Artykuł metodologiczny

Indukcja alkaliów rogówki i rąbka za pomocą techniki stempla i trepanacji w modelu mysim

3.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65609

⸱

4 sierpnia 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Stanford University School of Medicine, 2McGill University Faculty of Medicine and Health Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę wywoływania dokładnego i powtarzalnego uszkodzenia rogówki i rąbków w modelu mysim. Protokół jest korzystny, ponieważ pozwala na równomierne rozłożenie uszkodzenia silnie zakrzywionej rogówki i rąbka myszy.

Streszczenie

Rogówka ma kluczowe znaczenie dla widzenia, a gojenie rogówki po traumie ma fundamentalne znaczenie dla utrzymania jej przezroczystości i funkcji. Poprzez badanie modeli uszkodzeń rogówki naukowcy chcą pogłębić swoją wiedzę na temat tego, jak rogówka się goi, i opracować strategie zapobiegania i radzenia sobie z zmętnieniem rogówki. Uraz chemiczny jest jednym z najpopularniejszych modeli urazów, który został szeroko przebadany na myszach. Większość poprzednich badaczy używała płaskiego papieru nasączonego wodorotlenkiem sodu do wywołania uszkodzenia rogówki. Jednak wywoływanie uszkodzeń rogówki i rąbka za pomocą płaskiej bibuły filtracyjnej jest zawodne, ponieważ rogówka myszy jest bardzo zakrzywiona. Tutaj prezentujemy nowy instrument, zmodyfikowany stempel biopsyjny, który umożliwia naukowcom stworzenie dobrze opisanego, zlokalizowanego i równomiernie rozłożonego uszkodzenia alkalicznego mysiej rogówki i rąbka. Ta metoda stemplowania umożliwia naukowcom wywołanie dokładnego i powtarzalnego oparzenia chemicznego całej mysiej rogówki i rąbka, pozostawiając inne struktury, takie jak powieki, nienaruszone przez substancję chemiczną. Co więcej, badanie to wprowadza technikę enukleacji, która zachowuje przyśrodkowy karunek jako punkt orientacyjny do identyfikacji nosowej strony kuli ziemskiej. Spojówka opuszkowa i powiekowa oraz gruczoł łzowy są również utrzymywane w stanie nienaruszonym przy użyciu tej techniki. Badania okulistyczne przeprowadzono za pomocą biomikroskopu w lampie szczelinowej i barwienia fluoresceiną w 0, 1, 2, 6, 8 i 14 dniu po urazie. Wyniki kliniczne, histologiczne i immunohistochemiczne potwierdziły niedobór rąbkowych komórek macierzystych i niewydolność regeneracji powierzchni oka u wszystkich myszy eksperymentalnych. Prezentowany model alkalicznego uszkodzenia rogówki jest idealny do badania niedoboru rąbkowych komórek macierzystych, zapalenia rogówki i zwłóknienia. Metoda ta nadaje się również do badania przedklinicznej i klinicznej skuteczności miejscowych leków okulistycznych na mysiej powierzchni rogówki.

Wprowadzenie

Rogówka jest kluczowa dla widzenia i wykazuje unikalne cechy, w tym przezroczystość, która jest warunkiem wstępnym dla wyraźnego widzenia. Oprócz pełnienia głównej roli ochronnej, rogówka odpowiada za 2/3 mocy refrakcyjnej oka1. Ze względu na swoją znaczącą rolę w widzeniu, urazy i zmętnienie rogówki powodują znaczne pogorszenie wzroku i są odpowiedzialne za drugą co do wielkości przyczynę możliwej do uniknięcia ślepoty na świecie2,3. W urazach rogówki z ciężką dysfunkcją rąbka rogówki funkcja barierowa rąbka zmniejsza się, co powoduje migrację komórek spojówki w kierunku powierzchni rogówki i koniunktywalizację rogówki4,5, co dramatycznie pogarsza widzenie. Potrzebne są zatem skuteczne strategie zapobiegawcze i terapeutyczne, aby poradzić sobie z globalnym obciążeniem, jakim jest ślepota rogówki i związana z nią niepełnosprawność.

Obecne zrozumienie procesu gojenia się ran ludzkiej rogówki opiera się na wcześniejszych badaniach, które badały reakcje rogówki na różne urazy. Zastosowano kilka technik i modeli zwierzęcych w celu wywołania różnych chemicznych lub mechanicznych urazów rogówki6,7,8,9 oraz w celu zbadania różnych aspektów procesu gojenia się ran rogówki.

Model oparzenia alkalicznego jest dobrze znanym modelem urazu, który jest wykonywany poprzez bezpośrednie nałożenie wodorotlenku sodu (NaOH) na powierzchnię rogówki lub za pomocą płaskiej bibuły filtracyjnej10. Uszkodzenie alkaliczne powoduje uwolnienie mediatorów prozapalnych i infiltrację komórek wielojądrzastych nie tylko w rogówce i przedniej komorze oka, ale także w siatkówce. Powoduje to niezamierzoną apoptozę komórek zwojowych siatkówki i aktywację komórek CD45+11. Dlatego tak ważne jest, aby precyzyjnie zlokalizować miejsce urazu, aby uniknąć nadmiernych niezamierzonych obrażeń przy użyciu modelu uszkodzenia alkalicznego.

Osiowa długość mysiej gałki ocznej wynosi około 3 mm12. Ze względu na tę niewielką odległość między rogówką a siatkówką, istnieje stroma krzywizna rogówki, która zapewnia wysoką moc refrakcyjną w celu skupienia światła na siatkówce (Rysunek 1A). Jak już wcześniej informowaliśmy13, wywołanie chemicznego uszkodzenia tej mocno zakrzywionej powierzchni za pomocą płaskiej bibuły filtracyjnej jest trudne, szczególnie na rąbku (Rysunek 1B). Wywołanie urazu rąbka wymaga przechylenia bibuły filtracyjnej, co może spowodować niezamierzone uszkodzenie otworu i przyległej spojówki14. Inne podejście polega na bezpośrednim naniesieniu środka chemicznego w postaci kropli na powierzchnię rogówki. Jednak ta metoda nie ma kontroli nad czasem ekspozycji i istnieje potencjalne ryzyko wywołania uszkodzenia spojówek, sklepienia i powiek z powodu dyfuzji cieczy do tych obszarów.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, to badanie przedstawia nowatorską metodę wywoływania obrażeń. Technika ta ma kilka zalet, w tym (i) wywoływanie skutecznego chemicznego uszkodzenia całej powierzchni rogówki i rąbka rogówki w modelu mysim, (ii) wywoływanie zlokalizowanego i dobrze opisanego uszkodzenia rogówki, (iii) możliwość stosowania dowolnego płynu przez z góry określony czas oraz (iv) zdolność do wywoływania różnych rozmiarów urazów rogówki poprzez wybór odpowiednich stempli biopsyjnych. Metoda ta jest również wykonalna w przypadku modeli urazów szczurów i królików, które również wykazują zakrzywioną powierzchnię rogówki i są powszechnymi modelami zwierzęcymi używanymi do badania gojenia się ran na powierzchni oka.

Protokół

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z numerem 33420 Stanford laboratory animal care APLAC, wykorzystanie zwierząt do celów naukowych, oraz Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystywania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. W sumie 10 samców i samic myszy C57BL/6 w wieku 8-12 tygodni zostało hojnie dostarczonych przez laboratorium Irvinga L. Weissmana. Zwierzęta zaaklimatyzowano do 12-godzinnego cyklu światło-ciemność i zaopatrywano je w wodę i paszę ad libitum. Uraz został spowodowany w jednym oku zwierzęcia.

1. Przygotowanie do eksperymentu

  1. Przygotowanie materiałów
    UWAGA: Wszystkie odczynniki należy przechowywać w temperaturze pokojowej.
    1. Przygotuj stempel-trepanację: Przygotuj stempel do biopsji o średnicy 3,5 mm i zaznacz trzon stempla w odległości 5 mm od jego dystalnej krawędzi. Mocno przymocuj stempel i odetnij zaznaczoną dystalną część jego trzonu za pomocą dwubiegowego narzędzia obrotowego. Podczas tego procesu należy nosić ochronę oczu. Przytnij wałek na głębokość 3,5 mm i pozostaw dołączone ostatnie 1,5 mm. Zegnij końcówkę pod kątem 90°, jak pokazano na rysunku Rysunek 1.
    2. Przygotować 0,5 M roztwór NaOH, rozpuszczając 1 g NaOH w 50 ml wody destylowanej.
    3. Przygotuj 10 ml koktajlu znieczulającego, łącząc 2 ml ketaminy 100 mg/ml i 1 ml 20 mg/ml ksylazyny. Przed wstrzyknięciem należy rozcieńczyć tę mieszaninę w 7 ml 0,9% NaCl (sól fizjologiczna).
    4. Przygotować 0,1% roztwór sodowy fluoresceiny, dodając 0,1 ml 10% płynu fluorescencyjnego AK-Fluor do 9,9 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS).
    5. Przygotować PBS (1x) rozpuszczając 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 i 0,23 g NaH2PO4w 900 ml wody destylowanej. Doprowadzić pH roztworu do 7,4. Doprowadź roztwór do końcowej objętości 1 l, dodając wodę destylowaną.
    6. Przygotować 4% roztwór paraformaldehydu (PFA) do utrwalenia. Pod kapturem chemicznym rozpuść 2 g PFA w 45 ml PBS. Podgrzać mieszaninę do temperatury 65 °C i miareczkować jej pH do 7,4. Po rozpuszczeniu PFA doprowadzić roztwór do końcowej objętości 50 ml.

2. Przygotowanie zwierząt

  1. Zważ mysz, aby określić odpowiednią objętość koktajlu znieczulającego do wstrzykiwań. Po prawidłowym obchodzeniu się z myszą i unieruchomieniu jej zgodnie z opisem w Machholz et al.15, podaj koktajl znieczulający dootrzewnowo (IP) w dawce 0,01 ml / g16,17. Celuj w dolne ćwiartki jamy brzusznej do wstrzyknięcia IP, aby zapobiec uszkodzeniu narządów.
  2. Buprenorfinę należy wstrzykiwać podskórnie w postaci zawiesiny do wstrzykiwań o przedłużonym uwalnianiu (3,25 mg/kg) w celu dodatkowego znieczulenia w trakcie i po zabiegu, ponieważ uszkodzenie alkaliów rogówki jest niezwykle bolesne.
  3. Poczekaj, aż zostanie osiągnięta głęboka płaszczyzna znieczulenia. Sprawdź, czy nie ma reakcji na szczypanie palca u nogi jako oznakę udanego znieczulenia głębokiego. Przed rozpoczęciem operacji nałóż prostą maść do oka na przeciwległe oko, aby zapobiec jego wysuszeniu.
  4. Po znieczuleniu umieść mysz na stole operacyjnym przygotowanym zgodnie ze standardowymi zasadami chirurgii gryzoni18. Umieść poduszkę o wysokości 5 mm pod głową gryzonia, ustawioną w bocznej pozycji odleżynowa. Poduszka pomaga podeprzeć głowę gryzonia podczas operacji.
  5. Podawać chlorowodorek tetrakainy (0,5%) krople do oczu w celu dalszego znieczulenia. Dokładnie osusz powierzchnię oka za pomocą chirurgicznej włóczni do oka i przytnij rzęsy.

3. Indukcja uszkodzeń alkalicznych

  1. Przed rozpoczęciem operacji uporządkuj stół operacyjny zgodnie ze standardowymi zasadami chirurgii gryzoni18,19 i utrzymuj sterylność pola operacyjnego podczas operacji. Ustaw mikroskop chirurgiczny tak, aby prawidłowo uwidocznić znieczuloną mysz i ustaw timer na 30 s. Umieść skręcony ręcznik papierowy na pysku zwierzęcia, aby zapobiec niezamierzonemu zachłyśnięciu nosa podczas procesu płukania.
  2. Określ obwód obszaru rąbka za pomocą mikroskopu chirurgicznego, upewniając się, że powieki myszy są szeroko otwarte za pomocą kciuka i palca wskazującego. Delikatnie trzymaj czysty stempel równolegle do osi oka, nie wywierając nacisku w dół. Unikaj kręcenia instrumentu i utrzymuj oś stempla równolegle do osi kuli ziemskiej.
  3. Poproś asystenta chirurgicznego o wrzucenie 3 kropli roztworu NaOH (równego 40 μl) do otworu stempla w celu napełnienia narzędzia i odpowiedniego pokrycia powierzchni rogówki. Napięcie powierzchniowe cieczy zapobiega wyciekom z instrumentu (Rysunek 1).
    UWAGA: Użyliśmy strzykawki 1 mm z igłą 27G ze spłaszczoną końcówką ustawioną pod kątem 50°, aby ostrożnie upuścić roztwór NaOH.
  4. Po 30 s natychmiast przepłukać rogówkę i sklepienie 5 ml PBS (1x). Film 1 przedstawia procedurę wywoływania obrażeń chemicznych.
  5. Użyj uniwersalnego papieru wskaźnikowego pH, aby zapewnić pH 7 - 7,5 na powierzchni rogówki uszkodzonego oka. Następnie nałóż maść okulistyczną z potrójnym antybiotykiem na chemicznie uszkodzoną powierzchnię oka.
    UWAGA: Ruch ogona podczas operacji jest oznaką niskiej głębokości znieczulenia. Zastosuj dodatkowy koktajl znieczulający (ketamina + ksylazyna) poprzez wstrzyknięcie środka znieczulającego [bolus IP (50% objętości początkowej)].
  6. Po operacji upewnij się, że mysz jest w stabilnym stanie. Drugą buprenorfinę należy podawać, jeśli zwierzę odczuwa ból. Stosować tę samą technikę obchodzenia się, co w ppkt 2.2. Rozpocznij badanie pooperacyjne, gdy zwierzę jest pod narkozą.
  7. Po zabiegu umyć, osuszyć i zdezynfekować stempel-trepanację oraz stół operacyjny 70% etanolem.

4. Ocena kliniczna

  1. Do badania znieczulij mysz zgodnie z wcześniejszym opisem w kroku 2.1.
  2. Zbadaj oczy (uszkodzone i nieuszkodzone) pod biomikroskopem z lampą szczelinową. Do robienia zdjęć używaj aparatu (w tym badaniu użyto aparatu w telefonie w trybie kinowym).
  3. Oceń zmętnienie rogówki zgodnie z systemem ocen Yoeruek20: 0 = normalna, przezroczysta rogówka; 1 = łagodne zmętnienie; 2 = większe przezroczystość, ale tęczówka i źrenica są łatwe do odróżnienia; 3 = tęczówka i źrenica są ledwo rozróżnialne; 4 = rogówka jest całkowicie nieprzezroczysta z niewidoczną źrenicą.
  4. Zastosuj 0,1% krople do oczu z fluoresceiną. Osusz nadmiar płynu fluorescencyjnego bawełnianym aplikatorem i oceń pod kątem obecności ubytków nabłonka rogówki za pomocą filtra kobaltowego. Rób zdjęcia.
  5. Monitorować zwierzę do momentu, aż odzyska wystarczającą przytomność, aby utrzymać pozycję leżącą w mostku. Nie należy ponownie wprowadzać zwierzęcia do innych zwierząt, dopóki całkowicie nie wyzdrowieje.

5. Wyłuszczenie

  1. Eutanazja myszy 2 tygodnie po indukcji urazu chemicznego przez zwichnięcie szyjki macicy w 3-5 s21.
  2. Wyłuszczyć oko, zachowując przyśrodkową karułkę i całą spojówkę powiekową w następującej kolejności, jak pokazano na filmie 2.
  3. Pod mikroskopem chirurgicznym ostrożnie wypreparuj połączenie karunku i skóry. Za pomocą kleszczyków do zębów cofnij karułę i poprowadź końcówkę nożyczek chirurgicznych pod spojówką powiekową w kierunku jej połączenia z płytką stępu.
  4. Przetnij spojówkę wzdłuż linii przylegania w kierunku bocznej kantu. Następnie obróć nożyczki chirurgiczne do połączenia spojówki i dolnej płytki stępu na płaszczyźnie podspojówkowej.
  5. Po zakończeniu rozwarstwienia spojówek należy cofnąć powieki górną i dolną od strony nosa kciukiem i palcami wskazującymi. Podczas chowania poprowadź końcówkę pęsety z zakrzywioną końcówką za wystającą łzą w kierunku nerwu wzrokowego. Mocno chwyć nerw wzrokowy i wyciągnij kulę (Rysunek 2).
  6. Przepłukać kulę PBS (1x) i przenieść ją do roztworu utrwalającego.

6. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz kwasem okresowym Schiffa (PAS)

  1. Utrwal kule w 10% roztworze formaliny na noc w temperaturze pokojowej.
  2. Odwodnić tkanki za pomocą sekwencyjnej serii stopniowanego alkoholu o stężeniach 70% etanolu, 80% etanolu, 90% etanolu i 100% etanolu, każdy przez 10-15 minut. Następnie zanurz oczy w ksylenie na 10 minut. Na koniec zamknij oczy w parafinie.
  3. Podzielić bloki parafiny na plastry o grubości 6 μm i umieścić je na szklanych szkiełkach mikroskopowych do barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz kwasem okresowym Schiffa (PAS), zgodnie z opisem w pliku uzupełniającym 1.

7. Obrazowanie i analiza immunofluorescencyjna

  1. W przypadku badań immunohistochemicznych (IHC) należy umieścić oczy w 1 ml PBS (1x) zawierającym 4% PFA w temperaturze 4 °C przez noc. Przemyć próbkę 3x w 1 ml PBS (1x) przez 5 minut każdy.
  2. Aby zapobiec tworzeniu się kryształków lodu i chronić struktury molekularne białek, należy przeprowadzić seryjne nasycenie sacharozy stężeniami 10% sacharozy, 20% sacharozy i 30% sacharozy w PBS. Osadzanie kul w roztworze optycznej koherentnej tomografii (OCT; Rysunek 2) i przechowuj je w temperaturze -80 °C.
  3. Pokrój blok OCT na plastry o grubości 12 μm i zamontuj na szklanych szkiełkach mikroskopowych w celu barwienia IHC.
  4. Przepuszczalność skrawków tkanek na szkiełkach mikroskopowych w 0,1% Triton X −100 w PBS (1x) przez 15 min. Następnie zablokuj antygeny niespecyficzne za pomocą 5% BSA w PBS (1x) przez dodatkową 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Skrawki tkanek inkubować na szkiełkach mikroskopowych w temperaturze 4 °C przez noc w koktajlu docelowych przeciwciał pierwszorzędowych przygotowanych w PBS (1x) zawierającym 1% BSA. W tym eksperymencie pierwszorzędowymi przeciwciałami były rozcieńczone w stosunku 1:100 królicze przeciwciała antykeratynowe 13 (K13) i antykeratynowe 12 (K12) o stężeniu odpowiednio 2,24 μg/ml i 1,56 μg/ml.
  6. Po inkubacji przemyć skrawki tkanek na szkiełkach mikroskopowych 3x PBS (1x). Następnie wykryj związane przeciwciała pierwotne za pomocą 1:500 rozcieńczonego anty-króliczego IgG. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę w ciemności. Następnie prać w PBS (1x) 3x po 5 minut.
  7. Nałóż kroplę anty-blaknięcia fluorescencyjnego medium mocującego zawierającego DAPI na skrawki tkanek pod mikroskopem i przykryj szkiełkiem nakrywkowym. Pozostaw próbki do wyschnięcia w ciemności i zbadaj je pod mikroskopem fluorescencyjnym z tym samym ustawieniem lasera dla zdrowych i uszkodzonych oczu.

Wyniki

Skuteczność metody w indukowaniu niedoboru limbalnych komórek macierzystych (LSCD) oceniano poprzez analizę klinicznych i histologicznych objawów LSCD. Ocena kliniczna została przeprowadzona za pomocą mikroskopii w lampie szczelinowej oraz obrazowania przedniego odcinka za pomocą optycznej koherentnej tomografii (AS-OCT) (Rycina 3 i Rycina 4).

Reepitelializacja przebiegała w sposób dośrodkowy i była szybsza w części skroniowej rogówki w porównaniu do jej części nosowej. W oczach uszkodzonych bezpośrednio po urazie chemicznym rozwinęło się zmętnienie rogówki stopnia 2+-3+ (Rysunek 3). Komórki nabłonka migrowały z spojówki na powierzchnię rogówki po uszkodzeniu limbusa. Rozległy defekt nabłonka rogówki uległ całkowitej reepitelializacji w dniach 12-14, co trwało dłużej niż w przypadku uszkodzenia nabłonka rogówki o podobnej wielkości przy nienaruszonej błonie piwnicznej i rąbku, które zazwyczaj goją się w ciągu 5 dni po urazie8,9. W wyniku LSCD u 50% uszkodzonych oczu pod koniec drugiej tygodnia rozwinęły się trwałe defekty nabłonka (Rysunek 3). Obrzęk rogówki był bardziej wyraźny w ciągu pierwszych kilku dni (Rysunek 3, Rysunek 4), natomiast w drugim tygodniu wystąpiła znaczna włóknienie rogówki, co doprowadziło do zmętnienia rogówki stopnia 4+ u 100% uszkodzonych oczu.

Wczesne oznaki neowaskularyzacji (NV) zaobserwowano klinicznie i histologicznie 24 h po indukcji uszkodzenia chemicznego, co zilustrowano na Rysunku 5; jest to zgodne z ramami czasowymi NV zidentyfikowanymi w badaniu Kvanta i wsp., w którym wykazano obecność oznak NV w obrębie limbusa 24 h po urazie22. W procesie gojenia nowe naczynia dojrzewały, a do 14. dnia po urazie NV przekroczyła limbus i dotarła do centralnej części rogówki. Limbus, wyznaczający granicę między spojówką a rogówką, uległ zniszczeniu.

Histologiczne dowody na niedobór komórek macierzystych limbalnych oraz konjunktywizację zaobserwowano poprzez obecność PAS-dodatnich komórek kubkowych i naczyń krwionośnych w obrębie zrębu23,24,25,26. Komórki kubkowe zaobserwowano w obecnym modelu uszkodzenia, co zaznaczono strzałką na Rysunku 6.

Nabłonek spojówki i rogówki wykazuje przede wszystkim ekspresję unikalnych keratyn, odpowiednio K13 i K1227. Po urazie limbalnym nowe komórki nabłonkowe pochodzące ze spojówki pokryły obnażoną rogówkę, a K12 nie była wyrażana na powierzchni rogówki żadnego z uszkodzonych zwierząt w ciągu 2 tygodni po urazie. Wynik ten, zgodny z innymi badaniami28, wskazywał na całkowite LSCD oraz brak komórek nabłonka rogówki na powierzchni rogówki. Jednak w badaniu przeprowadzonym przez Parka i wsp.29 wykryto ekspresję K12 w 20. i 32. tygodniu po urazie, co sugeruje możliwość transdyferencjacji komórek nabłonka.

W konsekwencji zaobserwowano, że uszkodzenie chemiczne doprowadziło do zniszczenia limbusa oraz limbalnych komórek macierzystych, co skutkowało migracją komórek nabłonkowych spojówki do centrum rogówki w celu pokrycia odsłoniętej powierzchni rogówkowej. Zostało to dodatkowo potwierdzone przez ekspresję markera komórek nabłonkowych spojówki, K13, który występował w całej spojówce oraz na powierzchni rogówki, co przedstawiono na Rysunku 7.

Procedura chirurgiczna i materiały do implantu ocznego w eksperymencie optycznym; widok mikroskopowy, skala linijki.
Rysunek 1: Prawe oko myszy i trepan do wywoływania urazu rogówki i limbusa. (A) Widok boczny pokazujący oko myszy z silnie zakrzywioną rogówką (groty strzałek wskazują limbus). (B) Obraz wykazuje, że nawet duży krążek papieru filtracyjnego jest niewystarczający do odpowiedniego pokrycia obszaru limbusa. Średnica oka myszy mierzona od limbusa do limbusa wynosi prawie 4 mm, a trepan o średnicy zewnętrznej 4,5 mm i średnicy wewnętrznej 3,5 mm (panele D i H) odpowiednio pokrywa rogówkę i powierzchnię limbusa, jak pokazano na panelach (C) i (E). (F) Trepan jest odpowiednio przyłożony do gałki ocznej w obrębie obszaru limbusa. (G) Aby upewnić się, że nie dochodzi do wycieku przez krawędź trepana, po odpowiednim ustawieniu go równolegle do osi gałki ocznej, otwór wypełnia się błękitem metylenowym. Nie stwierdzono wycieku błękitu metylenowego. Pasek skali = 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Etapy rozwoju embrionalnego; obrazy mikroskopowe; embriologia; cechy anatomiczne.
Rycina 2: Enukleowane oczy. (A) Oczy zostały enukleowane z zachowaniem spojówki bulbarnej i powiekowej, gruczołu łzawnego (grot strzałki) oraz nerwu wzrokowego (strzałka). Oczy zdrowe (B) i uszkodzone (C) nasycono 30% sacharozą w celu ochrony przed tworzeniem się kryształów lodu. Nosową część gałki ocznej można rozpoznać po kąciku wewnętrznym oka (oznaczonym jako N). Pasek skali = 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Gojenie rany rogówki; poklatkowo, dni 0-14; obrazy makroskopowe i mikroskopia fluorescencyjna.
Rycina 3: Gojenie rany lewego oka. Przedstawiono proces gojenia rany lewego oka myszy w ciągu 2 tygodni po zasadowym uszkodzeniu rogówki i limba w modelu mysim (A-F). Badanie oka za pomocą lampy szczelinowej. Obrzęk rogówki jest bardziej wyraźny w dniach 0 i 2 (A,B), podczas gdy włóknienie jest bardziej widoczne w drugim tygodniu po urazie (E-F). A.f-F.f przedstawiają proces reepitelializacji tego samego oka. W A.f widoczny jest całkowity defekt nabłonka rogówki i limba bezpośrednio po wywołaniu urazu. Defekt nabłonka zagoił się poprzez migrację komórek nabłonka spojówki w sposób dośrodkowy do 12-14 dnia (A.f-F.f). Jednak w 50% uszkodzonych oczu w drugim tygodniu rozwinął się trwały defekt nabłonka, co wskazano strzałką na obrazach F i F.f. Pasek skali = 1 mm (panel C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Ultradźwiękowe badanie gojenia rogówki: stan normalny, po urazie, 2 tygodnie później; postęp procesu gojenia.
Rysunek 4: OCT przedniego odcinka oka myszy. (A) AS-OCT przedstawia prawidłową krzywiznę rogówki i komorę przednią. Struktura tęczówki jest wyraźna i rozpoznawalna. W średniej peryferii tęczówki nie stwierdzono zrostów tęczówkowo-rogówkowych. (B) Bezpośrednio po urazie grubość rogówki zwiększa się z powodu powstania obrzęku, a w średniej peryferii tęczówki rozwija się zrost tęczówkowo-rogówkowy. (C) Dwa tygodnie po urazie krzywizna rogówki uległa zmianie, widoczny jest całkowity zrost tęczówkowo-rogówkowy wraz z destrukcją komory przedniej. Pasek skali = 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces gojenia rogówki w ciągu 14 dni; analiza histologiczna; obrazy mikroskopowe; regeneracja tkanki.
Rysunek 5: Neowaskularyzacja rogówki. Kliniczne i histologiczne objawy neowaskularyzacji rogówki można zaobserwować podczas procesu gojenia rany po uszkodzeniu wodorotlenkiem sodu (NaOH). (A) Wstępne oznaki neowaskularyzacji stają się wykrywalne w pierwszym dniu po urazie, charakteryzując się czerwonawym przebarwieniem rogówki (wskazane białą strzałką). Przebarwienie to wynika z agregacji erytrocytów w zrębie, co zilustrowano na odpowiadającym mu obrazie histologicznym (D) (wskazane żółtymi grotami strzałek). (B) W ciągu pierwszego tygodnia regeneracji liczba nowych naczyń sukcesywnie rośnie i rozprzestrzeniają się one w całej rogówce. (C) Pod koniec 2 tygodni obszar limbalny jest zniszczony, a nowe naczynia nadal ewoluują. (E) Przekrój histologiczny rogówki dodatkowo ilustruje obecność głębokiej neowaskularyzacji zrębu (pokazana grotami strzałek). Pasek skali obrazu z lampy szczelinowej = 1 mm, pasek skali obrazu histologicznego = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Histologia i immunofluorescencja: tkanka rogówki, barwienie K12/K13, różnicowanie komórek nabłonkowych.
Rysunek 6: Barwienie kwasem periodykowym i Schiffem oraz barwienie immunohistochemiczne (IHC) rogówki.Barwienie kwasem periodykowym i Schiffem oraz barwienie immunohistochemiczne zdrowej i uszkodzonej rogówki wykonano 2 tygodnie po urazie. Zdrowy nabłonek rogówki myszy składa się z 4-5 warstw komórek (A). Uszkodzenie zasadą rogówki i limbusa doprowadziło do koniunktywalizacji rogówki z pojawieniem się komórek kubkowych na powierzchni rogówki, co wskazują czarne strzałki w (D). Zdrowe komórki nabłonka rogówki wykazują ekspresję K12 (B), która nie występuje w komórkach spojówki pokrywających uszkodzoną rogówkę (E). K13, charakterystyczny marker komórek nabłonkowych spojówki, nie jest ekspresowany w zdrowych komórkach nabłonka rogówki (C). Jest on jednak obecny na powierzchni rogówki uszkodzonej wodorotlenkiem sodu (NaOH), co jest oznaką koniunktywalizacji rogówki (F). Pasek skali na obrazie histologicznym = 50 µm, pasek skali na obrazie barwionym IHC = 20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia limbusa prawidłowego i uszkodzonego NaOH, markery K12/K13, barwienie DAPI, porównanie histologiczne.
Rycina 7: Barwienie hematoksyliną i eozyną oraz barwienie immunohistochemiczne. Wykonano barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz barwienie immunohistochemiczne tkanek limbusa prawidłowego i uszkodzonego. (A) Prawidłowy limbus wyznacza obszar przejściowy między końcem twardówki a początkiem rogówki. Region ten jest zazwyczaj pokryty jedną lub dwiema warstwami komórek nabłonkowych spojówki (wskazane strzałkami). W zdrowym oku ekspresja specyficznego markera nabłonka rogówki, zwanego K12, rozpoczyna się w obrębie limbusa i rozciąga się na powierzchnię rogówki (pokazano na obrazie B). Z kolei ekspresja markera spojówki znanego jako K13 jest ograniczona do limbusa i nie wykracza poza jego obręb (wskazana białą strzałką na obrazie C). W oczach uszkodzonych wodorotlenkiem sodu (NaOH) granice limbusa zostają zaburzone. Prowadzi to do migracji komórek spojówki w kierunku uszkodzonej rogówki. (D) Obrazy limbusa uszkodzonego NaOH wykazują obecność neowaskularyzacji zarówno pod warstwą nabłonkową, jak i w obrębie tkanki zrębowej. Po urazie na uszkodzonej powierzchni rogówki brakuje ekspresji K12 (E), podczas gdy K13 jest obficie wyrażany na powierzchni rogówki (F). Pasek skali obrazu histologicznego = 50 µm, pasek skali obrazu barwionego IHC = 100 µm. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Plik uzupełniający 1: Protokół barwienia. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Wideo 1: Uraz rogówki i limbusa wywołany NaOH w modelu mysim z użyciem trepanu dziurkacza. Film przedstawia procedurę indukowania urazu rogówki i limbusa za pomocą NaOH w modelu mysim z wykorzystaniem trepanu dziurkacza. Kluczowe jest trzymanie trepanu dziurkacza w osi równoległej do gałki ocznej i przykładanie minimalnego nacisku do limbusa. Prawidłowa technika jest niezbędna, aby zapobiec wyciekom i osiągnąć optymalne wyniki. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo 2: Ilustracja techniki enukleacji z zachowaniem spojówki bulbarnej. Aby odróżnić stronę nosową gałki ocznej od strony skroniowej, wraz z gałką zachowuje się karynkę nosową. Całą spojówkę oddziela się, zaczynając od miejsca jej połączenia z płytką tarczową. Przy minimalnym nacisku zawartość oczodołu wysuwa się na zewnątrz. Prowadząc kleszczyki w stronę tylnej części gałki ocznej, chwyta się nerw wzrokowy i usuwa tkankę. Enukleowana tkanka obejmuje gałkę oczną, tłuszcz oczodołowy oraz gruczoł łzowy oczodołowy. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Dyskusja

W niniejszym badaniu zaproponowano innowacyjne urządzenie, stempel-trepanę, które może być wykorzystane do skutecznego i powtarzalnego wywołania skutecznego i powtarzalnego uszkodzenia rogówki i rąbka w modelu mysim. Ten model niedoboru rąbkowych komórek macierzystych jest idealny do badania dynamiki gojenia się ran rogówki i koniunktywalizacji po urazie.

Dowody sugerują, że zarówno nisza rąbkowa, jak i środkowa część mysiej rogówki zawierają komórki macierzyste30. W związku z tym do wytworzenia modelu niedoboru komórek macierzystych potrzebne jest skuteczne uszkodzenie rogówki i rąbka, a przedstawiony tutaj model urazu umożliwia wystawienie zakrzywionego rąbka rogówki na działanie czynnika chemicznego przez określony czas. Aby określić najlepsze stężenie i czas trwania uszkodzenia NaOH, zadawano urazy o różnych stężeniach i czasie trwania NaOH. Wyższe stężenia NaOH lub dłuższy czas ekspozycji powodowały zwiększone uszkodzenie tkanek i zwłóknienie. Dlatego naukowcy mogą dostosować te parametry w oparciu o konkretne cele swojego badania i pożądaną ciężkość urazu.

Aby skutecznie odtworzyć ten model uszkodzenia rogówki i rąbka, należy wziąć pod uwagę kilka kluczowych kwestii. Po pierwsze, konieczne jest zmierzenie średnicy rąbka do rąbka docelowego oka, aby określić odpowiedni rozmiar stempla. Zaleca się wybór stempla do biopsji o średnicy zewnętrznej o 0,5 - 1 mm większej niż ta średnica.

Napięcie powierzchniowe użytej cieczy jest ważnym czynnikiem zapobiegającym wyciekom na granicy faz między powierzchnią oka a krawędzią trepanacji stempla, jak pokazano na rysunku 1G. Dlatego nie ma potrzeby wywierania nacisku na końcówkę biopsji stempla.

Aby uniknąć mechanicznego uszkodzenia tkanki, bardzo ważne jest, aby trzymać trepanację stempla w osi równoległej do oka i powstrzymać się od wywierania nacisku na rąbek. Niewłaściwa regulacja osi trepanacji stempla może zwiększyć ryzyko wycieku i spowodować zdecentrowanie miejsca urazu oraz niedokładne wyniki.

Niektóre potencjalne ograniczenia tej techniki obejmują konieczność wyboru odpowiedniego rozmiaru stempla, nabycie wprawy w trzymaniu trepanacji stempla oraz potencjalne ryzyko spowodowania obrażeń mechanicznych. Ograniczenia te można jednak przezwyciężyć poprzez praktykę i postępowanie zgodnie z instrukcjami zawartymi w niniejszym protokole. Szczep i przedział wiekowy myszy to inne czynniki, które wpływają na proces reepitelializacji i muszą być brane pod uwagę w badaniu.

Co więcej, proponowany protokół jest korzystny, ponieważ szczegółowo opisuje metodę enukleacji, która zachowuje spojówkę opuszkową i powiekową oraz pozwala na określenie nosowej części gałki ziemskiej bez stosowania szwów chirurgicznych jako markera. Wcześniejsze badania wykazały, że obszar nosowy oka ma najniższe unerwienie nerwowe w porównaniu z innymi obszarami rogówki, co czyni go bardziej podatnym na neowaskularyzację i zmniejszoną skuteczność regeneracyjną31,32.

Podsumowując, objawy kliniczne LSCD, takie jak zmętnienie rogówki (CO), utrzymujące się ubytki nabłonka i neowaskularyzacja rogówki (NV), wraz z obserwowanymi zmianami histologicznymi, w tym metaplazją komórek kubkowych, ekspresją K13 na powierzchni rogówki i brakiem K12 na powierzchni rogówki, potwierdzają obecność LSCD w tym modelu. Odkrycia te dostarczają dowodów na to, że ta nowatorska technika jest skuteczna w indukowaniu LSCD. Ten model uszkodzenia chemicznego może być wykorzystany w badaniach przedklinicznych w celu zbadania nowych leków i terapii farmaceutycznych w dziedzinie uszkodzeń i regeneracji rogówki.

Oświadczenia

Żaden z autorów nie ma żadnego interesu finansowego w żadnej z firm lub produktów opisanych w tym badaniu. Autorzy deklarują brak innych konfliktów interesów.

Podziękowania

Potwierdzamy, że NEI P30-EY026877 wspiera te badania. Bardzo dziękujemy Charlene Wang i laboratorium dr Irva Weissmana w Instytucie Biologii Komórek Macierzystych i Medycyny Regeneracyjnej Uniwersytetu Stanforda za ich życzliwą pomoc w dostarczaniu zwierząt doświadczalnych. Dziękujemy Hiradowi Rezaeipoorowi za pomoc w przygotowaniu i edycji zdjęć.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało anty-K12ABCAMab185627
Przeciwciało anty-K13ABCAMab92551
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Myszy ThermoFisher ScientificB14
C57BL/6Dr Weissman Lab, Uniwersytet
Zakrzywione kleszczeStorzE1885
Jednorazowa igła wygięta pod kątem 90 stopni
Jednorazowy dziurkacz do biopsjiMed blades
Osioł anty-królik IgG H& LABCAMab150073
EtanolThermoFisher ScientificT038181000CS
Ethiqa XR (zawiesina iniekcyjna buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu)Fidelis Animal Health
Poduszka grzewcza pod mysz 
Chlorowodorek ketaminyAmblerANADA 200-055
OCTTissue-Tek 4583
Okulistyczne nożyczki
Wskaźnik pH w sztyfcieWhatman
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)ThermoFisher ScientificAM9624
Prolong gold antifade odczynnik z DAPIInvitrogenP36935
Mikroskop szczelinowyNIDEKSL-450
Fluoresceina sodowa AK-fluor 10%DailymedNDC17478-253-10
Sterylny roztwór do irygacji (BSS)Alcon9017036-0119
Sterylna strzykawka, 1 i 5 ml
Kleszcze prosteKatena K54550- Storz E1684
Włócznie chirurgicznedo oczu Amerykański biały 17240 Krzyż
Mikroskop chirurgicznyMikroskop
Tetrakaina kropla okulistycznaAlcon     NDC0065-0741-14
Timer
Potrójna antybiotykowa maść okulistycznaBausch and Lomb
TritonX -100Fisher Scientific   50-295-34
Dwubiegowe narzędzie obrotowe200-1/15 Dwubiegowy zestaw
KsylazynaAnaSedNADA#139-236
StanfordachirurgiczneZeiss S5narzędzi obrotowych

Bibliografia

  1. Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
  2. Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: a global problem. Clinical & experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
  3. Lamm, V., Hara, H., Mammen, A., Dhaliwal, D., Cooper, D. K. C. Corneal blindness and xenotransplantation. Xenotransplantation. 21 (2), 99-114 (2014).
  4. Danjo, S., Friend, J., Thoft, R. A. Conjunctival epithelium in healing of corneal epithelial wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (9), 1445-1449 (1987).
  5. Shapiro, M. S., Friend, J., Thoft, R. A. Corneal re-epithelialization from the conjunctiva. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 21 (1 Pt 1), 135-142 (1981).
  6. Shah, D., Aakalu, V. K. Murine Corneal Epithelial Wound Modeling. Wound Regeneration: Methods and Protocols. Das, H. , Springer US. 175-181 (2021).
  7. Rittié, L., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Mouse models of corneal scarring. Fibrosis: Methods and Protocols. 1627, 117-122 (2017).
  8. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
  9. Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (178), 63112(2021).
  10. Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
  11. Paschalis, E. I., et al. The Role of Microglia and Peripheral Monocytes in Retinal Damage after Corneal Chemical Injury. The American Journal of Pathology. 188 (7), 1580-1596 (2018).
  12. Jiang, M., et al. Single-Shot Dimension Measurements of the Mouse Eye Using SD-OCT. Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 43 (3), 252-256 (2012).
  13. Shadmani, A., Razmkhah, M., Jalalpoor, M. H., Lari, S. Y., Eghtedari, M. Autologous Activated Omental versus Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells in Corneal Alkaline Injury: An Experimental Study. Journal of Current Ophthalmology. 33 (2), 136-142 (2021).
  14. Swarup, A., et al. PNP Hydrogel Prevents Formation of Symblephara in Mice After Ocular Alkali Injury. Translational Vision Science & Technology. 11 (2), 31-31 (2022).
  15. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), 2771(2012).
  16. Jaber, S. M., et al. Dose Regimens, Variability, and Complications Associated with Using Repeat-Bolus Dosing to Extend a Surgical Plane of Anesthesia in Laboratory Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 684-691 (2014).
  17. Navarro, K. L., et al. Mouse Anesthesia: The Art and Science. ILAR Journal. 62 (1-2), 238-273 (2021).
  18. Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in Aseptic Rodent Surgery. Current Protocols in Immunology. 1, 1.12.1-1.12.14 (2008).
  19. ACLAM Medical Records Committee. Medical Records for Animals Used in Research, Teaching, and Testing: Public Statement from the American College of Laboratory Animal Medicine. ILAR Journal. 48 (1), 37-41 (2007).
  20. Yoeruek, E., et al. Safety, penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn. Acta Ophthalmologica. 86 (3), 322-328 (2008).
  21. Shomer, N. H., et al. Review of rodent euthanasia methods. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (3), 242-253 (2020).
  22. Kvanta, A., Sarman, S., Fagerholm, P., Seregard, S., Steen, B. Expression of Matrix Metalloproteinase-2 (MMP-2) and Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in Inflammation-associated Corneal Neovascularization. Experimental Eye Research. 70 (4), 419-428 (2000).
  23. Tseng, S. C., Hirst, L. W., Farazdaghi, M., Green, W. R. Goblet cell density and vascularization during conjunctival transdifferentiation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (10), 1168-1176 (1984).
  24. Huang, A. J., Tseng, S. C. Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium. Investigative ophthalmology & visual science. 32 (1), 96-105 (1991).
  25. Rama, P., et al. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
  26. Deng, S. X., et al. Global consensus on the definition, classification, diagnosis and staging of limbal stem cell deficiency. Cornea. 38 (3), 364-375 (2019).
  27. Wei, Z. G., Wu, R. L., Lavker, R. M., Sun, T. T. In vitro growth and differentiation of rabbit bulbar, fornix, and palpebral conjunctival epithelia: Implications on conjunctival epithelial transdifferentiation and stem cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 34 (5), 1814-1828 (1993).
  28. Kao, W. W. Y. Keratin expression by corneal and limbal stem cells during development. Experimental Eye Research. 200, 108206(2020).
  29. Park, M., et al. Plasticity of ocular surface epithelia: Using a murine model of limbal stem cell deficiency to delineate metaplasia and transdifferentiation. Stem Cell Reports. 17 (11), 2451-2466 (2022).
  30. Li, J., et al. Identification for Differential Localization of Putative Corneal Epithelial Stem Cells in Mouse and Human. Scientific Reports. 7 (1), 5169(2017).
  31. McKenna, C. C., Lwigale, P. Y. Innervation of the Mouse Cornea during Development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 30-35 (2011).
  32. He, J., Bazan, H. E. P. Neuroanatomy and Neurochemistry of Mouse Cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (2), 664-674 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oszczuwanie rog wki zasadamimysi model rog wkiniedob r limbalnych kom rek macierzystychgojenie ran rog wkimodel oparzenia chemicznegobadanie w lampie szczelinowejbarwienie fluoresceinregeneracja powierzchni oka
Indukcja alkaliów rogówki i rąbka za pomocą techniki stempla i trepanacji w modelu mysim
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.