. Dodatek PASEF do TIMS zwiększa wydajność MS/MS. Ponieważ TIMS-PASEF jest sprzężony z MS/MS, możliwa jest bardziej efektywna fragmentacja. W przeciwieństwie do konwencjonalnej detekcji MS/MS, sygnał prekursora jest kompresowany z TIMS-PASEF, a jony fragmentacyjne są wykrywane jednocześnie z czasem elucji TIMS i pozycją ruchliwości jonów prekursora3.
Podczas pobierania danych ze spektrometru masowego, dostępne są opcje w trybie skanowania. Akwizycja zależna od danych (DDA) wybiera jony prekursorowe ze skanu MS1 na podstawie ich obfitości, przed ich fragmentacją i wykonaniem skanowania MS2. Ten tryb skanowania fragmentuje jak najwięcej prekursorów. Podejście DDA jest ukierunkowane, a wyniki będą zależeć od wyboru jonów3. Jednak w ramach DDA-PASEF często występują problemy z odtwarzalnością między powtórzeniami. Podczas gdy DDA jest doskonałym narzędziem w ukierunkowanej analizie, złożone mieszaniny mają większe trudności z pozyskiwaniem danych6. Dzieje się tak dlatego, że tylko niewielka ilość jonów może być monitorowana jednocześnie3. Akwizycja niezależna od danych (DIA) to metoda, w której wstępnie wybrane okna m/z są fragmentowane niezależnie od ich intensywności, a wszystkie są skanowane w zakresie7. W tym trybie skanowania całe chmury jonów są przesyłane z IMS do spektrometru mas3. W badaniach proteomicznych powoduje to ilościowe oznaczanie większych ilości białek w krótszym czasie w porównaniu z DDA. Ponadto DIA pomija mniej wartości m/z w porównaniu z DDA. W związku z tym ta alternatywa wykazała znaczną poprawę odtwarzalności danych w zakresie stosunku sygnału do szumu i lepszą kwantyfikację niż DDA. W niniejszej pracy naszym celem jest implementacja DIA do metody opisanej przez Tose et al.2. Poprawiliśmy odtwarzalność i intensywność sygnałów, uzyskując dalsze i bardziej rozstrzygające informacje na temat mobilizacji, dystrybucji i metabolizmu lipidów SIL w próbkach biologicznych z wykorzystaniem akwizycji DDA i DIA.
Protokół
1. Przygotowanie próbki
- Rozwarstwienie owadów
- Wypreparuj jajniki komarów Aedes aegypti w wieku 7 dni w buforowanym fosforanem roztworze soli fizjologicznej za pomocą mikroigieł.
- Zebrać osiem jajników z buforowanego fosforanem roztworu soli fizjologicznej za pomocą mikroigieł i przechowywać w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml w temperaturze -80 °C.
- Zbieraj jajniki w replikach biologicznych.
- Ekstrakcja lipidów
- Dodać 10 μl wzorca wewnętrznego (ISTD) do ośmiu pobranych jajników w stężeniu 1 ppm. ISTD jest znakowaną mieszaniną lipidów z siedmioma deuterami 1-pentadekanoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny-D7 (15:0-18:1 (D7) PC), lizofosfatydylocholina-D7 (18:1 (D7) Lyso PC), 1-pentadekanoilo-2-oktadecenoilo-glicero-3-fosfoetanoloamina-D7 (15:0-18:1 (D7) PE), 1-oleoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-D7 (18:1 (D7) Lyso PE), 1-pentadekanoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfoinozytol-D7 (15:0-18:1 (D7) PI), 1-pentadekanoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfo-L-seryna-D7 ( 15:0-18:1 (D7) PS), 1,2-dipentadekanoilo-3-oktadecenoilo-sn-glicerol (15:0-18:1-15:0 (D7) TAG), 1-pentadekanoilo-2-oktadecenoilo)-sn-glicerol-D7 (15:0-18:1 (D7) DAG), 2-oktadecenoilo-sn-glicerol-D7 (18:1 MAG (D7)), oleinian cholesterolu-D7 (18:1 (D7) Chol Ester).
- Poczekaj, aż wyschnie w temperaturze pokojowej. Dodać 100 μl butanolu/metanolu i 3 μl butylowanego hydroksytoluenu. Homogenizować ręcznie przez 10 s za pomocą tłuczków polipropylenowych o pojemności 1,5 ml.
- Opłucz tłuczek 200 μl butanolu/metanolu i połącz z homogenizowanym roztworem.
- Sonikować probówkę mikrowirówki w temperaturze pokojowej i średniej mocy przez 30 minut.
- Probówki wirować o sile 1600 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C. Przenieść supernatant do fiolki z automatycznym samplerem z 300 μl wkładek ze szkła silanizowanego.
2. Konfiguracja instrumentu
- Przygotowanie fazy mobilnej
- Przygotować fazę ruchomą o składzie 30:40:30 (faza ruchoma A) i 10:5:85 (faza ruchoma B), stosując acetonitryl, wodę i izopropanol w odpowiednich proporcjach. W obu fazach ruchomych dodaj 10 mmol/l mrówczanu amonu do wody i 0,1% kwasu mrówkowego, aby stworzyć stan buforowy.
- Odważyć 3,15 g mrówczanu amonu w 10 ml wody. Dodaj 500 μl tego roztworu do 12,5 ml wody. Następnie umieścić w kolbie miarowej o pojemności 250 ml i napełnić izopropanolem około 2/3 kolby. Mieszaj przez mieszanie.
- Dodaj 250 μl kwasu mrówkowego (85%), napełnij 25 ml acetonitrylu i izopropanolu do linii napełniania 250 ml i wymieszaj.
- W systemie MS, po lewej stronie ekranu w ustawieniach MS, określ zakres masy, wybierając 50 jako minimum i 1850 jako maksymalne ustawienie skanowania.
- Wybierz Polaryzacja jako tryb jonów dodatnich. Wybierz tryb skanowania jako DIA-PASEF. W tym celu wybierz opcję Dostrajanie i otwórz metodę analizy z poprzedniej metody atrybucji opartej na danych z następującymi parametrami LC.
- Do separacji gradientowej:
Wstrzyknięcie próbki: 0% B, czas podtrzymania 1 min.
Zwiększ do 55% B, przytrzymaj do 6,4 min.
Zwiększyć do 65% B, przytrzymać do 24 min.
Zwiększ do 88% B, przytrzymaj do 40,8 min.
Zwiększyć do 95% B, utrzymać do 48,1 min.
Zmniejsz do 35% B, przytrzymaj do 56 min.
Zmniejsz do 0% B, przytrzymaj do 60 min. - Dla warunków HPLC:
Objętość wtrysku: 5 μL
Szybkość rozpuszczalnika: 0,25 ml/min
Całkowity czas pracy: 60 min, z czego 5 minut ma na przygotowanie kolumny. - Przygotować chromatograf cieczowy, wkładając kolumnę do chromatografu cieczowego. Uruchom ślepą próbę, aby wyczyścić kolumnę i sprawdzić, czy nie ma wycieków. Można to zauważyć w przyrządzie, który nie utrzymuje ciśnienia ani przepływu.
- Do separacji gradientowej:
- Wybierz Polaryzacja jako tryb jonów dodatnich. Wybierz tryb skanowania jako DIA-PASEF. W tym celu wybierz opcję Dostrajanie i otwórz metodę analizy z poprzedniej metody atrybucji opartej na danych z następującymi parametrami LC.
- Aby utworzyć nową metodę, wykonaj kroki opisane poniżej (Rysunek 1 i Rysunek 2).
- Otwórz oprogramowanie i kliknij Podłącz wszystkie instrumenty. Jeśli połączenie się powiedzie, system LC wyda jeden sygnał dźwiękowy, a na ekranie sterowania pojawi się HyStar w polu Status bez żadnych komunikatów o błędach.
- Kliknij zakładkę Akwizycja. W nawigatorze przykładowej tabeli znajdź menu rozwijane znacznika i wybierz poprzednią metodę.
- Podwój najnowszą tabelę próbek. Kliknij Zapisz jako... i zapisz nową przykładową listę w formacie: YYYYMMDD_LIP_C30_(XXXX), gdzie (XXXX) jest krótkim opisem analizy.
- Kliknij prawym przyciskiem myszy metodę separacji i kliknij Edytuj metodę. Kliknij Edytuj metodę modułu.
- Kliknij Pobierz. Jeśli się powiedzie, pojawi się komunikat Pobierz powiodło się. Zamknij ekran bez metody zapisywania.
- W ustawieniach MS przejdź do ustawień TIMS, wybierz 1/k0 początek od 0.70 i koniec 1/k0 od 1.85. Ustaw czas narastania na 150 ms. Dzięki temu cykl pracy i szybkość narastania są automatycznie dostosowywane.
- W dolnym oknie wybierz zakładkę Źródło. Wybierz typ źródła jako ESI i ustaw przesunięcie płyty końcowej na 800 V, a kapilary na 4500 V. Zaznacz skrzynkę nebulizatora i ustaw ciśnienie na 4,0 bar. Ustawić suchy gaz na 4,0 l/min, a temperaturę suchego na 250 °C.
- Po prawej stronie karty źródła wybierz kartę Strojenie. Kliknij kartę Ogólne i pod nagłówkiem transferu upewnij się, że masz następujące parametry:
Ugięcie 1 delta: 70 V
Lejek 1 RF: 250 vpp
Energia isCID: 0 eV
Lejek 2 RF: 250 vpp
Wielobiegunowy RF: 500 vpp.- Pod nagłówkiem komórki kolizji upewnij się, że następujące parametry:
Energia zderzenia: 6.0 eV
Kolizja RF: 1200 vpp. - Pod nagłówkiem kwadrupol należy zapewnić następujące parametry:
Energia jonów: 6 eV
Niska masa: 250 m/z. - Na karcie fokus przed TOF upewnij się, że masz następujące parametry:
Czas transferu: 45 μs
Magazynowanie impulsów wstępnych: 5,0 μs.
- Pod nagłówkiem komórki kolizji upewnij się, że następujące parametry:
- Kliknij kartę podrzędną Przetwarzanie. Detekcja pików widm masowych zapewnia następujące parametry:
Próg bezwzględny: 667
Próg bezwzględny (na 100 ms AccuTime): 445.- W przypadku wykrywania szczytów mobilności należy zapewnić następujące parametry:
Próg bezwzględny: 30,00.
- W przypadku wykrywania szczytów mobilności należy zapewnić następujące parametry:
- Kliknij podzakładkę TIMS. Na karcie przesunięć upewnij się, że masz następujące parametry:
Δt1: -20 V
Δt2: -150 V
Δt3: 70 V
Δt4: 150 V
Δt5: 0 V
Δt6: 150 V
Komórka kolizyjna: 300 V. - Po prawej stronie karty strojenia kliknij kartę MS/MS. W zakładce jony prekursorowe upewnij się, że następujące parametry:
Liczba ramp PASEF: 8
Minimalna opłata: 1
Maksymalne ładowanie: 1.- Na karcie planowania kliknij przycisk Zaawansowane i upewnij się, że spełnione są następujące parametry:
Intensywności: 0,1500, 5000, 10000
Powtórzenie: 1, 10, 5, 1
Próg intensywności: 1500. - Na karcie aktywnego wykluczenia upewnij się, że masz następujące parametry:
Znacznik wyboru aktywnego wykluczenia
Wydanie po: 0,4 min. - W ustawieniach energii zderzenia upewnij się, że następujące parametry:
K0 (V-s/cm3): 0,70, 1,60
Energia zderzenia (eV): 20.00, 35.00. - W ustawieniach szerokości izolacji upewnij się, że masz następujące parametry:
Masa (m/z): 622, 1222
Szerokość (m/z): 1,00 2,50.
- Na karcie planowania kliknij przycisk Zaawansowane i upewnij się, że spełnione są następujące parametry:
- Konfiguracja DIA -PASEF: Wybierz DIA-PASEF z trybu skanowania ustawień MS po lewej stronie. Na karcie MS/MS wybierz Edytor okien. W tym miejscu upewnij się, że spełnione są następujące parametry (Rysunek 3):
Ustawienia okna: Szerokość masy: 50 Da; Nakładanie się masy: 0,0 Da; Obliczać z wielokąta: kroki masowe; Liczba okien mobilności: 1.
3. Kalibracja
- Kalibracja przyrządu (Rysunek 4)
- Na podkarcie Kalibracja kliknij m/z, wybierz Tuning Mix z pola rozwijanego i kliknij Kalibruj w prawym dolnym rogu.
- Kontynuuj klikanie przycisku Kalibruj, aż zostanie osiągnięty wynik 100%.
- Teraz wybierz zakładkę Mobilność i postępuj zgodnie z tymi samymi krokami, co powyżej, aż do osiągnięcia 100% wyniku kalibracji.
- Krzywa kalibracyjna
- Mieszanina wzorca wewnętrznego lipidów Spike z 10 μl deuterowanej mieszaniny wzorca wewnętrznego.
Użyć siedmiu punktów kalibracji od 0,1 do 500 ng/ml mieszaniny wzorcowej z 10 μl deuterowanej mieszaniny wzorca wewnętrznego. - Ręcznie opisz łańcuchy kwasów tłuszczowych na podstawie wzorców PASEF MS/MS już opisanych w2.
- Mieszanina wzorca wewnętrznego lipidów Spike z 10 μl deuterowanej mieszaniny wzorca wewnętrznego.
- Wydajność etykietowania SIL
- Obliczyć stosunek powierzchni izotopów zawierających SIL do powierzchni izotopów niezawierających SIL.
- Oblicz teoretyczny wzór, określając prawdopodobieństwo znalezienia oznaczonego atomu w dowolnym miejscu.
- Oblicz wzbogacenie SIL, dopasowując eksperymentalne profile izotopowe do wzorca teoretycznego symulowanego w oprogramowaniu do analizy danych.
- Rozpoczynanie biegu
- Aktywuj piec kolumnowy, klikając przycisk Termometr. Aktywuj pompy, klikając przycisk Zawór.
- Ustaw metodę MS na metodę zapisaną wcześniej. Sprawdzić, czy objętość wstrzyknięcia wynosi 5 μl i czy linia 1 będzie skierowana na fiolkę 20:1.
- Upewnij się, że fiolka 20:1 zawiera 50% IPA/ACN. Zapisz przykładową listę.
- Rozpocznij sekwencję i sprawdź, czy zostało wykonane pomyślne wstrzyknięcie (potwierdzone komunikatem wyświetlanym w systemie z informacją o wstrzyknięciu).
- Skopiuj wiersz 1 i wklej poniżej, aby wygenerować nowy wiersz. Wypełnij wiersz 2 próbkami w zależności od bieżącego eksperymentu. Upewnij się, że używana jest właściwa pozycja w podajniku próbek.
- Jeśli faza ruchoma jest świeża, należy najpierw wykonać test kształtu piku, wstrzykując wzorce mieszaniny lipidów od producenta. Porównaj z poprzednimi wynikami. 2 Standardy to mieszanina lipidów 1-pentadecanoyl-2-oleoilo-sn-glycero-3-fosfocholina (15:0-18:1 PC), lizofosfatydylocholina (18:1 Lyso PC), 1-pentadecanoyl-2-oktadecenoilo-glicero-3-fosfoetanoloamina (15:0-18:1 PE), 1-oleoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina (18:1 Lyso PE), 1-pentadekanoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfoinozytol (15:0-18:1 PI), 1-pentadecanoyl-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfo-L-seryna (15:0-18:1 PS), 1, 2-dipentadekanoilo-3-oktadecenoilo-sn-glicerol (15:0-18:1-15:0 TAG), 1-pentadekanoilo-2-oktadecenoilo)-sn-glicerol (15:0-18:1 DAG), 2-oktadecenoilo-sn-glicerol (18:1 MAG), oleinian cholesterolu (18:1 Chol Ester).
- Upewnij się, że nowe linie mają prawidłową metodę separacji, a nie metodę kondycjonowania wstępnego zastosowaną w linii 1. Upewnij się, że metoda MS jest poprawna (metoda z bieżącego dnia).
- Sprawdź, czy załadowano poprawną metodę przetwarzania i czy jest włączona opcja Uruchom proces automatyczny.
- Zapisz listę próbek, aby upewnić się, że próbki są analizowane po zakończeniu bieżącego przebiegu.
4. Analiza danych
- Otwarte oprogramowanie do analizy danych (Rysunek 5). W lewym górnym rogu kliknij przycisk Plik i wybierz Otwórz...
- Wybierz żądane pliki. Kliknij prawym przyciskiem myszy nazwę pliku i wybierz Właściwości.
- Wybierz stan kalibracji (Rysunek 6). W polu rozwijanym wybierz opcję Wstępna kalibracja dla spektrometru mas. Upewnij się, że wszystkie błędy są mniejsze niż 1 ppm.
- Następnie wybierz opcję Initial Mobility Calibration (Początkowa kalibracja mobilności) i upewnij się, że błąd jest mniejszy niż 1 ppm.
- Kliknij prawym przyciskiem myszy na Chromatogram i wybierz Edytuj chromatogram (Rysunek 6C). W polu Typ kliknij pole rozwijane i wybierz Chromatogram wyekstrahowanych jonów (Rysunek 6D). W obszarze filtru wybierz opcję Wszystkie MS, a w trybie skanowania wybierz opcję Wszystkie. Ma to na celu wyświetlenie pików interesującej cząsteczki, a nie tylko jej fragmentów.
- Poniżej znajdują się dwie opcje filtrowania wyboru cząsteczek: Masy lub Formuła. W przypadku wybrania Mas można wybrać teoretyczne m/z interesujących nas cząsteczek. W tym przypadku wybierz 829.7985 m/z. W przypadku wybrania opcji Formuła można wybrać formułę dla cząsteczki, a także interesujące formy jonów dla chromatogramu. W takim przypadku wybierz amon [M+NH4]. Wynika to z buforu amonowego w fazie ruchomej, który będzie sprzyjał jonizacji w tej formie jonów (Rysunek 7).
- W polu Szerokość wybierz ±1. W przypadku polaryzacji upewnij się, że utrzymuje tryb dodatni. W obszarze Mobilność wybierz 1,455-1,465. Ma to na celu odfiltrowanie wszelkich cząsteczek, które nie mieszczą się w tych wartościach i wyizolowanie interesującej cząsteczki.
- Po wybraniu parametrów kliknij przycisk Dodaj > OK w prawym górnym rogu. Po krótkim czasie oprogramowanie przetworzy selekcje i wygeneruje chromatogram.
- Kliknij prawym przyciskiem myszy na linii bazowej na początku szczytu zainteresowania i przeciągnij, przytrzymując koniec szczytu. Ta ręczna integracja zapewni żywe spektrum masowe fragmentów w tym czasie przechowywania.
- Mobilogram
- Kliknij prawym przyciskiem myszy po lewej stronie ekranu na Mobilogram i wybierz Edytuj Mobilogram (Rysunek 8). Pojawi się okno o nazwie Edytuj ślady mobilogramu. Wykonaj te same kroki, od C.e.i.1 do C.e.i.5 (Rysunek 9).
- W polu Czas przechowywania wprowadź czas przechowywania szczytu zainteresowania. W tym przypadku 37,45-37,55 min.
- Po wybraniu parametrów kliknij przycisk Dodaj > OK w prawym górnym rogu. Po krótkim czasie oprogramowanie przetworzy selekcje i wygeneruje chromatogram.
- W przypadku wyekstrahowanych jonów powtarzaj kroki 4.2.3.1-4.3.2.2, aż utworzy się lista jonów.
- U dołu okna MS wybierz Profil MS i Fragment MS. Umożliwi to uzyskanie wglądu w widmo jonów z pełnego skanowania i PASEF.
- W widoku widma kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Kopiuj widma złożone. Dzięki danym widma, które pojawiają się po prawej stronie, można znaleźć więcej informacji na temat swojego związku, takich jak rozdzielczość, zdolność rozdzielcza, intensywność i stosunek sygnału do szumu (S/N; Rysunek 10).
- przetwarzanie
- Aby przetworzyć dane, należy ręcznie zintegrować chromatogram i piki ruchliwości, aby uzyskać cenne informacje na temat cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania (Rysunek 10).
- Kliknij prawym przyciskiem myszy Znajdź i wybierz Chromatogram lub mobilogram tylko całkowanie (Rysunek 11). Kliknij lewym przyciskiem myszy i podświetl żądany szczyt. Informacje te obejmują czas przechowywania, powierzchnię, S/N i mobilność.
Wyniki
Stabilne znakowanie izotopowe ułatwia wizualizację triglicerydów w badaniach dynamiki lipidów w jajnikach samic komarów. W domenie mobilności 2D trigliceryd 48:1 jest wyświetlany w obszarze o określonym czasie retencji w odniesieniu do mobilności 1/K0. Intensywność triglicerydu można zidentyfikować po ciemniejszej niebieskiej linii. Pozostałe punkty reprezentują dodatkowe triglicerydy znalezione w jajniku. Czas retencji oraz mobilność różnią się ze względu na różnice w masach i strukturach, w związku z czym pojawiają się w różnych obszarach wykresu. Różnice te są kluczowe przy rozróżnianiu triglicerydów w próbce (Rycina 12A,B). Powiększona projekcja widma masowego tego obszaru pokazuje jon triglicerydu 48:1 sprzężony z jonem amonowym przy 822 m/z. Wizualizowane są również inne triglicerydy, takie jak 50:2 i 52:3, jednak w obszarach o wyższym m/z ze względu na różnice w strukturze, wielkości i fragmentacji (Rycina 12C,D). W tym przykładzie interesowała nas analiza izotopów znakowanych deuterem. Obszar TG 48:1 został dodatkowo powiększony, aby zwizualizować jony znakowane izotopowo. Wraz ze wzrostem ilości deuteru w jonie intensywność piku maleje. Dzieje się tak, ponieważ występuje mniejsza liczba jonów o wysokim stopniu znakowania deuterem. Stosunek m/z nieznacznie zwiększa się przy każdym dodaniu deuteru ze względu na wzrost masy. Intensywności te pozwolą w dalszej kolejności określić ilość każdego izotopu obecnego w próbce.
Podczas oceny intensywności fragmentów w widmie mas należy porównać izotopy nieznakowane z izotopami znakowanymi 2H (Rysunek 12E). Kolor niebieski oznacza intensywność dla próbek nieznakowanych, a przerywane czarne linie reprezentują intensywności teoretyczne. Kolor czerwony obrazuje wyniki dla izotopów znakowanych. Wykazują one większe intensywności zarówno w stosunku do próbek nieznakowanych, jak i do wartości teoretycznych. Wzbogacenie cząsteczek znakowaniem izotopowym skutkuje większą intensywnością niż w przypadku teoretycznych cząsteczek nieznakowanych. Wyższe intensywności pozwalają na wizualizację triglicerydów dzięki wyraźnym rozbieżnościom. Fragmentacja również odgrywa kluczową rolę w identyfikacji lipidów, ponieważ metoda PASEF zapewnia zwiększoną fragmentację w porównaniu do pełnego skanowania MS/MS. Wynika to z faktu, że kwasy tłuszczowe w łańcuchach lipidowych mogą fragmentować w różnych wzorach, zatem linie w widmach pokazują intensywność fragmentów w zależności od procesu fragmentacji triglicerydu (Rysunek 12F). Dostarcza to informacji strukturalnych o kwasie tłuszczowym i pomaga ustalić, który izomer danej cząsteczki jest obecny. Podczas analizy danych z metody DIA liczba fragmentów wzrasta, co skutkuje lepszym skanowaniem MS/MS i dokładniejszą identyfikacją niż w typowej metodzie DDA.
Rysunek 1: Typowy ekran główny oprogramowania. Ekran główny umożliwia tworzenie metod oraz uruchamianie instrumentu. (A) Ekran oprogramowania zawierający ustawienia sterowania TIMS i MS/MS. Na dole ekranu znajduje się zakładka źródła, służąca do edycji tych sterowań w instrumencie. (B) Ekran oprogramowania z otwartą zakładką strojenia (tune). (C) W tym miejscu można przygotować instrument do ogólnego strojenia. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Ekran oprogramowania z otwartą kartą strojenia (tune). Tutaj można edytować parametry strojenia przetwarzania. (A) Ekran oprogramowania z otwartą kartą strojenia. Tutaj można edytować parametry strojenia dla części TIMS instrumentu. (B) Ekran oprogramowania z wybraną kartą MS/MS na dole ekranu. (C) Tutaj można edytować parametry dla tandemowego spektrometru mas. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Ekran wyboru szerokości okien DIA-PASEF. Tutaj można edytować kolory dla obfitości, a także zmieniać rozmiar okien akwizycji danych. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4: Kalibracja spektrometru mas według stosunku masy do ładunku (m/z). Do kalibracji wybrano listę referencyjną. (A) W prawym dolnym rogu klikano przycisk Calibrate, aż do pojawienia się akceptowalnej wartości. Kalibracja spektrometru mobilności jonowej według mobilności. Do kalibracji wybrano listę referencyjną. (B) W prawym dolnym rogu klikano przycisk Calibrate, aż do pojawienia się akceptowalnej wartości. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Rycina 5: Typowy ekran główny oprogramowania do analizy danych. Aby otworzyć plik, należy kliknąć przycisk Plik w lewym górnym rogu, aby wyświetlić rozwijane menu z dostępnymi opcjami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 6: Oprogramowanie do analizy danych. Ekran oprogramowania potwierdzający pomyślną kalibrację z (A>) sposobem wyboru wyników kalibracji oraz (B>) wyborem kategorii kalibracji. (C) Wybór chromatogramu do analizy oraz (D) wybór wyekstrahowanego chromatogramu jonów. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek 7: Okno wyskakujące. Okno wyskakujące służące do wyboru i ekstrakcji chromatogramu jonowego za pomocą (A) filtra masy i (B) filtra wzoru. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 8: Oprogramowanie do analizy danych. Ekran oprogramowania, na którym po lewej stronie wybrano mobilogram do analizy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 9: Okno pop-up mobilogramu. Okno pop-up służące do wyboru wyekstrahowanego mobilogramu jonowego za pomocą (A) filtra masy i (B) filtra wzoru. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 10: Ekran analizy danych. (A) Ekran oprogramowania; po lewej stronie zaznaczono możliwość utworzenia listy wyekstrahowanych jonów. (B) Ekran analizy danych, na którym w dolnej części przygotowano widmo związku z wyekstrahowanych jonów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 11: Ekran analizy danych. Ekran oprogramowania przedstawiający wyniki ręcznej integracji widm związków. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 12Wynik LC-TIMS MS. (A) LC-TIMS MS 4 dni po karmieniu 2Dietę z sacharozą znakowaną izotopem H oraz jajniki owadów można zobaczyć w dwuwymiarowej domenie ruchliwości.B) Typowe widma MS dla sygnałów odpowiadających TG 48:1, TG 50:2 i TG 52:3 z próbki znakowanej. (C) Powielony region MS 822 – 827 m/z oznaczający profil znakowanych TG. (DNależy zwrócić szczególną uwagę na piki MS zaznaczone kolorem czerwonym, które stanowią powiększony profil izotopowy.E-F) The 2Profil izotopowy znakowany H zaznaczono kolorem czerwonym; poniżej profil izotopowy nieznakowany zaznaczono kolorem niebieskim. Teoretyczne profile izotopowe przedstawiono jako linie przerywane (13C w kolorze czarnym; 2H na zielono). W prawym górnym rogu przedstawiono również potencjalną strukturę triglicerydu 48:3. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Dyskusja
Oceniając stosowanie tego protokołu, należy upewnić się, że parametry DIA-PASEF i MS/MS mają zastosowanie do przedmiotowych triglicerydów. W szczególności okna mobilności i szerokość okna powinny być zgodne ze wzorcem trójglicerydów. Można to określić na podstawie poprzedniego uruchomienia przy użyciu metody atrybucji opartej na danych. Podczas śledzenia trójglicerydów w wzorcu wewnętrznym, okna dla konfiguracji DIA powinny obejmować wszystkie wstępnie zidentyfikowane cząsteczki będące przedmiotem zainteresowania. Wszystkie okna powinny mieć jednakowe rozmiary, a zakresy mieszczą się w m/z i 1/k0 pożądanych związków (rysunek 7). Przy nieprawidłowym doborze okien jony, które mają zostać rozdrobnione, zostaną pominięte, a widma plonów będą miały mniejszą odtwarzalność. Zasadniczo, bez odpowiedniej optymalizacji zakresu okien w lipidomice, wyniki DIA nie poprawią danych DDA. Okna powinny reprezentować krok po kroku dla procesu pozyskiwania danych. Jeżeli tak nie jest, należy zmienić parametry w ustawionym oknie DIA-PASEF tak, aby były reprezentatywne dla pełnego profilu lipidowego. Bez tego kroku krytyczne kwasy tłuszczowe zostaną pominięte w pozyskanych danych.
Ograniczenia instrumentalne obejmują głównie te, które są dostarczane z metodami LC-MS. Obejmuje to ograniczenia multipleksowania w szerokości piku. W związku z tym konieczna jest optymalizacja elucji pików w celu uzyskania odpowiedniej oceny ilościowej, promującej selektywność podczas pozyskiwania danych. Zazwyczaj dzieje się tak w przypadku wybranych prekursorów, takich jak DDA. Jednak w przypadku DIA nie wybiera się żadnych prekursorów, co stwarza ryzyko ograniczeń w selektywności instrumentalnej8. Chociaż metody DIA zapewniają zwiększoną fragmentację, nadal istnieją ograniczenia. Najbardziej widocznym ograniczeniem jest zmniejszenie selektywności prekursorów. Okna dla metody DIA są od 5 do 10 razy szersze niż w przypadku typowej metody DDA. W rezultacie, pozwalając na większą fragmentację, może to zmniejszyć cykl pracy i akwizycję seryjną. Można to zaobserwować w spektrometrach masowych, które wykorzystują schodkowy kwadrupol. Ponieważ nie ma wyboru prekursorów i tego, które jony powinny zostać rozdrobnione, okna izolacji statycznej są sekwencyjnie przełączane, aby zakryć okno m/z. Ponieważ okno jest znacznie większe niż typowa metoda DDA, należy użyć szerszych zakresów, aby spróbować uzyskać czułość9. Problem z akwizycją szeregową zmniejsza zatem czułość. Drugim ograniczeniem jest generowanie bibliotek. Jest to czasochłonne i wymaga dużej ilości próbek do sformułowania. Chociaż można korzystać z bibliotek zewnętrznych, wzorce fragmentacji mogą się różnić w zależności od warunków eksperymentalnych i oprzyrządowania10.
Podczas analizy danych lipidowych przy użyciu znakowania stabilnymi izotopami konieczne jest zminimalizowanie zakłóceń ze strony innych cząsteczek znajdujących się w organizmie. Odbywa się to za pomocą narzędzi do analizy o wysokiej rozdzielczości, takich jak LC-TIMS-TOF-MS/MS 2. Obecnie zastosowanie tych narzędzi o wysokiej rozdzielczości do oddzielania znakowanych izotopów od szumu tła jest nadal bardzo nowatorskie w porównaniu z tradycyjnymi metodami. Tradycyjne rozważania instrumentalne obejmują separację za pomocą chromatografii gazowej, a następnie jonizacji chemicznej lub elektronowej. Pozwala to na chemiczne wyprowadzenie za pomocą bromku pentafluorobenzylu lub fragmentację w wyniku jonizacji elektronów. To właśnie od niedawna LC-MS znajduje zastosowanie w badaniach izotopowych. Zastosowanie spektrometrów masowych o wysokiej rozdzielczości pozwala na uzyskanie wysokiej dokładności masy i możliwość prowadzenia badań wieloznacznikowych przy użyciu wielu znaczników izotopowych zamiast pojedynczego izotopu. Bez wysokiej rozdzielczości przyrządu nie byłoby możliwe rozróżnienie różnych stopni oznakowania, takich jak 13C2 i 13C. Pozwala to na uzyskanie większej ilości informacji z jednego przebiegu w porównaniu z tradycyjnym oprzyrządowaniem o niższej rozdzielczości10.
Chociaż DIA ma lepszą odtwarzalność niż DDA, inne pojawiające się metody pozyskiwania danych mogą się z nim porównywać. Hybrydowe strategie DIA-DPA, takie jak p-SMART, są w stanie połączyć mocne strony każdej z metod w celu utrzymania doskonałej detekcji i kwantyfikacji, przy jednoczesnym utrzymaniu wysokiego poziomu ukierunkowanych analiz jakościowych. W tej metodzie użycie jednego dopasowanego jonu produktu może zwiększyć czułość i selektywność DIA, ponieważ zawęzi okna DIA w porównaniu z szerokim podejściem nieukierunkowanym8. W lipidomice struktura trójglicerydu może różnić się w zależności od struktury izomerycznej. PASEF pozwala na wizualizację różnych wzorców fragmentacji, poprawiając identyfikację gatunków2. Dzięki zastosowaniu DIA-PASEF zwiększona fragmentacja dostarcza informacji o izomerach o takiej samej liczbie fragmentów, jak inne, które normalnie nie są w stanie zostać rozdzielone ze względu na ograniczenia metody DDA. Informacje te dostarczają dowodów na to, jakie kwasy tłuszczowe są obecne w jajnikach komarów. Metoda ta może być stosowana do innych badań lipidów de novo w różnych organizmach.
Oświadczenia
Matthew Willetts i Melvin A. Park są pracownikami firmy Bruker Daltonics Inc., producenta komercyjnego instrumentu timsTOF. Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy lubią doceniać wkład dr Cesara Ramireza podczas początkowego rozwoju metody. Badania te zostały sfinansowane z grantów NIAID R21AI167849 FGN, projekt 22-21244S z Czeskiej Fundacji Naukowej, Republika Czeska do MN.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Accucore C30 colum | Thermo Fisher Scientific | 27826-252130 | |
| Analiza danych kompasu Bruker | Bruker Daltonics Inc | 2363525870 | wersja 5.2 |
| d-Glucose-13C6 | Sigma-Aldrich | ||
| probówki eppendorf | Fisher Scientific | 14-282-300 | |
| EquiSplash Lipidomix | Avanti Polar Lipids | 330731-1EA | |
| szklane fiolki | Thermo Fisher Scientific | 11-417-236 | |
| ciężka woda (2H2O) | Sigma-Aldrich | 1.13366 | |
| tłuczki polipropylenowe | Fisher Scientific | BAF199230001 | |
| Prominence LC-20 CE ultraszybki chromatograf cieczowy | Shimadzu | L20234651907 | |
| wkładki ze szkła silanizowanego | Thermo Fisher Scientific | 03-251-826 | |
| Sacharoza-13C12 | Sigma-Aldrich | ||
| timsTOF | Bruker Daltonics Inc | 1.84443E+11 | |
| Standard kalibracji mieszanki strojenia | Agilent Technologies | 36 |
Bibliografia
- Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not. Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).
- Tose, L. V., et al. Coupling stable isotope labeling and liquid chromatography-trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight-tandem mass spectrometry for de novo mosquito ovarian lipid studies. Anal Chem. 94 (16), 6139-6145 (2022).
- Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Mol Cell Proteomics. 20, 100138(2021).
- Basit, A., Pontis, S., Piomelli, D., Armirotti, A. Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics. Metabolomics. 12 (3), 50(2016).
- Meier, F., et al. Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer. Mol Cell Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).
- Koopmans, F., Ho, J. T. C., Smit, A. B., Li, K. W. Comparative analyses of data independent acquisition mass spectrometric approaches: DIA, WiSIM-DIA, and untargeted DIA. Proteomics. 18 (1), 1700304(2018).
- Fernández-Costa, C., et al. Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results. J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).
- Prakash, A., et al. Hybrid data acquisition and processing strategies with increased throughput and selectivity: PSMART analysis for global qualitative and quantitative analysis. J Proteome Res. 13 (12), 5415-5430 (2014).
- Tsou, C. C., et al. DIA-umpire: Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics. Nat Methods. 12 (3), 258-264 (2015).
- Triebl, A., Wenk, M. R. Analytical considerations of stable isotope labelling in lipidomics. Biomolecules. 8 (4), 151(2018).
Przedruki i uprawnienia
