Artykuł metodologiczny

Produkcja glukozy w wątrobie, mocznicozna, i lipoliza oznaczone ilościowo przy użyciu perfundowanego modelu wątroby myszy

2.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65596

⸱

6 października 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2NNF Center for Protein Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 3Department for Clinical Biochemistry, Copenhagen University Hospital - Bispebjerg and Frederiksberg, 4Department of Cellular and Molecular Medicine, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 5NNF Center for Basic Metabolic Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy solidną metodę perfuzji in situ wątroby myszy do badania ostrej i bezpośredniej regulacji metabolizmu wątroby bez naruszania architektury wątroby, ale przy braku czynników pozawątrobowych.

Streszczenie

Wątroba pełni wiele funkcji, w tym metabolizm składników odżywczych. W przeciwieństwie do innych modeli badań wątroby in vitro i in vivo, izolowana perfuzja wątroby pozwala na badanie biologii i metabolizmu wątroby w całej wątrobie z nienaruszoną architekturą wątroby, oddzieloną od wpływu czynników pozawątrobowych. Perfuzje wątroby zostały pierwotnie opracowane dla szczurów, ale metoda została dostosowana również do myszy. Tutaj opisujemy protokół perfuzji in situ wątroby myszy. Wątroba jest perfundowana przednio przez żyłę wrotną za pomocą natlenionego buforu wodorowęglanu Krebsa-Henseleita, a wyjście jest pobierane z żyły głównej dolnej nadwątrobowej z zaciskaniem żyły podwątrobowej dolnej w celu zamknięcia obwodu. Za pomocą tej metody można ocenić bezpośrednie działanie badanego związku na wątrobę ze szczegółową rozdzielczością czasową. Czynność wątroby i jej żywotność są stabilne przez co najmniej 3 godziny, co pozwala na włączenie kontroli wewnętrznej do tego samego eksperymentu. Możliwości eksperymentalne z wykorzystaniem tego modelu są liczne i mogą wnioskować o wgląd w fizjologię wątroby i choroby wątroby.

Wprowadzenie

Wątroba jest niezbędnym organem w metabolizmie. Odgrywa kluczową rolę w kontroli bilansu energetycznego całego organizmu poprzez regulację metabolizmu glukozy, lipidów i aminokwasów. Wzrost liczby chorób wątroby na całym świecie staje się głównym globalnym obciążeniem zdrowotnym i potrzebna jest większa wiedza na temat patofizjologii i jej konsekwencji dla funkcji wątroby.

Różne modele in vitro zostały opracowane do badań nad wątrobą, aby uzupełnić badania in vivo. Szeroko stosowane są izolowane i hodowane hepatocyty pierwotne od gryzoni i ludzi. Komórki niemiąższowe można oddzielić od hepatocytów za pomocą wirowania różnicowego i gradientowego, a kokultura różnych typów komórek jest przydatna do badania przesłuchów międzykomórkowych1. Chociaż pierwotne ludzkie hepatocyty są uważane za złoty standard w testowaniu toksyczności leków, kilka badań wykazało, że hepatocyty szybko deróżnicują się w hodowli tkankowej, co powoduje utratę funkcji wątroby2,3,4. Hodowla hepatocytów w systemie sferoidalnym 3D łagodzi odróżnicowanie, jest bardziej stabilna i wydaje się naśladować wątrobę in vivo w większym stopniu niż tradycyjne systemy hodowli 2D5. Precyzyjnie wycięte plastry wątroby to kolejny dobrze sprawdzony model in vitro, który utrzymuje nienaruszoną architekturę tkanki i zawiera komórki niemiąższowe obecne w liver6. Bardziej zaawansowane modele in vitro obejmują wątrobę na chipie7 i organoidy wątrobowe8. Jednak przy wszystkich tych podejściach dochodzi do utraty integralności strukturalnej i dynamiki przepływu, w tym wektorowego przepływu żyły wrotno-wątrobowej, co prawdopodobnie wpływa na możliwość uogólnienia.

Izolowana perfundowana wątroba szczura została po raz pierwszy opisana przez Claude'a Bernarda w 1855 roku9, i jest nadal używana w różnych dziedzinach nauki do badań nad biologią wątroby, toksykologią i patofizjologią. Zalety perfundowanej wątroby w porównaniu z wyżej wymienionymi modelami in vitro obejmują utrzymanie architektury wątroby, przepływu naczyniowego, polarności i strefowości hepatocytów oraz interakcji między hepatocytami a komórkami niemiąższowymi. W porównaniu z badaniami in vivo, perfundowana wątroba pozwala na badanie metabolizmu wątroby w sposób izolowany, unikając czynników pozawątrobowych przenoszonych przez krew i z pełną kontrolą nad warunkami eksperymentalnymi. Na przestrzeni lat wprowadzono kilka modyfikacji w celu ulepszenia modelu perfuzji wątroby szczura10,11,12,13. Chociaż myszy były wykorzystywane do izolowanych badań nad perfuzją wątroby, dostępna jest mniejsza literatura. W tym miejscu przedstawiamy metodę perfuzji in situ wątroby myszy poprzez kaniulację żyły wrotnej i żyły głównej nadwątrobowej dolnej w celu zbadania ostrych i bezpośrednich odpowiedzi metabolicznych na substraty metaboliczne i hormony mierzone w wątrobowym wycieku żylnym z wątroby myszy w czasie rzeczywistym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą Duńskiego Inspektoratu Eksperymentów na Zwierzętach, Ministerstwa Środowiska i Żywności Danii (zezwolenie 2018-15-0201-01397) oraz lokalnej komisji etycznej zgodnie z dyrektywą UE 2010/63/UE, Narodowymi Instytutami Zdrowia (publikacja nr 85-3) i zgodnie z wytycznymi duńskiego ustawodawstwa regulującego eksperymenty na zwierzętach (1987). Jest to zabieg nieuleczalny, a przyczyną zgonu jest wykrwawienie i perforacja przepony w głębokim znieczuleniu.

1. Zwierzęta doświadczalne

  1. Uzyskaj myszy o pożądanej odmianie, wieku i płci. W badaniu wykorzystano samce myszy C57BL/6JRj w wieku 11-16 tygodni. Trzymaj do 5 samców lub 8 samic myszy w klatce z dostępem ad libitum do jedzenia i wody oraz utrzymuj cykl 12 godzin/12 godzin światła i ciemności z włączonym światłem od 6 rano do 18 wieczorem.

2. Przygotowania przedoperacyjne

  1. Zrób bufor perfuzyjny wątroby.
    1. Bufor Krebsa-Henseleita. Wymieszać i rozpuścić 118 mmol/L NaCl, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/LMgSO4 i 1,2 mmol/L KH2PO4 w dH2O. Rozpuścić 1,25 mmol/L CaCl2 w oddzielnej zlewce i dodać bufor.
    2. Rozpuścić 25 mmol/l NaHCO3 i powoli dodawać do buforu, mieszając. Przechowywać bufor w temperaturze 4 stopni. Bufor jest stabilny przez co najmniej 1 miesiąc.
      UWAGA: Wytrącanie się może wystąpić, jeśli CaCl2 i NaHCO3 nie zostaną rozpuszczone pojedynczo przed dodaniem.
  2. Przefiltrować bufor perfuzyjny przez filtr 2 μm i dostosować pH do 7,5 za pomocą HCl.
    UWAGA: Ten krok należy wykonać w dniu eksperymentu, ponieważ pH wzrasta z czasem, nawet gdy jest przechowywane w zamkniętych kolbach.
  3. Przygotować badane związki w stężeniu wyższym niż pożądane stężenie końcowe (np. 20-krotne stężenie przy podawaniu w infuzji z szybkością 0,175 ml/min za pomocą pompy bocznej) w przefiltrowanym i dostosowanym pH buforze perfuzyjnym Krebsa-Henseleita. W razie potrzeby rozcieńczyć badane związki w buforze perfuzyjnym Krebsa-Henseleita z dodatkiem 1% BSA jako nośnika (w celu uniknięcia przywierania do rurek i wyrobów szklanych, co jest niezbędne dla wszystkich peptydów), przefiltrowane przez filtr o odpowiedniej wielkości.

3. Działanie i perfuzja

UWAGA: Ilustracja konfiguracji perfuzji użytej w tym badaniu znajduje się w Rysunek 1.

  1. Gazować bufor perfuzyjny (95%O2, 5% CO2) przez co najmniej 30 minut, aby dostarczyć wystarczającą ilość tlenu do wątroby i utrzymać prawidłowe pH od początku operacji (system buforowy wodorowęglanowy osiągnie pH 7,4 przy ciągłym gazowaniu, patrz rysunek uzupełniający 1).
  2. Znieczulić mysz, podając ketaminę (90 mg/kg) i ksylazynę (10 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym.
  3. Umieść mysz na wznak na rozgrzanym stole operacyjnym i potwierdź brak odruchów w odpowiedzi na uszczypnięcie palca. Spryskaj 70% etanolem, aby włosy nie przyklejały się do nożyczek. Przymocowanie myszy do ciepłej powierzchni pomaga zwiększyć stabilność podczas poniższych procedur.
  4. Wykonaj nacięcie nożyczkami u podstawy brzucha i przetnij w górę do klatki piersiowej po obu stronach, aby odsłonić jamę brzuszną. Przesuń jelita w prawo za pomocą bawełnianego wacika, odsłaniając żyłę wrotną.
  5. Umieść dwie ligatury pod żyłą wrotną za pomocą zakrzywionych kleszczy i przygotuj luźny węzeł dla każdej ligatury.
  6. Wprowadzić cewnik 0,7 mm do żyły wrotnej. Po perforacji wyjmij igłę z cewnika i poprowadź cewnik przez żyłę, aż końcówka cewnika znajdzie się blisko wątroby, jak pokazano na rysunku Rysunek 2. Krew napływa do cewnika.
  7. Dokręć ligatury. Jeśli cewnik nie jest wypełniony krwią, napełnij go buforem perfuzyjnym, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza.
  8. Podłączyć rurkę perfuzyjną i rozpocząć perfuzję wątroby buforem wodorowęglanowym Krebsa-Henseleita w temperaturze 37 °C, uruchamiając pompę rolkową przy natężeniu przepływu perfuzyjnego 0,8 ml/min. Wątroba blednie w ciągu kilku sekund.
  9. Przetnij klatkę piersiową i przeponę za pomocą nożyczek. W tym momencie zwierzę zostaje poddane eutanazji. Umieść ligaturę pod żyłą główną nadwątrobową dolną za pomocą cienkich kleszczyków punktowych. Umieść długopis, zwinięty gazę lub inny jednorazowy przedmiot pod grzbietem myszy, aby żyła była bardziej dostępna.
  10. Wprowadzić cewnik do żyły głównej nadwątrobowej dolnej przez prawy przedsionek serca. Po perforacji wyjmij igłę z cewnika i poprowadź cewnik przez żyłę, aż końcówka cewnika znajdzie się blisko wątroby. Bufor krwi i perfuzji natychmiast się wyczerpuje.
  11. Dokręcić ligaturę i założyć rurkę do zbierania ścieków perfuzyjnych. Zabezpiecz wszystkie rurki wodoodporną taśmą (elegancką taśmą lub podobną).
  12. Użyj adaptera zacisku naczynia, aby umieścić zacisk naczynia w poprzek żyły podwątrobowej bezpośrednio nad prawą żyłą nerkową, aby zapobiec domieszce (Rysunek 2).
  13. Zwiększ natężenie przepływu perfuzji do 3,5 ml/min i uruchom timer. Rozpocznij rejestrację ciśnienia. Udana perfuzja zwykle skutkuje ciśnieniem ~10 mm/Hg.
  14. Przykryj wątrobę sterylną serwetą zwilżoną solą fizjologiczną i dodaj sól fizjologiczną podczas eksperymentu, aby zapobiec jej wysuszeniu.
  15. Zbieraj ścieki perfuzyjne przez 1 minutę i mierz objętość. Objętość powinna wynosić około 3,5 ml/min. Na tym etapie nie oczekuje się domieszki krwi, a serce już nie pompuje.
  16. Odczekaj 30 minut okresu równowagi przed rozpoczęciem eksperymentu.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Ilustracja konfiguracji perfuzji. (A)Stół operacyjny jest umieszczony na statywie i podgrzany do temperatury 37 °C. Bufor perfuzyjny jest gazowany (95%O2, 5% CO2 ), pompowany za pomocą perystaltycznej pompy rolkowej i podgrzewany w wymienniku ciepła z wbudowaną pułapką pęcherzykową. System składa się ponadto z manometru i pompy wrzecionowej do regulacji ciśnienia perfuzji. Ciśnienie perfuzji jest w sposób ciągły rejestrowane i wizualizowane za pomocą przetwornika na komputerze, programu do rejestracji ciśnienia. (B) Czerwona ramka rejestruje połączenia kranów trójdrogowych. Pierwszy trójdrogowy zawór odcinający jest otwarty do infuzji badanego związku za pomocą pompy strzykawkowej, a drugi jest zamknięty. Trzeci jest otwarty do ciągłych pomiarów ciśnienia. Czwarty kran może być używany do pobierania próbek wejściowych, np. do analizy gazu w perfundowanej wątrobie. Łączniki mogą być modyfikowane w zależności od potrzeb do konkretnych eksperymentów wymagających większej lub mniejszej liczby linii infuzyjnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Zdjęcia jamy brzusznej myszy przed i podczas perfuzji wątroby. (A)Zielona kropka wskazuje położenie końcówki cewnika do żyły wrotnej. Ważne jest, aby końcówka cewnika znajdowała się tuż poniżej punktu rozgałęzienia żyły wrotnej do lewej i prawej żyły wrotnej wątroby, ale powyżej gałęzi trzustkowo-dwunastniczej, aby uniknąć przecieku. Żółta kropka wskazuje prawidłowe położenie zacisku naczynia na żyłie podwątrobowej dolnej między prawą żyłą nerkową a wątrobą, aby uniknąć cofania się krwi do perfundowanej wątroby. (B, C) Perfundowana wątroba myszy z dwoma cewnikami wprowadzonymi do żyły wrotnej (B) i żyły głównej dolnej nadwątrobowej (C) oraz zaciskiem naczynia na żyłie głównej dolnej podwątrobowej (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Eksperyment

  1. Rozpocznij eksperyment od zebrania pierwszych próbek wyjściowych za pomocą kolektora frakcji pod koniec okresu równowagi. Pobieraj próbki w żądanym odstępie czasu i natychmiast umieszczaj je na lodzie.
  2. Regularnie sprawdzaj pułapkę bąbelkową i uzupełniaj buforem perfuzyjnym, gdy jest bliska opróżnienia.
  3. Pobrać próbkę buforu przez trójdrożny kran bezpośrednio przed jego wejściem do narządu oraz z cewnika zbiorczego wprowadzonego do żyły głównej dolnej (po jego perfuzji przez wątrobę).
  4. Zmierzyć próbki za pomocą analizatora gazometrii krwi, aby potwierdzić, że narząd jest aktywny metabolicznie (na co wskazuje wzrost ciśnienia parcjalnego CO2 i spadek pH).
  5. Powtórz kroki 4.3-4.4 na końcu eksperymentu, aby ocenić żywotność przez cały czas trwania eksperymentu (Rysunek uzupełniający 2).
    UWAGA: Spadek ciśnienia parcjalnego tlenu nie zapewnia wiarygodnego pomiaru oddychania z powodu strat tlenu z przewodów, narządu itp.
  6. Po 15 minutach perfuzji wyjściowej rozpocząć pierwszą stymulację od podania substancji badanej przez trójdrogowy kran odcinający z pożądaną szybkością przepływu za pomocą pompy strzykawkowej (np. 20-krotne stężenie substancji badanej przy podawaniu w infuzji z szybkością 0,175 ml / min za pomocą pompy bocznej). Alternatywnie, należy zmienić bufor podstawowy na nowy (natleniony i podgrzany) bufor zawierający badany związek w końcowym stężeniu.
  7. Przerwij stymulację i zbieraj próbki wyjściowe przez 20-30 minut przed rozpoczęciem drugiej stymulacji.
  8. Na zakończenie eksperymentu podawać odpowiednią kontrolę pozytywną przez 5-10 minut.
  9. Po eksperymencie wyciąć perfundowaną wątrobę i zważyć ją, aby znormalizować wydajność do masy wątroby. Zatrzaskowo zamroź wątrobę w ciekłym azocie w celu potencjalnego pomiaru zawartości białka w celu normalizacji wydajności do zawartości białka.

5. Pomiary biochemiczne

  1. Określić ilościowo stężenie cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania za pomocą testów odpowiednich do pomiarów w buforze perfuzyjnym (własne lub dostępne na rynku testy kolorymetryczne lub ELISA). Bufor jest kompatybilny z większością technik omicznych, takich jak metabolomika i proteomika.
    UWAGA: W tym badaniu mocznik mierzono na podstawie testu kolorymetrycznego opisanego wcześniej 14. Glukozę i nieestryfikowane kwasy tłuszczowe oznaczono ilościowo przy użyciu dostępnych na rynku zestawów.

6. Analiza danych

  1. Przedstaw dane na wykresach XY pokazujących wydzielanie w czasie.
    UWAGA: Jedną z zalet systemu perfuzji in vitro jest to, że możliwe jest wyrażenie danych jako rzeczywistego wyjścia (stężenie × natężenie przepływu, np. μmol/min) zamiast zmierzonego stężenia na wyjściu (mmol/L), jak w badaniach in vivo. Rozważ normalizację wydajności do masy wątroby podczas porównywania różnych modeli myszy lub do całkowitej zawartości białka (mierzonej przez BCA) podczas porównywania myszy kontrolnych z modelami mysi z otyłością lub chorobami wątroby, w których wzrost masy wątroby może być spowodowany zwiększoną zawartością tłuszczu.
  2. Przedstaw dane podsumowujące jako pojedyncze kropki na zwierzę reprezentujące średnią lub całkowitą produkcję w okresie wyjściowym i w okresie stymulacji (zwykle 15-30 min) lub przyrostową produkcję przy użyciu poprzedniego punktu odniesienia dla każdego okresu stymulacji, w zależności od projektu badania.
  3. Przeanalizuj dane za pomocą sparowanego testu t (dwie grupy) lub jednoczynnikowej ANOVA z powtarzającymi się stymulacjami (więcej niż dwie grupy) z odpowiednim testem post-hoc dla wielu testów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Do określenia, czy bodziec czy substrat prowadzi do uwolnienia cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania, wymagany jest stały punkt odniesienia. Rysunek 3A przedstawia przykład udanego eksperymentu. Wytwarzanie mocznika w perfundowanej wątrobie jest mierzone w odstępach 2-minutowych i przedstawiane jako średnia ± SEM. Okresy wyjściowe poprzedzające każdy z dwóch okresów stymulacji są stałe. Średnia produkcja mocznika podczas dwóch okresów stymulacji i od...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wyizolowana perfundowana wątroba myszy jest silnym narzędziem badawczym do badań nad dynamiką i mechanizmami molekularnymi metabolizmu wątrobowego. Możliwość pobierania próbek z minuty na minutę zapewnia szczegółową ocenę bezpośredniego wpływu badanego związku na wątrobę. W porównaniu z badaniami in vivo, perfundowana wątroba pozwala na badanie metabolizmu wątroby w sposób izolowany, z pominięciem czynników pozawątrobowych przenoszonych przez krew i z pełną kontrolą nad warunkami doświadczalnymi. Zaletą perfuzji...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów istotnego dla tego artykułu.

Podziękowania

Badania i Nicolai J. Wewer Albrechtsen były wspierane przez Novo Nordisk Foundation Excellence Emerging Investigator Grant - Endokrynologia i Metabolizm (nr wniosku. NNF19OC0055001), Europejska Fundacja Badań nad Cukrzycą Future Leader Award (NNF21SA0072746) oraz Niezależny Fundusz Badawczy Dania, Sapere Aude (1052-00003B). Centrum Badań nad Białkami Fundacji Novo Nordisk jest wspierane finansowo przez Fundację Novo Nordisk (umowa o grant NNF14CC0001). Rysunek 1B został stworzony przy użyciu biorender.com. Dziękujemy dr Rune E. Kuhre (Novo Nordisk A/S) za owocne dyskusje na temat perfundowanej wątroby myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3-drożny kranBD394601
Dieta hodowlana AltrominAltromin Spezialfutter1319
Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2· 2H2O)SigmaC8106
Cewniki (0,7 mm)BD381812
Bibuła filtracyjna (wielkość porów 2,0 i #181; m)Zestaw doMillipore AP2029325
QuantiChromTMDIGL-100Protokół niskiego stężenia
KetaminaMSD Zdrowie zwierząt51148590 mg / kg
Ligatura (sterylny jedwab)Agnthos14739
Siarczan magnezu (MgSO4)Sigma230391
Nieestryfikowany tłuszcz zestaw kwasówFujifilm Wako ChemicalsNEFA-HR(2)
Stół operacyjny, podgrzewany na statywie, typ 873Harvard Bioscience, Inc.
Chlorek potasu (KCl)SigmaP9541
Diwodorofosforan potasu (KH2PO4)Merck1.04877
Pompa rolkowa, z czterema kanałamiHarvard Bioscience, Inc.730100
Elegancka taśmaMediq danmark4001910
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)SigmaS5761
Chlorek sodu (NaCl)SigmaS1679
Cyrkulator termostatycznyHarvard Bioscience, Inc.730125Pojemność wanny 3 l, 230 V/50 Hz
WężykTygonE3603Średnica wewnętrzna 1,59 mm, średnica zewnętrzna 3,18 mm
Uniwersalny system perfuzyjnyHarvard Bioscience, Inc.732316Jednostka podstawowa uniper UP-100, typ 834
VaminFresenius KabiB05ABA01Mieszane aminokwasy
Adapter zacisku naczyniaDeutsche BiomedicalDBC1002
Zaciski do naczyńDeutsche BiomedicalDBC1005
WindkesselHarvard Bioscience, Inc.
XylazineRompun Vet53070110 mg/kg
pomiaru glukozy 733776732068

Bibliografia

  1. Bale, S. S., Geerts, S., Jindal, R., Yarmush, M. L. Isolation and co-culture of rat parenchymal and non-parenchymal liver cells to evaluate cellular interactions and response. Scientific Reports. 6, 25329(2016).
  2. Lauschke, V. M., et al. Massive rearrangements of cellular MicroRNA signatures are key drivers of hepatocyte dedifferentiation. Hepatology. 64 (5), 1743-1756 (2016).
  3. Seirup, M., et al. Rapid changes in chromatin structure during dedifferentiation of primary hepatocytes in vitro. Genomics. 114 (3), 110330(2022).
  4. Gupta, R., et al. Comparing in vitro human liver models to in vivo human liver using RNA-Seq. Archive of Toxicology. 95 (2), 573-589 (2021).
  5. Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function, and disease. Scientific Reports. 6, 25187(2016).
  6. Dewyse, L., Reynaert, H., van Grunsven, L. A. Best practices and progress in precision-cut liver slice cultures. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7137(2021).
  7. Li, X., George, S. M., Vernetti, L., Gough, A. H., Taylor, D. L. A glass-based, continuously zonated and vascularized human liver acinus microphysiological system (vLAMPS) designed for experimental modeling of diseases and ADME/TOX. Lab on a Chip. 18 (17), 2614-2631 (2018).
  8. Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).
  9. Bartošek, I., Guaitani, A., Miller, L. L. Isolated Liver Perfusion and its Applications. , Raven Press. New York. (1973).
  10. Gores, G. J., Kost, L. J., LaRusso, N. F. The isolated perfused rat liver: conceptual and practical considerations. Hepatology. 6 (3), 511-517 (1986).
  11. Mischinger, H. J., et al. An improved technique for isolated perfusion of rat livers and an evaluation of perfusates. Journal of Surgical Research. 53 (2), 158-165 (1992).
  12. Vairetti, M., et al. Correlation between the liver temperature employed during machine perfusion and reperfusion damage: role of Ca2. Liver Transplantation. 14 (4), 494-503 (2008).
  13. Ferrigno, A., Richelmi, P., Vairetti, M. Troubleshooting and improving the mouse and rat isolated perfused liver preparation. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 107-114 (2013).
  14. Zawada, R. J. X., Kwan, P., Olszewski, K. L., Llinas, M., Huang, S. -G. Quantitative determination of urea concentrations in cell culture medium. Biochemistry and Cell Biology. 87 (3), 541-544 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ureogeneza w trobowalipoliza w trobowaperfuzja w trobysygnalizacja glukagonumetabolizm sk adnik w od ywczychkanulacja y y wrotnejanaliza gaz w krwiglikogenoliza

Powiązane artykuły