Artykuł metodologiczny

Produkcja i optymalizacja LTE, bezkomórkowego systemu ekspresji białek pochodzących z Leishmania tarentolae do produkcji białek rekombinowanych

DOI:

10.3791/65592

⸱

8 listopada 2024

 ,  , 
1CSIRO-QUT Synthetic Biology Alliance, Queensland University of Technology, 2ARC Centre of Excellence in Synthetic Biology, Queensland University of Technology, 3Centre for Agriculture and the Bioeconomy, Queensland University of Technology, 4School of Biology and Environmental Science, Queensland University of Technology, 5Centre for Genomics and Personalised Health, Queensland University of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leishmania Translational Extract (LTE) to eukariotyczny system ekspresji białek bez komórek, pochodzący od jednokomórkowego pasożyta, Leishmania tarentolae. Ten zoptymalizowany protokół sprawia, że produkcja LTE jest prosta i opłacalna. Nadaje się do różnych zastosowań skoncentrowanych na wielorównoległej ekspresji i badaniu złożonych białek eukariotycznych i ich interakcji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje produkcję i optymalizację eukariotycznego Systemu Ekspresji Białek Wolnych od Komórek (CFPS) pochodzącego z jednokomórkowego wiciowca Leishmania tarentolae, określanego jako Leishmania Translational Extract lub LTE. Chociaż organizm ten pierwotnie wyewoluował jako pasożyt gekonów, można go łatwo i niedrogo hodować w kolbach lub bioreaktorach. W przeciwieństwie do Leishmania major nie jest patogenny dla ludzi i nie wymaga specjalnych środków ostrożności laboratoryjnej. Kolejną zaletą stosowania Leishmania w CFPS jest to, że dodanie pojedynczego oligonukleotydu antysensownego do CFPS, ukierunkowanego na konserwatywną sekwencję lidera splicingu na końcu 5' wszystkich RNA kodujących białka, może hamować endogenną ekspresję białek. Zapewniamy procedury rozbijania komórek i przetwarzania lizatów, które zostały uproszczone i ulepszone w porównaniu z poprzednimi wersjami. Procedury te rozpoczynają się od prostych kultur kolbowych. Ponadto wyjaśniamy, jak wprowadzać informacje genetyczne za pomocą wektorów zawierających niezależne od gatunku miejsca inicjacji translacji (SITS) oraz jak przeprowadzić prostą optymalizację partii i kontrolę jakości, aby zapewnić stałą jakość ekspresji białek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W latach sześćdziesiątych XX wieku bezkomórkowe systemy ekspresji białek odegrały kluczową rolę w odkryciu kodu genetycznego1. Jednak prokariotyczne bezkomórkowe systemy ekspresji białek, oparte głównie na E. coli, dominują obecnie zarówno w zastosowaniach laboratoryjnych, jak i komercyjnych. Podczas gdy systemy oparte na E. coli oferują korzyści, takie jak opłacalność, skalowalność i wysoka wydajność ekspresji, napotykają wyzwania podczas produkcji białek wielodomenowych w ich aktywnych formach i ułatwiania składania kompleksów białkowych2,3. W dzisiejszych czasach powszechnie stosowane formy eukariotycznej syntezy białek bezkomórkowych (CFPS) obejmują ekstrakt z kiełków pszenicy (WGE), lizat retikulocytów królika (RRL) i lizat komórek owadów (ICL)4,5,6. Niniejsza praca przedstawia alternatywny, bezkomórkowy system eukariotyczny, który jest zarówno prosty, jak i skalowalny, oparty na jednokomórkowym pasożytze wiciowców Leishmania tarentolae.

Leishmania tarentolae może być łatwo hodowany w kolbach przy użyciu opłacalnych pożywek, a także może być skalowany w bioreaktorach, aby osiągnąć większą gęstość komórek. Obecność endogennych mRNA w lizacie komórkowym, które w przeciwnym razie mogłyby konkurować z wprowadzonymi wiadomościami, może być neutralizowana za pomocą oligonukleotydów antysensownych ukierunkowanych na konserwatywną sekwencję lidera splicingu mRNA Leishmania7. W przeciwieństwie do swojego bliskiego krewnego Leishmania major, który powoduje choroby u ludzi, L. tarentolae infekuje gekona mauretańskiego (Tarentolae mauritanica), dzięki czemu nadaje się do hodowli w warunkach laboratoryjnych PC2 bez konieczności stosowania specjalnych środków ostrożności. Wcześniej był używany jako organizm transgeniczny do ekspresji białek in vivo8.

Aby ułatwić tworzenie matryc w systemach bezkomórkowych, zaprojektowano uniwersalne sekwencje oparte na polimerowych strukturach RNA, które zwiększają inicjację translacyjną9. Te niezależne od gatunku sekwencje translacyjne (SITS) mają zastosowanie zarówno do systemów prokariotycznych, jak i eukariotycznych bezkomórkowych i są odpowiednie do wprowadzania informacji genetycznej do LTE. Chociaż protokół ten nie zapewnia szczegółowego wyjaśnienia budowy wektorów do ekspresji białek bezkomórkowych LTE, optymalizacja i kontrola jakości wymagają odpowiednich wektorów zawierających fuzje fluoroforowe pożądanych białek będących przedmiotem zainteresowania poniżej miejsca SITS. W tym celu odpowiednie wektory LTE zostały zdeponowane w repozytorium genów Addgene, takie jak wektor pCellFree_G03, który koduje N-końcową fuzję eGFP do pożądanego białka będącego przedmiotem zainteresowania przy użyciu miejsc klonowania Gateway.

LTE udowodniło swoją wartość w szerokim zakresie zastosowań wymagających ekspresji białek, w tym w analizie samoorganizacji białek10,16, produkcja ludzkich integralnych białek błonowych17, badania nad kandydatami na leki przeciwwirusowe18, rozwój biotechnologicznie użytecznych enzymów19, prototypowanie biosensorów białkowych20,21, oraz badanie leków biologicznych od tęgoryjców22. LTE odegrało również zasadniczą rolę w mapowaniu sieci interakcji białko-białko w dziedzinie wirusologii i struktur komórkowych21,32. LTE zostało przetestowane pod kątem działania podobnego do innych systemów eukariotycznych bezkomórkowych pod względem ekspresji białek o pełnej długości, monorozproszonych i niezagregowanych33, a wszystko to przy jednoczesnym oferowaniu bardziej opłacalnej i skalowalnej produkcji.

Ten protokół dostarcza technik hodowli i zakłócania organizmu gospodarza, przygotowania lizatu i uzupełniania roztworu żywieniowego (FS) do sprzężonej ekspresji białek transkrypcyjnych/translacyjnych. Dodatkowo zawiera protokół do optymalizacji partii produkcyjnych. W początkowej wersji systemu bezkomórkowego Leishmania zaobserwowano niepożądane różnice między partiami w poziomach ekspresji, frakcji białek o pełnej długości i obecności agregatów białkowych, co prowadziło do utylizacji batches34. Kolejne ulepszenia protokołu zostały wprowadzone w celu rozwiązania tego problemu25. Obecny protokół opiera się na tych ulepszeniach, umożliwiając optymalizację poszczególnych partii pod kątem szczytowej ekspresji i wielkości białka. Osiąga to poprzez ścisłą kontrolę obciążenia ogniw zakłócających (mierzone jako gęstość optyczna przy 600 nm; OD600nm) i normalizując otrzymaną produkcję lizatu za pomocą absorbancji przy 280 nm (Abs280nm). Ponadto zawiera metodę częściowego uzupełniania lizatu w rNTP i magnez podczas produkcji, z późniejszą optymalizacją tych składników roztworu paszowego podczas wyrażeń testowych. Chociaż ta optymalizacja jest przedstawiona jako opcja w protokole, jest zdecydowanie zalecana przez autorów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół zawiera szczegółowe receptury i kroki związane z hodowlą, wirowaniem, pomiarem fluorescencji GFP za pomocą wielomodowego czytnika płytek, pomiarem ODkultury 600nm i oceną lizatu Abs280nm. Obejmuje również konfigurację i obrazowanie żeli białkowych SDS-PAGE. Materiały wymagane lub sugerowane dla tego protokołu są wymienione w arkuszu kalkulacyjnym Materiały. Ważne jest, aby pamiętać, że typowe zasoby laboratoryjne, takie jak komponenty pożywek, wirówki, probówki, spektrofotometry i zestawy do elektroforezy żelowej, mogą być prawdopodobnie używane zamiennie, chyba że określono inaczej. Rysunek 1 przedstawia podsumowanie procesu produkcji LTE.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przegląd protokołu produkcji LTE. Ten rysunek zawiera zwięzłe podsumowanie protokołu produkcyjnego LTE. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Wzrost kultur Leishmania tarentolae

  1. Przygotować co najmniej 3 l pożywki wzrostowej TBGG (baktotrypton 12 g/l, ekstrakt drożdżowy 24 g/l, glicerol 8 ml/l, glukoza 1 g/l, KH2PO4 2,3 g/l, K2HPO4 2,5 g/l, patrz tabela materiałów). Wysterylizuj media za pomocą filtra 0,22 μm w próżni lub podobnej konfiguracji.
  2. Przechowywać pożywkę w temperaturze pokojowej (RT), z ostatnimi dodatkami (Hemin, antybiotyki) dodanymi tuż przed inokulacją L. tarentolae. Hemin (0,25% v/v w 50% trietanoloaminie) dodaje się w stężeniu 0,2% v/v, penicylinę (10 000 jednostek/ml) i streptomycynę (10 000 μg/ml) miesza się w 0,5% v/v.
    UWAGA: Punktem wyjścia dla tego protokołu jest utrzymywana hodowla 2 x 10 ml dzikiego typu L. tarentolae. Kultury konserwacyjne hoduje się w temperaturze 27 °C w standardowych kolbach do hodowli tkankowych o pojemności 50 ml z niskim wytrząsaniem (75 obr./min). Takie 10 ml kultur można utrzymywać w nieskończoność z ~1/20 rozcieńczeniami w sterylnym (TBGG + hemina, penicylina, streptomycyna) co 2-3 dni. Zalecana jest standardowa komora bezpieczeństwa biologicznego w laboratorium PC2; jednak zakażeniom bakteryjnym zwykle zapobiega się za pomocą dodanych antybiotyków, podczas gdy zanieczyszczenia grzybicze są na ogół wyrastane przez L. tarentolae.
  3. W ciągu dwóch dni należy zwiększyć zawartość kultur podtrzymujących L. tarentolae do 200 ml (dzień 1), a następnie 2 litrów (dzień 2) poprzez rozcieńczenia w stosunku 1:10 ze zwiększającą się objętością TBGG + heminy/antybiotyków każdego dnia. Oba rozcieńczenia wykonać w wysterylizowanych w autoklawie, szklanych kolbach o pojemności 5 l (napełnionych maksymalnie do 1 l). Drugie rozcieńczenie musi nastąpić po południu między godziną 15 a 18, z zamiarem rozpoczęcia produkcji lizatu następnego dnia w godzinach 8-11.
    UWAGA: Ten protokół wykorzystuje minimalną objętość początkową do produkcji LTE (2 kultury po 1 l). Możliwe jest również rozszerzenie kultury do 10 l do produkcji LTE poprzez włączenie dodatkowego kroku ekspansji (np. Dzień 1: 100 ml; Dzień 2: 1 L; Dzień 3: 10 L). Chociaż protokół ten wykorzystuje kolby z przegrodami (patrz tabela materiałów) do hodowli L. tarentolae, opcjonalnie można zastosować konwencjonalne bioreaktory zaprojektowane do wzrostu bakterii z wirnikami Rushton, pod warunkiem, że szybkość mieszania jest utrzymywana poniżej 100 obr./min. Ulepszone napowietrzanie i kontrola pH w bioreaktorach generalnie wydłużają wzrost kultur L. tarentolae w fazie logarytmicznej, co pozwala na zastosowanie wyższego poziomu OD600 nm wynoszącego 10 w kroku 1.4.
  4. Zapisać OD600 nm kultury w trzech powtórzeniach przez rozcieńczenie 1:10 w TBGG bezpośrednio w kuwecie spektrofotometru. Odpowiedni zakres wyjściowy do wytwarzania lizatu to OD600nm = 4,0-8,0.
  5. Zapewnij dodatkowy czas inkubacji, jeśli OD600nm < 4,0. Hodowla z OD600nm > 8 jest użyteczna i spowoduje większą objętość lizatu ekspresyjnego bez komórek, ale o niższej jakości ze względu na początek późnej fazy wzrostu. Umieść kolby hodowlane na lodzie, czekając na kolejne kroki.
    UWAGA: Dokładny pomiar końcowej średnicy zewnętrznej kultury600 nm ma kluczowe znaczenie, ponieważ służy do obliczania końcowej objętości dla skoncentrowanych komórek przed rozerwaniem. Obliczenia te zastępują metodę ważenia granulek stosowaną we wcześniejszych wersjach produkcji LTE do kalibracji stężenia ogniw przed zakłóceniami34, w celu uproszczenia protokołu. Upewnij się, że rozcieńczyłeś TBGG do pomiaru OD600 nm, ponieważ w przeciwnym razie szok osmotyczny zmieni kształt komórki, powodując błąd pomiaru. Pipetą wymieszaj rozcieńczenie 1:10 do pomiaru OD600 nm (bezpośrednio w kuwecie) na kilka sekund przed wykonaniem odczytu spektrofotometrycznego, ponieważ komórki L. tarentolae szybko osiadają z charakterystycznym mętnym wyglądem. Jeżeli końcowa objętość kultury ekspresji jest uważana za przybliżoną, zaleca się również ważenie kolb podczas zbioru (z odpowiednią tarą z pustej kolby) w celu uzyskania lepszej szacowanej objętości (przy 1 g = 1 ml). Maksymalny OD600 nm możliwy do uzyskania przy wzroście L. tarentolae w kolbach z przegrodami wynosi 15-20, chociaż jest to nieodpowiednie do wytwarzania lizatu ze względu na osiągnięcie fazy stacjonarnej.

2. Koncentracja kultur L. tarentolae

  1. Komórki Leishmania muszą zostać umyte i skoncentrowane około 60 razy przed rozerwaniem. Obliczyć objętość docelową dla stężenia komórek na podstawie OD600nm = 300 dla końcowego koncentratu. Równanie jest następujące: V = objętość zbioru (ml) x (zbiór OD600nm/300). Na przykład, przy użyciu kultury o pojemności 2 litrów z OD600 = 5, docelowa objętość wynosi 33 ml.
    UWAGA: Docelowy OD600 nm wynoszący 300 może być modyfikowany; Dotychczasowa produkcja LTE przyjmowała wartości w zakresie 150-350. Wyższe stężenia komórek ulegających zaburzeniom będą miały tendencję do dawania końcowych reakcji ekspresji bezkomórkowej z wyższą wydajnością białka, ale ze zwiększoną tendencją do agregacji wrażliwych białek. OD600nm = 300 stanowi odpowiedni domyślny cel dla produkcji LTE.
  2. Zebrane kultury przenieść do odpowiednich butelek wirówkowych i wirować je w temperaturze 2500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zdekantować supernatant do odpadów hodowlanych.
    UWAGA: Ważne jest, aby zminimalizować straty komórek do odrzuconego supernatantu, ponieważ wpływa to na obliczanie obciążenia zakłócającego. W poprzednich protokołach produkcji LTE stężenie komórek L. tarentolae do rozbijania było kalibrowane poprzez odwirowanie koncentratu komórkowego w probówce do mikrowirówki testowej i zmierzenie masy granulki w stosunku do masy całkowitej34. Ten uproszczony protokół wykorzystuje zamiast tego teoretyczny cel OD600 nm dla koncentratu, oparty na zmierzonym zbiorze OD600 nm i zakłada niską utratę komórek podczas koncentracji komórek i mycia.
  3. Przemyć osad komórkowy w buforze SEB (45 mM HEPES-KOH pH 7,6, 250 mM sacharozy, 100 mM KOAc, 3 mM Mg(OAc)2, przechowywany na lodzie) trzy razy, za każdym razem odwirowując przy 2500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Do pierwszego przemycia ponownie zawiesić każdy 1 l granulowanej kultury w 100 ml buforu SEB, a następnie połączyć je w jednej kolbie wirówkowej. Do drugiego prania użyj również 100 ml SEB na każdy 1 l oryginalnej kultury.
    UWAGA: W celu końcowego ponownego zawieszenia osadu należy dodać bufor SEB do 50% końcowej docelowej objętości zawieszenia (krok 2.1). Pozwala to na ostrożne uzupełnienie zgromadzonego koncentratu dokładnie do końcowej objętości docelowej w kroku 2.4. Każde ponowne wymieszanie musi być tak delikatne, jak to możliwe, aby uniknąć przedwczesnej lizy L. tarentolae, na przykład poprzez delikatne obracanie dodanego SEB wokół zdekantowanego osadu lub pipetowanie SEB na osad przylegający do ścianki probówki wirówkowej. Wygodniej jest przenieść supernatanty do mniejszych probówek wirówkowych w celu wykonania ostatniego etapu.
  4. Wlać ponownie zawieszony koncentrat do odpowiedniego umytego szklanego cylindra objętościowego, a następnie uzupełnić objętość do objętości docelowej (krok 2.1) za pomocą dodatkowego zimnego SEB i delikatnie wymieszać.

3. Liza koncentratu L. tarentolae

  1. Przenieść koncentrat komórek do urządzenia do kawitacji azotu (patrz tabela materiałów) wstępnie schłodzonego do 4 °C, zwiększyć ciśnienie azotu do 70 barów i inkubować przez 45 minut na lodzie.
    UWAGA: Chociaż kawitatory azotowe nie są powszechnymi przedmiotami laboratoryjnymi, są zalecane do produkcji LTE. Wypróbowano alternatywne metody, takie jak zamrażanie i rozmrażanie komórkowe oraz zakłócacze typu prasy francuskiej; Jednak aktywność ekspresji białek wynosiła <50% w porównaniu z zastosowaniem metody kawitacji azotu. Urządzenie do kawitacji azotu musi być dokładnie oczyszczone przed użyciem i między cyklami, podobnie jak wszystkie ponownie używane naczynia, które mają kontakt z lizatem komórkowym od tego etapu (takie jak kolba odbiorcza). Odpowiedni schemat czyszczenia polega na umyciu detergentami laboratoryjnymi, a następnie dokładnym spłukaniu wodą dejonizowaną.
  2. Otwórz odpowietrznik w urządzeniu do kawitacji azotu i wyrzuć powstały lizat do odpowiednio wytrzymałego pojemnika, takiego jak kolba odbiorcza próżniowa na lodzie. Przechylić kolbę odbiorczą, aby upewnić się, że cały powstały lizat osiada i może być pipetowany do świeżej probówki wirówkowej lub podobnego naczynia.
    UWAGA: Czynniki zakłócające kawitację azotu polegają na nagłym przejściu koncentratu ogniw z 70 barów azotu do ciśnienia otoczenia, osiąganym poprzez silny przepływ najpierw cieczy, a następnie azotu przez zawór wylotowy urządzenia. Wentylacja musi być wykonana za pomocą odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE) w kapturze bezpieczeństwa przeciwchemicznego. Istnieje ryzyko rozbicia naczynia docelowego i utraty lizatu, dlatego zamiast zwykłej kolby używamy solidnego odbiornika próżniowego. Jeśli zawór wylotowy urządzenia jest rurką, należy unikać umieszczania rurki bezpośrednio w odbiorniku, aby zapobiec nadmiernemu wzrostowi ciśnienia w punkcie odpowietrzania.

4. Wirowanie lizatu komórkowego

  1. Przenieść lizat do odpowiednich probówek wirówkowych o sile g i wirować przy 10 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant do świeżych, podobnych probówek wirówkowych.
  2. Odwirować lizat przy 30 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, a następnie usunąć końcowy supernatant do świeżej probówki wirówkowej lub podobnego pojemnika umieszczonego na lodzie. Oszacuj całkowitą objętość.

5. Filtracja żelowa lizatu komórkowego

UWAGA: Filtracja żelowa służy do usuwania sacharozy zawartej w buforze SEB. Podczas gdy sacharoza pomaga w stabilizacji maszynerii komórkowej podczas rozbijania komórek, zmniejsza wydajność, jeśli jest zatrzymywana w reakcjach ekspresji białek.

  1. Ustaw wystarczającą liczbę grawitacyjnie zasilanych żelowych kolumn filtracyjnych PD-10 (patrz Tabela materiałów) w formacie stojaka, który umożliwia im kapanie do tacki zbiorczej lub podobnego pojemnika pod spodem, zapewniając, że mogą przefiltrować całą objętość lizatu po 2.5 ml na kolumnę. Wstępnie zrównoważyć kolumny, przepuszczając przez nie wcześniej 10 ml buforu EB o temperaturze 4 °C (45 mM HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM KOAc, 3 mM Mg(OAc)2).
    UWAGA: Wszystkie kroki od tego momentu powinny być przeprowadzane w chłodni o temperaturze 4 °C. Nadaje się jednak również do przechowywania wszystkich lizatów i odczynników na blacie lodowym. Jedynym wyjątkiem jest etap filtracji żelowej, w którym autorzy umieszczają stojak z kolumnami w lodówce o temperaturze 4 °C podczas buforowania. W pierwotnych wersjach tego protokołu nowe żelowe kolumny filtracyjne były "blokowane" poprzez początkowe buforowanie lizatu i odrzucanie pierwszego wyjścia. Chociaż nie uważa się tego za konieczne, kolumny muszą być przepłukiwane buforem EB i przechowywane w temperaturze 4 °C między partiami lizatu. Pierwszy wyjściowy lizat może mieć niższą aktywność ekspresji białka niż kolejne wyjścia ze względu na pewne zatrzymywanie składników lizatu w tle w nowej kolumnie.
  2. Dodaj 2,5 ml lizatu do każdej kolumny i poczekaj, aż przejdzie do kolumny. Dodać dodatkowe 0,5 ml EB, aby osadzić lizat w kolumnie, odrzucając eluat.
  3. Eluować przefiltrowany żelem lizat, dodając dodatkowe 2,5 ml EB do każdej kolumny, zbierając wyjście, umieszczając świeżą, czystą tacę lub inny pojemnik pod kolumnami.

6. Suplementacja lizatu komórkowego

  1. Użyj spektrofotometru nanokropli (patrz tabela materiałów), aby zmierzyć abs280 nm lizatu przefiltrowanego żelem. Jeśli przekroczy 60, rozcieńczyć go, aby osiągnąć Abs280nm = 60, używając dodatkowego buforu EB o temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Podczas gdy kontrolowanie gęstości komórek wprowadzanych do zakłóceń za pomocą OD600 nm w przybliżeniu określa siłę wyjściową lizatu, normalizacja Abs280 nm po rozerwaniu i przetwarzaniu lizatu dodatkowo poprawia spójność partii wydajności lizatu. Lizat Abs280nm można regulować w górę i w dół, co ma konsekwencje dla wydajności i agregacji ekspresji białka (patrz sekcja Dyskusja). Jeśli nieuzupełniony lizat wskazuje na Abs280 nm < 60, może być konieczne włączenie większej ilości biomasy Leishmania do etapu rozrywania, tj. zwiększenie obciążenia czynnika zakłócającego ogniwa do OD600 nm > 300 w kroku 2.1.
  2. Dodaj 5x roztwór do karmienia (5x FS, Tabela 1) do lizatu w stosunku 2:5 i dokładnie wymieszaj. Przelać go do odpowiednich pojemników (np. probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml) i zamrozić w ciekłym azocie. Jeśli ktoś wykonuje poniższe opcjonalne kroki 7.1-7.3 w celu optymalizacji ekspresji LTE, powinien użyć zmniejszonej rNTP.Mg 5x FS z tabeli 1 zamiast domyślnego 5x FS. Dołącz 5 porcji po 100 μl do zamrażania do wykorzystania w eksperymentach optymalizacyjnych.
    UWAGA: Zamrażanie z domyślnym 5x FS w stosunku 2:5 tworzy gotowe do ekspresji uzupełnione LTE, używane przy ekspresji 7 μL/10 μL (stąd 5x FS staje się 1x FS w końcowej reakcji). Jednak autorzy zalecają wykonanie dalszych opcjonalnych kroków, w których 0,6 razy domyślna ilość rNTP i magnezu jest dostarczana w 5 x FS. Po tym następuje etap optymalizacji, w którym dodaje się równomolową mieszankę tych dwóch (określaną jako rNTP.Mg) w celu uzupełnienia reakcji testowych do zoptymalizowanej wartości. Częściowy 5x FS zawiera również oligonukleotyd, który wyłącza endogenną ekspresję mRNA (patrz sekcja Wprowadzenie). Sekwencja oligonukleotydu to CAATAAAGTACAGAAACTGATACTTATATAGCGTT.

7. Kontrola jakości i optymalizacja końcowego uzupełnionego LTE

UWAGA: Minimalne niezbędne kroki do określenia odpowiedniego 'uzupełniającego' dodatku rNTP.Mg do zredukowanego rNTP i lizatu uzupełnionego magnezem obejmują ekspresję eGFP lub podobnego fluoroforu (np. sfGFP) bez partnera fuzyjnego. Rosnące stężenia rNTP.Mg są dodawane do reakcji w celu określenia punktu, w którym poziom ekspresji (mierzony jako eGFP RFU za pomocą wielomodowego czytnika płytek) jest optymalizowany. Przedwczesne zakończenie eGFP, które nie jest fluorescencyjne, staje się widoczne poprzez zmniejszenie RFU eGFP przy zbyt wysokich stężeniach rNTP.Mg. Jednak nieprawidłowe działanie LTE w postaci krótkich produktów występuje częściej w białkach o większej ekspresji (>50 kDa). W związku z tym możliwe jest przeprowadzenie tej optymalizacji przy użyciu większego szablonu niż eGFP, zwłaszcza jeśli jest on dostępny w odpowiednim wektorze ekspresji, zapewniającym fuzję fluoroforu, która jest pożądana do wytworzenia przez LTE dla określonego zastosowania lub badania (patrz sekcja Reprezentatywne wyniki).

  1. Rozmrozić podwielokrotność 100 μl i ustawić sześć reakcji ekspresji 10 μl, z których każda składa się z 7 μl częściowo uzupełnionego lizatu z etapu 6.2, 1 μl roztworu uzupełniającego zgodnie z tabelą 2 i 2 μl ultraczystej wody zawierającej wystarczającą ilość matrycy kontrolnej DNA do osiągnięcia końcowego stężenia 50 ng/μl w reakcji.
  2. Inkubować reakcje przez 2 godziny w temperaturze 25 °C i monitorować wzrost fluorescencji GFP za pomocą wielomodowego czytnika płytek.
    UWAGA: Odpowiednie wartości konfiguracyjne dla GFP to wzbudzenie przy 485 nm (szerokość pasma 5 nm), emisja przy 516 nm (szerokość pasma 5 nm), z interwałem odczytu 1 min przez 2 h.
  3. Uszereguj końcowe wartości wyrażenia, aby określić stężenie rNTP.Mg odpowiadające najwyższemu RFU eGFP. Jeśli dostępne są dane kinetyczne, przekroczenie rNTP.Mg będzie również wskazane przez dwufazowy wzrost eGFP RFU w ciągu 2-godzinnego okresu ekspresji (patrz sekcja Reprezentatywne wyniki).
  4. Po ustaleniu zoptymalizowanego stężenia rNTP.Mg uzupełniającego dodaj go do wszystkich dalszych ekspresji białka, używając partii LTE, która została częściowo uzupełniona w poprzednich krokach.
    UWAGA: Jeżeli porcjowanie w kroku 6.2 odbywa się ostrożnie z ustalonymi objętościami, uzupełnienie można dodać retrospektywnie do każdej podwielokrotności bez rozmrażania, np. z podwielokrotnościami umieszczonymi na suchym lodzie. Te podwielokrotności są teraz w pełni uzupełnione, ponieważ właściwe rNTP.Mg uzupełnianie zostanie zmieszane przez każdy z nich, gdy zostaną rozmrożone i wymieszane do użycia.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem ekspresji białek bezkomórkowych jest wytwarzanie pełnowymiarowych białek w złożonej, aktywnej formie, odpowiedniej do szerokiego zakresu zastosowań. LTE (ekstrakt z Leishmania tarentolae) był wcześniej porównywany z innymi prokariotycznymi i eukariotycznymi systemami ekspresji bezkomórkowej, wykazując wysoką zdolność do unikania skracania i agregacji podczas optymalnego działania, szczególnie w porównaniu z ekspresją bezkomórkową opartą na E. coli33. Wcześniej jednak towarzyszyły temu znaczne różnice w jakości produkcji między partiami. Obecna metoda obejmuje dalsze ulepszenia w celu zapewnienia stałej jakości wyjściowej, przede wszystkim poprzez częściowe uzupełnienie niezbędnego roztworu żywieniowego przed wstępnym zamrożeniem LTE w porcjach. Następnie następuje optymalizacja rNTP.Mg wejściowego transkrypcji w roztworze uzupełniającym, który można dodawać do każdej kolejnej reakcji lub używać do bezpośredniego uzupełniania zamrożonych podwielokrotności. Warto zauważyć, że reakcje optymalizacyjne reprezentują również typowe zastosowanie LTE do praktycznej ekspresji białek, przy czym reakcje przeprowadza się w temperaturze 25 °C przez 2 godziny.

Dane z optymalizacji stężenia rNTP.Mg w reakcjach bezkomórkowych dostarczają reprezentatywnego zestawu danych. Poziomy ekspresji zwykle rosną wraz ze wzrostem danych wejściowych transkrypcji (rNTP.Mg), co wskazuje na pomyślne wyrażenie. Osiągany jest jednak próg, w którym system dąży do nieproduktywnej ekspresji okrojonych produktów, szczególnie w przypadku większych białek (>50 kDa). Ta nieoptymalna ekspresja prowadzi do utraty sygnału fluorescencji wraz ze wzrostem rNTP.Mg, co jest szczególnie widoczne w przypadku fuzji fluoroforów C-końcowych, w których translacja polipeptydu nie dociera do samego fluoroforu. W przypadku fuzji N-końcowych, podczas gdy zmniejszenie całkowitego RFU (względnych jednostek fluorescencji) niekoniecznie występuje przy nadmiarze rNTP.Mg, nieudana ekspresja jest wyraźnie widoczna na żelach SDS-PAGE jako wiele produktów fluorescencyjnych o malejących rozmiarach. Podejście to wykorzystuje zdolność GFP (Green Fluorescent Protein) do utrzymywania fluorescencji nawet po wizualizacji na konwencjonalnym żelu SDS-PAGE, pod warunkiem, że próbki nie są podgrzewane po zmieszaniu. Zamiast tego są one mieszane z buforem ładującym żel i ładowane bezpośrednio na żel. Podczas gdy materiały i sprzęt żelowy SDS-PAGE są na ogół wymienne, imager żelowy musi być w stanie wizualizować fluorescencję GFP. Typową konfiguracją do wizualizacji GFP jest wzbudzenie przy 485 nm (szerokość pasma 5 nm), emisja przy 516 nm (szerokość pasma 5 nm) i 1-minutowy interwał odczytu w ciągu 2 godzin.

Optymalizacja systemu przy użyciu samego wyrażenia eGFP jest możliwa. Rysunek 2A,B (wstawka) przedstawia typowe wyniki reakcji optymalizacyjnych dla dwóch partii LTE, przy czym eGFP RFU rośnie wraz ze wzrostem stężeń rNTP.Mg, osiągając optymalny poziom +0,6x rNTP.Mg (Rysunek 2A) i +0,3x rNTP.Mg (Rysunek 2B) dla maksymalnego RFU. Rozwiązanie o zmniejszonej wartości dodanej rNTP obejmuje 0,6 raza rNTP.Mg, co daje łączne poziomy rNTP.Mg 1,2 x i 0,9 razy więcej niż domyślna wartość dla tych partii LTE. Rysunek 2C ilustruje kinetykę wzrostu RFU podczas reakcji dla partii LTE w Rysunek 2B, pokazujący reakcję dwufazową z dwiema odrębnymi fazami w czasie trwania reakcji.

figure-results-1
Rysunek 2: Optymalizacja dodawania rNTP.Mg doładowanie w LTE ze zmniejszonym rNTP 5x FS. (A) Poziomy ekspresji eGFP po 140 minutach ekspresji z plazmidu kontrolnego przy różnych poziomach rNTP.Mg uzupełniania w reakcji ekspresji bezkomórkowej (n = 3, wykreślona średnia ± SD). (B) Optymalizacja innej partii produkcyjnej LTE, wykazująca zmniejszoną ekspresję powyżej pewnego progu rNTP.Mg. (C) Kinetyka akumulacji eGFP w tych samych reakcjach co (B), ze wzrostem rNTP.Mg uzupełniania. Dane te reprezentują również typową kinetykę akumulacji białka w ekspresji partii LTE. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Należy jednak zauważyć, że eGFP, będąc małym białkiem (27 kDa), które jest łatwe do złożenia, prawdopodobnie ulega ekspresji, fałdowaniu i dojrzewaniu niezależnie od użytego systemu ekspresji bezkomórkowego. Awaria systemu jest bardziej prawdopodobna w przypadku ekspresji większych białek będących przedmiotem zainteresowania, przy czym skrócone produkty stają się bardziej widoczne przy rozmiarach białka wejściowego większych niż 70 kDa33. W związku z tym lepsza jest optymalizacja systemu z białkami przeznaczonymi do rzeczywistego użytku, przy czym eGFP jest nadal obecny do oceny ilościowej, ale jako N-końcowa fuzja z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania.

Rysunek 3 przedstawia typową optymalizację poziomu uzupełnienia rNTP.Mg przy użyciu większej matrycy białkowej, skłonnej do dostarczania produktów okrojonych (eGFP-Sox18). Korzystając z półnatywnego formatu żelu SDS-PAGE (tj. bez podgrzewania próbek), możliwe jest zobrazowanie postępującego braku ekspresji. Optymalna addycja rNTP.Mg przy +0,1x (w połączeniu z 0,6x rNTP.Mg w roztworze do częściowego karmienia, wynosząca łącznie 0,7x) wyraźnie zmniejsza frakcję prążka białkowego na całej długości jako część całkowitych produktów ekspresji fluorescencyjnej, co oznacza awarię systemu przy nadmiarze rNTP.Mg dodaniu.

Jak wspomniano w protokole, możliwe jest pominięcie kroku optymalizacji rNTP.Mg i bezpośrednie dodanie pełnej ilości rNTP.Mg do "domyślnego" roztworu żywieniowego podczas suplementacji bezpośrednio po filtracji żelu w kroku 6.2. W ten sposób protokół zasadniczo powraca do oryginalnych opublikowanych metod tworzenia LTE34. Autorzy uważają jednak, że dostosowanie systemu do optymalnej wydajności, jak pokazano na rysunku Rysunek 3 (od pasa D do pasa E), przeważa nad dodatkową złożonością protokołu i zwiększa wartość LTE jako narzędzia do ekspresji białek.

figure-results-2
Rysunek 3: Wpływ zwiększenia doładowania rNTP.Mg na ekspresję eGFP-Sox18 w częściowo uzupełnionym LTE. Półnatywny żel SDS-PAGE obrazujący wpływ rosnącego doładowania rNTP.Mg na ekspresję eGFP-Sox18. Tor A: +0,1x (rNTP.Mg) doładowanie, tor B: +0,2x (rNTP.Mg), tor C: +0,3x (rNTP.Mg), tor D: +0,4x (rNTP.Mg). N-końcowa fuzja eGFP jest wizualizowana przez skanowanie fluorescencyjne żelu. Podstawowe pasmo na torze A reprezentuje pełnowymiarowy eGFP-Sox18. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

cyfrowa szt. szt. ( Rozdział szt.
KomponentKoncentracja zapasów5x roztwór paszowyμL zapasu/ml 5x roztwór paszowy
Domyślne (zmniejszone rNTP)Domyślne (zmniejszone rNTP)
spermidyna100 mM1,25 mM12
Naziemna telewizja500 mM10 mM20
Fosforan kreatyny1000 mM200 mM200
HEPES-KOH pH 7,62500 mM100 mMRozdział 40
PEG30000,5 V/V0,05 V/V100
Koktajl inhibitorów proteazy120x5xRozdział 43
Aminokwasy3,6 mM (szt.)0,68 mM (szt.)Rozdział 190
Atp100 mM8,5 (5,1) mM85 (51)
GTP (GTP)100 mM3,2 (1,9) mM32 (19)
Utp100 mM2,5 (1,5) mM25 (15)
Informacja o zgodności z umową100 mM2,5 (1,5) mM25 (15)
Mg(OAc)21 mln16,7 (10) mM16,7 (10)
Przypon antyspawowy oligo1mM0,05 mM50
Polimeraza RNA T75 mg/ml0,5 mg/ml100
Fosfokinaza kreatynowa5 jednostek/μl0,2 jednostki/μl42 Rozdział 42
Woda ultraczysta19 (93)

Tabela 1: Skład 5x roztworu zasilającego (5x FS) dla LTE. 1 ml 5x FS jest wymagany na każde 2,5 ml nieuzupełnionego lizatu po filtracji żelowej. Uzupełnienie o domyślny 5x FS tworzy gotowe do ekspresji LTE do stosowania w reakcjach ekspresji w stosunku 7 μL/10 μL. Receptura o zmniejszonej rNTP.Mg (ilości kursywą) jest zalecana do optymalizacji ekspresji LTE i zawiera 0,6 razy więcej niż domyślne poziomy rNTP i magnezu. Można je dostosować do zmiennych poziomów (od 0,6 do 1,1 razy) w kolejnym eksperymencie optymalizacyjnym, korzystając z dodatków opisanych w tabeli 2.

szt. SZT.
Doładowanie rNTPATP (100 mM)GTP (100 mM)Skrętka komputerowa (100 mM)CTP (100 mM)MgOAc (1 m)Woda ultraczysta
(1 μL/10 μL rxn)μL/200 μLμL/200 μLμL/200 μLμL/200 μLμL/200 μL
+0x00000200
+0,1x/a3.41.3110,7193
+0,2x6.8Rozdział 2.5cyfra arabskacyfra arabska1.3185 Rozdział 185
+0,3xRozdział 10.23.833cyfra arabskaRozdział 178
+0,4xRozdział 13,65.1442.7171 Rozdział 171
+0,5x176,4553.3163 Rozdział 163

Tabela 2: Skład (rNTP.Mg) rozwiązań doładowujących do optymalizacji LTE. Roztwory te służą do optymalizacji LTE poprzez dodanie 1 μl roztworu uzupełniającego na 10 μl reakcji ekspresji białka. Po ustaleniu poziomu uzupełnienia w eksperymencie optymalizacyjnym można go konsekwentnie dodawać do wszystkich kolejnych reakcji ekspresji białek przy użyciu tych samych podwielokrotności wsadowych LTE. Alternatywnie można go dodać bezpośrednio do samych podwielokrotności w ilości 1 μl na 7 μl (bez rozmrażania). Po rozmrożeniu i wymieszaniu lizaty te są stosowane w stężeniu 8 μl LTE na 10 μl ekspresji białka, utrzymując rNTP.Mg poziom uzupełniania ustalony podczas optymalizacji.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoły tworzenia LTE zostały opublikowane w ciągu ostatniej dekady7 i były okresowo aktualizowane25,34. Jednak nowicjusze w tej technice często napotykają stromą krzywą uczenia się, co skutkuje opóźnieniami w osiąganiu wysokiej jakości i wysokowydajnej ekspresji białek. Podobne wyzwania zostały zgłoszone przez inne grupy badawcze pracujące nad LTE35, w szczególności w odniesieniu do znacznych różnic między partiami. Format protokołu oparty na wideo może potencjalnie dostarczyć dodatkowej, mniej oczywistej wiedzy na temat konfiguracji, która przyniesie korzyści potencjalnym użytkownikom34. Do protokołu wprowadzono modyfikacje, mające na celu zwiększenie prawdopodobieństwa sukcesu, uproszczenie procedury, skrócenie czasu i zminimalizowanie błędów związanych ze złożonością.

W przypadku rozbijania komórek kluczowa jest precyzyjna kontrola nad ładowaniem komórek do rozdzielacza kawitacji azotu34. Osiągnięcie tego może być trudne ze względu na dużą gęstość komórek po zagęszczeniu komórek i umyciu. W pierwotnych protokołach stosowano różne metody, takie jak odwirowanie niewielkiej objętości końcowej zagęszczonej kultury i ilościowe określenie frakcji komórkowej. Jednak w tym protokole przyjęto prostsze podejście. Mierzy się objętość zbioru kultur i OD600 nm , a pomiary te służą do obliczenia docelowej objętości koncentratu komórkowego w mililitrach, dążąc do pożądanego końcowego OD600 nm wynoszącego 300. W obliczeniach tych zakłada się, że podczas prania nie dochodzi do znaczącej utraty komórek. Jeśli istnieje podejrzenie utraty komórek, stosuje się alternatywną metodę polegającą na trzykrotnym seryjnym rozcieńczeniu 1:10 zagęszczonych komórek po przemyciu, co ostatecznie prowadzi do rozcieńczenia 1:1000. Pozwala to na zmierzenie rzeczywistej średnicy zewnętrznej koncentratu600 nm, upewniając się, że osiąga on docelową średnicę zewnętrzną600 nm = 300 przed załadowaniem go do zakłócacza.

Nawet przy dokładnej kontroli obciążenia komórek zakłócających działanie substancji chemicznych może wystąpić znaczna zmienność zawartości białka lizatu po rozerwaniu, na co wskazuje Abs280nm filtrowanego żelem niesuplementowanego lizatu34. Dlatego przed wprowadzeniem suplementacji lizatu dokonuje się pomiaru Abs280nm , a lizat rozcieńcza się, aby osiągnąć Abs280nm = 60. Ponieważ reakcje ekspresji białek ostatecznie obejmują lizat 0,5 v/v, daje to standaryzowany lizat reakcyjny o Abs280nm = 30. Wydajność lizatu skonfigurowana z niższą niż Abs280nm = 30 ma tendencję do uzyskiwania długotrwałych reakcji o niskiej ekspresji, podczas gdy wartości większe niż Abs280nm = 30 mają tendencję do uzyskiwania wyższej ekspresji, ale zwiększonej tendencji do agregacji białek wyjściowych.

Optymalizacja wydajności lizatu polega na dostosowaniu danych wejściowych transkrypcji w roztworze żywieniowym, który uzupełnia lizat, w szczególności rNTP i magnez, w opcjonalnych krokach reakcji 7,0-7,3. Ważne jest, aby pamiętać, że rNTP i magnez odgrywają złożone i wielorakie role w sprzężonym systemie transkrypcji-translacji, takim jak LTE25. Wykazano jednak, że LTE ma przybliżone optimum ekspresji magnezu przy rNTP (mM) + 1,5. Ponieważ sam lizat wnosi 1,5 mM Mg do końcowej mieszaniny reakcyjnej, zapewnia to prosty sposób na różnicowanie i optymalizację wejścia rNTP bez współoptymalizacji Mg poprzez zmianę rNTP.Mg równomolowej.

Wydajność lizatu wykazuje znaczną zmienność przy zwiększaniu rNTP.Mg, przy czym ekspresja białka na ogół wzrasta do progu, w którym optymalizacja ulega odwróceniu, co skutkuje nieprawidłowym funkcjonowaniem ekspresji w postaci krótkich produktów zamiast białek o pełnej długości25. Dlatego korzystna jest końcowa optymalizacja systemu w celu zidentyfikowania tego progu. Oryginalny protokół LTE wykorzystywał stałą recepturę rozwiązania żywieniowego, z sugerowaną pewną optymalizacją Mg34. Podejście to zostało później zmodyfikowane o bardziej rozbudowaną optymalizację rNTP. Jednak ta metoda wymagała natychmiastowego zamrożenia lizatu w postaci nieuzupełnionej, aby umożliwić optymalizację podwielokrotności, która miała tendencję do zmniejszania ostatecznych poziomów ekspresji lizatu. Zmniejszenie to przypisano utracie właściwości krioprotekcyjnych roztworu zasilającego podczas błyskawicznego zamrażania nieuzupełnionego lizatu bezpośrednio po etapie filtracji żelu. Obecny protokół zapewnia równowagę poprzez suplementację roztworem żywieniowym zawierającym zmniejszoną rNTP.Mg przed zamrożeniem, który można uzupełnić do optymalnego poziomu w miejscu odciągania.

Oczekuje się, że te ulepszenia protokołu zwiększą użyteczność systemu LTE dla początkujących użytkowników poprzez złagodzenie głównych źródeł zmienności i poprawę spójności wyjściowej ekspresji białek.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie występują żadne konkurencyjne interesy finansowe.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować wielu członkom laboratorium Aleksandrowa, którzy przyczynili się do rozwoju systemów LTE w ciągu ostatnich 10 lat, w szczególności Sergeyowi Mureevowi, który był pionierem systemu i opracował miejsce wejścia rybosomów SITS. Rysunek 1 został stworzony przez Biorender.com i powielany na licencji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PD-10 SuperDex 25 kolumnCytiva17085101Żelowe kolumny filtracyjne
Kawitacja azotu Zaburzacz komórekParr Industries4635 lub 4639Cell Disrupter
Hemin pochodzenia bydlęcego HeminSigma-AldrichH5533Dodatek do hodowli
Penicylina/Streptomycyna 10000U/mlThermo-Fisher15140122Mieszanka
antybiotykówOptiplate 384Perkin-Elmer6007290Płytka wielodołkowa do ekspresji 10ul
Syntezaoligonukleotydów  Oligo z sekwencją CAATAAAGTACAGAAACTGATAC
TTATATAGCGTT
Fosfokinaza kreatynowaSigma-Aldrich9001-15-4Enzym
Tecan SparkTecanlub podobny Wielomodowy czytnik płytek
Chemidoc MP ImagerBioradlub podobny żel SDS-PAGE Imager
4-12% Bis-Tris GelsInvitrogenNW04125SDS-PAGE gels
BiofotometrEppendorflub podobny Spektrofotometr kuwetowy
Nanodrop OneThermofisherSpektrofotometr Nanodrop
Wirówka Avanti JXN-26 BeckmanCoulterlub podobna wirówka, z wirnikami/probówkami o wartości 10K i 50K g
Mikrowirówka 5424REppendorflub podobna mikrowirówka, z probówkami
do mikrowirówek o pojemności 1,5 mlInkubator kolb Inova S44iEppendorflub podobny wytrząsarka do inkubatora kolb odpowiednia do kolb 5L
Szklane kolbySzklane kolby z przegrodami do wzrostu kultur
BaktotryptonBD211705Pożywka wzrostowa
Ekstrakt drożdżowyMerckVM930053Pożywka wzrostowa
GlicerolDowolna klasa analityczna
GlukozaDowolna klasa analityczna
KH2PO4Dowolna klasa analityczna
K2HPO4Dowolna klasa analityczna
UltraPurewater Invitrogen10977-015Lub wyjście z dowolnego dystrybutora wody typu MilliQ
IDT hodowlane 5L

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. The dependence of cell-free protein synthesis in E.coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci USA. 47 (10), 1588-1602 (1961).
  2. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  3. Kelwick, R., Webb, A. J., MacDonald, J. T., Freemont, P. S. Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements. Metab Eng. 38, 370-381 (2016).
  4. Ezure, T., et al. Cell-free protein synthesis system prepared from insect cells by freeze-thawing. Biotechnol Prog. 22 (6), 1570-1577 (2006).
  5. Harbers, M. Wheat germ systems for cell-free protein expression. FEBS Letters. 588 (17), 2762-2773 (2014).
  6. Kobs, G. Selecting the cell-free protein expression system that meets your experimental goals. Promega Corporation. 21, 6-9 (2008).
  7. Kovtun, O., et al. Leishmania cell-free protein expression system. Methods. 55 (1), 58-64 (2011).
  8. Basile, G., Peticca, M. Recombinant protein expression in Leishmania tarentolae. Mol Biotechnol. 43 (3), 273-278 (2009).
  9. Mureev, S., Kovtun, O., Nguyen, U. T., Alexandrov, K. Species-independent translational leaders facilitate cell-free expression. Nat Biotechnol. 27 (8), 747-752 (2009).
  10. Gambin, Y., et al. Single-molecule fluorescence reveals the oligomerization and folding steps driving the prion-like behavior of ASC. J Mol Biol. 430 (4), 491-508 (2018).
  11. Sierecki, E., et al. Rapid mapping of interactions between human SNX-BAR proteins measured in vitro by AlphaScreen and single-molecule spectroscopy. Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2233-2245 (2014).
  12. Sierecki, E., et al. Nanomolar oligomerization and selective co-aggregation of alpha-synuclein pathogenic mutants revealed by single-molecule fluorescence. Sci Rep. 6, 37630(2016).
  13. Leitao, A., Bhumkar, A., Hunter, D. J. B., Gambin, Y., Sierecki, E. Unveiling a selective mechanism for the inhibition of alpha-synuclein aggregation by beta-synuclein. Int J Mol Sci. 19 (2), 334(2018).
  14. Gambin, Y., et al. Single-molecule analysis reveals self assembly and nanoscale segregation of two distinct cavin subcomplexes on caveolae. Elife. 3, e01434(2013).
  15. Ve, T., et al. Structural basis of TIR-domain-assembly formation in MAL- and MyD88-dependent TLR4 signaling. Nat Struct Mol Biol. 24 (9), 743-751 (2017).
  16. Guo, Z., et al. Subunit organisation of in vitro reconstituted HOPS and CORVET multisubunit membrane tethering complexes. PLoS One. 8 (12), e81534(2013).
  17. Ruehrer, S., Michel, H. Exploiting Leishmania tarentolae cell-free extracts for the synthesis of human solute carriers. Mol Membr Biol. 30 (4), 288-302 (2013).
  18. Varasteh Moradi, S., et al. Mapping Interactions among cell-free expressed Zika virus proteins. J Proteome Res. 19 (4), 1522-1532 (2020).
  19. Gagoski, D., et al. Cell-free pipeline for discovery of thermotolerant xylanases and endo-1,4-beta-glucanases. J Biotechnol. 259, 191-198 (2017).
  20. Ergun Ayva, C., et al. Exploring performance parameters of artificial allosteric protein switches. J Mol Biol. 434 (17), 167678(2022).
  21. Lau, D., et al. Fluorescence biosensor for real-time interaction dynamics of host proteins with HIV-1 capsid tubes. ACS Appl Mater Interfaces. 11 (38), 34586-34594 (2019).
  22. Ryan, S. M., et al. Novel antiinflammatory biologics shaped by parasite-host coevolution. Proc Natl Acad Sci USA. 119 (36), e2202795119(2022).
  23. McMahon, K. A., et al. Identification of intracellular cavin target proteins reveals cavin-PP1alpha interactions regulate apoptosis. Nat Commun. 10 (1), 3279(2019).
  24. Sierecki, E., et al. A cell-free approach to accelerate the study of protein-protein interactions in vitro. Interface Focus. 3 (5), 20230018(2013).
  25. Johnston, W. A., Moradi, S. V., Alexandrov, K. Adaption of the Leishmania cell-free expression system to high-throughput analysis of protein interactions. Methods Mol Biol. 2025, 403-421 (2019).
  26. Jung, W., et al. Cell-free formation and interactome analysis of caveolae. J Cell Biol. 217 (6), 2141-2165 (2018).
  27. Fontaine, F. R., et al. Functional domain analysis of SOX18 transcription factor using a single-chain variable fragment-based approach. MAbs. 10 (4), 596-606 (2018).
  28. Overman, J., et al. Pharmacological targeting of the transcription factor SOX18 delays breast cancer in mice. Elife. 6, e21221(2017).
  29. Kubala, M. H., et al. Mammalian farnesyltransferase alpha subunit regulates vacuolar protein sorting-associated protein 4A (Vps4A)--dependent intracellular trafficking through recycling endosomes. Biochem Biophys Res Commun. 468 (4), 580-586 (2015).
  30. Han, S. P., et al. Cortactin scaffolds Arp2/3 and WAVE2 at the epithelial zonula adherens. J Biol Chem. 289 (11), 7764-7775 (2014).
  31. Das Gupta, K., et al. Class IIa histone deacetylases drive toll-like receptor-inducible glycolysis and macrophage inflammatory responses via pyruvate kinase M2. Cell Rep. 30 (8), 2712-2728.e8 (2020).
  32. Leitão, A. D. G., et al. Selectivity of protein interactions along the aggregation pathway of α-synuclein. BioRxiv. , (2021).
  33. Gagoski, D., et al. Performance benchmarking of four cell-free protein expression systems. Biotechnol Bioeng. 113 (2), 292-300 (2016).
  34. Johnston, W. A., Alexandrov, K. Production of eukaryotic cell-free lysate from Leishmania tarentolae. Methods Mol Biol. 1118, 1-15 (2014).
  35. Hunter, D. J. B., Bhumkar, A., Giles, N., Sierecki, E., Gambin, Y. Unexpected instabilities explain batch-to-batch variability in cell-free protein expression systems. Biotechnol Bioeng. 115 (8), 1904-1914 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekstrakt z Leishmania tarentolaeoptymalizacja ekspresji bia ekeukariotyczny system bezkom rkowykawitacja azotowafiltracja elowakontrola jako ci partiizwijanie bia ekmultipleksowa synteza bia ek

Powiązane artykuły